專利名稱：多表位疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含多個(gè)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位的疫苗，本發(fā)明還涉及包括多個(gè)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位的編碼序列的多核苷酸。
CD8+αβ細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)識別與I類主要組織相容復(fù)合物1(MHC)的特異等位基因相關(guān)聯(lián)的短肽(表位，一般長度8-10氨基酸)。這些肽表位主要是通過一種被認(rèn)為是涉及多催化性蛋白體復(fù)合物的蛋白水解過程2-7，由胞液蛋白所產(chǎn)生的。適當(dāng)長度的肽被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中特定的表位與MHC相聯(lián)。然后MHC/表位復(fù)合物被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面供CTL識別。關(guān)于CTL表位旁側(cè)的序列對這些表位的蛋白水解加工的影響尚存爭議8-12。然而，通過構(gòu)建編碼含9種CD8 CTL表位的人工多肽蛋白的重組痘病毒，本發(fā)明人已確定天然位于CTL表位旁側(cè)的序列不為I類加工所必需，即在多表位蛋白中的每一種表位總能通過自身多表位疫苗感染的靶細(xì)胞被有效地加工并呈遞給相應(yīng)的CTL克隆。
因此，本發(fā)明的首要方面是一種重組多表位細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞疫苗。該疫苗包括一種重組蛋白，所述重組蛋白包括來自一種或多種病原體的多個(gè)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位，其中所述的至少一種重組蛋白基本上不含天然存在于細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位旁側(cè)的序列。
優(yōu)選的是，至少一種重組蛋白不含任何天然存在于細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位旁側(cè)的序列。然而，應(yīng)理解的是天然位于細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位旁側(cè)的短序列(例如，1-5個(gè)氨基酸)可能被包括在內(nèi)。術(shù)語“基本上不含天然存在于細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位旁側(cè)的序列”應(yīng)被認(rèn)為包括這樣的短旁側(cè)序列。
本發(fā)明的第二個(gè)方面是一種多核苷酸，它包括至少一種編碼來自一或多種病原體的多個(gè)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位的序列，其中所述的至少一種序列基本上不含編碼天然存在于細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位旁側(cè)的肽的序列。
同樣，術(shù)語“基本上不含編碼天然存在于細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位旁側(cè)的肽的序列”應(yīng)理解為有可能包括天然位于細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位旁側(cè)的短肽(1-5個(gè)氨基酸)編碼序列。
本發(fā)明的第三個(gè)方面為核酸疫苗，該疫苗包括本發(fā)明第二個(gè)方面所涉及的多核苷酸及一種可接受的載體。
本發(fā)明的第四個(gè)方面為疫苗配制品，該疫苗包括本發(fā)明第一個(gè)方面所涉及的重組蛋白及一種可接受的載體和/或佐劑。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的至少一種重組蛋白包括至少三種細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位，所述的至少一種序列編碼至少三種細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位。
在另一個(gè)的優(yōu)選實(shí)施方案中，表位來自多種病原體。
還應(yīng)看到的是，本發(fā)明的疫苗可以包括免疫調(diào)節(jié)化合物(如細(xì)胞因子)，其它蛋白/化合物(如melittin或調(diào)節(jié)蛋白)和/或佐劑。該疫苗還可以包括輔助表位/CD4表位和蛋白，B細(xì)胞表位，或含有這類表位的蛋白，如破傷風(fēng)毒素。本發(fā)明的疫苗的另一個(gè)例子包括一重組疫苗的構(gòu)建物，其中含CTL表位的多表位連在含B細(xì)胞和/或CD4表位的胞外糖蛋白上。
本發(fā)明的疫苗可由各種載體，如痘病毒載體、禽痘病毒載體、細(xì)菌載體、病毒樣顆粒(VLP’s)和棒狀病毒載體來輸送，或通過核酸接種技術(shù)來輸送。由于多表位蛋白在制備中和/或注射后在血清中很容易對蛋白水解敏感，我們認(rèn)為這種疫苗最好采用核酸接種技術(shù)12、或采用保護(hù)多表位蛋白不受蛋白水解作用的載體系統(tǒng)或佐劑系統(tǒng)輸送。關(guān)于載體的其它資料可參見Chatfield等，疫苗，7，495-499，1989；Taylor等，疫苗，13，539-549，1995；Hodgson，細(xì)菌疫苗載體，《農(nóng)業(yè)疫苗》。
本發(fā)明的多表位疫苗還可包括來自一種病原體的大量表位(如10個(gè)或更多)，以便靶種群HLA多樣性也包括在內(nèi)。例如含受HLA A1、A2、A3、A11和A24限制的表位的疫苗可以包括大約90％的高加索種群。
本發(fā)明的多表位疫苗還可由受單個(gè)HLA等位基因限制的多個(gè)表位來構(gòu)建。
在本發(fā)明的第四個(gè)方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，疫苗配制品包括ISCOMs，關(guān)于ISCOMs的資料可參見澳大利亞專利558258，EP019942，US4578269和US4744983，這些公開的專利在此附上供參考。
為了使本發(fā)明的性質(zhì)得到更清楚的理解，現(xiàn)根據(jù)下面的實(shí)施例和附圖對本發(fā)明的優(yōu)選形式進(jìn)行描述，其中

圖1表達(dá)編碼含有9種CTL表位的多表位蛋白的合成DNA插入物的重組痘病毒的構(gòu)建。加框的序列表示線性B細(xì)胞表位。
圖2重組多表位痘病毒構(gòu)建物表達(dá)的每種表位的CTL識別。
圖3多表位痘病毒可激發(fā)表位特異性應(yīng)答。通過用多表位痘病毒以0.01MOI感染外周血單核細(xì)胞(PBMC)2小時(shí)并洗滌2次后，從供體(A)CM-A24，A11，B7，B44；(B)YW-A2，B8，B38；(C)NB-A2，A24，B7，B35產(chǎn)生了大量效應(yīng)細(xì)胞。于10％FCS/1640RPMI中培養(yǎng)10天后，在一標(biāo)準(zhǔn)的5小時(shí)鉻釋放檢測14中，這些大量效應(yīng)細(xì)胞用于對抗用所示肽(10μM)致敏的自體植物凝聚素T細(xì)胞的母細(xì)胞靶細(xì)胞(E∶T＝20∶1)。通過加入經(jīng)照射的自體A型LCLs14產(chǎn)生的大量效應(yīng)細(xì)胞(LCL∶PMBC＝1∶50)給出的結(jié)果與以上所示的相似。
圖4表示含10個(gè)鼠CTL表位的多表位DNA插入物的構(gòu)建。
圖5示出圖1的多表位DNA插入物的序列。
圖6提供了在脾細(xì)胞上進(jìn)行的CTL檢測的結(jié)果，該脾細(xì)胞收集自用包括圖3所示的DNA插入物的重組痘病毒接種過的小鼠。
圖7顯示多表位痘病毒接種后第5周與用MCMV進(jìn)行攻擊后第4天的脾細(xì)胞MCMV滴度比較(土標(biāo)準(zhǔn)誤差)。p值-未配對的student T-測試圖8用不同質(zhì)粒對Balb/C小鼠進(jìn)行的DNA接種。
圖9來自Balb/c、CBA、C56BL/6品系的小鼠用小鼠多表位痘病毒免疫接種(IP)后，取出其脾臟，用肽(如A和A’)重新刺激脾細(xì)胞，流感病毒NP肽“TYQRTRALV刺激產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞再用于肽包被的靶細(xì)胞(A-J)，病毒感染的靶細(xì)胞(A’-J’)和腫瘤靶細(xì)胞(I’)。病毒感染的靶細(xì)胞用尿囊液感染(A’、F’)作為陰性對照，或者鼠多表位痘病毒(Vacc Mu PT)(B’-D’、F’-J’)感染的靶細(xì)胞用人多表位痘病毒(VaccHu PT)感染作為陰性對照。實(shí)施例1來自一些Epstein-Barr病毒核抗原(EBNA)的9種I類限制性CTL表位已在以前用CTL克隆確定10，18-20。這些克隆是從一系列正常健康的EB病毒(EBV)血清陽性供體分離而來的并受不同HLA等位基因限制(表1)。一種編碼含所有這九種CTL表位的單一人工蛋白的重組多表位痘病毒(多表位痘病毒)已被構(gòu)建(見圖1)。編碼這一蛋白的DNA序列是通過重疊延伸剪接(SOEing)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)連接六個(gè)重疊的寡核苷酸制備得到。該插入序列克隆入pBluescript II，測序鑒定后轉(zhuǎn)入pBCBO715的痘病毒驅(qū)動子后，得到pSTPT1。該質(zhì)粒隨后通過利用標(biāo)記-獲救重組16產(chǎn)生多表位痘病毒。通過這種痘病毒表達(dá)的人工多表位蛋白因此不含在出發(fā)蛋白中發(fā)現(xiàn)的位于CTL表位旁側(cè)的天然序列(圖1)CTL克隆關(guān)聯(lián)表位來源HLA限制性參考文獻(xiàn)LC13 FLRGRAYGLEBNA3B8 13LC15 QAKWRLQTLEBNA3B8 14CS31 EENLLDFVRF EBNA6B44 15YW22 SVRDRLARLEBNA3A020314CM4KEHVIQNAFEBNA6B44 13NB26 YPLHEQHGMEBNA3B350114LX1* HLAAQGMAYEBNA3714JSA2 DTPLIPLTIF EBNA3B51#/A2 13CM9IVTDFSVIKEBNA4A11 16表1CTL克隆、其關(guān)聯(lián)表位、出發(fā)蛋白(來源)和它們的HLA限制性的描述?？寺〉念^兩個(gè)字母指供體。*未測試(見圖2)。#近期的證據(jù)提示此表位可能受HLA-B51限制。除了EENLLDFVRF和DTPLIPLTIF，所有表位均被最小化。
編碼多表位氨基酸序列的DNA序列是以在哺乳動物中最常使用的密碼子來設(shè)計(jì)的，并在起始密碼上游加入一Kozac序列13和一BamHI位點(diǎn)。六個(gè)重疊20個(gè)堿基對的70聚體寡核苷酸通過重疊延伸剪接(SOEing)在20μl反應(yīng)體系中剪接在一起，該反應(yīng)體系包括標(biāo)準(zhǔn)PCR緩沖液、2mM MgCl2，O.2mM dNTPs，1.5U Taq聚合酶(熱起始溫度94℃)，采用下面的熱循環(huán)程序94℃10秒，45℃20秒和72℃20秒(40個(gè)循環(huán))。將每一凝膠純化的二聚體樣本的一半，與加入的0.5μl的α32P dCTP在第二次PCR反應(yīng)中(12個(gè)循環(huán))相結(jié)合，該反應(yīng)液經(jīng)6％丙烯酰胺凝聚電泳，將相應(yīng)于六聚體產(chǎn)物位置的帶分離出來。在退火溫度56℃和25個(gè)循環(huán)的條件下，用2個(gè)20聚體的寡聚核苷酸PCR擴(kuò)增所述的六聚體。凝膠純化的片段克隆到pBluescriptII KS-的EcoRV位點(diǎn)，測序鑒定后，利用痘苗質(zhì)粒載體pBCBO715中的BamHI/SalI位點(diǎn)將該片段克隆入痘病毒P7.5早期/晚期啟動子之后，得到pSTPT1。TK-重組病毒的構(gòu)建是利用上述的標(biāo)記獲救組合16在pSTPT1和VV-WR-L929間進(jìn)行的。噬菌斑純化的病毒進(jìn)行TK表型檢驗(yàn)，以病毒DNA的Southern印跡分析16檢測適當(dāng)?shù)幕蚪M排列。
為了確定是否每種表位都可以從多表位蛋白中加工而得，用多表位痘病毒感染一組表達(dá)限制每種表位的HLA等位基因的靶細(xì)胞。在標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放檢測中每種表位的特異性自體CTL克隆用作為效應(yīng)細(xì)胞。在所有檢測中，CTL克隆均識別和殺傷與HLA相配的、用多表位痘病毒和適當(dāng)?shù)?見表1)EBNA痘病毒(陽性對照)感染的靶細(xì)胞，但不識別和殺傷TK-痘病毒(陰性對照)感染的靶細(xì)胞(見圖2)。
圖2顯示了在多表位痘病毒構(gòu)建物中表達(dá)的每種表位的CTL識別。效應(yīng)細(xì)胞CTL如表1所列(E∶T＝5∶1)。靶細(xì)胞(見下面)用表達(dá)(i)由CTL克隆識別的EPV核抗原(EBNA)(見表1)(陽性對照)，(ii)TK-(陰性對照)，或(iii)多表位構(gòu)建物(即多表位痘病毒)的重組痘病毒感染。靶細(xì)胞的痘病毒感染以5∶1的感染倍數(shù)進(jìn)行，37℃孵育14-16小時(shí)后用于標(biāo)準(zhǔn)的5小時(shí)51Cr-釋放檢測29。檢測時(shí)不再使用LX1克隆。有兩種EBV類型的靶細(xì)胞，A型和B型，它們的EBNA蛋白序列存在顯著差別。CTL克隆LC13，LC15，CM4，NB26，JSA2和CM9識別用A型EBV而非B型轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，CTL克隆CS31和YW22識別A型EBV和EBV轉(zhuǎn)化的細(xì)胞10，18- 20。用于A型特異性CTL的靶細(xì)胞因此是用B型病毒轉(zhuǎn)化的自身淋巴樣干細(xì)胞細(xì)胞系(B-型LCLs)。用于CS31和YW22的靶細(xì)胞為EBV陰性B細(xì)胞母細(xì)胞，其是用抗CD40抗體和rIL-4確定的。
另一系列的實(shí)驗(yàn)采用了多表位痘病毒體外激發(fā)來自外周血單核細(xì)胞(PBMC)的二次CTL應(yīng)答，該P(yáng)BMC來自健康的EBV血清陽性供體。產(chǎn)生的大量CTL培養(yǎng)物隨后在標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放檢測中用作效應(yīng)細(xì)胞，以對抗肽表位致敏的自身PHA母細(xì)胞。多表位痘病毒能夠激發(fā)CTL應(yīng)答，該應(yīng)答對由每一供體表達(dá)的HLA等位基因所限制的表位有特異性(圖3)。
圖3顯示了多表位痘病毒能夠激發(fā)起表位特異應(yīng)答。用多表位痘病毒以0.01MOI感染外周血單核細(xì)胞(PBMC)2小時(shí)并洗滌兩次后，從供體(A)CM-A24，A11，B7，B44；(B)YW-A2，B8，B38和(C)NB-A2，A24，B7，B35產(chǎn)生了大量效應(yīng)細(xì)胞。在10％FCS/1640 RPMI中培養(yǎng)10天后，這些效應(yīng)細(xì)胞在一標(biāo)準(zhǔn)的5小時(shí)鉻釋放檢測19中用于對抗靶細(xì)胞，該靶細(xì)胞為用所示肽(10μM)致敏的自身植物凝聚素T細(xì)胞母細(xì)胞(E∶T＝20∶1)。另外通過加入受過輻射的自身A型LCLs19(LCL∶PBMC＝1∶50)產(chǎn)生的大量效應(yīng)細(xì)胞所得到的結(jié)果與上述結(jié)果相似。
兩種被單克隆抗體(分別為8G10/4822和8E7/5523)識別的線性B細(xì)胞表位(STNS和NNLVSGPEH)被摻入到多表位構(gòu)建物(圖1)的兩端以跟蹤多表位蛋白的表達(dá)。用這些抗體對多表位痘病毒感染的淋巴樣干細(xì)胞細(xì)胞系(LCLs)和加工缺陷型T2細(xì)胞系6，7進(jìn)行Western印跡分析和免疫熒光抗體染色，沒有檢測到多表位蛋白產(chǎn)物(數(shù)據(jù)未附)。用同樣的P7.5啟動子由痘病毒表達(dá)的重組蛋白通常很容易檢測到24，這示意多表位蛋白在哺乳動物細(xì)胞的胞質(zhì)中很快被降解。這一降解作用不依賴于LMP2和7，因?yàn)門2細(xì)胞系不表達(dá)這些與蛋白體相關(guān)的內(nèi)肽酶6，7。這一現(xiàn)象與其它在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)截短的蛋白或肽的研究結(jié)果25一致，很可能反應(yīng)了這種蛋白不能折疊為二級或三級結(jié)構(gòu)。
構(gòu)建了一個(gè)含人多表位的谷光甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的融合表達(dá)載體。編碼人多表位的DNA序列用BamHI/HincII從pBSpolytope中切下來并克隆人pGex-3x(GST基因融合系統(tǒng)，Pharmacia)的BamHI/AmaI限制性位點(diǎn)中，得到pFuspoly。該質(zhì)粒用于在細(xì)菌中通過標(biāo)準(zhǔn)的誘導(dǎo)方法表達(dá)多表位融合體。該細(xì)菌的一份于上樣緩沖液中裂解并在20％SDSPAGE膠上與分子量標(biāo)準(zhǔn)一起電泳。電泳結(jié)果表明所期望的約為38KD的蛋白(人多表位加上GST結(jié)構(gòu)(26KD))被含該質(zhì)粒的細(xì)菌表達(dá)。用兩種單克隆抗體8G10/48和8E7/55進(jìn)行的Western印跡分析證明所檢測的融合體含人多表位，在多表位構(gòu)建物的每個(gè)末端附加有兩個(gè)線性B細(xì)胞表位(分別為STNS和NNLVSCPEH)。這一蛋白可以組裝入脂質(zhì)體或ISCOMs中。
使用谷光甘肽瓊脂糖珠進(jìn)行的GST純化以純化融合蛋白的嘗試由于在細(xì)菌抽提物上清中缺乏融合蛋白而失敗。所有的融合蛋白都與細(xì)胞碎片共沉淀。由于在不同細(xì)菌培養(yǎng)物中由其自身表達(dá)的GST存在于細(xì)胞抽提物上清中并易于純化，說明純化方法沒有問題。這些數(shù)據(jù)提示除非被隔離到細(xì)菌包涵體中，否則融合蛋白在細(xì)菌中被迅速降解，用GST系統(tǒng)純化融合蛋白是很困難的。實(shí)施例2材料和方法表達(dá)鼠多表位蛋白的重組痘病毒的構(gòu)建為了得到分別對應(yīng)于三種品系小鼠所帶的H-2Db、H-2Kb，H-2Kd，H-2Kk和H-2Ld的兩種表位，選擇了來源于各種疾病的10種I類小鼠CTL表位(見表2)。這些氨基酸序列是如此安排以便使頭5個(gè)表位中的每一個(gè)都受不同的HLA等位基因的限制，緊接著是第二組6-10個(gè)表位。利用通用密碼使用資料將這兩組表位變換為DNA序列。這兩種DNA序列用一個(gè)SpeI位點(diǎn)分開，并在5’端加上一個(gè)XbaI限制性位點(diǎn)，在3’端加上一個(gè)AvrII位點(diǎn)。同時(shí)在5’端還加入一BamHI限制性位點(diǎn)、一Kozac序列13和一甲硫氨酸起始密碼。而在3’端有一個(gè)來自Plamodium falciparum的B細(xì)胞表位，一個(gè)終止密碼和一個(gè)SalI限制性位點(diǎn)，見圖4和5。代表這341bp序列的相互重疊20個(gè)堿基對的5個(gè)75聚體寡核苷酸和一個(gè)76聚體寡核苷酸，通過重疊延伸剪接(SOEing)14和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)剪接在一起。引物二聚體由引物1和2、3和4、5和6(各0.4μg)組成，反應(yīng)在含標(biāo)準(zhǔn)1×Pfu PCR緩沖液，0.2mM dNTPs和1U克隆的Pfu DNA聚合酶(熱起始溫度94℃)的40μl體系中進(jìn)行，使用Perkin Elmer 9600 PCR儀，熱程序如下94℃10秒，42℃20秒和72℃20秒，5個(gè)循環(huán)。5個(gè)循環(huán)結(jié)束后PCR程序暫停于72℃，2號和3號反應(yīng)液以20μl等分混合(1號反應(yīng)液留在PCR儀中)并再進(jìn)行5個(gè)循環(huán)。在第10個(gè)循環(huán)時(shí)程序暫停，20μl1號反應(yīng)液加入2和3號反應(yīng)混合物中，再繼續(xù)進(jìn)行5個(gè)循環(huán)。40μl的混合樣品經(jīng)4％Nusieve瓊脂糖凝膠(FMC)純化，將相應(yīng)于正確大小的片段的膠帶剪下并通過Watmann 3MM濾紙旋轉(zhuǎn)離心回收。采用上述的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合液和50℃的退火溫度，使用2個(gè)20聚體的寡核苷酸經(jīng)25個(gè)循環(huán)PCR擴(kuò)增全長產(chǎn)物。全長PCR片段用4％Nusieve瓊脂糖凝膠純化后，克隆到pBluescript II KS-中的EcoRV位點(diǎn)，得到pBSMP，并測序檢測突變。含正確序列的質(zhì)粒中的DNA插入物用BamHI/SalI限制酶切下，并用相同的酶克隆到穿梭載體質(zhì)粒pBCB0715的痘病毒P7.5早期/晚期啟動子的后面，得到pSTMOUSEPOLY。按前述方法16，通過標(biāo)記獲救重組，用pSTMOUSEPOLY和VV-WR-L929構(gòu)建TK-重組病毒。噬菌斑純化后的病毒用病毒DNA的Souther印跡分析17進(jìn)行TK表型檢測和正確基因組排列檢測。
用重組鼠多表位痘病毒接種小鼠重組痘病毒用于各接種3只Balb/cv，C57BL/6和CBA三種品系小鼠。靜脈注射50μl含5×107pfu的痘病毒后，讓小鼠恢復(fù)3個(gè)星期，本實(shí)驗(yàn)中用TK-痘病毒作為陰性對照注射三種品系的小鼠。
細(xì)胞毒T細(xì)胞檢測從接種3個(gè)星期的小鼠收集脾細(xì)胞，用適當(dāng)?shù)碾?1μg/ml)體外再刺激16。沒有肽的再刺激作為陰性對照。培養(yǎng)7天后，收集再刺激的效應(yīng)細(xì)胞用于5小時(shí)51Cr-釋放檢測。在檢測中用作靶細(xì)胞的是分別來自這三種品系小鼠的被每種品系所帶的肽包被的ConA母細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞之比為50∶1，10∶1和2∶1，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果鼠重組多表位痘病毒的構(gòu)建表2列出了包括在鼠多表位中的表位。
表2 鼠CTL多表位中的CTL表位
多表位DNA插入物的構(gòu)建概括于圖4。圖5表明多表位序列。CTL檢測多表位中每一表位均引起帶有相應(yīng)MHC等位基因的小鼠的初次CTL應(yīng)答。沒有觀察到受相同等位基因限制的兩個(gè)表位間存在競爭。(作為TK-對照的CBA小鼠的高fluNP反應(yīng)很可能是因?yàn)樘烊猾@得了流感病毒)。
含有來自各種病原體的受各種MHC等位基因限制的多CTL表位的多表位構(gòu)建物，顯然能夠激發(fā)對多表位痘病毒中每種表位的初次CTL應(yīng)答。這一點(diǎn)顯然能應(yīng)用于所有需要CTL應(yīng)答作保護(hù)的疫苗中。例如，多HIV CTL表位可以包括在一治療性疫苗中以預(yù)先保護(hù)逃逸突變表達(dá)的表位，從而防治疾病的發(fā)展。鼠多表位小鼠具有能在體外和體內(nèi)殺傷卵清蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系EG7的SIINFEKL特異性CTL體外殺傷EG7腫瘤細(xì)胞的SIINFEKL特異性CTL.
來自用鼠痘病毒致敏的小鼠的脾細(xì)胞于接種4周后收集，并在體外用10μg/mlSIINFEKL再刺激7天。效應(yīng)細(xì)胞不能溶解未轉(zhuǎn)染的親代細(xì)胞系EL4但能溶解EG7腫瘤細(xì)胞和用SIINFEKL致敏的EL4細(xì)胞。鼠多表位提供的體內(nèi)抗EG7腫瘤的保護(hù)作用通過皮下注射，小鼠(C57B6)接受人多表位痘病毒(Thomson等，1995)或鼠多表位痘病毒(107pfu/小鼠/ip)，4周后再接受107EL4或EG7腫瘤細(xì)胞(Moore等，1988，細(xì)胞54，777)(每組10或11只小鼠)這里給出了第9天出現(xiàn)可見腫瘤(所有的腫瘤直徑均大于1cm)的小鼠數(shù)目。
*(有兩只小鼠的腫瘤直徑小于1cm)抗MCMV的保護(hù)作用多表位痘病毒免疫BALB/c小鼠5周后，再用MCMV(K181株，8×103pfu，100μl腹膜內(nèi)注射)攻擊小鼠。攻擊4天后測定每克脾臟的病毒滴度，結(jié)果見圖7(方法參見Scalzo等17)。DNA質(zhì)粒輸送的多表位疫苗的評價(jià)上述多表位蛋白含有一種由單克隆抗體識別的線性抗體表位。然而，如上所述，該多表位蛋白不能在感染了多表位痘病毒的細(xì)胞中檢測到，這表明它很不穩(wěn)定；這很可能是它沒有折疊結(jié)構(gòu)所致。因此考慮采用核酸接種技術(shù)或采用一種防止蛋白水解的佐劑系統(tǒng)(如脂質(zhì)體或ISCOMs)可能是最好的輸送多表位疫苗的方法。
將來自pCIS2.CXXNH(Eaton et al(1986)“生物化學(xué)”25(26)p8343)的CMV啟動子盒，按LacZ基因相同的方向，克隆到pUC8的EcoRI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pDNAVacc(在DNA接種實(shí)驗(yàn)中用作對照質(zhì)粒)。然后在該質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)的XhoI處插入小鼠多表位(來自pBSMP)，得到pSTMPDV。質(zhì)粒pRSVGM/CMVMP帶有許多來源于不同質(zhì)粒的片段。RSV啟動子取自pRSVHygro(Long etal(1991)，人類免疫學(xué)，31，229-235)，鼠GM-CSF基因來自pMPZen(GM-CSF)(Johnson etal(1989)，EMBO，8，441-448)，CMV啟動子盒來自pCS(Kienzie etal(1992)Arch.Virol，124，p123-132)。鼠多表位肽被克隆到CMV盒的多克隆位點(diǎn)中的SmaI處。鼠GM-CSF基因和鼠多表位基因均采用來自SV40的雙向polyA。
9只6周齡的Balb/c系雌鼠分別皮下注射在50μlPBS(見下圖)中的50μg的pDNAVacc(質(zhì)粒對照)，或pSTMPDV(僅有鼠多表位)，或pRSVGM/CMVMP(鼠GM-CSF和鼠多表位)。在第三周用另外50μg的相同質(zhì)粒加強(qiáng)免疫。接種8周后處死這些小鼠并取出脾臟。分離出脾細(xì)胞并將之按上述方法與多肽共培養(yǎng)以用于痘病毒接種動物。然后采用標(biāo)準(zhǔn)51Cr-釋放測試分析這些效應(yīng)細(xì)胞對包被有下述肽的P815細(xì)胞的作用，所述的肽對應(yīng)于鼠多表位中由Balb/c小鼠提呈的表位。測試分別以2∶1，10∶1和50∶1的E∶T比值進(jìn)行6小時(shí)。
這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖8所示。鼠多表位痘病毒誘導(dǎo)的抗肽包被的和病毒感染的靶細(xì)胞的特異性CTL活性方法1、接種與效應(yīng)細(xì)胞的制備用5×107pfu痘病毒腹膜內(nèi)注射(IP)接種小鼠(每組3只)。3周后以同樣的途徑及同樣的痘病毒用量加強(qiáng)免疫小鼠。初次接種6周后取出脾臟，用ACK緩沖液(0.15MNH4Cl，1mM KHCO3，0.1mM Na2EDTA)溶解紅細(xì)胞后，分離脾細(xì)胞(免疫學(xué)新方法，JECoLigan，AM Kruisbeek，DH Margulies，EM Shevach，W Strober編，1994，John Wiley andSans Inc.，USA)。每孔5×106脾細(xì)胞在T細(xì)胞培養(yǎng)液(RPMI/10％胎牛血清(FCS)，2mM谷氨酰胺，5×l0-5M2-巰基乙醇)中用肽(1μg/ml)再刺激7天，然后用51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞17進(jìn)行細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)分析。再刺激所用的肽如上所述為A-J。效應(yīng)細(xì)胞用于抗肽包被的靶細(xì)胞A-J，或病毒感染的靶細(xì)胞(A′-J′)或轉(zhuǎn)染的抗原表達(dá)靶細(xì)胞(I′)。
2、靶細(xì)胞的制備在這些檢測中用作靶細(xì)胞的細(xì)胞系為對應(yīng)于Balb/c(H-2d)的P815，對應(yīng)于C57BL/6(H-2b)的EL-4和EG7，對應(yīng)于CBA(H-2k)L929的L929，或分別來自Balb/c，C57BL/6或CBA小鼠的ConA母細(xì)胞1。為表達(dá)CTL殺傷所需的表位，將靶細(xì)胞與(i)肽(A-J)，(ii)痘病毒(B′-D′，F(xiàn)′-J′)，或(iii)流感病毒(A′，E′)預(yù)孵育，或(iV)在SILNFEKL表位系統(tǒng)的情況下作為El-4(EG7)的卵清蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染子保存(I′)。
(i)肽包被的靶細(xì)胞(A-J)靶細(xì)胞于1000rpm離心5分鐘，傾去上清至細(xì)胞濃度約為200μg/ml，在細(xì)胞沉淀中加入10-20μlRPMI(無肽)或200μg/ml肽RPMI儲存液(肽包被的)(終濃度10μg/ml)。細(xì)胞沉淀中加入100μl51Cr，細(xì)胞于37℃孵育1小時(shí)。然后用RPMI/10％FCS通過一FCS墊洗滌細(xì)胞二次，懸浮細(xì)胞至105/ml，以用作CTL檢測中的靶細(xì)胞。
(ii)痘病毒(Vacc.)感染的靶細(xì)胞(B′-D′，F(xiàn)′-J′)用于感染靶細(xì)胞的痘病毒為鼠多表位(Vacc MuPT)，以人多表位(Vacc HuPT)作陰性對照。痘病毒感染的細(xì)胞系為P815(B′-D′)，L929(F′)和EL-4(G′-J′)。靶細(xì)胞于1000rpm離心5分鐘。傾去上清至大約200μl，加入20μl痘病毒(109pfu/ml)以10∶1的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染細(xì)胞(約106個(gè)細(xì)胞)，于37℃孵育1小時(shí)。再加入5mlRPMI/10％FCS，混勻細(xì)胞并于37℃孵育過夜。隨后離心棄上清，細(xì)胞沉淀中加入100μl51Cr，細(xì)胞于37℃孵育1小時(shí)。通過一FCS墊用RPMI/10％FCS洗滌細(xì)胞兩次，細(xì)胞重懸至105/ml用作CTL檢測中的靶細(xì)胞。
(iii)流感病毒感染的靶細(xì)胞(A′，E′)A/PR/8/34流感病毒株用于感染Balb/c靶細(xì)胞(A′)，A/Taiwan/1/86(IVR-40)病毒株用于感染CBA靶細(xì)胞(E′)。尿囊液用作陰性對照。流感病毒感染的細(xì)胞系為P815(A′)和L929(E′)。于1000rpm/5分鐘離心靶細(xì)胞，棄上清。向細(xì)胞沉淀加入50μl流感病毒(108/mlEID)或尿囊液，50μl51Cr，400μl RPMI/1％FCS，使總體積為500μl，于37℃孵育1小時(shí)。再加入10mlRPMI/10％FCS，繼續(xù)于37℃孵育2小時(shí)。然后通過一FCS墊用RPMI/10％FCS洗滌細(xì)胞兩次，細(xì)胞重懸至105/ml以用作CTL檢測中的靶細(xì)胞。
(iv)表達(dá)卵清蛋白的靶細(xì)胞(I′)EG7細(xì)胞是用含雞卵清蛋白cDNA的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的EL-4細(xì)胞(Moore MW，Carbone FR和Bevan BJ(1988)抗原加工和呈遞的I類途徑中的可溶蛋白的介紹，細(xì)胞54777-785)。這些細(xì)胞保存于RPMI/10％FCS，20mM肝素，2mM谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉，1001U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素中。每月一次在以500μg/mlGeneticin(G-418)中選擇并保持質(zhì)粒。不含肽的EL-4細(xì)胞(EL4 no pep.)用作陰性對照。于1000rpm/5分鐘離心細(xì)胞，上清棄至約200μl。于細(xì)胞沉淀中加入100μl51Cr，細(xì)胞于37℃培養(yǎng)1小時(shí)。通過FCS墊用RPMI/10％FCS洗滌細(xì)胞2次，細(xì)胞重懸至105/ml用作CTL檢測中的靶細(xì)胞。
3.CTL檢測再刺激的脾細(xì)胞(5×106ml)以三份分配(100μl)于三種效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞比(50，10，2×104效應(yīng)細(xì)胞1×104靶細(xì)胞)用于CTL檢測。向所有的效應(yīng)細(xì)胞和對照孔中加入100μl靶細(xì)胞(105/ml)(自發(fā)釋放＝100μl培養(yǎng)液；最大釋放＝100μl 0.5％SDS/RPMI/10％FCS)。微滴板以500rpm離心5分鐘，于37℃孵育6小時(shí)。500rpm/5分鐘再次離心板，取25μl上清計(jì)數(shù)51Cr的釋放。特異性溶解百分率表示三次計(jì)數(shù)的平均值100×(檢測cpm-自發(fā)cpm)/(最大cpm-自發(fā)cpm)。
結(jié)果如圖9所示。DNA接種實(shí)驗(yàn)初次DNA接種實(shí)驗(yàn)說明多表位可用DNA接種輸送。另外通過細(xì)胞因子基因(GM-CSF)的共輸送，接種可以得以改善，盡管在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中這種改善沒有統(tǒng)計(jì)顯著性。
目前的系統(tǒng)顯然不是最優(yōu)化的。有希望的改善可能是使用潛在的更好的質(zhì)粒載體如來自Vical，San Diego的載體(Sedegah M，R Hedstrom，P Hobart，SL Hoffman，1994，用編碼環(huán)子孢子蛋白的質(zhì)粒DNA免疫接種的抗瘧疾保護(hù)作用，美國國家科學(xué)進(jìn)展91，9866-9870)或使用采用基因槍的更好的輸送系統(tǒng)(肌肉注射)(Sun WH，Burkholder JK，Sun J，CulpJ.Lu XG，Pugh TD，Ershler WB，Yang NS.使用基因槍體內(nèi)轉(zhuǎn)送細(xì)胞因子基因減弱小鼠腫瘤生長。美國國家科學(xué)進(jìn)展922889-2893，1995)。另外，CTL表位的活化常常要求CD4 T細(xì)胞的幫助17，因而在構(gòu)建物中包括輔助表位或蛋白可以通過小鼠DNA疫苗多表位提高CTL活化的水平和可靠性。“初始抗原過失”的缺乏或當(dāng)個(gè)體已具有對多表位中的一個(gè)表位的應(yīng)答時(shí)，某一多表位激發(fā)對多表位中所有表位的免疫反應(yīng)能力介紹初始抗原過失(0riginal antigenic sin)是用于一種基于抗體的現(xiàn)象的術(shù)語，指對一個(gè)表位應(yīng)答的現(xiàn)存抗體阻止與第一個(gè)表位處于相同蛋白的第二個(gè)表位的免疫反應(yīng)的發(fā)生(Benjamini E.，Andria M.L.，Estin C.D.，Notron，F(xiàn).L.and Leung C.Y.(1988)，對一種蛋白抗原的一個(gè)表位應(yīng)答的克隆研究。表位識別克隆活化的隨機(jī)性和克隆優(yōu)勢的發(fā)展，免疫學(xué)雜志141，55)。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因是，特異于第一個(gè)表位的活化B細(xì)胞在特異于第二個(gè)抗體的幼稚B細(xì)胞有機(jī)會結(jié)合抗原并將之加工并提呈給T幫助者細(xì)胞之前，就結(jié)合并清除了所有可遇到的抗原。當(dāng)一個(gè)體在已具有對多表位中某一表位的應(yīng)答時(shí)再接受多表位接種，也可能發(fā)生類似的現(xiàn)象。在其它所有表位被提呈給幼稚T細(xì)胞前，已存在的CTL可能殺死了所有表達(dá)多表位的細(xì)胞。方法為了檢測這一可能性，小鼠(Balb/c)被104pfu的鼠巨細(xì)胞病毒(MCMV)(K181株-Scalzo等，1995)感染，5周后，發(fā)生特異于MCMV表位YPHFMPTNL的強(qiáng)CTL應(yīng)答(Scalzo等1995-圖2A)。這些小鼠隨后接種鼠多表位痘病毒，并于10天后檢測脾細(xì)胞對其它三種由該系小鼠多表位攜帶的表位的CTL特異性(RPQASGVYM，淋巴細(xì)胞絨毛膜腦膜炎病毒核蛋白，H-2Ld；TYQRTRALV，流感病毒核蛋白，H-2Kd和SYIPSAEKI，P.Berghei環(huán)子孢子蛋白，H-2Kd)。結(jié)果多表位接種后觀察到對應(yīng)于這三種新表位的各自的應(yīng)答，說明當(dāng)四種表位共存于多表位中時(shí)，YPHFMPTNL特異性CTL不阻止RPQASGVYMTYQRTRALV和SYIPSAEKI特異性CTL的活化(對照動物接受人多表位痘病毒而接受小鼠多表位痘病毒，僅表現(xiàn)出YPHFMPTNL特異性CTL)。
這一系列實(shí)驗(yàn)說明，一種多表位假如設(shè)計(jì)為包括各種不同的疾病，一個(gè)已具有其中某一個(gè)疾病的個(gè)體再接受這種多表位疫苗仍可以對多表位中余下的CTL表位具有免疫能力。
正如本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員所顯而易見的，本發(fā)明人已指出CTL表位的天然旁側(cè)序列不為I類加工所需，也就是說多表位蛋白中的每一個(gè)表位總能通過自身痘病毒感染的靶細(xì)胞有效地被加工和提呈給適當(dāng)?shù)腃TL克隆。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員會明白多表位可以包括非天然存在于表位旁側(cè)的序列。
如上面所討論的，本發(fā)明可以利用一系列表位，一系列的表位可以從Brusic等，核酸研究1994，22；3663-5所給的Internet地址上得到。
本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員應(yīng)理解的是，在不違反前面充分闡述的本發(fā)明的實(shí)質(zhì)或范圍條件下，可對本發(fā)明的實(shí)施方案做大量的改變和/或修改。因而這里所提供的實(shí)施方案應(yīng)看作是舉例說明而非限制性的。參考文獻(xiàn)1、T·埃里奧特，M·史密斯，P·德里斯考爾，A·麥克邁克爾，《流行生物學(xué)》3，854(1993)2、A·L·戈德伯，L·R·肯尼斯，《自然》357，375-379(1992)3、M·T·邁克萊克，E·P·格蘭特，C·格萊姆，A·L·戈德伯，K·L·洛克，《自然》363，552-554(1993)4、J·德里斯考爾，M·G·布朗，D·凡利，J·J·墨納克，《自然》365，262-264(1993)5、M·格克金斯卡，K·L·洛克，A·L·戈德伯，《自然》365，264-267(1993)6、D·阿諾德等人，《自然》360，171-174(1992)7、F·毛姆伯格等人，《自然》360，174-177(1992)8、M·B·A·奧德斯通等人，《病毒學(xué)雜志》67，4372-4378(1993)9、J·L·惠通，N·盛，M·B·A·奧德斯通，T·A·麥克基，《病毒學(xué)雜志》67，348-352(1993)10、R·漢納等人，《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》176，169-176(1992)11、R·P·約翰森，A·特羅查，T·M·布坎南，B·D·沃爾克，《病毒學(xué)雜志》67，438-445(1993)12、J·B·烏爾墨等人，《科學(xué)》259，1745-1748(1993)13、M·科扎克，《細(xì)胞》44，283-292(1986)14、S·N·霍，H·D·亨特，R·M·霍頓，J·K·普倫，L·R·皮斯，《基因》77，51-59(1989)15、M·E·安德魯?shù)热?，《病毒學(xué)雜志》61，1954-1060(1987)16、D·B·博伊爾，B·E·H·庫帕爾，G·W·博斯，《基因》35，169-177(1985)17、A·A·斯卡佐，S·埃里奧特，J·考克斯，J·卡德納，D·J·莫斯，A·祖爾比爾，1994，使用一種九肽和人相容性佐劑(Montanide ISA 720)將保護(hù)性細(xì)胞毒性T細(xì)胞導(dǎo)入鼠巨細(xì)胞病毒，《病毒學(xué)雜志》65，1306-130918、S·R·伯羅斯，S·R·漢納，I·S·密斯科，T·B·斯庫雷，免疫學(xué)研討會，97-104(1992)19、S·R·伯羅斯等人，《普通病毒學(xué)雜志》(已接受)(1994)20、V·萊維斯基等人，《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》176，1297-1305(1994)21、R·漢納，C·A·雅克，S·R·伯羅斯，D·J·莫斯，《免疫學(xué)方法雜志》164，41-49(1993)22、R·J·埃平等人，《分子生物化學(xué)寄生蟲學(xué)》28，1-10(1988)23、U·卡拉等人，《分子生物化學(xué)寄生蟲學(xué)》38，19-24(1990)24、R·漢納等人，《免疫學(xué)》74，504-510(1991)25、L·C·埃森羅爾，D·W·尤德爾，班尼克，《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》175，481-487(1992)
權(quán)利要求
1.一種重組多表位細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞疫苗，該疫苗包括至少一種重組蛋白，所述重組蛋白含有來自一種或多種病原體的多個(gè)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位，其中所述的至少一種重組蛋白基本上不含天然存在于細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位旁側(cè)的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的重組多表位細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞疫苗，其中所述的至少一種重組蛋白不含天然存在于細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位旁側(cè)的序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述的重組多表位細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞疫苗，其中重組蛋白包括至少三種細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的重組多表位細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞疫苗，其中所述的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位來自多種病原體。
5.一種多核苷酸，包括至少一種編碼來自一種或多種病原體的多個(gè)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位的序列，其中所述的至少一種序列基本上不含編碼天然存在于細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位旁側(cè)的肽序列的序列。
6.如權(quán)利要求5所述的多核苷酸，其中所述的至少一種序列不含編碼天然存在于細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位旁側(cè)的肽序列的序列。
7.如權(quán)利要求5或6所述的多核苷酸，其中所述的至少一種序列編碼至少三種細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位。
8.如權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其種所述的至少一種序列編碼來自多種病原體的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位。
9.一種核酸疫苗，該核酸疫苗包括如權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)所述的多核苷酸和一種可接受的載體。
10.一種包括權(quán)利要求5至8中任一項(xiàng)所述的多核苷酸的載體。
11.如權(quán)利要求10所述的載體，其中所述載體選自痘病毒載體、禽痘病毒載體、細(xì)菌載體、病毒樣顆粒(VLP’s)和棒狀病毒載體。
12.一種疫苗配制品，該疫苗配制品包括如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的重組蛋白和可接受的載體和/或佐劑。
13.如權(quán)利要求12所述的疫苗配制品，其中所述的配制品包括ISCOMs。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組多表位細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞疫苗。該疫苗包括至少一種重組蛋白，所述重組蛋白包括來自一種或多種病原體的多個(gè)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位，其中所述的至少一種重組蛋白基本上不含天然存在于細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位旁側(cè)的序列。此外，本發(fā)明還提供了一種多核苷酸，它包括至少一種編碼來自一種或多種病原體的多個(gè)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位的序列。
文檔編號C12N15/86GK1154069SQ95194368
公開日1997年7月9日 申請日期1995年7月27日 優(yōu)先權(quán)日1994年7月27日
發(fā)明者安德烈亞斯·祖爾比爾, 斯科特·安東尼·湯姆森, 拉吉夫·康納, 斯科特·倫頓·伯羅斯, 芭芭拉·伊利莎白·豪伊森·庫帕爾, 丹尼斯·詹姆斯·莫斯 申請人:昆士蘭醫(yī)學(xué)研究所, 聯(lián)邦科學(xué)技術(shù)研究組織, 墨爾本大學(xué)