專利名稱：非毒性、非產(chǎn)毒性、非致病性鐮孢屬表達系統(tǒng)及所用啟動子和終止子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于重組蛋白生產(chǎn)的宿主細胞.具體地講，本發(fā)明涉及非毒性、非產(chǎn)毒性、非致病性鐮孢屬(Fusarium)真菌宿主細胞，可將其用于重組蛋白，尤其是酶的高水平表達。本發(fā)明還涉及可用于該系統(tǒng)的啟動子序列和終止子序列。
近年來，由于將重組宿主細胞用于表達異源蛋白，已極大地簡化了大量有商業(yè)價值的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，這種蛋白質(zhì)原來只能從其天然來源中純化.目前，已有多種可選擇的表達系統(tǒng)，可從中選擇生產(chǎn)任何特定蛋白質(zhì)所需的表達系統(tǒng)，包括原核宿主和真核宿主。適當(dāng)表達系統(tǒng)的選擇通常不僅取決于宿主細胞產(chǎn)生適量產(chǎn)率所述蛋白質(zhì)的能力，而且在很大程度上取決于預(yù)想的該蛋白質(zhì)的最終用途。
盡管哺乳動物細胞和酵母細胞一直是最常用的真核宿主，但現(xiàn)在已開始認識到絲狀真菌是可用于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的很有用的宿主細胞.現(xiàn)在被利用或被推薦用于上述方法的絲狀真菌的例子有粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)、Acremonium chrysogenum、Tolypocladium geodes、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)和Trichoderma reesei，構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(A.niger)和米曲霉(A.oryzae)。
鐮孢屬的某些種已被用作植物致病性研究和基因調(diào)控研究的模式系統(tǒng)，如尖鐮孢(Fusarium oxysporum)(Dioletz等，1993，Gene13161-67；Langin等，1990，Curr Genet.17313-319；Malardier等，1989，Gene 78147-156和Kistler及Benny，1988，Curr，Genet.13145-149)、腐皮鐮孢(F.solani)(Crowhurst等，1992，Curr，Gene.21463-469)和大刀鐮孢(Fusarium culmorum)(Curragh等，1992，Mycol.Res.97313-317)。這些鐮孢菌不適用于異源蛋白的商品化生產(chǎn)，因為它們具有一些不理想的特征，例如，是植物病原體，或是會產(chǎn)生超過安全水平的真菌毒素。Dickman和Leslie(1992，Mol.Gen.Genet.235458-462)披露了用一種帶有粗糙脈孢霉的nit-2的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化玉蜀黍赤霉(Gibberella.zeae)的方法。由Dickman和Leslie披露的玉蜀黍赤霉菌株是一種植物病原體，并能產(chǎn)生玉米赤霉烯酮-一種雌激素類真菌毒素。Sanchez-Fernandez等(191，Mol.Gen.Genet.225231-233)披露了用一種帶有黑曲霉niaD基團的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化具有niaD突變的藤倉赤霉(Gibberellafujikoroi)的方法。
理想的表達系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)是這樣的它基本上不產(chǎn)生蛋白酶和真菌毒素，而且基本上沒有大量其它內(nèi)源產(chǎn)生的分泌性蛋白，它能以比現(xiàn)有宿主細胞更高的水平表達。本發(fā)明現(xiàn)在就提供滿足上述要求的新型鐮孢屬表達系統(tǒng)。
本發(fā)明提供了一種重組的非毒性、非產(chǎn)毒性和非致病性鐮孢屬宿主細胞，它包括一個與一個啟動子可操縱連接的編碼一種異源蛋白的核酸序列.這里所說的“非毒性”是指該宿主細胞不是植物或動物的毒物。例如，如果以大約20ml(1∶1稀釋)培養(yǎng)3天的鐮孢屬培養(yǎng)基/kg體重/小鼠的劑量給大約5只小鼠注射鐮孢屬培養(yǎng)基約14天之后，這些小鼠中無一只因鐮孢處理而死亡的話，就認為這種鐮孢宿主細胞是非毒性的。這里所說的“非產(chǎn)毒性”是指經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)分析方法，如HPLC分析測定基本沒有真菌毒素的宿主細胞。例如，可用有機溶劑提取一定量的生長在盛有固體營養(yǎng)基的2×9cm培養(yǎng)皿上的鐮孢菌，并將該提取物的0.5％加注到HPLC中進行分析。通過沒有在真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)的已知位置上出現(xiàn)可檢測到的HPLC峰這一現(xiàn)象，可以推斷沒有已知的真菌毒素。這里所說的“非致病性”是指該宿主細胞不會導(dǎo)致健康植株或健康動物明顯發(fā)病。例如，一種能使植物致病的鐮孢菌，會出現(xiàn)對植物木質(zhì)部組織的真菌性侵入，并導(dǎo)致以典型的枯萎癥狀為特征的病態(tài)。這里所說的“異源蛋白”是指一種對該宿主細胞來說不是天然的蛋白質(zhì)，或是一種已通過修飾使其天然序列發(fā)生改變的天然蛋白質(zhì)，或是一種對其表達做過定量改變的天然蛋白質(zhì)，這種表達的定量改變可以是對表達該天然蛋白質(zhì)所需的天然調(diào)節(jié)序列，如啟動子、核糖體結(jié)合位點等進行操作的結(jié)果，或是用重組DNA技術(shù)對宿主細胞進行其它操作的結(jié)果。所述核酸序列可操縱連接在一個合適的啟動子序列上，該啟動子序列可指導(dǎo)所述核酸序列在所述選擇的宿主細胞中轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法，該方法包括在有利于蛋白質(zhì)表達的條件下培養(yǎng)上述菌種之一的宿主細胞，該宿主細胞帶有一個編碼一種異源蛋白質(zhì)的核酸序列；以及從培養(yǎng)物中回收所述蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選實施方案中，所述蛋白質(zhì)是一種真菌蛋白，最好是一種真菌酶。采用本發(fā)明的方法，至少能產(chǎn)生0.5g異源蛋白質(zhì)/1宿主細胞。
出人意料的是，本發(fā)明的宿主細胞僅分泌少量蛋白酶，在下文的實施例1部分所公開的酪蛋白澄清試驗證實了這一點；具體地講，僅能檢測到小的水解區(qū)或檢測不到。本發(fā)明的宿主細胞和方法在某些真菌酶的生產(chǎn)方面出人意料地比其它已知真菌菌種，如黑曲霉、米曲霉或尖鐮孢更為有效。
本發(fā)明還涉及一個由編碼一種尖鐮孢類胰蛋白酶蛋白酶的基因或其片斷衍生的啟動子序列，所述片斷具有基本上與該序列相同的啟動子活性。該啟動子的序列如SEQ ID NO5所示。
此外，本發(fā)明還涉及一個由編碼一種尖鐮孢類胰蛋白酶蛋白酶的基因或其片斷衍生的終止子序列，所述片斷具有基本上與該序列相同的終止子活性。該終止子的序列如SEQ ID NO6所示。


圖1表示由禾本科鐮孢(Fusarium graminearum)(泳道1)、黑曲霉(泳道2)和米曲霉(泳道3)分泌的蛋白質(zhì)的SDS凝膠電泳結(jié)果。泳道4表示分子量標(biāo)記。
圖2表示對下列樣品進行的蛋白酶試驗結(jié)果米曲霉(孔1)；黑曲霉(孔2)；禾本科鐮孢(孔3)；空白孔對照(孔4-6)。
圖3表示質(zhì)粒pJRoy6的構(gòu)建。
圖4表示對禾本科鐮孢20334的轉(zhuǎn)化體中所分泌的類胰蛋白酶蛋白酶進行SDS-PAGE分析的結(jié)果。泳道1分子量標(biāo)記泳道2空白；泳道3純化的類胰蛋白酶蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)；泳道4空白；泳道5未轉(zhuǎn)化的禾本科鐮孢20334；泳道6空白泳道7用質(zhì)粒pJRoy6轉(zhuǎn)化的禾本科鐮孢菌株20334；泳道8空白；泳道9分子量標(biāo)記。
圖5表示pJRoy20的限制圖。
圖6表示pDM151的限制圖。
圖7表示pDM155的限制圖。
圖8A和8B表示當(dāng)DSM151-4在禾本科鐮孢中發(fā)酵20-160小時后Carezyme在禾本科鐮孢中的表達水平。圖8A表示Carezyme的分析結(jié)果。圖8B表示對在所述禾本科鐮孢中Carezyme產(chǎn)生的SDS-PAGE分析結(jié)果。泳道1分子量標(biāo)記；泳道220小時；泳道350小時；泳道470小時；泳道590小時；泳道6120小時；泳道7140小時；泳道8160小時。
圖9A和9B表示當(dāng)DSM 155-10在禾本科鐮孢中發(fā)酵20-160小時后Liploase的表達水平。圖9A表示Lipolase分析結(jié)果。圖9B表示對在所述禾本科鐮孢中Liploase產(chǎn)生的SDS-PAGE分析結(jié)果。泳道1分子量標(biāo)記；泳道220小時；泳道350小時；泳道460小時；泳道590小時；泳道6120小時；泳道7140小時；泳道8160小時。
圖10表示pCaHj418的限制圖。
圖11表示pDM148的限制圖。
圖12表示pDM149的限制圖。
圖13表示pMHan37的限制圖。
圖14表示pDM154的限制圖。
鐮孢屬的特征是菌絲體伸展在培養(yǎng)中呈絮狀，在固體培養(yǎng)基上的菌絲體常帶有一些粉紫或黃色。分生孢子梗細長、長度不同而且是單的，或粗、短、不規(guī)則地分枝，或具有一個瓶梗螺環(huán)，單的或組合成分生孢子座。分生孢子主要有兩類，通常藏在濕的小頭中幾個細胞的大分生孢子，其尖尾略有卷曲或彎曲，一般為舟狀；一個細胞的小分生孢子，卵圓形或長橢圓形，單生或呈鏈狀。某些分生孢子為中等大小，2或3個細胞，長橢圓形或略有卷曲。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明的宿主細胞是禾本科鐮孢的種，它具有以下特征。分生孢子無小分生孢子。大分生孢子明顯有隔膜，厚壁，直至中等鐮狀，不均等彎曲，其腹面近于垂直而背面呈光滑的弧形。基細胞為特異足狀。頂端細胞呈錐形或收縮成進口錐狀。分生孢子梗不分枝或分枝的單瓶梗。厚壁孢子在培養(yǎng)物中通常極緩慢地生成當(dāng)確實發(fā)生時，它們最常見的是生成于大分生孢子上，但也可生成于菌絲體上。菌落形態(tài)學(xué)在PDA培養(yǎng)基上生長迅速，具有稠密的氣生菌絲體，這些菌絲體幾乎充滿試管，通常為黃色至黃褐色，其邊緣呈白色至洋紅色。假如有的話，紅棕至橙色分生孢子座也是稀疏的，只有當(dāng)培養(yǎng)物在30天以上齡時才會出現(xiàn)。其下表面通常為洋紅色。這種真菌能產(chǎn)生任何類型褪色部分的直筒狀(背面與腹面平行)的大分生孢子。
在一個最具體的實施方案中，所述禾本科鐮孢是Fusariumgraminearum Schwabe IMI145425，由美國典型培養(yǎng)物保藏所保藏，編號為ATCC 20334(US專利號4,041,189)，以及它的衍生物和突變體，它們同樣是非毒性、非產(chǎn)毒性和非致病性的，例如在U.S.專利號4,041,189中所披露的。
應(yīng)當(dāng)理解，在本說明書及權(quán)利要求中，所用的“禾本科鐮孢(Fusarium graminearum)”不但指包括在該種內(nèi)的有機體，而且包括那些原先是該種的有機體的種或目前在另一種分類體系中被稱為其它的種，但是仍具有與上文中所述的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征相同的特征的種，而且可能與禾本科鐮孢同義。這些種包括(但不限于)Fusarium roseum，F(xiàn).roseum var.graminearum，玉蜀黍赤霉或Gibberella roseum，Gibberella roseum f.sp.cerealis。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還知道，對這里所述宿主菌種的成功轉(zhuǎn)化并不局限于采用本文具體列舉的載體、啟動子和選擇標(biāo)記。一般而言，用于轉(zhuǎn)化尖鐮孢、腐皮鐮孢和大刀鐮孢的技術(shù)也可用于轉(zhuǎn)化本發(fā)明的宿主細胞。例如，盡管amdS選擇標(biāo)記是優(yōu)選的，其它可用的選擇標(biāo)記包括arg B(構(gòu)巢曲霉或黑曲霉)、trp C(黑曲霉或構(gòu)巢曲霉)、pyrG(黑曲霉、米曲霉或構(gòu)巢曲霉)、niaD(構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或尖鐮孢)、及hyg B(大腸桿菌)標(biāo)記。所述啟動子可以是在這些種中具有強轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，并可以由編碼胞外和胞內(nèi)蛋白質(zhì)，如淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶和糖酵解酶的基因衍生而來。所述啟動子的例子包括(但不限于)構(gòu)巢曲霉amdS啟動子或來自用于糖酵解酶和基因的啟動子，如TPI、ADH、GAPDH和PGK。所述啟動子還可以是同源啟動子，即某一基因的啟動子是所用宿主菌株先天固有的。啟動子序列還可以帶有接頭，以便引入特異限制性位點，有利于該啟動子序列與所選擇的基因連接，或與所選擇的信號肽或前導(dǎo)區(qū)(preregion)連接。
所述啟動子序列可以由一個編碼尖鐮孢類胰蛋白酶蛋白酶的基因或其片斷衍生而來，該片斷具有與該序列基本相同的啟動子活性。所述啟動子的序列如SEQ ID No5所示。本發(fā)明還包括能在下列條件下與所述啟動子序列雜交的核酸序列在5×SSC中預(yù)浸泡，并在40℃下在由20％甲酰胺、5×Denhardt’s溶液、50mM磷酸鈉、pH6.8和50μg變性的超聲處理的小牛胸腺DNA組成的溶液中預(yù)雜交1小時，隨后在大約40℃下在補充了100μM ATP的相同溶液中雜交18小時，接著在溫度大約為45℃的0.4×SSC中洗滌；或者該核酸序列與SEQ ID No5的同源性至少約為90％，最好約為95％，但它具有基本上與所述序列相同的啟動子活性。在另一個實施方案中，所述啟動子可以是包括大量AreA結(jié)合位點的一段序列，AreA是在氯限制期間表達的基因的正調(diào)節(jié)物；在粗糙脈孢霉中這些位點被稱為nit-2(Fu和Marzlus，1990，Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A.875331-5335)。可通過增加或取代該AreA位點對上述啟動子序列進行修飾。
終止子和聚腺苷酸化序列也可來自與所述啟動子相同的序列。在一個特定實施方案中，終止子序列可以由一個編碼尖鐮孢類胰蛋白酶蛋白酶的基因或其片斷衍生而來，所述片斷具有基本上與該序列相同的終止子活性。該終止子的序列如SEQ ID No6所示。本發(fā)明還包括能在下列條件下與所述終止子序列雜交的核酸序列在5×SSC中預(yù)浸泡，并在大約40℃，在由20％甲酰胺、5×Denhandt’s溶液、50mM磷酸鈉(pH6.8)和50μg變性的超聲處理的小牛胸腺DNA組成的溶液中預(yù)雜交1小時，隨后在40左右、在補充了100μM ATP的相同溶液中雜交18小時，接著在45℃左右的0.4×SSC中洗滌；或者該核酸序列與SEQ ID No5的同源性至少約為90％，最好約為95％，但它具有基本上與所述序列相同的終止子活性。
還可以把增強子序列插入該構(gòu)建體中。
為了避免破壞細胞以獲取表達產(chǎn)物，并減少表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)可能發(fā)生的降解，該產(chǎn)物最好能被分泌到細胞外面。為此，在一個優(yōu)選實施方案中，將目的基因同一個前導(dǎo)區(qū)，如信號肽或前導(dǎo)肽連接，該前導(dǎo)區(qū)可引導(dǎo)表達產(chǎn)物進入細胞的分泌途徑。所述前導(dǎo)區(qū)可由任何生物的用于任何分泌性蛋白的基因衍生而來，或者是天然前導(dǎo)區(qū)。該前導(dǎo)區(qū)的可選來源有曲霉菌的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因、芽孢桿菌的淀粉酶基因、Rhizomucor miehei的脂肪酶或蛋白酶基因、來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-因子編碼基因或小牛前凝乳酶(prochymosin)基因。所述前導(dǎo)區(qū)可來自用于米曲酶TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、地衣型芽孢桿菌(B.licheniformis)α-淀粉酶、來自芽孢桿菌NCIB11837的生麥淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)α-淀粉酶或地衣型芽孢桿菌枯草蛋白酶的基因。有效的信號序列是米曲霉TAKA淀粉酶信號、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶信號和Rhizomucor miehei脂肪酶信號。另外，還可以采用被表達基因的天然前導(dǎo)區(qū)，例如SEQID No4中氨基酸-24至-5之間的片段。
同啟動子和終止子序列功能性地連接著的用于目的產(chǎn)物的基因可以插入帶有選擇標(biāo)記的一種載體中，或是攜帶在能夠整合到宿主菌株的基因組里的一個單獨的載體或質(zhì)粒上。另外，所用的載體可以作為線狀或環(huán)狀染色體外因子在宿主細胞中復(fù)制。舉例來說，這類載體包括質(zhì)粒和微型染色體。所述載體系統(tǒng)可以是單個的載體或質(zhì)粒，或者是共同攜帶有待整合到基因組中去的全部DNA的兩個或兩個以上的載體或質(zhì)粒.載體或質(zhì)?？梢允蔷€狀或閉環(huán)分子。
可采用本領(lǐng)域已知的方法，如轉(zhuǎn)化法和電穿孔法(例如，參見Fincham，1989，Microbial Rev.53148-170)，用編碼所述異源蛋白的核酸轉(zhuǎn)化宿主細胞。
可采用本領(lǐng)域已知的方法培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細胞。簡單地說，是在標(biāo)準(zhǔn)的生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)宿主細胞，例如，那些含有無機鹽、維生素、適當(dāng)?shù)挠袡C碳源(如葡萄糖或淀粉)、各種復(fù)合營養(yǎng)源中的任一種(酵母提取物、水解酪蛋白、大豆粉等)的生長培養(yǎng)基。例子之一是FP-1培養(yǎng)基(5％大豆粉、5％葡萄糖、2％K2HPO4、0.2％CaCl2、0.2％MgSO4·7H2O和0.1％Pluronicacid(BASF))。在pH約為4.5-8.0和溫度大約為20-37℃的條件下發(fā)酵大約2-7天。
本發(fā)明的宿主細胞可用于表達任何感興趣的原核或真核異源蛋白，但最好用于表達真核蛋白質(zhì)。這種宿主細胞的特別有用的用途是用于表達異源蛋白，特別是真菌酶。這種新型表達系統(tǒng)可用于表達各種酶，例如過氧化氫酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、氧化還原酶、纖維素酶、木聚糖酶、過氧化物酶、脂肪酶、水解酶、酯酶、角質(zhì)酶、蛋白酶及其它蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶、肌醇六磷酸酶、裂合酶、果膠酶及其它溶果膠酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、甘露糖苷酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)化酶、轉(zhuǎn)移酶、核糖核酸酶、殼多糖酶、變位酶(mutanose)及脫氧核糖核酸酶。
在一個特定實施方案中，所述酶是一種堿性蛋白酶，例如尖鐮孢前原胰蛋白酶(pre-pro-trypsin)基因。在一個最為具體的實施方案中，基因組序列如SEQ ID No3所示，而蛋白質(zhì)序列如SEQID No4所示。
在另一個具體實施方案中，所述酶是一種堿性內(nèi)切葡聚糖酶，它可與一種抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，這種抗體針對來自Humicolainsolens，DSM 1800的高度純化的-43kD內(nèi)切葡聚糖酶；或是具有纖維素酶活性的-43kD內(nèi)切葡聚糖酶的衍生物(參見WO91/17243)。下文中稱之為“Carezyme”的內(nèi)切葡聚糖酶可以由SEQ ID NO7所示的基因編碼，并可以具有SEQ ID NO8所示的蛋白質(zhì)序列.這種酶還可以是Carezyme的變體。
在又一個具體實施方案中，所述酶是一種1，3-特異性脂肪酶，下文中稱之為Lipolase的變體。這種酶可以由SEQ ID NO9所述的DNA序列編碼，并可以具有SEQ ID NO10所示的氨基酸序列。這種酶還可以是Lipolase的變體，例如D96L，E210K、E210L(參見WO92/05249)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，“真菌酶”一詞不僅包括天然真菌酶，而且還包括通過氨基酸取代、缺失、添加修飾過的真菌酶，或是對其進行其它修飾以增強其活性、熱穩(wěn)定性、pH耐受性等的真菌酶。本發(fā)明的宿主細胞還可用于表達有藥用價值的異源蛋白，如激素、生長因子、受體等。
下面將通過非限定性實施例對本發(fā)明做進一步說明。
實施例1.禾本科鐮孢20334僅分泌少量的蛋白質(zhì)將禾本科鐮孢菌株20334、米曲霉和黑曲霉的分生孢子懸浮液接種到盛在體積為125ml的搖瓶里的25ml YPD培養(yǎng)基(1％酵提取物(Difco)、2％細菌培養(yǎng)用胨(Difco)、2％葡萄糖)中，并在30℃、以300rpm的速度搖動的條件下培養(yǎng)5天。通過離心收集該培養(yǎng)物中的上清液。將每種樣品共10μl與10μl 0.1M二硫蘇糖醇(Sigma)和10μl加樣緩沖液(40mM Tris堿、6％十二烷基硫酸鈉、2.5mM EDTA、15％甘油、2mg/ml溴甲酚紫)混合。將上述樣品煮沸5分鐘，并在4-12％聚丙烯酰胺凝膠(Navex)上電泳5分鐘。通過考馬斯蘭染色顯現(xiàn)上述蛋白質(zhì)。結(jié)果(圖1)表明，禾本科鐮孢菌株20334僅能產(chǎn)生極少的分泌性蛋白質(zhì)。
2.禾本科鐮孢20334僅分泌少量的蛋白酶將來自禾本科鐮孢菌株20334、米曲霉和黑曲霉的培養(yǎng)基(參見1.)共40μl各用移液管分別加注到在酪蛋白瓊脂平皿(2％無脂奶粉(Lucerne)、50mM Tris-HCl pH＝7.5、1％惰性瓊脂(Difco))上切出的孔中。將上述平皿在37℃培養(yǎng)5小時，并觀察蛋白質(zhì)水解范圍。結(jié)果(圖2)表明，禾本科菌株20334培養(yǎng)物只有極小的蛋白酶解活性。
3.尖鐮孢基因組前原胰蛋白酶基因的克隆由尖鐮孢基因組DNA制備在λ噬菌體中的基因組文庫，所采用的方法如Sambrook等在Molecular Cloning(A laboratoryManual，Cold Spring harber)N.Y.1989)一書中所述。將總計50μg基因組DNA放在含有10mM Tris(pH＝7.5)、50mM NaCl、7mMMgCl2、7mM2-巰基乙醇和4個單位的Sau3A限制酶的體積為200μl的溶液中，在37℃溫度下消化1分鐘。通過瓊脂糖凝膠電泳分離分子大小為10-20kb的部分消化的DNA，接著電洗脫到透析膜上，并用一個Elutip-D柱(Schleicher和Schuell)進行濃縮。將1μg用限制酶BamHI切過、并用磷酸酶(Clonetech)處理過的EMBL4噬菌體的λ臂與300-400μg用Sau 3A切過的基因組DNA在25μl的體積中、在標(biāo)準(zhǔn)條件下連接(參見Sambrook等，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，cold Springharbor，NY)。采用一種商品化試劑盒(Gigapack Gold II，Stratagene)，按照生產(chǎn)商的說明由上述連接混合物制備λ噬菌體。
采用標(biāo)準(zhǔn)方法，鋪平板培養(yǎng)大約15,000個重組λ噬菌體，并生產(chǎn)濾膜吸取物(吸至Hybond N+濾膜上，Amersham)(Sambrook，等，1989，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbar，NY)。按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor，NY)處理該濾膜，與Genius試劑盒雜交，進行非放射性核酸檢測.用作探針的DNA是用地高辛配基(DIG)標(biāo)記的、存在于質(zhì)粒pSX233上的尖鐮孢類胰蛋白酶蛋白酶(以下稱SP387)基因的完整編碼區(qū)的0.75kb的PCR片段，該探針已由NRRL保藏，入藏號為NRRLB-21241。該PCR反應(yīng)的引物是5′-tgcggatcc ATGGTCAAGTTCGCTTCCGTC(正向引物，SEQ ID NO1)和5′-gacctcgag TTAAGCATAGGT GTCAATGAA(反向引物；SEQ ID NO2)。在以上兩個引物中，小寫字母表示接頭序列，而大寫字母表示上述SP387基因的編碼區(qū)。為了進行PCR，將25ng帶有來自質(zhì)粒pSx233的SP387基因的長度為907bp的BamH1/XbaI DNA片段，分別與68pmol的正向引物和反向引物混合。
將上述DNA片段與引物的混合物用1×Taq緩沖液/1×DIG標(biāo)記Mix/5單位Taq(Boehringer Mannheim)調(diào)至80μl體積。反應(yīng)條件為95℃3分鐘，然后進行這樣的35個循環(huán)(95℃30秒，50℃1分鐘，72℃1分鐘)。通過PCR由尖鐮孢類胰蛋白酶蛋白酶基因得到的DNA序列如SEQ ID NO3所示。采用一種改進的(Engler和Blum，1993，Anal.Biochem.210235-244)Genius試劑盒(Boehringer M-annheim)，用由DIG標(biāo)記的探針篩選噬菌斑。分離陽性克隆并通過又一輪鋪平皿培養(yǎng)和雜交進行純化。制備帶有尖鐮孢類胰蛋白酶蛋白酶基因的重組λ噬菌體，并用Quiagenλmidi制備試劑盒(Quiagen)從該噬菌體中分離DNA。
4.表達質(zhì)粒pJRoy6的構(gòu)建將限制作圖、Southern印跡和雜交技術(shù)(Sambrook等，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，NY)用于鑒定來自所述重組噬菌體之一的一個5.5kb的Pst1限制酶片段，它帶有尖鐮孢類胰蛋白酶蛋白酶編碼基因及側(cè)翼DNA序列。將這個5.5kb的Pst1片段亞克隆到Pst1消化的pUC118上，并將質(zhì)粒命名為pJRoy4(見圖3)。用限制酶EcoR1消化質(zhì)粒pJRoy4，分離帶有SP387基因和pUC118多接頭的43bpEcoR1/Pst1區(qū)的3.5kb的EcoRI片段，并將其亞克隆到載體pToC90上，制成質(zhì)粒pJRoy6(圖3)。
5. SP387表達盒的構(gòu)建構(gòu)建一種帶有SP387啟動子和終止子的表達盒(pJRoy20)，該表達盒是通過把所述啟動子和終止子連接在pUC118上的BamH1位點而構(gòu)成的。已將帶有pJRoy20的大腸桿菌菌株保藏在NRRL。上述啟動子片段是通過用EcoR1(切點為-1200)和Nco1(切點為翻譯起始位點，見圖5)消化SP387載體pJRoy6而產(chǎn)生的。上述終止子序列(圖5中的堿基從2056-3107)是通過PCR擴增而產(chǎn)生的，擴增反應(yīng)使用以下寡核苷酸正向5′ gcacaccatggtcgctggatccATACCTTGTTGGAAGCGTCG3′(SEQ ID N11)反向5′ atcggagcatgcggtaccgtttaaacgaatta AGGTAAACAAGATATAATTTTCTG3′(SEQ ID NO12)大寫字母與SP387終止子DNA互補，而小寫字母是帶有工程限制位點的尾部。
在用Nco1和Sph1消化之后，分離所產(chǎn)生的帶有終止子的擴增產(chǎn)物，在該終止子靠近5′末端的一側(cè)有Nc01和BamH1位點，而在靠近其3′末端的一側(cè)有EcoR1、Pme1、Kpn 1和Sph1位點。連接上述啟動子片段、終止子片段和用Kpn1/Sph1切過的pUC118三者，以制成pJRoy20(見圖5)。
6. Carezyme構(gòu)建體將位于SP387啟動子的-15位置上的EcoRV位點和位于Carezyme編碼區(qū)的+243位置上的Nco1位點用于在SP387啟動子與Carezyme基因之間產(chǎn)生正確融合。采用以下引物由Carezyme載體pCaHj418(見圖10)產(chǎn)生PCR片段，該片段帶有SP387上-18至-1的片段，緊接著是Carezyme基因上-1至+294的片段。
正向EcoRV5′ ctcttggatatctatctcttcaccATGCGTTCCTCCCCCCTCCT3′ (SEQ ID NO13)反向5′ CAATAGAGGTGGCAGCAAAA3′ (SEQ ID NO14)正向引物里的小寫字母是SP387啟動子上從-24至-1處的bp，而大寫字母是Carezyme上從1至20處的bp。
所采用的PCR條件為95℃5分鐘，接著進行30個循環(huán)(95℃30秒，50℃1分鐘，72℃1分鐘).用Invitrogen’s TA克隆試劑盒把所得到的0.32kb片段克隆到載體pCRII上，制成pDM148(見圖11)。從pDM148中分離0.26kb的EcoRV/Nco1片段，并用來自pCaHj418的0.69kb Ncol/Bg III片段連接，再將其克隆到用EcoRV/BamH1消化過的pJRoy20上，制成pDM149(見圖12)。將3.2kb EcoR1 Carezyme表達盒(SP387啟動子/Carezyme/SP387終止子)從pDM149上分離下來，并將其克隆到pToC90的EcoR1位點上，以制成pDM151(見圖6)。表達構(gòu)建體pDM151帶有上述表達盒和amd S選擇標(biāo)記。已把帶有pDM151的大腸桿菌菌株保藏在NRRL。
7. Lipolase構(gòu)建體將位于SP387啟動子的-15位置上的Ec0RV位點和位于Lipolase編碼區(qū)的+6位置上的Sacl位點用于在SP387啟動子和Lipolase基因之間產(chǎn)生正確融合。構(gòu)建一個帶有SP387啟動子的最后15個bp、后接Lipolase編碼區(qū)的前6個bp的銜接頭，該接頭如下所示。
EcoRVSacIatctatctcttcaccATGAGGAGCT (SEQ ID NO15)tagatagagaagtggTACTCC (SEQ ID NO16)LipolasecDNA基因的一個0.9kb SacI/BamHI片段是從米曲霉表達構(gòu)建體pMHan37(見圖13)上分離的。連接所述EcoRV/SacI銜接頭和SacI/BamHI Lipolase片段，并將其克隆到用EcoRV/BamHI消化的pJRoy20上，制成質(zhì)粒pDM154(見圖14)。從pDM154上分離3.2kb的KpnI Lipolase表達盒(SP387啟動子/Lipolase/SP387終止子)，并將其克隆到pToC90的KpnI位點上，制成質(zhì)粒pDM155(見圖7)。表達構(gòu)建體pDM155帶有Lipolase表達盒和amdS選擇標(biāo)記。已將攜帶pDM151的大腸桿菌菌株保藏在NRRL。
8.禾本科鐮孢的轉(zhuǎn)化在25℃下，將禾本科鐮孢菌株ATCC20334培養(yǎng)物在加有1.5％葡萄糖和1.5％瓊脂的Vogels培養(yǎng)基(Vogel，1964，Am.Nature98435-446)的培養(yǎng)皿(100×15mm)上生長3周。用移菌環(huán)把分生孢子(每皿約108個)移至10ml無菌水中，并通過4層干酪包布、最后通過一層米拉布(miracloth)過濾而進行純化。離心濃縮分生孢子。用108個分生孢子接種50mlYPG(1％酵母提取物(Difco)、2％細胞培養(yǎng)用胨(Difco)、2％葡萄糖)，并在20℃和150rpm的條件下培養(yǎng)14小時。把所得菌絲截留在無菌的0.4m濾膜上，并用消毒蒸餾水和1.0M MgSO4連續(xù)洗滌。將上述菌絲重新懸浮在10ml Novozym234(Novo Nordisk)溶液(2-10mg/ml，溶于1.0MMgSO4中)里，并在34℃下以80rpm速度振蕩的條件下消化15-30分鐘。通過用4層干酪包布和米拉布進行連續(xù)過濾，將未消化的菌絲材料從所得原生質(zhì)體中除去。讓20ml1M山梨醇通過上述干酪包布和米拉布，并與原生質(zhì)體溶液合并。混合以后，通過離心使原生質(zhì)體(約5×108個)沉淀，并通過在20ml 1M山梨醇中和在20ml STC(0.8m山梨醇，50mM Tris-HClpH-8.0，50mM CaCl2)中進行再懸浮和離心連續(xù)洗滌原生質(zhì)體。將洗滌過的原生質(zhì)體再懸浮于4份STC和1份SPTC(0.8M山梨醇，4％聚乙二醇4000(BDH)，50mM Tris-HCl pH＝8.0，50mMCaCl2)中，濃度為1-2×108/ml。將100μl原生質(zhì)體懸浮液加進盛于聚丙烯試管(17×100mm)中的5μg pJRoy6和5μl肝素(以5mg/ml的濃度溶于STC中)里，并在冰上培養(yǎng)30分鐘。將1ml SPTC輕輕混入上述原生質(zhì)體懸浮液中，并在室溫下繼續(xù)培養(yǎng)20分鐘。將原生質(zhì)體鋪在一種選擇培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基由加有10mM乙酰胺的Cove鹽(Cove，D.J.1966，Biochem.Biophys.Acta11351-56)、15mMCsCl2/2.5％惰性瓊脂(Difco)和1.0M蔗糖組成，并在該培養(yǎng)基上疊放一層含有0.6M蔗糖和1.0％低熔點瓊脂糖(Sigma)的相同培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿在25℃溫度下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化子在第6-21天出現(xiàn)。
9.類胰蛋白酶蛋白酶在禾本科鐮孢中的表達將轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移到COVE2培養(yǎng)基(與上述COVE培養(yǎng)基相同，但沒有氯化銫，并把1.0M的蔗糖的濃度改為30g/l)，并在25℃下生長3天或3天以上。用由COVE2平皿培養(yǎng)物切成的約為1cm的瓊脂塊接種盛在150ml燒瓶里的25ml FP1培養(yǎng)基(5％大豆粉、5％葡萄糖、2％ K2HPO4、0.2％ CaCl2、0.2％MgSO4·7H2O和0.1％Pluronic acid(BASF))等分試樣，并在30℃、振蕩(150rpm)下培養(yǎng)6天。離心后回收上清液樣品，并進行以下SDS-PAGE分析。將每種上清液20μl與10μlSDS-PAGE樣品緩沖液(1ml 0.5M Tris pH＝6.8、0.8ml甘油、1.6ml 10％ SDS、0.4ml 0.8M二硫蘇糖醇、0.2ml 1％溴酚藍)、2μl溶于異丙醇中的2％PMSF(Sigma)和2μl甘油混合。上述樣品在沸水浴中放4分鐘，并取每種樣品40μl在10-27％聚丙烯酰胺凝膠(Novex)上電泳。按照標(biāo)準(zhǔn)方法，用考馬斯染料對上述凝膠進行染色和脫色.經(jīng)測定，類胰蛋白酶蛋白酶的表達水平≥0.5g/l。
10.酶分析10.1 Carezyme緩沖劑磷酸鈉(50mM，pH7.0)底物AZCL-HE纖維素(Megazyme)，2mg/ml緩沖液。
酶標(biāo)準(zhǔn)將100mg Carezyme標(biāo)準(zhǔn)(10,070 ECu/g)溶于1ml緩沖液中，并在-20℃下保存。在用于酶分析之前，用緩沖液稀釋上述儲液(1∶100)。試驗的范圍為0.5-5.0ECU/ml。采用650，000ECU/g Carezyme轉(zhuǎn)換因子。
將底物溶液(990μl)加至24孔微量滴定板的樣品孔中。將10μl Carezyme樣品(在緩沖液中稀釋，以產(chǎn)生0.5-10E CU/ml的活性)加進上述底物中。在45℃下培養(yǎng)30分鐘以進行反應(yīng)，把上清液轉(zhuǎn)移到96孔微量滴定板上，并測量在650nm處的光吸收。
10.2 Lipolase分析緩沖液0.1M MOPS，pH7.5，含有4mM CaCl2。
底物將10ml丁酸對硝基苯酯(pNB)溶于1ml DMSO中；將4ml緩沖液加進溶解在DMSO中的底物里*儲液濃度＝11.5mM，溶于20％DMSO中酶標(biāo)準(zhǔn)以1000LU/ml的濃度把Lipolase(23,100LU/g)溶于50％甘油中，并在-20℃下保存。在試驗之前以1∶100的比例將該儲液稀釋于緩沖液中。試驗范圍為0.125-3.0LU/ml。
將100μl pNB儲液加進100μl經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶樣品中。在25℃下用5分鐘時間測405nm處的活性(mOD/分鐘)。
10.3 SP387分析在使用之前，通過把溶于二甲亞砜中的0.2M L-BAPNA(Sigma B3133)儲液(冰凍保存)在緩沖液(0.01M谷氨酸二甲酯(Sigma)、0.2M硼酸和0.002M CaCl2，用NaOH把pH調(diào)至6.5)稀釋為0.004M而制備L-BAPNA底物。對1μl培養(yǎng)物進行離心(14500×g，10分鐘)。將100μl稀釋過的培養(yǎng)物上清液等分試樣加至96孔微量滴定板中的100μl底物中。采用一臺ELISA計數(shù)器，在25℃溫度下用5分鐘時間以30秒的間隔測定405nm處的光吸收變化。結(jié)果是參比純化的SP387標(biāo)準(zhǔn)計算出來的。
11. Carezyme的表達純化23個pDM151轉(zhuǎn)化體，在搖瓶里的大豆/葡萄糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并于9天之后檢驗Carezyme活性(見下面的表1)。4個轉(zhuǎn)化體以大約50-100mg/L的水平表達Carezyme。將轉(zhuǎn)化體pDM151-4在小型發(fā)酵罐中培養(yǎng)，采用生產(chǎn)SP387時所使用的條件(見9)。7天后，出現(xiàn)大約6.0g/L的Carezyme。以7天計，Carezyme中含有高于90％的分泌性蛋白(圖8A)。根據(jù)SDS凝膠電泳測得Carezyme含有高于90％的分泌性蛋白(圖8B)。
表I
12. Lipolase的表達純化15個pDM155轉(zhuǎn)化體，在盛于搖瓶里的大豆/葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并于9天之后檢驗Lipolase活性(表2)。
表II
4個轉(zhuǎn)化體以大約100-200mg/l的水平(基于pNB分析)表達Lipolase。在小型發(fā)酵罐中培養(yǎng)pDM155-10，采用生產(chǎn)SP387時所使用的條件(見9)。7天后，出現(xiàn)大約2.0g/l的Lipolase(圖8A)。根據(jù)SDS凝膠電泳測得Lipolase含有90％以上的分泌性蛋白(圖8B)。
7.微生物的保藏已將下列生物材料保存在NRRL(Agricultural ResearchService Patent Culture Collection)，Northern Regional ResearchCenter，1815，University Street，Peoria，Illinois，61604，USA.
上述菌株在這樣的條件下保藏確保在該專利申請期間，由專利商標(biāo)局長指定的人可以獲得其培養(yǎng)物，是按照37C.R.R§1.14和35U.S.C.§122和布達佩斯條約的條件確定的。該保藏物代表每種保藏菌株的生物學(xué)純培養(yǎng)物。可按照向其提交了該申請的副本或后續(xù)申請的外國國家的專利法要求，向其提供保藏物。不過，應(yīng)當(dāng)明白，可以得到保藏物并不意味著可以實施本發(fā)明而使由政府授予的專利權(quán)喪失效力。
在這里所披露和要求保護的本發(fā)明，并不局限于具體實施方案所限定的范圍，因為這些實施方案只是用于說明本發(fā)明的幾個方面的。任何類似實施方案都包括在本發(fā)明范圍之內(nèi).實際上，通過以上說明，除本文所披露的內(nèi)容外，對本發(fā)明所做的各種改進對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。這樣的改進同樣落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
這里所引用的各對比文件所披露的內(nèi)容的整體，被作為本申請的參考。
序列表(1)一般資料(I)申請人(A)名稱Novo Nordisk Biotech，Inc.
(B)街道1445 Drew Avenue，Ste.105(C)城市Davis(D)州California(E)國家US(F)郵政編碼95616-4880(G)電話(916)757-8100(H)傳真(916)758-0317(ii)發(fā)明名稱非毒性、非產(chǎn)毒性、非致病性鐮孢屬表達系統(tǒng)及所用啟動子和終止子(iii)序列數(shù)16(iv)有關(guān)地址(A)地址Novo Nordisk of North America，Inc.
(B)銜道405 Lexington Avenue，64th Floor(C)城市New York(D)州New York(E)國家USA(F)郵編10174-6401(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent IN Release#1.0，Version#1.30(vi)本申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)柎?B)申請日1995年6月15日(C)分類號(vii)優(yōu)先權(quán)申請資料(A)申請?zhí)朥S08/269,449(B)申請日1994年6月30日(vii)優(yōu)先權(quán)申請資料(A)申請?zhí)朥S 08/404,678(B)申請日1995年3月15日(viii)律師/代理人信息(A)姓名Agris Dr.，Cheryl H.(B)登記號34,086(C)參考/案卷號4216.204-WO(ix)通訊信息(A)電話212-867-0123(B)傳真212-878-9655(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度30bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線性(xi)序列表述SEQ ID NO1TGCGGATCCA TGGTCAAGTT CGCTTCCGTC 30(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度30bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線性(xi)序列表述SEQ ID NO2GACCTCGAGT TAAGCATAGG TGTCAATGAA 30(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度998bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線性(xi)序列表述SEQ ID NO3ATCATCAACC ACTCTTCACT CTTCAACTCT CCTCTCTTGG ATATCTATCT CTTCACCATG 60GTCAAGTTCG CTTCCGTCGT TGCACTTGTT GCTCCCCTGG CTGCTGCCGC TCCTCAGGAG120ATCCCCAACA TTGTTGGTGG CACTTCTGCC AGCGCTGGCG ACTTTCCCTT CATCGTGAGC180ATTAGCCGCA ACGGTGGCCC CTGGTGTGGA GGTTCTCTCC TCAACGCCAA CACCGTCTTG240ACTGCTGCCC ACTGCGTTTC CGGATACGCT CAGAGCGGTT TCCAGATTCG TGCTGGCAGT300CTGTCTCGCA CTTCTGGTGG TATTACCTCC TCGCTTTCCT CCGTCAGAGT TCACCCTAGC360TACAGCGGAA ACAACAACGA TCTTGCTATT CTGAAGCTCT CTACTTCCAT CCCCTCCGGC420GGAAACATCG GCTATGCTCG CCTGGCTGCT TCCGGCTCTG ACCCTGTCGC TGGATCTTCT480GCCACTGTTG CTGGCTGGGG CGCTACCTCT GAGGGCGGCA GCTCTACTCC CGTCAACCTT540CTGAAGGTTA CTGTCCCTAT CGTCTCTCGT GCTACCTGCC GAGCTCAGTA CGGCACCTCC600GCCATCACCA ACCAGATGTT CTGTGCTGGT GTTTCTTCCG GTGGCAAGGA CTCTTGCCAG660GGTGACAGCG GCGGCCCCAT CGTCGACAGC TCCAACACTC TTATCGGTGC TGTCTCTTGG720GGTAACGGAT GTGCCCGACC CAACTACTCT GGTGTCTATG CCAGCGTTGG TGCTCTCCGC780TCTTTCATTG ACACCTATGC TTAAATACCT TGTTGGAAGC GTCGAGATGT TCCTTGAATA840TTCTCTAGCT TGAGTCTTGG ATACGAAACC TGTTTGAGAA ATAGGTTTCA ACGAGTTAAG900AAGATATGAG TTGATTTCAG TTGGATCTTA GTCCTGGTTG CTCGTAATAG AGCAATCTAG960ATAGCCCAAA TPGAATATGA AATTTGATGA AAATATTC998(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度248個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線性(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..224(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置-24..0(D)其它資料/product＝ “OTHER”/note＝“Label＝pre-propeptide”(xi)序列表述SEQ ID NO4Met Val Lys Phe Ala Ser Val Val Ala Leu Val Ala Pro Leu Ala Ala-20 -15 -10Ala Ala Pro Gln Glu Ile Pro Asn Ile Val Gly Gly Thr Ser Ala Ser-5 15Ala Gly Asp Phe Pro Phe Ile Val Ser Ile Ser Arg Asn Gly Gly Pro10 15 20Trp Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn Ala Asn Thr Val Leu Thr Ala Ala25 30 35 40His Cys Val Ser Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Phe Gln Ile Arg Ala Gly45 50 55Ser Leu Ser Arg Thr Ser Gly Gly Ile Thr Ser Ser Leu Ser Ser Val60 65 70Arg Val His Pro Ser Tyr Ser Gly Asn Asn Asn Asp Leu Ala Ile Leu75 80 85Lys Leu Ser Thr Ser Ile Pro Ser Gly Gly Asn Ile Gly Tyr Ala Arg90 95 100Leu Ala Ala Ser Gly Ser Asp Pro Val Ala Gly Ser Ser Ala Thr Val105 110 115 120Ala Gly Trp Gly Ala Thr Ser Glu Gly Gly Ser Ser Thr Pro Val Asn125 130 135Leu Leu Lys Val Thr Val Pro Ile Val Ser Arg Ala Thr Cys Arg Ala140 145 150Gln Tyr Gly Thr Ser Ala Ile Thr Asn Gln Met Phe Cys Ala Gly Val155 160 165Ser Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Ile170 175 180Val Asp Ser Ser Asn Thr Leu Ile Gly Ala Val Ser Trp Gly Asn Gly185 190 195 200Cys Ala Arg Pro Asn Tyr Ser Gly Val Tyr Ala Ser Val Gly Ala Leu205 210 215Arg Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ala220(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度1206bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線性(xi)序列表述SEQ ID NO5GAATTCTTAC AAACCTTCAA CAGTGGAGAC TTCCGACACG ACATATCGAT CCTTTGAAGA60TACGGTGAGC GTCAGATCAT GAATTTCATA CATCCTCACG TCCTTCCTCT TTCAAACTAT 120GCAAAGTCCT TCTAGTACCT CCCAAAACTT GATTTACGCG CTCTCCAATC AAAAGTACCT 180TCCAAAAGTG ATCTACCTCA GCTCTAGATC AGGGCACCTA TTCGCAAAGA TCTACAAGCT 240GAACTAGTAA GCATAGCGGG AGAATATCCC ACATCATTCG AGAAGGCCTT CGTATTAGAC 300CTAGTGGGAT CGACAGAAAA GATAAGACGG AGATAGATGC TATGTTTGGA AGGTAGGGGA 360TGGAATAGGA TGCAACAGGT ATTGGCATAA GCGATGCAAT AGGTGCATCT AGAAACTAGG 420TGACAGACTG GCCACAGAGG TGTATCCTAT GCAGGTCGAT GCGTGCGTTA TCGCAGGGCT 480GCTATTGCGT GGTGGTGGCT ACAAAAGTTC TATGTGGTTT CCAGTTTCAG AATATTGGGC 540CATTGTGATT GATGGCGCAT GACCGAATTA TAGCAGTGAA CCCCGCCCAG AGTAGTAGTG 600CAGATGCGCT TTGATGCTTG GCGATTCCTC GGGCTAAATA ACTCCGGTTG GTCTGTAGAA 660TGCTGACGCG ATGATCCTTC GGCATTAATC GTAGATCTTG GGGGGGGATA AGCCGATCAA 720AGACACACTG TAGATCAGCT CTTCGATGAC TCTTACCAGC TTTATAATAA CATTCATCTT 780GAACGTCTTT TTCGTCCAGT GTTTACCTTT CGTCCTATTT ATCCGTCATA TCCACAGTGT 840TATTGGCGAT AGAGTTATCG ACTTTCCTCA TCGGGATACT GGCCCCTGCT GCCAAGGGCC 900TTATATGCCG ATCACTTTCA CGGGAGCATG ATAAGGTTAA TGCTTCTTCT GAATGCCGAA 960CTAGACTACG GAACAACGGA GCTTAGTACC AGAAAGGCAG GTACGCCTAT TCGCAAACTC 1020CGAAGATACA ACCAAGCAAG CTTATCGCGG GATAGTAACC AGAGAGGCAG GTAAGAAGAC 1080ACAACAACAT CCATAGCTAT GTAGATTCTC GAATATAAAA GGACCAAGAT GGACTATTCG 1140AAGTAGTCTA TCATCAACCA CTCTTCACTC TTCAACTCTC CTCTCTTGGA TATCTATCTC 1200TTCACC 1206(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度1188bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線性(xi)序列表述SEQ ID NO6TAAATACCTT GTTGGAAGCG TCGAGATGTT CCTTGAATAT TCTCTAGCTT GAGTCTTGGA60TACGAAACCT GTTTGAGAAA TAGGTTTCAA CGAGTTAAGA AGATATGAGT TGATTTCAGT 120TGGATCTTAG TCCTGGTTGC TCGTAATAGA GCAATCTAGA TAGCCCAAAT TGAATATGAA 180ATTTGATGGA AATATTCATT TCGATAGAAG CAACGTGAAA TGTCTAGCAG GACGAAAAGT 240AGATCAAGGC TGTTATGTTC CCCGACCAAC CTACCTTGAT GTCAGTCTGC GAGTCGTGTG 300CAGTGACCCA GAATGATGGA TTGACTTGGA CATTTTCTGT CTATGAAGTA TTATGAACAT 360GAATATCGTT TCCTCATTAT CTATGTTGGC AGCCTAAAGT TTTACCATAT AGCTAGCAAT 420CAGTCAAGTA TCTGCGTATG AAGGGTTGTT AAGCCAGGAC GGTATCAGCG TTGAATATTT 480AAAGAATGAT ATGAGATAAT CAACATTGAC ATGATAAAAG AAAAGGGGAA ACAAATTGTG 540CATATAGTAA AGACTTCAGG TCGACCCCTC AATAGACATA TGCGAACCGA AAACCAACAG 600GATACAATTT ATAGATAAGT ATAACTACAG TTATCTGTCT GCCGAACAAA TACTCTTTTG 660TGAAACAAAT GAAGAGTACA TAAGCTACAG TTCCTCAGTA GGAACATCCT TTACAATAAC 720TCCCTTGACT TCCTTCAGCT TCTCAATAGC CTCCAAAGTC ATCGGTCTGC CATCAAGGCA 780CGTCAGCTCT GGTGTAGCAT ACAGCAGTGC CATACTTACG GAGGATAGGA AGTGGGAGGA 840ATCGTTCGTG TCTGCCTCCA AAAATCGACA CCAGTGTCCT TTTTGACGAT ACTGATATGG 900TGGTAAGCTT GGGAGTCTAT TGTTGACGTT GCATCACTTA CTTAAGCACG GTTTCATTCC 960TCTGCTGATA GTCCTCCAAC TTCTCGAAGT CGTAAACGAT GGCCTATAGT ATCTTATTGA 1020GAAATATGTC TTCTCAGAAA ATTATATCTT GTTTACCTTT CGGTCCGCCA TGGGTGCTAA 1080AACTGCTGGG AAATTCAAAA GCGCAGCACA AGCAGCAAGA GTGATGGGCA CAACGTGATA 1140TGTTGATAAA AGCATCAGTA TCGATAAGTT CCACTCAGAA ACCTGCAG 1188(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度1060bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線性(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置10..924(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞mat-peptide(B)位置73..924(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞sig-peptide(B)位置10..72(xi)序列表述SEQ ID NO7GGATCCAAG ATG CGT TCC TCC CCC CTC CTC CCG TCC GCC GTT GTG GCC 48Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Pro Ser Ala Val Val Ala-21 -20 -15-10GCC CTG CCG GTG TTG GCC CTT GCC GCT GAT GGC AGG TCC ACC CGC TAC96Ala Leu Pro Val Leu Ala Leu Ala Ala Asp Gly Arg Ser Thr Arg Tyr-51 5TGG GAC TGC TGC AAG CCT TCG TGC GGC TGG GCC AAG AAG GCT CCC GTG 144Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Val10 15 20AAC CAG CCT GTC TTT TCC TGC AAC GCC AAC TTC CAG CGT ATC ACG GAC 192Asn Gln Pro Val Phe Ser Cys Asn Ala Asn Phe Gln Arg Ile Thr Asp25 30 35 40TTC GAC GCC AAG TCC GGC TGC GAG CCG GGC GGT GTC GCC TAC TCG TGC 240Phe Asp Ala Lys Ser Gly Cys Glu Pro Gly Gly Val Ala Tyr Ser Cys45 50 55GCC GAC CAG ACC CCA TGG GCT GTG AAC GAC GAC TTC GCG CTC GGT TTT 288Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val Asn Asp Asp Phe Ala Leu Gly Phe60 65 70GCT GCC ACC TCT ATT GCC GGC AGC AAT GAG GCG GGC TGG TGC TGC GCC 336Ala Ala Thr Ser Ile Ala Gly Ser Asn Glu Ala Gly Trp Cys Cys Ala75 80 85TGC TAC GAG CTC ACC TTC ACA TCC GGT CCT GTT GCT GGC AAG AAG ATG 384Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met90 95 100GTC GTC CAG TCC ACC AGC ACT GGC GGT GAT CTT GGC AGC AAC CAC TTC 432Va1 Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe105 110 115 120GAT CTC AAC ATC CCC GGC GGC GGC GTC GGC ATC TTC GAC GGA TGC ACT 480Asp Leu Asn Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr125 130 135CCC CAG TTC GGC GGT CTG CCC GGC CAG CGC TAC GGC GGC ATC TCG TCC 528Pro Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser140 145 150CGC AAC GAG TGC GAT CGG TTC CCC GAC GCC CTC AAG CCC GGC TGC TAC 576Arg Asn Glu Cys Asp Arg Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr155 160 165TGG CGC TTC GAC TGG TTC AAG AAC GCC GAC AAT CCG AGC TTC AGC TTC 624Trp Arg Phe Asp Trp Phe Lys Asn Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe170 175 180CGT CAG GTC CAG TGC CCA GCC GAG CTC GTC GCT CGC ACC GGA TGC CGC 672Arg Gln Val Gln Cys Pro Ala Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg185 190 195 200CGC AAC GAC GAC GGC AAC TTC CCT GCC GTC CAG ATC CCC TCC AGC AGC 720Arg Asn Asp Asp Gly Asn Phe Pro Ala Val Gln Ile Pro Ser Ser Ser205 210 215ACC AGC TCT CCG GTC AAC CAG CCT ACC AGC ACC AGC ACC ACG TCC ACC 768Thr Ser Ser Pro Val Asn Gln Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr220 225 230TCC ACC ACC TCG AGC CCG CCA GTC CAG CCT ACG ACT CCC AGC GGC TGC 816Ser Thr Thr Ser Ser Pro Pro Val Gln Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys235 240 245ACT GCT GAG AGG TGG GCT CAG TGC GGC GGC AAT GGC TGG AGC GGC TGC 864Thr Ala Glu Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly Asn Gly Trp Ser Gly Cys250 255 260ACC ACC TGC GTC GCT GGC AGC ACT TGC ACG AAG ATT AAT GAC TGG TAC 912Thr Thr Cys Val Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr265 270 275 280CAT CAG TGC CTG TAGACGCAGG GCAGCTTGAG GGCCTTACTG GTGGCCGCAA 964His Gln Cys LeuCGAAATGACA CTCCCAATCA CTGTATTAGT TCTTGTACAT AATTTCGTCA TCCCTCCAGG 1024GATTGTCACA TAAATGCAAT GAGGAACAAT GAGTAC 1060(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長度305個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列表述SEQ ID NO8Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Pro Ser Ala Val Val Ala Ala Leu Pro-21 -20 -15 -10Val Leu Ala Leu Ala Ala Asp Gly Arg Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys-51 5 10Cys Lys Pro Ser Cyg Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Val Asn Gln Pro15 20 25Val Phe Ser Cys Asn Ala Asn Phe Gln Arg Ile Thr Asp Phe Asp Ala30 35 40Lys Ser Gly Cys Glu Pro Gly Gly Val Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln45 50 55Thr Pro Trp Ala Val Asn Asp Asp Phe Ala Leu Gly Phe Ala Ala Thr60 65 70 75Ser Ile Ala Gly Ser Asn Glu Ala Gly Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu80 85 90Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met Val Val Gln95 100 105Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn110 115 120Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp G1y Cys Thr Pro Gln Phe125 130 135Gly Gly Leu Pro Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asn Glu140 145 150 155Cys Asp Arg Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe160 165 170Asp Trp Phe Lys Asn Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe Arg Gln Val175 180 185Gln Cys Pro Ala Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp190 195 200Asp Gly Asn Phe Pro Ala Val Gln Ile Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser205 210 215Pro Val Asn Gln Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr220 225 230 235Ser Ser Pro Pro Val Gln Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu240 245 250Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly Asn Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys255 260 265Val Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr His Gln Cys270 275 280Leu(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度876bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線性(xi)序列表述SEQ ID NO9ATGAGGAGCT CCCTTGTGCT GTTCTTTGTC TCTGCGTGGA CGGCCTTGGC CAGTCCTATT60CGTCGAGAGG TCTCGCAGGA TCTGTTTAAC CAGTTCAATC TCTTTGCACA GTATTCTGCA 120GCCGCATACT GCGGAAAAAA CAATGATGCC CCAGCTGGTA CAAACATTAC GTGCACGGGA 180AATGCCTGCC CCGAGGTAGA GAAGGCGGAT GCAACGTTTC TCTACTCGTT TGAAGACTCT 240GGAGTGGGCG ATGTCACCGG CTTCCTTGCT CTCGACAACA CGAACAAATT GATCGTCCTC 300TCTTTCCGTG GCTCTCGTTC CATAGAGAAC TGGATCGGGA ATCTTAACTT CGACTTGAAA 360GAAATAAATG ACATTTGCTC CGGCTGCAGG GGACATGACG GCTTCACTTC GTCCTGGAGG 420TCTGTAGCCG ATACGTTAAG GCAGAAGGTG GAGGATGCTG TGAGGGAGCA TCCCGACTAT 480CGCGTGGTGT TTACCGGACA TAGCTTGGGT GGTGCATTGG CAACTGTTGC CGGAGCAGAC 540CTGCGTGGAA ATGGGTATGA TATCGACGTG TTTTCATATG GCGCCCCCCG AGTCGGAAAC 600AGGGCTTTTG CAGAATTCCT GACCGTACAG ACCGGCGGAA CACTCTACCG CATTACCCAC 660ACCAATGATA TTGTCCCTAG ACTCCCGCCG CGCGAATTCG GTTACAGCCA TTCTAGCCCA 720GAGTACTGGA TCAAATCTGG AACCCTTGTC CCCGTCACCC GAAACGATAT CGTGAAGATA 780GAAGGCATCG ATGCCACCGG CGGCAATAAC CAGCCTAACA TTCCGGATAT CCCTGCGCAC 840CTATGGTACT TCGGGTTAAT TGGGACATGT CTTTAG 876(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長度291個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線性(xi)序列表述SEQ ID NO10Met Arg 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Asp Ile210 215 220Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro225 230 235 240Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp245 250 255Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro260 265 270Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly275 280 285Thr Cys Leu290(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長度42bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線性(xi)序列表述SEQ ID NO11GCACACCATG GTCGCTGGAT CCATACCTTG TTGGAAGCGT CG 42(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長度56bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線性(xi)序列表述SEQ ID NO12ATCGGAGCAT GCGGTACCGT TTAAACGAAT TCAGGTAAAC AAGATATAAT TTTCTG 56(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長度44bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線性(xi)序列表述SEQ ID NO13CTCTTGGATA TCTATCTCTT CACCATGCGT TCCTCCCCCC TCCT44(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線性(xi)序列表述SEQ ID NO14CAATAGAGGT GGCAGCAAAA 20(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長度25bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線性(xi)序列表述SEQ ID NO15ATCTATCTCT TCACCATGAG GAGCT 25(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長度21bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線性(xi)序列表述SEQ ID NO16TAGATAGAGA AGTGGTACTC C 2權(quán)利要求
1.一種非毒性、非產(chǎn)毒性、非致病性重組鐮孢屬(Fusarium)宿主細胞，它包括一個與一個啟動子可操縱連接的編碼一種異源蛋白的核酸序列。
2.如權(quán)利要求1的宿主細胞，其中，所述鐮孢菌是禾本科鐮孢(Fusarium graminearum)。
3.如權(quán)利要求1的宿主細胞，其中，所述禾本科鐮孢具有ATCC20334的鑒定特征。
4.如權(quán)利要求1的宿主細胞，其中，所述異源蛋白是一種真菌蛋白。
5.如權(quán)利要求1的宿主細胞，其中，所述異源蛋白是一種分泌性蛋白。
6.如權(quán)利要求1的宿主細胞，其中，所述異源蛋白是一種真菌酶。
7.如權(quán)利要求6的宿主細胞，其中，所述真菌酶選自過氧化氫酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、氧化還原酶、纖維素酶、木聚糖酶、過氧化物酶、脂肪酶、水解酶、酯酶、角質(zhì)酶、一種蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶、肌醇六磷酸酶、裂合酶、溶果膠酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、甘露糖苷酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)化酶、轉(zhuǎn)移酶、核糖核酸酶、殼多糖酶和脫氧核糖核酸酶。
8.如權(quán)利要求6的宿主細胞，其中，所述真菌酶是一種蛋白酶。
9.如權(quán)利要求6的宿主細胞，其中，所述真菌酶是一種堿性蛋白酶。
10.如權(quán)利要求9的宿主細胞，其中，所述堿性蛋白酶是尖鐮孢(Fusarium oxysporum)類胰蛋白酶蛋白酶。
11.如權(quán)利要求10的宿主細胞，其中，所述尖鐮孢類胰蛋白酶蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。
12.如權(quán)利要求6的宿主細胞，其中，所述真菌酶是一種內(nèi)切葡聚糖酶或其變體。
13.如權(quán)利要求14的宿主細胞，其中，所述內(nèi)切葡聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO8所示。
14.如權(quán)利要求6的宿主細胞，其中，所述真菌酶是1，3脂肪酶或其變體。
15.如權(quán)利要求12的宿主細胞，其中，所述1，3脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO10所示。
16.如權(quán)利要求1的宿主細胞，其中，所述異源蛋白選自激素，生長因子和受體。
17.如權(quán)利要求1的宿主細胞，其中，所述啟動子是一種真菌啟動子。
18.如權(quán)利要求17的宿主細胞，其中，所述啟動子選自來自構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)amdS的啟動子。
19.如權(quán)利要求17的宿主細胞，其中，所述真菌啟動子來自一個編碼尖鐮孢類胰蛋白酶蛋白酶的基因或其片段，該片段具有基本上與所述序列相同的啟動子活性。
20.如權(quán)利要求19的宿主細胞，其中，所述啟動子序列如SEQ IDNO5所示。
21.如權(quán)利要求1的宿主細胞，它還包括一個選擇標(biāo)記。
22.如權(quán)利要求13的宿主細胞，其中，所述標(biāo)記選自arg B、trpC、pyrG、amdS、niaD和hygB。
23.如權(quán)利要求1的宿主細胞，它還包括一個終止子。
24.如權(quán)利要求23的宿主細胞，其中，所述終止子來自一個編碼尖鐮孢類胰蛋白酶蛋白酶的基因或其片段，該片段具有基本上與所述序列相同的終止子活性。
25.如權(quán)利要求24的宿主細胞，其中，所述終止子序列如SEQ IDNO6所示。
26.一種生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)的方法，它包括培養(yǎng)一種非毒性、非產(chǎn)毒性、非致病性重組鐮孢屬宿主細胞，該宿主細胞包括一個與一個啟動子可操縱連接的編碼所述蛋白質(zhì)的核酸序列，以及分離所述蛋白質(zhì)。
27.一種來自一個編碼尖鐮孢類胰蛋白酶蛋白酶的基因或其片段的啟動子序列，所述片段具有基本上與所述序列相同的啟動子活性，其中，該啟動子的序列如SEQ ID NO5所示。
28.一種來自一個編碼尖鐮孢類胰蛋白酶蛋白酶的基因或其片段的終止子序列，所述片段具有基本上與所述序列相同的終止子活性，其中，該終止子的序列如SEQ ID NO6所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種非毒性、非產(chǎn)毒性、非致病性重組鐮孢(Fusarium)，如禾本科鐮孢(Fusarium)如禾本科鐮孢(Fusarium graminearum)宿主細胞，它包括一個與一個啟動子可操縱連接的編碼一種異源蛋白質(zhì)的核酸序列。本發(fā)明還涉及一種利用這種鐮孢宿主細胞生產(chǎn)重組蛋白的方法，本發(fā)明還涉及可用于這種細胞的一個啟動子和終止子序列。
文檔編號C12N9/24GK1151762SQ95193875
公開日1997年6月11日 申請日期1995年6月15日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月30日
發(fā)明者J·C·洛耶, D·L·墨耶, W·約德, J·R·舒斯特 申請人:諾沃諾爾迪斯克生物技術(shù)有限公司