專利名稱：檢測(cè)人細(xì)胞色素p4502d6基因多態(tài)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種診斷與藥物代謝有關(guān)酶的基因的方法，更具體而言，是檢測(cè)細(xì)胞色素P450 2D6(下文中縮寫為CYP2D6)基因多態(tài)的一種新方法。
背景技術(shù)：
人細(xì)胞色素P450(P450)是一種酶，在解毒，藥物或外源物質(zhì)的代謝活化，以及類固醇激素和膽酸的生物合成中起重要作用。CYP2D6屬于所述的P450分子之一，特別與許多重要的臨床治療藥物的代謝有關(guān)。迄今為止，已報(bào)道多達(dá)26種藥物如抗高血壓藥異喹胍和普羅帕酮，β阻斷劑普萘洛爾，三環(huán)抗抑郁藥丙咪嗪等為所述的CYP2D6的特異底物[艾切爾鮑姆M，格羅斯As Clin.Pharmac.Ther.，46，337-394(1990)]。另外，已顯示CYP2D6存在多態(tài)性。據(jù)報(bào)道，弱(poor)代謝者(下文中縮寫為PMs)按通常劑量服用一種藥物，由于藥物被保持高血液濃度，可能會(huì)產(chǎn)生過(guò)度的效應(yīng)(有害的效應(yīng))。CYP2D6多態(tài)性有種族差異，在歐洲人和美國(guó)人中，PMs的百分率為5～10％[Kimura，S.，Umeno，M.，Skoda，RC Meyer U.A.和Gonzalez，F(xiàn).J.，美國(guó)人類遺傳學(xué)雜志45，889-904(1989)]。而在日本人中，其百分率低于0～2％[Yokota，T.，Tamura，S.，F(xiàn)uruya，H.，Kimura，S.，Watanabe，M.，Kanazawa，I.，Kondo，I.和Gonzalez，F(xiàn).J.，藥理遺傳學(xué)，3，256-263(1993)]。因此，如果一種新藥在批準(zhǔn)之前是CYP2D6的特異底物，很有可能在臨床研究階段，因PMs的低發(fā)生率，某些嚴(yán)重的副作用被忽略，可是藥品上市后，顯露出來(lái)。就日本人而言，應(yīng)對(duì)這方面引起特別的注意[Kamataki，Tetsuya，TDM Kenkyu，10，2-7(1993)]。
近年來(lái)，對(duì)歐洲人和美國(guó)人的CYP2D6所作的基因分析表明，CYP2D6基因突變是上述CYP2D6多態(tài)性的原因[Gonzalez，F(xiàn).J.和Meyer，U.A.，Clin.Pharmac.Ther.，50，233-238(1991)；海姆M.和邁耶UA，柳葉刀，336，529-532(1990)；Smith.，C.A.D.，Gough，A.C.，Leigh，P.N.，Summers，B.A.，Harding，A.E.Maranganore，D.M.，Sturman，S.G.，Schapira，A.H.V.，Williams，A.C.，Spurr，N.K.和Wolf，C.R.，柳葉刀，339，1373-1377(1992)]。盡管CYP2D6基因由9個(gè)外顯子所組成，據(jù)報(bào)道僅有三類突變，即A型突變由基因組DNA第2637位，屬外顯子5區(qū)的一個(gè)堿基置換所組成；B型突變由第1934位的外顯子-內(nèi)含子交接處，屬外顯子4區(qū)的一個(gè)堿基置換所組成；D型突變由完全缺失所組成。已經(jīng)表明這些突變和缺失導(dǎo)致代謝能力的明顯損害。
上述的CYP2D6突變中，估計(jì)A型和B型突變占很高的百分率。據(jù)一項(xiàng)報(bào)告，在歐洲人和美國(guó)人中，95％的PMs是上述的二類突變所引起的。[達(dá)利，AK，阿姆斯特朗M，門克曼SC，艾達(dá)爾ME和艾達(dá)爾JK，藥理遺傳學(xué)，1，33-41(1991)]。另一項(xiàng)報(bào)告稱，歐洲人和美國(guó)人中，75％的PMs為B型突變，5～11％為A型突變[Gonzalez，F(xiàn).J.，et a1.，op cit.]。
不過(guò)，至于日本人，這些突變發(fā)生的頻率很低，以致相關(guān)的研究鮮有進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明顯示CYP2D6基因的一種新突變，其目的是提供檢測(cè)CYP2D6基因多態(tài)的新方法。尤其是，本發(fā)明的目的是開發(fā)一種簡(jiǎn)單、方便的檢測(cè)方法，用少量DNA樣品，能高度敏感準(zhǔn)確地，檢測(cè)出涉及CYP2D6基因多態(tài)性的新類型。
為達(dá)到以上目的，本發(fā)明者對(duì)日本人的PMs做了CYP2D6基因分析和家系分析。結(jié)果他們發(fā)現(xiàn)了可用于上述目的的一種新基因多態(tài)，因而成功地發(fā)展了一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)，完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明是關(guān)于檢測(cè)CYP2D6基因多態(tài)之一的方法，它包括檢測(cè)CYP2D6基因外顯子9中，由9個(gè)堿基亞序列TCACCCGTG重復(fù)所組成的插入序列的發(fā)生率。
本發(fā)明特別地把氨基酸和堿基序列用IUPAC-IUB推薦的縮寫，或者相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域通用或習(xí)慣使用的縮寫表示，堿基的編號(hào)與CYP2D6基因組DNA相一致[用法見Yokota T.et a1.op cit]。
本發(fā)明顯示的新型突變，其特征是依據(jù)插入序列的發(fā)生率，該序列由第4213位，即CYP2D6基因外顯子9區(qū)，9個(gè)堿基亞序列TCACCCGTG重復(fù)所組成。
本發(fā)明的方法并不局限于規(guī)定的能檢測(cè)特別突變的任何特別的技術(shù)和方法。這樣，任一種不同的便利的方法和技術(shù)均可采用。由于本發(fā)明能對(duì)被檢的基因突變予以確認(rèn)和詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易地挑選一項(xiàng)適當(dāng)?shù)募夹g(shù)，作為本發(fā)明申請(qǐng)內(nèi)容相一致的檢測(cè)。例如，本發(fā)明方法可組成，當(dāng)然也包括以上特定位點(diǎn)的堿基序列分析。選擇Southern雜交技術(shù)或斑點(diǎn)雜交技術(shù)也是合適的[每項(xiàng)技術(shù)見索森EM，分子生物學(xué)雜志，98，503-517(1975)]?？刹捎弥T如PCR(多聚酶鏈反應(yīng))-RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)法，PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性法[Orita，M.，Iwahana，H.，Kanazawa，H.，Hayashi，K.和Sekiya，T.，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，86，2766-2770(1989)]，PCR-SSO(特異序列寡核苷酸)法，和使用PCR-SSO和斑點(diǎn)雜交的ASO(等位基因特異寡聚體)法[Saiki，R.K.，Bugawan，T.L，Horn，G.T.，Mullis，K.B.和Erlich，H.A.，自然，324，163-166(1986)]，以及其他方法。
特別是上面提到的RFLP技術(shù)，是本發(fā)明實(shí)施中優(yōu)先采用的方法，尤其是該技術(shù)與應(yīng)用PCR的DNA擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合時(shí)，有可能用少量DNA樣品，簡(jiǎn)單容易，高度敏感準(zhǔn)確地檢出多態(tài)性。此后，將以這項(xiàng)檢測(cè)方法(PCR-RFLP法)作為實(shí)施例，詳細(xì)地描述本發(fā)明。
依據(jù)本發(fā)明，檢測(cè)方法可采用的不同步驟，如某些DNA的化學(xué)合成，DNA裂解、缺失、添加或延伸的酶處理，DNA分離，純化，復(fù)制，挑選等，每項(xiàng)均可按常規(guī)方法進(jìn)行[例Bunshi Idengaku Jikkenh。(分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn))，1983年由Kyoritsu Shuppan出版；PCR技術(shù)，1990年由Takara Shuzo出版]。如可用瓊脂糖凝膠電泳等方法分離純化DNA，DNA測(cè)序可用雙脫氧法[桑格F，尼科蘭S和科爾森AR，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，74，5463-5467(1977)]，(Maxam-Gilbert)馬克塞姆-吉爾伯特法[馬克塞姆，AM和吉爾伯特，W.，酶學(xué)方法，65，499-560(1980)]等。DNA堿基序列測(cè)定也可用商品化的序列測(cè)定試劑盒等，很容易地進(jìn)行。也可按常規(guī)方法，用PCR擴(kuò)增某一DNA的特定區(qū)段[如Saiki，R.K.，Scharf，S.，F(xiàn)aloona，F(xiàn).A.，Mullis，K.B.，Horn，G.T.，Erlich，H.A.和Arnheim，N.，科學(xué)，230，1350-1354(1985)]。這些不同的基本步驟，可按文中所引的各種參考文獻(xiàn)進(jìn)行，只要把參考文獻(xiàn)和后面所敘的實(shí)施例結(jié)合在一起就可。
至于用本發(fā)明的檢測(cè)方法，對(duì)基因組DNA進(jìn)行分析，任一種來(lái)源于人的DNA樣品均可使用，沒有任何特別限制?？烧f(shuō)的例子有，體液如血，骨髓液，精液和腹腔液，肝和其他組織細(xì)胞，體毛如頭發(fā)，及其他樣品。按常規(guī)方法，從這些樣品中抽提純化，制備基因組DNA。對(duì)基因組DNA中，把含本發(fā)明所提及的突變位點(diǎn)的某一DNA區(qū)段擴(kuò)增后，可得到大量的濃縮試樣。若用PCR技術(shù)，采用適當(dāng)設(shè)計(jì)的引物，僅特異地?cái)U(kuò)增包含有上述外顯子9區(qū)插入部分的CYP2D6基因，即可實(shí)現(xiàn)。能用常規(guī)方法設(shè)計(jì)這種引物。如被擴(kuò)增區(qū)段的堿基長(zhǎng)度并不關(guān)鍵，但一般來(lái)說(shuō)，長(zhǎng)約100～500bp。所選擴(kuò)增的DNA區(qū)段，含一個(gè)任意的限制酶切點(diǎn)，以適用于下一步RFLP操作。規(guī)定任選的DNA區(qū)段，用酶處理DNA區(qū)段得到的裂解片段，有長(zhǎng)度差異，以便檢測(cè)時(shí)比較突變基因和正常(野生)基因。這樣設(shè)計(jì)引物的優(yōu)選例子在文后的實(shí)施例中顯示。引物是有義引物(9-S)和反義引物(9-AS)，該設(shè)計(jì)可特異單獨(dú)地?cái)U(kuò)增上述所需的CYP2D6區(qū)段，明顯與CYP2D6堿基序列高度同源的CYP2D7和CYP2D8二個(gè)假基因相區(qū)別。按這樣要求設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增所需的DNA區(qū)段長(zhǎng)度為334bp(野生)或343bp(突變)，含唯一所需的限制酶切點(diǎn)(Sty I點(diǎn))，用酶處理后，產(chǎn)生一條77bp(野生)或86bp(突變)的裂解片段和一條257bp的共同片段。
因此，用PCR擴(kuò)增的所需的DNA區(qū)段，采用如Sourthern印跡或凝膠電泳技術(shù)，作RFLP檢測(cè)，就能方便地對(duì)其中所含的突變予以檢測(cè)和鑒定。用上面提到的，適當(dāng)選擇的限制酶處理(消化)所需的DNA區(qū)段，對(duì)出現(xiàn)的裂解片段，按常規(guī)法鑒定其特異帶。
按上法所獲的帶型，就能檢測(cè)出CYP2D6基因多態(tài)(本發(fā)明者顯示了突變的發(fā)生率)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1示參考實(shí)施例2(1)中所設(shè)計(jì)和構(gòu)建的引物的堿基序列和發(fā)生位點(diǎn)。
圖2示實(shí)施例1(1)中所設(shè)計(jì)和構(gòu)建的引物的堿基和發(fā)生位點(diǎn)。
圖3示按實(shí)施例1方法得到的電泳圖，結(jié)果觀察到PM和EM，以及9個(gè)堿基插入的堿基。
圖4顯示堿基序列和所設(shè)計(jì)的引物存在位點(diǎn)，按實(shí)施例2(1)繪制。
圖5說(shuō)明實(shí)施例2(3)中按CYP2D6基因外顯子9的插入的帶長(zhǎng)所做的鑒定結(jié)果。
圖6是依據(jù)圖5顯示的原理所判定的不同類型的圖解。
圖7顯示按實(shí)施例2從一例PM和其父母得到的結(jié)果。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式以下實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但絕不是限定發(fā)明的范圍。
下列縮寫用于不同實(shí)施例中所用的試劑和其他材料。組合物用每升濃度或量表示。必要時(shí)，某些材料高壓滅菌(121℃，20分)等。
-TE溶液…10mM Tris-HCl(pH7.5)1mM乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)(pH8.0)；-20×SSC…3M氯化鈉，0.3M檸檬酸鈉，5×(Denhardt′s)溶液…10g菲可，10g聚乙烯吡咯烷酮，10g牛血清白蛋白(BSA)；-2×雜交緩沖液(pH8.0)…0.1M Tris-HCl(pH8.0)，2M氯化鈉，20mM EDTA，0.2％十二烷基硫酸鈉(SDS)；-SE溶液…10mM Tris-HCl(pH7.4)， 50mM EDTA，0.5％十二烷基肌氨酸二鈉鹽。
-甲酰胺染液…100ml甲酰胺，0.1g二甲苯藍(lán)，0.1g溴酚藍(lán)，4ml0.5M EDTA；-STE…100mM氯化鈉，10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mMEDTA(pH8.0)；-LB培養(yǎng)基…1g葡萄糖，5g氯化鈉，5g酵母提取物，10g細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨；-LBAmp+培養(yǎng)基…1g葡萄糖，5g氯化鈉，5g酵母提取物，10g細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨，青霉素(培養(yǎng)基高壓滅菌后加，終濃度25μg/ml)；-LBAmp+平板…以上LBAmp+培養(yǎng)基補(bǔ)加11g瓊脂；-2×TY培養(yǎng)基…16g細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨，10g酵母提取物，5g氯化鈉；-2×TY平板…以上2×TY培養(yǎng)基補(bǔ)加11g瓊脂；-10×PCR緩沖液(pH8.3)…100mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH8.3)，50mM氯化鉀，0.01％(W/V)明膠，氯化鎂(此后每次特定濃度是mM)；-H瓊脂培養(yǎng)基…20g細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨，8g氯化鈉，12g瓊脂粉；-H頂層瓊脂…20g細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨，8g氯化鈉，8g瓊脂粉；
-10×T4DNA聚合酶緩沖液(pH8.8)…667mM三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸(pH8.8)，67mM氯化鎂，116mM硫酸銨，100mM2-巰基乙醇，67μM EDTA，0.167％BSA；-10×變性緩沖液(pH9.5)…20mM三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸(pH9.5)，1mM亞精胺，0.1mM EDTA；-10×平末端緩沖液…0.5mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH9.5)，0.1M氯化鎂，0.1M2-巰基乙醇；-標(biāo)記混合液…7.5μM 5′-脫氧鳥苷三磷酸(dGTP)，7.5μM 5′-脫氧胞苷三磷酸(dcTP)，7.5μM 5′-脫氧胸苷三磷酸(dTTP)；-40％丙烯酰胺貯液…38g丙烯酰胺，2g雙丙烯酰胺，加純化水至總體積100ml；-10×TBE(pH8.3)…108g三羥甲基氨基甲烷，55g硼酸，9.3gEDTA；-A膠…76.8g尿素，24ml 40％丙烯酰胺貯液，8ml 10×TBE，加純水至總體積160ml；-B膠…14.4g尿素，4.5ml 40％丙烯酰胺貯液，7.5ml10×TBE，3.0g蔗糖，溴酚藍(lán)染液(10mg/ml)，加純水至總體積30ml；-10×H溶液…500mM三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，100mM氯化鎂，10mM二硫蘇糖醇(DDT)，100mM氯化鈉；-10×M溶液…100mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，100mM氯化鎂，10mM DTT，500mM氯化鈉。
參考實(shí)施例1(1)人外周血基因組DNA的制備按以下方法從人外周血中制備基因組DNA。用抗凝劑肝素收集10ml人外周血，3,000rpm離心10分鐘，出現(xiàn)血沉棕黃層。加相同體積的冷PBS到所獲的血沉棕黃層中，重復(fù)同樣的離心操作2或3次。所獲的血沉棕黃層層(buffer coat)用5倍體積的0.2％氯化鈉-5mM EDTA清洗，5,000rpm離心10分鐘，回收沉淀。重復(fù)上述清洗操作，直至沉淀中血紅蛋白的顏色不見為止。加TE溶液(0.5ml)到沉淀中，成完全懸浮液后，加2μl核糖核酸酶(Rnase A，10mg/ml)和100μl肌動(dòng)蛋白酶E(20mg/ml)。重懸浮操作后，加1.5ml SE溶液，混合物在37℃下溫育2小時(shí)，然后用1ml TE溶液稀釋。
然后，用苯酚-氯仿溶液重復(fù)抽提，直至沒有蛋白層出現(xiàn)為止，最后用氯仿抽提。抽提物用1/20體積的5M氯化鈉和3倍體積的冷乙醇處理，以引起沉淀。由此所得到的DNA用70％乙醇清洗，所獲的基因組DNA溶解于TE溶液中，測(cè)定260nM吸光度定量(分光光度計(jì)ShimadzuUV-160)。
(2)用CYP2D6 cDNA進(jìn)行Sourthern印跡分析在上(1)中所得到的基因組DNA(8μg)用限制酶EcoR I或Xba I消化，在脈沖電場(chǎng)中，0.8％瓊脂糖凝膠上電泳(用Toyo′s Elepos Ps-1510；100V，正向2秒，反向0.6秒)，接著用0.5N氫氧化鈉-1M氯化鈉溶液和1M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.4)-1M氯化鈉溶液變性，每次中和作用為30分鐘。膠浸于20×SSC中30分鐘，毛細(xì)管法把DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上8～12小時(shí)。用3×SSC洗膜，80℃烤膜2小時(shí)，使DNA固定在尼龍膜上。
尼龍膜溫育在含100μg/mg熱變性的鮭精DNA預(yù)雜交緩沖液中(pH8.0)(含1×雜交緩沖液和1×Denhardt′s溶液)，65℃封閉2小時(shí)，然后加50ng探針(總長(zhǎng)為1.5kb的CYP2D6 cDNA)，該探針用[α-32P]dCTP(Amersham)在含100μg/mg熱變性的鮭精DNA的預(yù)雜交緩沖液(pH8.0)中標(biāo)記，然后熱變性，65℃進(jìn)行雜交8～12小時(shí)。雜交后，用一份2×SSC－0.1％SDS室溫洗尼龍膜15分鐘，一份0.5×SSC－0.1％SDS 50℃洗膜15分鐘，然后空氣干燥，-80℃進(jìn)行放射自顯影12～16小時(shí)。
(3)結(jié)果分析和討論外周血樣品從PMs抽提，PMs顯示的log10代謝比率為1.50(MR＝未變化的藥物/羥基化形式的代謝產(chǎn)物，PM規(guī)定為log10MR＞1.1的受實(shí)驗(yàn)者)，該比率是用抗高血壓藥異喹胍和其父母及廣譜代謝者(extensive為metabolizer(此后縮寫為EMs)，進(jìn)行人體代謝測(cè)試得到?；蚪MDNA樣品的制備，按上述(1)程序進(jìn)行。
按上述程序(2)的方法，制備的每一種基因組DNA用限制酶EcoR I或Xba I處理，進(jìn)行Southern印跡分析。
結(jié)果是，對(duì)來(lái)自PMs和他們的父母，EcoR I處理的樣品的CYP 2D6分析，證實(shí)均有16.0，9.4和8.6Kb帶。
同時(shí)，已報(bào)道CYP2D7和CYP2D8二個(gè)假基因的堿基順序與CYP2D6高度同源，已經(jīng)了解EcoR I處理后Southem分析，CYP2D6和這些假基因各自產(chǎn)生9.4，16.0和8.6Kb帶[cf.e.g.Kimura，S et al.op cit.]。
同樣地，分析Xba I處理后的上述樣品，一般產(chǎn)生的帶在三條帶中，29.0和4.8Kb帶，而在PMs和他們的父親中，觀察到一條11.5Kb的額外帶。
迄今為止，有關(guān)Xba I處理后，進(jìn)行上述Southern印跡分析的大量研究表明，基因多態(tài)性涉及44.0，29.0，11.5和16.0+9.0Kb帶。根據(jù)這些報(bào)告，當(dāng)三個(gè)CYP2D基因，自5′端以CYP2D8，CYP2D7和CYP2D6順序排列，檢測(cè)到29.0Kb帶；當(dāng)還有一個(gè)CYP2D7加到上面的三個(gè)基因之中，自5′端這些基因以CYP2D8，CYP2D7，CYP2D7和CYP2D6)頁(yè)序排列時(shí)，可檢測(cè)到44.0Kb帶。也有報(bào)道11.5Kb帶表明CYP2D6完全缺少(D型突變)[Johansson，I.，Yue，Q.Y.，Dahl，M.L，Heim，M.，Bertilsson，L，Meyer，U.A.，Sioquist，F(xiàn)和Ingelman-Sundberg，M.，Eur.J.Clin.Pharmacol.，40，553-556(1991)]，當(dāng)同時(shí)檢出16.0和9.0Kb帶時(shí)，CYP2D7和CYP2D6之間有一基因組DNA突變。
鑒于前述情況，可假定PMs有D型突變，CYP2D6等位基因之一完全缺乏，并且是從他們的父親遺傳而來(lái)。
參考實(shí)施例2PCR分析尋找CYP2D6基因突變(1)引物設(shè)計(jì)或選擇為檢測(cè)CYP2D6基因中A型突變和B型突變，引物應(yīng)這樣設(shè)計(jì)，僅使CYP2D6基因的這些突變位點(diǎn)特異擴(kuò)增。進(jìn)一步說(shuō)，鑒定A型突變，二個(gè)引物(A′-SW和A′-SM)的設(shè)計(jì)是將突變位點(diǎn)定位在3′端，選擇一個(gè)堿基的差異。
這些引物的堿基序列和其出現(xiàn)的位點(diǎn)顯示在圖1中。
(2)引物純化按上述11)中設(shè)計(jì)或選擇的引物，按下法制備和純化。每一合成和用3ml 29％氨水脫三苯甲基化的寡核苷酸，用3ml 29％氨水從樹脂上切落，60℃溫育4小時(shí)。氨水已揮發(fā)，所得的沉淀(pellet)溶于20μl甲酰胺染液中，100℃加熱染液5分鐘，然后進(jìn)行20％變性丙烯酰胺凝膠電泳。用于電泳的緩沖液是1×TBE。
電泳后，凝膠中含寡核苷酸的部分在紫外線照射下定位，切除，用1-ml注射器擠壓破碎。往里加STE(5ml)，在旋轉(zhuǎn)器上緩慢旋轉(zhuǎn)，抽提10～12小時(shí)。抽提液100℃加熱10分鐘，然后3,000rpm離心10分鐘。上清過(guò)DEAE-葡聚糖凝膠A-50柱，該柱預(yù)先用TE緩沖液平衡，因而能吸附寡核苷酸。依次地用150μl1.5M氯化鈉-10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，200μl 0.1N氫氧化鈉-1mM EDTA和50μl10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)過(guò)柱洗脫。為立刻中和洗脫液，回收寡核苷酸的管中預(yù)先放50μl1M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)。中和的溶液進(jìn)行乙醇沉淀，所得的寡核苷酸溶于適量的純水中，測(cè)定260nM的吸光度定量。
(3)PCR擴(kuò)增基因組DNA，以檢測(cè)CYP2D6基因A型突變。
含CYP2D6基因A型突變的基因組DNA(基因組DNA外顯子5第2637位的一個(gè)堿基缺失)，用DNA熱循環(huán)儀(Perkin Elmer Cetus)，按下法(參照?qǐng)D1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
加參考實(shí)施例1(1)中制備的1μl基因組DNA溶液(50ng/μl)，17.5μl純水，1μl 5mM5′-脫氧核糖核酸三磷酸(dNTP)溶液，2.5μl10×PCR溶液(10mM)， 1μl10μM有義引物(A-S)和1μl 10μM反義引物(A-AS)。混合物煮5分鐘，然后用冰冷卻3分鐘，加1μl Taq DNA聚合酶(1U/μl)到混合物中，使總體積為25μl。接著上鋪等體積的礦物油層后，按94℃1分，55℃2分和72℃2分循環(huán)，進(jìn)行反應(yīng)，25個(gè)循環(huán)以上。
反應(yīng)完成后，移去礦物油，依次進(jìn)行苯酚抽提，氯仿抽提和乙醇沉淀，得到的DNA片段溶于30μl TE中。
依據(jù)其帶長(zhǎng)度(757bp)和限制酶(Ava I和Pvu II)處理結(jié)果，確定擴(kuò)增的DNA片段是CYP2D6基因。Ava I處理，觀察到350，204和203bp帶；Pvu II處理，觀察到464和295bp帶。
如果以上過(guò)程CYP2D7基因被擴(kuò)增，Ava I處理觀察到的帶為400和350bp；若是CYP2D8被擴(kuò)增，觀察到的帶為431，146，90，70和27bp，因而這些基因能明顯地與上述CYP2D6相區(qū)別。
(4)鑒定CYP2D6基因A型突變用3′端僅差一個(gè)堿基的二個(gè)有義引物(A′-SW和A′-SM)，結(jié)合以上步驟(3)中所用的反義引物(A-AS)，以及以上步驟(3)中制備的樣品溶液，按下法作CYP2D6基因A型突變的鑒定。
加(3)中制備的1μl樣品溶液，17.5μl純水，1μl 5mM dNTP溶液，2.5μl10×PCR溶液(7.5mM)，1μl10M鑒定用的有義引物(A′-SW或A′-SM)和1μl10M反義引物(A-AS)?；旌衔镏?分鐘，然后用冰冷卻3分鐘。加Taq DNA聚合酶(1U/μl；1μl)，使其總體積為25μl，接著上鋪等體積的礦物油層。反應(yīng)通過(guò)94℃1分，55℃1分，72℃1分循環(huán)實(shí)現(xiàn)，25個(gè)循環(huán)以上。反應(yīng)完成后，移去礦物油，反應(yīng)混合物上含0.02％溴化乙錠(EtBr)的1.5％瓊脂糖凝膠，進(jìn)行電泳作鑒定。因有義引物在3′端僅差一個(gè)堿基，可預(yù)期A′-SW只特異擴(kuò)增野生型，A′-SM只特異擴(kuò)增A型突變。這樣，當(dāng)僅在A′-SW邊觀察到一條451bp帶時(shí)，該類型可鑒定為野生型；當(dāng)在A′-SW和A′-SM二邊均觀察到451bp帶時(shí)，為雜合基因A型突變；而僅在A′-SM觀察到451bp帶時(shí)，為純合基因A型突變。
結(jié)果是在PM和父母中，僅在A′-SW邊觀察到451bp帶，由此證實(shí)該突變不是A型突變。
(5)PCR擴(kuò)增基因組DNA，以檢測(cè)CYP2D6基因B型突變。
含CYP2D6基因B型突變(基因組DNA第1934位的一個(gè)堿基置換，該位即是外顯子4的外顯子-內(nèi)含子交接處)的基因組DNA，用上述(3)中相同的方法擴(kuò)增，用(B-S)作有義引物和(B-AS)作反義引物。
確認(rèn)所擴(kuò)增的DNA片段為CYP2D6，是依據(jù)其帶長(zhǎng)度(533bp)和限制酶(Ava I)處理后，觀察到311，146和76bp帶。如果以上過(guò)程，CYP2D6或CYP2D8被擴(kuò)增，用AvaI處理后觀察到457和76bp帶，因而這些基因和上述CYP2D6能作明顯的區(qū)別。
(6)鑒定CYP2D6基因B型突變利用限制酶MvaI識(shí)別位點(diǎn)的消失，能鑒定CYP2D6基因B型突變，其結(jié)果是外顯子4中外顯子-內(nèi)含子連接位點(diǎn)的一個(gè)堿基置換。
加上述(5)中制備的10μl樣品溶液，2μl10×M溶液，2μl MvaI(10U/μl)和6μl純水，使總體積達(dá)20μl。產(chǎn)生的混合液37℃溫育2小時(shí)，然后用2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。
當(dāng)觀察到279bp帶時(shí)，該類型可鑒定為野生型；觀察到384和279bp帶時(shí)，為雜合基因B型突變；而觀察到384bp帶時(shí)，為純合基因B型突變。
結(jié)果從PM和其父母觀察到279bp帶，這樣證實(shí)該突變不是B型突變。
實(shí)施例1分析PM的CYP2D6基因堿基序列(1)引物設(shè)計(jì)和純化引物設(shè)計(jì)要求，CYP2D6基因所有外顯子和外顯子-內(nèi)含子連接位點(diǎn)分為4部分后，能特異地?cái)U(kuò)增。與參考實(shí)施例2相同的方法，各自制備和純化引物，用這些引物，按下列PCR方法擴(kuò)增不同的片段。
所用的引物堿基序列和它們?cè)贑YP2D6上相應(yīng)的位點(diǎn)，以及所得到的不同片段的圖解見圖2。以上采用的反義引物(B-AS)擴(kuò)增的片段，包含外顯子2至4，有義引物(A-S)和反義引物(A-AS)擴(kuò)增包含外顯子5至6的片段，分別與參考實(shí)施例2所用的這些引物相同。
(2)CYP2D6基因的外顯子和外顯子-內(nèi)含子連結(jié)位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增含CYP2D6基因外顯子和外顯子-內(nèi)含子連接位點(diǎn)的基因組DNA，用PCR技術(shù)按下法擴(kuò)增。
加在參考實(shí)施例1制備的1μl基因組DNA溶液(50ng/μl)，17.5μl純水，1μl 5mMdNTP溶液，2.5μl10×PCR溶液(10mM)，1μl10μM有義引物和1μl10μM反義引物。混合液煮沸5分鐘，然后用冰冷卻3分鐘。往里加1μl Taq DNA聚合酶(1U/μl)，使總體積為25μl，接著上鋪等體積的礦物油后，以94℃1分，53℃(限于片段F1)，48℃(F2)，55℃(F3)或50℃(F4)2分和72℃2分循環(huán)進(jìn)行反應(yīng)，25個(gè)循環(huán)以上。反應(yīng)完成后，移去礦物油，依次進(jìn)行苯酚抽提，氯仿抽提和乙醇沉淀，各自得到的DNA片段溶于20μl TE中。
依據(jù)各自帶長(zhǎng)度和用一種合適的限制酶或酶(F1HhaI；F2AvaI；F3Ava I，PVUII；F4sty I)處理，觀察出現(xiàn)的帶，可證實(shí)擴(kuò)增的DNA片段分別來(lái)自CYP2D6的產(chǎn)物。
(3)亞克隆進(jìn)Bluescript載體在上述(2)中得到的CYP2D6各個(gè)DNA片段(F1～F4)，按下法變成平末端。
相當(dāng)于500ng量的各個(gè)片段溶于20μl TE中，加8μl2mMdNTP，1μl T4DNA聚合酶， 4μl10×T4DNA聚合酶緩沖液(pH8.8)和7μl純水，使總體積為40μl。37℃進(jìn)行反應(yīng)15分鐘，加純水至總體積200μl，然后進(jìn)行苯酚抽提(二次)和氯仿抽提(一次)。得到的上清液加15μl3M乙酸鈉(pH5.6)和375μl冷乙醇，產(chǎn)生的混合液冷卻至80℃，12,000rpm，4℃離心20分鐘，沉淀用70％乙醇洗后，干燥。
因?yàn)橐陨螾CR產(chǎn)物5′端缺乏磷酸化基因，按下法進(jìn)行磷酸化。各個(gè)平末端DNA片段加入75μl變性緩沖液(pH9.5)，混合液煮沸2分鐘，然后在冰上放2分鐘。加1μl腺苷三磷酸(ATP，50 picomoles/μl)，10μl10×平末端緩沖液，12μl純水和2μl T4多聚核苷酸激酶(11U/μl)，總體積為100μl，37℃進(jìn)行反應(yīng)1小時(shí)。加純水至總體積為200μl，然后進(jìn)行苯酚抽提(二次)和氯仿抽提(一次)，得到的上清液補(bǔ)加15μl3M乙酸鈉(pH5.6)和375μl冷乙醇，混合物冷卻至-80℃，然后4℃12,000rpm離心20分鐘，沉淀用70％乙醇清洗。干燥沉淀，溶于10μl純水中。用這種方法，制備不同的插入片段。
Bluescript載體(2μg)用Hinc II處理，然后加47μl1M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH8.0)和2μl堿性磷酸酶(0.5U/μl)，總體積達(dá)52μl，65℃進(jìn)行反應(yīng)30分鐘。加純水至總體積為200μl，然后進(jìn)行苯酚抽提(三次)和氯仿抽提(一次)。上清液中加15μl3M乙酸鈉(pH5.6)和375μl冷乙醇，混合液冷卻至-80℃，12,000rpm，4℃離心20分鐘，沉淀用70％乙醇清洗，然后干燥，溶于20μl TE中。用這種方法，完成載體去磷酸化。
各個(gè)含CYP2D6外顯子和外顯子-內(nèi)含子連接位點(diǎn)的片段(100ng)和10ng Bluescript載體混合，進(jìn)行連接。連接反應(yīng)完成后，把300μl感受態(tài)細(xì)胞懸液加到DNA溶液中，混合液放在冰上20分鐘。給予42℃熱休克超過(guò)2分鐘，然后加1ml LB溶液，混合液溫育1小時(shí)，接著4℃，3,000rpm離心20分鐘。移去上清液(1ml)，重新懸浮沉淀，接種于LB培養(yǎng)基中，37℃溫育過(guò)夜以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體。
所用的宿主大腸桿菌菌株是TG1，上述感受態(tài)細(xì)胞用下面的方法制備。
LB培養(yǎng)基(200ml)種入2ml過(guò)夜大腸桿菌菌株培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)直到650nM吸光度值達(dá)約0.6。培養(yǎng)液在冰水中冷卻30分鐘，然后收集細(xì)胞，懸浮在100ml 50mM氯化鈣中。緩慢倒轉(zhuǎn)搖動(dòng)15分鐘后，懸浮液立在冰上1小時(shí)。然后重新收集細(xì)胞，懸浮于20ml 50mM氯化鈣-20％甘油中。懸浮液以300-μl一份分裝于微量離心管中，立即用液氮冷卻，貯存于-80℃。細(xì)胞收集后的所有操作步驟，在低溫室(4℃)中進(jìn)行。
(4)小量制備雙鏈DNA
以上方法得到的轉(zhuǎn)化體克隆恢復(fù)培養(yǎng)在3ml LBAmp＋培養(yǎng)基中，離心培養(yǎng)液重獲細(xì)胞，用下面的方法，小量制備質(zhì)粒DNA。
上述培養(yǎng)液1.5ml轉(zhuǎn)移到一只微量離心管中，5000rpm離心5分鐘，重獲細(xì)胞沉淀，懸于200μl10mM EDTA溶液中，加400μl1％SDS-0.1M氫氧化鈉溶液，讓混合液放在冰上5分鐘。加200μl5M乙酸鉀后，產(chǎn)生的混合液在冰上冷卻5分鐘，13,000rpm離心5分鐘。上清液轉(zhuǎn)移到另一只微量離心管中，加700μl異丙醇。混合液于4℃，13,000rpm離心5分鐘，得到的沉淀懸浮在100μl20mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)/10mM EDTA溶液中，加1μl核糖核酸酶I(10mg/ml)，混合液65℃溫育15分鐘。苯酚抽提和氯仿抽提后，加12μl3M乙酸鈉(pH5.6)和224μl冷乙醇，混合液冷卻到-80℃，然后于4℃，13,000rpm離心10分鐘，沉淀用70％乙醇清洗。干燥后，沉淀溶于20μl TE中。依據(jù)載體的多克隆位點(diǎn)和插入DNA片段的限制酶圖譜，選擇限制酶，處理重得的質(zhì)粒，接著進(jìn)行瓊脂糖凝脈電泳，確認(rèn)不同DNA片段的插入按預(yù)期得到。
(5)亞克隆進(jìn)M13載體根據(jù)載體的多克隆位點(diǎn)和插入DNA片段的限制酶圖譜，選擇內(nèi)切酶處理，可確認(rèn)插入DNA片段在質(zhì)粒中的方向。
用二個(gè)其識(shí)別位點(diǎn)在載位多克隆位點(diǎn)上的限制酶(EcoR I和Bam HI)處理后，重新得到片段；M13載體也用與這些片段相同的方法處理；連接使片段插入M13載體中。300μl感受態(tài)細(xì)胞懸液加到連接反應(yīng)完成后得到的30μl各自DNA溶液(100ng)中，讓混合液在冰上放置40分鐘。42℃予以熱休克2分鐘后，3ml H頂層瓊脂和200μl過(guò)夜的大腸桿菌培養(yǎng)液混合，混合液鋪展在H瓊脂培養(yǎng)基上，37℃溫育過(guò)夜，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體。所用的宿主大腸桿菌菌株是JM103，感受態(tài)細(xì)胞按上述步驟(4)制備。
(6)制備單鏈?zhǔn)删wDNA單鏈?zhǔn)删wDNA的制備按下法進(jìn)行。獲取一轉(zhuǎn)化體噬菌斑，培養(yǎng)在3ml2×TY培養(yǎng)基中6小時(shí)。該培養(yǎng)液1.5-ml一份在15,000rpm下離心5分鐘(二次)，得到上清液。在1.3ml上清液中加200μl20％聚乙二醇(PEG)-2.5M氯化鈉?；旌弦菏覝?cái)R15分鐘，然后15,000rpm離心5分鐘，使噬菌體DNA沉淀。15,000rpm進(jìn)一步離心2分鐘后，完全移去上清液，沉淀溶于200μl TE中，加100μl苯酚，振蕩后，混合液室溫?cái)R15分鐘。接著加100μl氯仿，進(jìn)行同樣的操作，接著10,000rpm離心5分鐘。取上清液150-μl一份，加15μl3M乙酸鈉溶液(pH5.6)和375μl冷乙醇，混合液冷卻到-80℃乙醇沉淀。4℃，12,000rpm下進(jìn)行離心20分鐘，沉淀用70％乙醇清洗。干燥沉淀，溶于20μl TE中，以得到單鏈DNA。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用從沒有任何片段的M13載體制備的單鏈DNA作對(duì)照。根據(jù)檢測(cè)到低遷移率的一條帶，確認(rèn)片段按預(yù)期插入。
(7)CYP2D6基因外顯子和外顯子-內(nèi)含子連接位點(diǎn)的堿基序列分析用上述(6)中得到的單鏈DNA，按文獻(xiàn)描述的方法[Sanger，F(xiàn).，Miklen，S.and Coulson，A.R.美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，74，5463-5467(1977)]，進(jìn)行堿基序列分析，方法如下。按測(cè)序酶TMVER2.0附的操作指南，進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。
首先，混和7μl模板DNA(700ng)，1μl引物(1 picomole/μl)和2μl5×退火緩沖液(pH7.5)，混合液65℃加熱2分鐘，然后逐漸冷卻，使引物和模板DNA一起退火。然后，加1μl 0.1M DTT，2.0μl標(biāo)記混合液，0.5μl[α-33P]5′-脫氧腺苷三磷酸(dATP)和2μl 8-倍稀釋的測(cè)序酶，混合液室溫溫育2～5分鐘。在那段時(shí)間內(nèi)，含四種雙脫氧NTPs的反應(yīng)終止液，以2.5μl份分裝于微量離心管中，37℃預(yù)溫育。反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液分別以3.5μl份加到終止液中，接著進(jìn)一步37℃溫育5分鐘。加甲酰胺染液(4μl)，各個(gè)混合液煮2分鐘，然后加到凝膠中。凝膠是蔗糖密度梯度凝膠，膠厚0.4mm，用60cm玻璃板制做。在40ml A膠溶液和15ml B膠溶液中，分別加32μl20％N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)和9μl過(guò)硫酸銨(APS)。依次把A膠溶液和B膠溶液，吸進(jìn)-50-ml一次性的注射器中，吸2或3個(gè)氣泡輕輕搖動(dòng)，混合液灌進(jìn)玻璃板中。用上層膠注滿剩余的空間。用1×TBE，電泳在恒壓2,500～3,000V下進(jìn)行2～7小時(shí)。然后，凝膠浸在10％乙酸-10％甲醇中15分鐘，使DNA固定，然后在干膠器的吸力下干燥。X光片-80℃曝光過(guò)夜。
(8)結(jié)果分析和討論分析對(duì)各個(gè)來(lái)源于PM的外顯子和外顯子-內(nèi)含子連接位點(diǎn)的堿基序列，結(jié)果是證實(shí)外顯子9(4213bp)的9個(gè)堿基序列TCACCCGT(4213-4222bp)重復(fù)插入。
可推斷這種插入導(dǎo)致插入三個(gè)氨基酸(纈氨酸，脯氨酸，蘇氨酸)。該位點(diǎn)位于緊靠血色素(hem)結(jié)合區(qū)(HR-2區(qū))之后，該區(qū)是鐵結(jié)合位點(diǎn)，在藥物氧化反應(yīng)中很重要，在血色素蛋白(hem protein)P450中起重要作用。推測(cè)堿基插入引起的三個(gè)氨基酸插入，對(duì)PMs的代謝能力產(chǎn)生一定的影響，顯著地降低代謝能力。
CYP2D6基因上述突變是迄今為止未見報(bào)道的新型突變，這種突變可認(rèn)為是PMs的一個(gè)因素。
實(shí)施例2CYP2D6基因新型突變檢測(cè)(PCR-RFLP)(1)引物設(shè)計(jì)和純化有義引物設(shè)計(jì)要求是含插入位點(diǎn)，這是外顯子9中的新型突變位點(diǎn)；和只允許CYP2D6特異擴(kuò)增。所用的反義引物與實(shí)施例1構(gòu)建的相同(9-AS)，所選的引物和其位置在圖4顯示。
與參考實(shí)施例2相同的方法，純化各個(gè)引物。用這些引物，按下列的PCR方法，擴(kuò)增外顯子9的基因組DNA。
(2)CYP2D6基因外顯子9的PCR擴(kuò)增在參考實(shí)施例1中制備的1μl基因組DNA溶液(50ng/ml)中，加17.5μl純水，1μl5mMdNTP溶液，2.5μl10×PCR溶液[僅是本實(shí)施例，其組成液是200mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH8.4)，250mM氯化鉀，0.5％吐溫20，1mg/ml明膠，10mM氯化鎂]，1μl 10μM有義引物(9-S)和1μl10μM反義引物(9-AS)?；旌弦褐蠓?分鐘，然后冰上冷卻3分鐘。加進(jìn)1μl Taq DNA聚合酶(1U/μl)，使總體積為25μl，接著上鋪等體積的礦物油層后，以94℃1分，55℃1分，72℃2分循環(huán)進(jìn)行反應(yīng)，25個(gè)循環(huán)以上。
反應(yīng)后，移去礦物油，依次進(jìn)行苯酚抽提，氯仿抽提和乙醇沉淀，得到的DNA片段溶于20μl TE中。
證實(shí)擴(kuò)增的DNA片段來(lái)自CYP2D6，是依據(jù)其帶長(zhǎng)度(334bp)和觀察限制酶(Sty I，Asp718)處理的結(jié)果，Sty I處理為一條257bp帶和一條77bp帶，Asp718處理為一條189bp帶和一條145bp帶。如果在那種情況下，CYP2D7被擴(kuò)增，StyI處理后將觀察到一331bp帶，若是CYP2D8被擴(kuò)增，Asp718處理后，將觀察-320bp帶；因而，有可能與這些基因明顯區(qū)別。
(3)由PCR產(chǎn)物的限制酶處理，鑒定CYP2D6基因外顯子9中的插入用限制酶Sty I處理以上(2)中擴(kuò)增的DNA片段，接著測(cè)定帶長(zhǎng)度做出鑒定(圖5)。
在(2)中制備的10μl樣品液中，加2μl10×H溶液，2μl Sty I(10U/μl)和6μl純水，使總體積為20μl。產(chǎn)生的混合液37℃溫育2小時(shí)。反應(yīng)后，依次進(jìn)行苯酚抽提，氯仿抽提和乙醇沉淀，DNA片段溶于5μlTE中，用10％丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。當(dāng)觀察到一條77bp帶時(shí)，該DNA可鑒定為野生型，當(dāng)觀察到77bp帶和一條86bp帶時(shí)，為雜合基因突變；而觀察到一條886bp帶時(shí)，為純合基因突變(圖6)。
(4)結(jié)果和討論檢查一PM和PM的父母，作CYP2D6基因上述新型突變檢測(cè)的結(jié)果表示在圖7中。在PM和其母親(在圖中，MP)觀察到86bp帶，因而用本發(fā)明證實(shí)了涉及的突變(插入)。從而證明該突變從母親中遺傳。圖中，F(xiàn)P表示PM的父親，對(duì)一EM所做的結(jié)果也表示在圖中。
從以上結(jié)果顯而易見的是，根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)CYP2D6基因的新型突變，作PM的基因診斷是有用的。
工業(yè)應(yīng)用性依據(jù)本發(fā)明，顯示3CYP2D6基因的一種新型突變，提供了檢測(cè)含這種突變的新CYP2D6基因多態(tài)的一種方法。
靠檢測(cè)CYP2D6基因多態(tài)，有可能對(duì)PMs作基因診斷，尤其是在PMs中引起的因素不是已知的CYP2D6基因多態(tài)。因此，如在診斷，預(yù)測(cè)或研究不同的藥物物質(zhì)副作用的原因中，所述的檢測(cè)方法是十分有用的。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)人細(xì)胞色素P450 2D6基因多態(tài)的方法，它包括檢測(cè)人細(xì)胞色素P450 2D6基因外顯子9中，9個(gè)堿基TCACCCGTG重復(fù)插入的發(fā)生率。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測(cè)人細(xì)胞色素P450 2D6基因多態(tài)的方法，它包括檢測(cè)人細(xì)胞色素P450 2D6(CYP2D6)基因外顯子9中，9個(gè)堿基TCACCCGTG重復(fù)插入的發(fā)生率。根據(jù)本發(fā)明的方法，有可能檢出未見報(bào)道的新型CYP2D6多態(tài)。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1151763SQ95193979
公開日1997年6月11日 申請(qǐng)日期1995年5月2日 優(yōu)先權(quán)日1994年5月6日
發(fā)明者鎌瀧哲也 申請(qǐng)人:大制藥株式會(huì)社