專利名稱：制備手性α叔羧酸酯的酶促方法
背景技術(shù)：
目前市售的許多農(nóng)業(yè)化學(xué)品和藥品是外消旋或非對映體混合物，許多情況下，只有一種對映體/非對映體具有需要的生理作用，而另一種對映體/非對映體無活性甚至有害或有抑制作用。分離對映體的化學(xué)或酶技術(shù)正成為生產(chǎn)高對映體純度化學(xué)品的越來越重要地工具。
U.S.4,898,822中描述，用具有立體選擇性酯酶活性的酶或微生物水解相應(yīng)外消旋酯，制備有光學(xué)活性的二氫吲哚-2-羧酸。該專利公開的底物是具有如下通式的化合物
其中手性中心用星號標(biāo)出，是α仲碳原子。
U.S.5,202,260和Yee等人，有機(jī)化學(xué)雜志(J.Org.Chem.)(1992)573525-3527公開了用得自解脂假絲酵母的酶部分水解α叔羧酸酯制備有光學(xué)活性的酸及其相應(yīng)的酯。所用的酶完全來自一種酵母，只是將外消旋混合物的S-酯轉(zhuǎn)化成相應(yīng)S-酸而不轉(zhuǎn)化R-酯。
Feichter等人在J.Chem.Soc.Perkin Trans(1991)1653-654中，公開了通過特別是α-糜蛋白酶的作用，立體專一性水解外消旋苯基乳酸甲酯，形成相應(yīng)的R-酸和S-酯。
Peters等人在應(yīng)用微生物學(xué)生物技術(shù)(Appl.Microbiol.Biotechnol.)(1992)38334-340中描述了立體專一性還原酮酸或酮酯生產(chǎn)其相應(yīng)的手性羥基酸或酯。特別地，這些作者顯示近平滑假絲酵母和嗜紅紅球菌(Rhodococcus erythropolis)有立體專一性酮酯還原酶活性，可將外消旋無環(huán)的β-酮酸酯立體專一性地轉(zhuǎn)化成其相應(yīng)的手性羥基酸酯。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供一種用含有完整細(xì)胞或部分或高度純化的酶制劑的生物催化劑接觸α叔羧酸酯對映體混合物，從中富集相應(yīng)酸或酯對映體的方法。對映體酯化合物可用作制備藥物和農(nóng)業(yè)活性化合物的中間體。例如WO92/11249公開了以5-氯-2，3-二氫-2-羥基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯用于制備某些殺節(jié)肢動物的苯胺基甲酰。
本發(fā)明特別提供一種制備對映體富集的羧酸酯的方法，該方法包括將具有式I的酯對映體化合物與一種生物催化劑接觸，
其中R1和R2獨立地選自苯基和C1-C6烷基，它們?nèi)芜x地被鹵素、C1-C3
烷氧基和苯氧基中最多3個取代；條件是R1與R2不同；或
R1，R2和它們所連的碳一起形成如下基團(tuán)
其中
X選自C＝O，O，S和NH；
R3選自O(shè)H和NH2；
R4是C1-C6烷基；和
R5選自鹵素和C1-C3氟烷氧基，
其中手性碳由星號標(biāo)出；
所述生物催化劑選自IM60酯酶(Lipozyme)；手性酶(chirazyme)L-2脂酶；手性酶L-5脂酶；手性酶L-7脂酶；SP524脂酶；SP526脂酶；SP539蛋白酶；酯酶脂酶(Lipolase Lipase)；CR脂酶；霍克氏棒狀桿菌ATCC7005；黃桿菌屬ATCC27551；食油假單胞菌NRRL-B-3429；惡臭假單胞菌ATCC23973；假單胞菌屬NRRL-B-11330；馬紅球菌(Rhodococcus equi)ATCC14887；嗜紅紅球菌ATCC4277；嗜糞紅球菌NRRL-B-16536；rhodnii紅球菌NRRL-B-16535；玫瑰色紅球菌ATCC55602；紅球菌屬NRRL-B-16531；紅球菌屬NRRL-B-16534；灰色鏈霉菌ATCC6855；田野黃單胞菌ATCC21818；季也蒙氏假絲酵母ATCC6260；乳酒假絲酵母ATCC4135；熱帶假絲酵母ATCC46491；深紅酵母ATCC4557；Yarowia lipolytica ATCC9773；洋蔥曲霉ATCC10060；蠶白僵菌ATCC26037；蠶白僵菌ATCC74292；蠶白僵菌ATCC26851；蠶白僵菌ATCC38657；niyea白僵菌ATCC74294；刺孢小克銀漢霉ATCC8688；Lophotrichus martinii ATCC11221；馬昆德氏擬青霉ATCC10525；小孢盤多毛孢ATCC11816；米根霉ATCC10404；米根霉ATCC22580；擲孢酵母屬ATCC20290；同心發(fā)癬菌ATCC74293；蠟狀芽孢桿菌NRRL-B-14591；諾卡氏菌屬NRRL-B-5646；惡臭假單胞菌ATCC17453；釀酒酵母NRRL-Y-2034；八孢裂殖糖酵母NRRL-Y-854；洋蔥曲霉NRRL-315；產(chǎn)黃青霉ATCC10002；點青霉ATCC36740；Amycolatopsis rugosa NRRL-B-2295；馬紅球菌ATCC13556；內(nèi)涂鏈霉菌NRRL-B-2339；白色曲霉ATCC20022；和微孢藻真菌ATCC89821。
申請人發(fā)現(xiàn)某些本發(fā)明優(yōu)選生物催化劑可用于富集兩種特別優(yōu)選的酯對映體混合物的(+)或(-)對映體α-羥基-α-甲基-4-苯氧基苯乙酸乙酯
和5-氯-2，3-二氫-2-羥基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯
本發(fā)明對映體專一性生物轉(zhuǎn)化的假想機(jī)理包括對映體特異性水解α叔酯混合物的一種對映體，產(chǎn)生相應(yīng)羧酸，在酮酸酯對映體混合物情況下，對映體專一性還原酮基，形成相應(yīng)的α叔羥基酸酯。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及一種從含有α-叔羧酸酯的對映體混合物的起始底物中對映體富集α叔羧酸酯的制備方法。
起始化合物是具有α叔碳的如式I所示的酯對映體的混合物，
其中
R1和R2獨立地選自苯基和C1-C6烷基，它們?nèi)芜x地被鹵素、C1-C3烷氧基和苯氧基中最多3個取代；條件是R1與R2不同；或
R1，R2與它們所連的碳一起形成如下基團(tuán)
其中
X是C＝O，O，S和NH；
R3選自O(shè)H和NH2；
R4是C1-C6烷基；和
R5選自鹵素和C1-C3氟烷氧基，
其中手性碳由星號標(biāo)出。
優(yōu)選底物是式I的化合物，其中
R1是任選地被苯氧基取代的苯基；
R2是C1-C3烷基；或
R1，R2和它們所連的碳一起形成基團(tuán)
其中
X是C(=O)
R3是OH；
R4是C1-C3烷基；和
R5是鹵素。
特別優(yōu)選的底物是
α-羥基-α-甲基-4-苯氧基苯乙酸乙酯；和
5-氯-2，3-二氫-2-羥基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯。
本發(fā)明底物可由本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的技術(shù)方便地制備。例如α-羥基-α-甲基-4-苯氧基苯乙酸乙酯可如下制備一個250ml燒瓶配置(fit with)磁力攪拌器、水冷凝器、125ml滴液漏斗、溫度計和氮氣進(jìn)氣口，加2.7(110mmol)金屬鎂，加強力氮氣清洗(strong nitrogenpurge)下用熱槍干燥。冷卻后向漏斗中加17.5ml(24.9g，100mmol)4-溴二苯醚與67ml無水THF，10ml流入燒瓶。攪拌后立即發(fā)生Grignard(格林那)反應(yīng)，余下的溴溶液15分鐘內(nèi)加完，保持內(nèi)部溫度67-68℃，加液完畢，溫度保持68℃ 5分鐘，再開始降溫，45分鐘后到30℃。同時將烘干的250ml燒瓶，磁力攪拌子和125ml滴液漏斗在氮氣下趁熱組裝然后冷卻。然后加入低溫溫度計，燒瓶加11.5ml(12.2g，105mmol)丙酮酸乙酯溶液的66ml無水THF，將格林那試劑溶液用注射器轉(zhuǎn)移到滴液漏斗中。丙酮酸酯溶液冷凍至-10℃，邊充分?jǐn)嚢柽呍?5分鐘內(nèi)加入格林那試劑溶液，冷卻保持內(nèi)部溫度-5至-10℃。將得到的溶液攪拌，加50ml水再加50ml飽和氯化銨水溶液，得到澄清的兩相。分離兩相，將上層相循環(huán)蒸發(fā)除去大部分THF。加入50ml水和二氯甲烷，得澄清兩相。分離兩相，水相用另外25ml二氯甲烷洗，復(fù)合的有機(jī)相用水和鹽水洗，用硫酸鎂干燥，蒸發(fā)剩下23.8g橙黃色油。140℃/0.1-0.2mM Kugelrohr蒸餾60分鐘除去揮發(fā)性雜質(zhì)，剩下17.1g(60％)澄清的橙色油產(chǎn)物。
類似地，5-氯-2，3-二氫-2-羥基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯可按下述方法制備氫化鈉(24g 60％油溶液，0.6mol)用己烷洗去油，得到的NaH懸浮于200ml DMF，用50g(0.3ml)5-氯-1-二氫茚酮和150ml NMF的溶液處理，保持反應(yīng)溫度低于35℃。得到的混合物攪拌30分鐘，再用38ml(0.45mol)二甲基碳酸酯處理15分鐘，得到的混合物室溫下攪拌1.5小時，靜置過夜。將反應(yīng)混合物小心地倒入100ml濃縮HCl和約1000ml冰的混合物中。然后加入500ml醚，用醚兩次萃取水相。復(fù)合有機(jī)層用3份水沖洗，干燥(MgSO4)濃縮，得64.6g褐色油。5.0g(0.022mol)上述產(chǎn)物和70mL二氯甲烷的溶液在室溫下用10g(約0.032mol)的50-60％間氯過苯甲酸(Aldrich)處理。1小時后，反應(yīng)冷卻至0℃，小心加入飽和碳酸鈉水溶液驟冷。該層用飽和碳酸鈉水溶液洗兩次，用飽和亞硫酸氫鈉洗一次，干燥(MgSO4)濃縮，得到4.0g黃色固體。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所公開的酶和生物材料的生物催化作用將不需要的對映體轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物并方便地與未受影響的對映體分離。在本發(fā)明公開中，通過對1)回收度2)所需產(chǎn)物的對映體純度定量化，來測定本制備方法的效率?；厥斩仁巧锎呋幚砗笫Ｏ碌钠鹗嫉孜锇俜直?。所需產(chǎn)物的對映體純度通過計算生物催化處理后回收的底物中所需對映體比不需要的對映體多的量來確定，用下列方程之一從每種對映體濃度計算該對映體過量(％e.e.)
(+)形式的％e.e.＝([(+)]－[(-)])/([(+)]＋[(-)])×100
(-)形式的％e.e.＝([(-)]－[(+)])/([(-)]＋[(+)])×100
其中[(+)]和[(-)]分別是(+)和(-)形式的濃度。盡管并非本方法必不可少的方面，若需要還是可以用本領(lǐng)域已知的幾種方法從生物催化反應(yīng)混合物中分離對映體富集的酯產(chǎn)物(定義為≥50％e.e.)。
對于本發(fā)明目的，所公開的方法中作為底物的對映體混合物是％e.e.小于50的對映體酯的混合物，這當(dāng)然包括兩種對映體等量存在的消旋混合物，以及其中一種對映體比其互補的對映體多，但對映體過量小于50％的光學(xué)活性混合物。每種情況下本發(fā)明方法的結(jié)果均是制備了對映體富集的羧酸酯，其中得到的所需對映體的％e.e.至少為50。
對于本發(fā)明公開，申請人所用術(shù)語的含義如下
術(shù)語“對映體富集的”指得到的所需對映體的％e.e.至少為50。
術(shù)語“生物催化劑”包括完整細(xì)菌，酵母或真菌細(xì)胞或細(xì)胞提取物或產(chǎn)物的酶活性，或來自細(xì)菌，酵母，真菌或哺乳動物細(xì)胞的純化或部分純化形式的酶活性，它酶促催化本發(fā)明的反應(yīng)過程。
優(yōu)選的生物催化劑得到的對映體過量大于50％(表示所需對映體是另一對映體的3倍過量)。更優(yōu)選的是富集大于約90％，更為優(yōu)選的是富集大于約95％，最優(yōu)選的是富集大于約99％。
實驗過程中，發(fā)明人評價了多于四百種潛在的生物催化劑源，令人吃驚的是，此處公開的生物催化劑源具有發(fā)明人需要的活性。因此本發(fā)明的特征在于能進(jìn)行對映體專一性反應(yīng)的生物催化劑(微生物或其突變株，或酶)。優(yōu)選的生物催化劑選自下列微生物霍克氏棒狀桿菌ATCC7005；黃桿菌屬ATCC27551；食油假單胞菌NRRL-B-3429；惡臭假單胞菌ATCC23973；假單胞菌屬NRRL-B-11330；馬紅球菌ATCC14887；嗜紅紅球菌ATCC4277；嗜糞紅球菌NRRL-B-16536；rhodnii紅球菌NRRL-B-16535；玫瑰色紅球菌ATCC55602；紅球菌屬NRRL-B-16531；紅球菌屬NRRL-B-16534；灰色鏈霉菌ATCC6855；田野黃單胞菌ATCC21818；季也蒙氏假絲酵母ATCC6260；乳酒假絲酵母ATCC4135；熱帶假絲酵母ATCC46491；深紅酵母ATCC4557；Yarowialipolytica ATCC9773；洋蔥曲霉ATCC10060；蠶白僵菌ATCC26037；蠶白僵菌ATCC74292；蠶白僵菌ATCC26851；蠶白僵菌ATCC38657；nivea白僵菌ATCC74294；刺孢小克銀漢霉ATCC8688；Lophotrichus martiniiATCC11221；馬昆德氏擬青霉ATCC10525；小孢盤多毛孢ATCC11816；米根霉ATCC10404；米根霉ATCC22580；擲孢酵母屬ATCC20290；同心發(fā)癬菌ATCC74293；蠟狀芽孢桿菌NRRL-B-14591；諾卡氏菌屬NRRL-B-5646；惡臭假單胞菌ATCC17453；釀酒酵母NRRL-Y-2034；八孢裂殖糖酵母NRRL-Y-854；洋蔥曲霉NRRL-315；產(chǎn)黃青霉ATCC10002；點青霉ATCC36740；Amycolatopsis rugosa NRRL-B-2295；馬紅球菌ATCC13556；內(nèi)涂鏈霉菌NRRL-B-2339；白色曲霉ATCC20022；和微孢藻真菌ATCC89821。生物材料包括能完成本發(fā)明方法的對映體專一性酶，它們可以被分離出來或生物合成并被使用，但通常直接應(yīng)用合適的微生物更為便捷。
下列來源的水解酶純化制劑也是優(yōu)選的α-糜蛋白酶(牛胰制；Sigma化學(xué)品公司)；β-糜蛋白酶(牛胰制；Sigma化學(xué)品公司)；γ-糜蛋白酶(牛胰制；Sigma化學(xué)品公司)；δ-糜蛋白酶(牛胰制；Sigma化學(xué)品公司)；IM60酯酶(諾和諾德公司)；手性酶L-2脂酶(寶靈曼公司)；手性酶L-5脂酶〔寶靈曼公司)；手性酶L-7脂酶(寶靈曼公司)；SP524脂酶(諾和諾德公司)；SP526脂酶(諾和諾德公司)；SP539蛋白酶(諾和諾德公司)；酯酶脂酶(諾和諾德公司)；和CR脂酶(Altus Biologics公司)。
最優(yōu)選的生物催化劑來自下列微生物玫瑰色紅球菌ATCC55602；同心發(fā)癬菌ATCC74293；蠶白僵菌ATCC74292；和nivea白僵菌ATCC74294。
在這個從α叔羧酸酯對映體混合物中富集(+)或(-)對映體的方法中，可方便地用適于生產(chǎn)對映體專一性酶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，得到一種或多種對映體專一性酶，其作用即實現(xiàn)生物催化。選擇性地加入這樣得到的微生物，使其作用于(+)或(-)α叔羧酸酯，從而富集余下的(+)或(-)羧酸酯。用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的從酸中分離羧酸酯，從羥基酸酯中分離酮酸酯和分離每種對映體的方法，把所需產(chǎn)物(富集的羧酸酯)從不需要的產(chǎn)物((+)或(-)羧酸酯，或(+)或(-)羥基酸酯)中分離出來。顯而易見地，發(fā)明人認(rèn)識到本發(fā)明的方法也可同樣好地被描述為通過選擇性地生物催化α叔羧酸酯對映體混合物，對映體專一性富集(+)或(-)α叔羧酸酯或(+)或(-)羥基酸酯的過程。
本發(fā)明的生物催化劑包括來自或位于細(xì)菌酵母，真菌和哺乳動物細(xì)胞的生物材料。幾種生物催化劑已按照布達(dá)佩斯協(xié)議要求保藏到ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，12301，Parklawn Drive，洛克維爾，馬里蘭州20852)，保藏號如下
生物催化劑 保藏號
玫瑰色紅球菌 ATCC55602
同心發(fā)癬菌ATCC74293
蠶白僵菌 ATCC74292
nivea白僵菌 ATCC74294
本文用到下列縮寫
MCIC5-氯-2，3-二氫-2-羥基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯
EHPAα-羥基-α-甲基-4-苯氧基苯乙酸乙酯
HPLC高效液相色譜
DMF二甲基甲酰胺
ACN乙腈
e.e.對映體過量
SMSabouraud麥芽糖肉湯
SBG大豆甘油
NB營養(yǎng)肉湯
PD馬鈴薯右旋糖肉湯
為確定生物催化活性，用標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)技術(shù)將一小份冰凍或凍干的受試生物體原種接種到25ml適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基中。本發(fā)明公開的生物體生長培養(yǎng)基選自
SM(Sabouraud麥芽糖肉湯；BBL公司，Cockeysville，MD)
PD(馬鈴薯右旋糖肉湯；Difco實驗室公司，底特律，密歇根州)
NB(營養(yǎng)肉湯；Difco實驗室公司，底特律，密歇根州)
SBG(大豆甘油)(pH7.0) 克/升
甘油 20.0
酵母提取物 5.0
大豆粉 5.0
氯化鈉 5.0
磷酸鉀(二堿價) 5.0
每種公開的微生物的生長培養(yǎng)基由表1-6給出。種子培養(yǎng)物在28-30℃生長72小時，連續(xù)振蕩(250rpm；I期生長)。該起始培養(yǎng)物的10-20％被轉(zhuǎn)移入新鮮培養(yǎng)基(25ml)，繼續(xù)溫育24小時(II期生長)。收獲細(xì)胞再懸浮于合適的緩沖液(pH4.5-8.5)中，生物催化劑終濃度為約10-250mg催化劑(干重)每mL緩沖液，底物終濃度為約2-200mM。繼續(xù)溫育25-50℃4-72小時連續(xù)振蕩(250rpm)實現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化。反應(yīng)物然后被酸化，用二氯甲烷提取。CH2Cl2揮發(fā)后，殘余物再懸浮于ACN中。用反相HPLC確定ACN溶液中底物回收百分比，用手性HPLC確定對映體純度。
分析方法
用反相HPLC測量α叔羧酸酯和水解產(chǎn)物。用紫外吸收檢測。對MCIC用ZorbaxRX-C8柱(4.6×250mM)，流動相為40％乙腈和60％H2O+0.1％三乙胺(pH調(diào)至6.5)。對EHPA用ZorbaxC18柱(4.6×250mM)流動相為50％乙腈和50％用0.1％H3PO4酸化的水。通過與真正(authentic)標(biāo)準(zhǔn)比較來進(jìn)行酯的色譜確定和定量。
用于分離對映體的手性HPLC用得自Chromatech(瑞典)的α酸性糖蛋白柱進(jìn)行。分離酯對映體用的流動相總結(jié)如下
對映體 流動相
MCIC 98％0.01M磷酸緩沖液(pH4.8)2％乙醇
EHPA 91％H2O＋0.1％三乙胺(pH6.0)9％乙腈
分離對映體的手性HPLC用得自Chromatech(瑞典)的α-酸性糖蛋白柱進(jìn)行。分離酯對映體用的流動相總結(jié)如下。
時映體流動相
MCIC 98％0.01μ磷酸緩沖液(pH4.8)2％乙醇
EHPA 91％H2O＋0.1％三乙基胺(pH6.0)9％乙腈
實施例10中分離EHPA對映體用的手性HPLC用得自J.T.Baker的Bakerbond手性O(shè)D柱進(jìn)行。用來分離EHPA對映體的流動相是90％己烷10％丙醇。
通過與對映體或消旋混合物的真實標(biāo)準(zhǔn)相比較進(jìn)確定上述酯的對映體組成，濃度和色譜鑒定。
實施例1
對于表1列出的微生物株，離心收集II期生長的細(xì)胞，再懸浮于5m150mM磷酸鹽緩沖液pH6.0(50-100mg濕重細(xì)胞/mL緩沖液)。然后加入溶于50μL DMF的10μmol消旋MCIC。30℃溫育24小時后終止反應(yīng)(2mM生物轉(zhuǎn)化)或再加10μmol溶于50μl DMF的消旋MCIC繼續(xù)溫育24小時(4mM生物轉(zhuǎn)化)用3M H2SO4酸化至pH3終止2mM和4mM MCIC生物轉(zhuǎn)化。每個樣品加2體積的二氯甲烷，攪動懸浮液15分鐘。移去二氯甲烷層，在氮氣流下蒸發(fā)干，殘渣再懸浮于10ml乙腈中。分別用反相HPLC和手性HPLC確定MCIC回收百分比和(+)-MCICe.e，結(jié)果由表1給出。
實施例2
10mg每種糜蛋白酶樣品(表1)加入2mL 50mM磷酸鹽緩沖液pH6.0，然后加入4μmol溶于20μL DMF的消旋MCIC。相似地；把20mg手性酶L-7脂酶樣品加入50mM磷酸鹽緩沖液pH6.0，再加入40μmol溶于20μL DMF的消旋MCIC。30℃(糜蛋白酶)或25℃(L-7)溫育24小時后，按實施例1的萃取和分析過程，確定MCIC回收百分比和(+)-MCIC e.e.結(jié)果由表1給出。表1(+)-甲基5-氯-2，3-二氫-2-羥基-1-氧代-1H-茚并-2-羧酸的對映體富集
底物
株菌 生長溫育時間 加入
培養(yǎng)基(小時)mM數(shù) 回收％ ％e.e.霍克氏棒狀桿菌ATCC7005 SM4845350黃桿菌屬ATCC27551 SM4844752食油假單細(xì)菌NRRL-B-3429SBG 24219100惡臭假單細(xì)菌ATCC23973 NB2424960假單細(xì)胞菌屬NRL-B-11330SBG 4841464馬紅球菌ATCC14887 NB4842980嗜紅紅球菌ATCC4277 SBG 4842182嗜糞紅球菌NRRL-B-16535 SBG 48433100rhodnii紅球菌NRRL-B-16535 SBG 48415100玫瑰色紅球菌ATCC55602 SBG 4843598紅球菌屬NRRL-B-16534 SBG 4841466灰色鏈霉菌ATCC6855 SBG 4843366田野黃單胞菌ATCC21818 SBG 48436100深紅酵母ATCC4557 SBG 4843786蠶白僵菌ATCC74292 PD4844192蠶白僵菌ATCC26851 PD48431100刺孢小克銀漢霉ATCC8688 PD2423650馬昆德氏擬青霉ATCC10525SM4845260小孢盤多毛孢ATCC11816 PD4842050米根霉ATCC10404PD48449100米根霉ATCC22580PD48448100同心發(fā)癬菌ATCC74293PD4842092α-糜蛋白酶(Sigma) NAa 24246100β-糜蛋白酶(Sigma) NA24245100γ-糜蛋白酶(Sigma) NA24260100δ-糜蛋白酶(Sigma) NA2430 6072手性酶L-7脂酶(寶靈曼公司) NA2420 3480aNA-不可應(yīng)用
實施例3
對于表2列出的微生物株，離心收集II期生長的細(xì)胞，再懸浮于5ml50mM磷酸鹽緩沖液pH6.0(50-100mg濕重細(xì)胞/μL緩沖液)。與實施例1相同方式加入10μmol消旋MCIC。相同地溫育(4mM生物轉(zhuǎn)化)后，如實施例1用萃取和分析方法確定MCIC回收百分比和(-)-MCICe.e.。結(jié)果由表2給出。
實施例4
5mg手性L-2脂酶，10mg SP524脂酶，SP526脂酶，SP539蛋白酶或20mg手性酶L-5脂酶(表2)加入2ml 50mM磷酸緩沖液pH6.0。然后加入40μmol溶于20μL DMF的消旋MCIC(對SP526為20μmol)。25℃溫育24小時后，按與實施例1相同的萃取與分析方法確定MCIC回收百分比與(-)-MCIC e.e。結(jié)果由表2給出。
表2(-)-5-氯-2，3-二氫-2-羥基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的對映體富集
底物
株菌 生長 溫育時間 加入
培養(yǎng)基 (小時)mM數(shù) 回收％％ e.e.季也蒙式假絲酵母ATCC6260 SM 484 33 100乳酒假絲酵母ATCC4135 SM 481 NDa50熱帶假絲酵母ATCC46491 SM 484 29 76yarrowia lipolyticaATCC9773SM 484 32 50洋蔥曲霉ATCC10060 SM 481 ND 100nivea白僵菌ATCC74290 PD 484 38 86Lophotrichus martiniiATCC11221 PD 484 36 100擲孢酵母屬ATCC20290PD 484 45 100SP524脂酶(諾和諾德公司)NAb 2420 16 66SP526脂酶(諾和諾德公司)NA 2410 22 85SP539蛋白酶(諾和諾德公司) NA 2420 40 68手性酶L-2脂酶(寶靈曼公司) NA 2420 13 100手性酶L-5脂酶(寶靈曼公司) NA 2420 14 80aND-未確定bNA-不能應(yīng)用
實施例5
對表3列出的微生物株，每一24小時II期培養(yǎng)物中加入溶于10μlDMF的42μmol消旋MCIC。(25ml SBG培養(yǎng)基)。加入MCIC后，27℃溫育8小時或29小時后從肉湯中移出4ml。每個樣品加1ml乙酸乙酯，將懸浮液振蕩10秒。從每個樣品移出0.2ml乙酸乙酯層，氮氣流下蒸發(fā)干，殘余物再懸浮于3ml乙腈中，用反相HPLC和手性HPLC分別測定MCIC回收百分比和(-)-MCIC e.e.。結(jié)果由表3給出。
表3(-)-5-氯-2，3-二氫-2-羥基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯
底物
株菌生 長溫育時間 加 入
培養(yǎng)基 (小時)mM數(shù) 回收％ ％e.e蠟狀芽孢桿菌NRRL-B-14591 SBG 29 1.727 48諾卡菌屬NRRL-B-5646 SBG 29 1.712 60惡臭假單胞菌ATCC17453SBG 29 1.719 46釀酒酵母NRRL-Y-2034 SBG 29 1.735 78八孢裂殖糖酵母NRRL-Y-854 SBG 8 1.730 98洋蔥曲霉NRRL-315 SBG 29 1.712 64產(chǎn)黃青霉ATCC10002SBG 8 1.738 50點青霉ATCC36740 SBG 29 1.719 46
實施例6
對表4中檢測的微生物株，離心收集II期生長的細(xì)胞，再懸浮于5ml 50mM磷酸緩沖液pH6.0(50-100mg濕重細(xì)胞/mL緩沖液)。然后加入溶于50μL DMF的10μmol消旋EHPA。30℃溫育24小時后終止反應(yīng)(2mM生物轉(zhuǎn)化)或再加10μmol溶于50μL DMF的消旋EHPA繼續(xù)溫育24小時(4mM生物轉(zhuǎn)化)。用3M H2SO4酸化至pH3終止2mM和4mM EHPA生物轉(zhuǎn)化。每個樣品加2倍體積的二氯甲烷，攪動懸浮液15分鐘，移去二氯甲烷層，在氮氣流下蒸發(fā)干，殘余物再懸浮于10mL乙腈中。分別用反相HPLC和手性HPLC確定EHPA回收百分比和(+)-EHPAe.e.。結(jié)果由表4給出。
實施例7
20mg IM60酯酶，SP524脂酶，SP526脂酶或1mL酯酶脂酶樣品加入2ml 50mM磷酸緩沖液pH6.0(對酯酶為1mL)。然后加入20μmol溶于20μL DMF的EHPA。30℃溫育48小時(IM60酯酶)或25℃溫育24小時(SP 525，SP 526，酯酶)后，用3M H2SO4酸化至pH3終止反應(yīng)。按實施例6的萃取和分析過程確定EHPA百分比和(+)-EHPAe.e.結(jié)果由表4給出。
表4(+)-α-羥基-α-甲基-4-苯氧基苯乙酸乙酯的
對映體富集
底物
菌株生 長 溫育時間 加 入
培養(yǎng)基 (小時) mM數(shù) 回收％ ％e.e假單胞菌屬NRRL-B-11330SBG 24 2 52 86馬紅球菌ATCC13556 SBG 24 2 40 88熱帶假絲酵母ATCC46491 SM24 2 87 42白色曲霉ATCC20022 SM24 2 48 24蠶白僵菌ATCC26851 PD24 2 43 90蠶白僵菌ATCC38657 PD24 2 28 100微孢藻真菌ATCC89821 PD48 4 44 40同心發(fā)癬菌ATCC74293 PD48 4 39 100IM60脂酶(諾和諾德)NAa 48 1047 84SP524脂酶(諾和諾德) NA24 1010 60SP526脂酶(諾和諾德) NA24 1036 51Lipolase Lipase(諾和諾德) NA24 1022 50aNA-不能應(yīng)用
實施例8
對表5列出的兩個微生物株，離心收集II期生長的細(xì)胞，再懸浮于5ml 50mM磷酸鹽緩沖液pH6.0(50-100mg濕重細(xì)胞/mL緩沖液)。以與實施例5相同方式加入10μmol消旋EHPA。同樣地溫育(2mM生物轉(zhuǎn)化)后，如實施例5的萃取和分析過程確定EHPA回收百分比和(-)-EHPA e.e.結(jié)果由表5給出
表5(-)-乙基α-羥基-α-甲基-4-苯氧基苯乙酸乙酯
對映體富集
底物
菌株生長 溫育時間 加 入回收 ％
培養(yǎng)基 (小時) mM數(shù) ％ e.e.Amycolatopsis rugosa NRRL-B-2295 SM 24 23850內(nèi)涂鏈霉菌NRRL-B-2339SBG24 21282
實施例9
對表6列出的微生物株，離心收集II期生長的細(xì)胞-80℃凍存，化凍后再懸浮于2ml 50mM磷酸鹽緩沖液pH6.0(150-300mg濕重細(xì)胞/ml緩沖液)。細(xì)胞懸液加入含有100μmol 50％e.e.(+)-MCIC的反應(yīng)小試管中。30℃溫育24小時后，用3M H2SO4酸化至pH3終止反應(yīng)。每個樣品加5倍體積的二氯甲烷，懸浮液振蕩15分鐘。移去各二氯甲烷層的一半，在氮氣流下蒸發(fā)干，殘物再懸浮于10mL乙腈。分別用反相HPLC和手性HPLC確定MCIC回收百分比與(+)-MCIC e.e.。結(jié)果由表6給出。
表6 50％e.e.(+)-5-氯-2，3-二氫-2-羥基-1-氯-1H-茚-2-羧酸甲酯的對映體富集
菌株 生 長 細(xì)胞濃度 溫育時間 加 入回收 ％
培養(yǎng)基 (g/mL) (小時) mM數(shù) ％ e.e紅球菌屬NRRL-B-16531 SBG 0.30 245067 82紅球菌屬NRRL-B-16534 SBG 0.30 245082 82玫瑰色紅球菌ATCC55602SBG 0.30 245067 86同心發(fā)癬菌ATCC74293 PD 0.16 245077 76蠶白僵菌ATCC26037PD 0.29 245082 76無細(xì)胞 - - 2450100 50
實施例10
10mg CR酯酶(Altus生物公司，坎布里奇，麻省)加入2mL 50mM磷酸鹽緩沖液pH6.0中。然后加入溶于20μmol DMF的10μmol消旋EHPA。30℃溫育24小時后，用3M H2SO4酸化至pH3終止反應(yīng)。每個樣品加5倍體積的二氯甲烷，懸浮液振蕩15分鐘。移去各亞甲基氯層的一半，在氮氣流下蒸發(fā)干，殘渣再懸浮于10mL乙腈。分別用反相HPLC和手性HPLC確定EHPA回收百分比和(+)-EHPA。結(jié)果由表7給出。
表7(+)- α-羥基-α-甲基-4-苯氧基苯乙酸乙酯
對映體富集
底物
酶 溫育時間 加入mM數(shù) 回收％％e.eCR脂酶(Altus Biologics)24 5 3890
權(quán)利要求
1.一種對映體富集的羧酸酯的制備方法，它包括將式I的酯的對映體混合物與一種生物催化劑接觸，
其中
R1和R2獨立地選自苯基和C1-C6烷基，它們?nèi)芜x地被鹵素、C1-C3烷氧基和苯氧基中最多3個取代；條件是R1與R2不同；或
R1，R2和它們所連的碳原子一起形成如下基團(tuán)
其中
X選自C＝O，O，S和NH；
R3選自O(shè)H和NH2；
R4是C1-C6烷基；和
R5選自鹵素和C1-C3氟烷氧基，
其中手性碳由星號標(biāo)出；
所述生物催化劑選自IM60酯酶；手性酶L-2脂酶；手性酶L-5脂酶；手性酶L-7脂酶；SP524脂酶；SP526脂酶；SP539蛋白酶；酯酶脂酶；CR脂酶；霍克氏棒狀桿菌ATCC7005；黃桿菌屬ATCC27551；食油假單胞菌NRRL-B-3429；惡臭假單胞菌ATCC23973；假單胞菌屬NRRL-B-11330；馬紅球菌ATCC14887；嗜紅紅球菌ATCC4277；嗜糞紅球菌NRRL-B-16536；rhodnii紅球菌NRRL-B-16535；玫瑰色紅球菌ATCC55602；紅球菌屬NRRL-B-16531；紅球菌屬NRRL-B-16534；灰色鏈霉菌ATCC6855；田野黃單胞菌ATCC21818；季也蒙氏假絲酵母ATCC6260；乳酒假絲酵母ATCC4135；熱帶假絲酵母ATCC46491；深紅酵母ATCC4557；Yarowia lipolytica ATCC9773；洋蔥曲霉ATCC10060；蠶白僵菌ATCC26037；蠶白僵菌ATCC74292；蠶白僵菌ATCC26851；蠶白僵菌ATCC38657；nivea白僵菌ATCC74294；刺孢小克銀漢霉ATCC8688；Lophotrichus martinii ATCC11221；馬昆德氏擬青霉ATCC10525；小孢盤多毛孢ATCC11816；米根霉ATCC10404；米根霉ATCC22580；擲孢酵母屬ATCC20290；同心發(fā)癬菌ATCC74293；蠟狀芽孢桿菌NRRL-B-14591；諾卡氏菌屬NRRL-B-5646；惡臭假單胞菌ATCC17453；釀酒酵母NRRL-Y-2034；八孢裂殖糖酵母NRRL-Y-854；洋蔥曲霉NRRL-315；產(chǎn)黃青霉ATCC10002；點青霉ATCC36740；Amycolatopsis rugosa NRRL-B-2295；馬紅球菌ATCC13556；內(nèi)涂鏈霉菌NRRL-B-2339；白色曲霉ATCC20022；和微孢藻真菌ATCC89821。
2權(quán)利要求1的方法，其中式I中，
R1是任選地被苯氧基取代的苯基；
R2是C1-C3烷基；或
R1，R2和它們所連的碳一起形成如下基團(tuán)
其中
X是C(＝O)；
R3是OH；
R4是C1-C3烷基；和
R5是鹵素。
3.權(quán)利要求2的方法，其中式1的對映體酯混合物中的酯是5-氯-2，3-二氫-2-羥基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，其中對映體富集的羧酸酯是(+)對映體，其中生物催化劑選自霍克氏棒狀桿菌ATCC7005；黃桿菌屬ATCC 27551；食油假單胞菌NRRL-B-3429；惡臭假單胞菌ATCC 23973；假單胞菌屬NRRL-B-11330；馬紅球菌ATCC14887；嗜紅紅球菌ATCC 4277；嗜糞紅球菌NRRL-B-16536；rhodnii紅球菌NRRL-B-16535；玫瑰色紅球菌ATCC 55602；紅球菌屬NRRL-B-16531；紅球菌屬NRRL-B-16534；灰色鏈霉菌ATCC6855；田野黃單胞菌ATCC 21818；深紅酵母ATCC 4557，蠶白僵菌26037；蠶白僵菌ATCC 74292；蠶白僵菌ATCC 26851；刺孢小克銀漢霉ATCC8688；馬昆德氏擬青霉ATCC10525；小孢盤多毛孢ATCC 11816；米根霉ATCC 10404；米根霉ATCC 22580；同心發(fā)癬菌ATCC 74293；手性酶L-7脂酶。
4.權(quán)利要求2的方法，其中式I的對映體酯混合物是5-氯-2，3-二氫-2-羥基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯且對映體富集的羧酸酯是(-)對映體，其中生物催化劑選自季也蒙氏假絲酵母ATCC 6260；乳酒假絲酵母ATCC 4135；熱帶假絲酵母ATCC 46491；Yarrowialipolytica ATCC 9773；洋蔥曲霉ATCC 10060；nivea白僵菌ATCC74294；Lophotrichus martinii ATCC 11221；擲孢酵母屬ATCC 20290；蠟狀芽孢桿菌NRRL-B-14591；諾卡氏菌屬NRRL-B-5646；惡臭假單胞菌ATCC 17453；釀酒酵母NRRL-Y-2034；八孢裂殖糖酵母NRRL-Y-854；洋蔥曲霉NRRL-315；產(chǎn)黃青霉ATCC 10002；點青霉ATCC 36740；SP524脂酶；SP526脂酶；SP539蛋白酶；手性酶L-2脂酶和手性酶L-5脂酶。
5.權(quán)利要求2的方法，其中式I的對映體酯混合物是α-羥基-α-甲基-4-苯氧基苯乙酸乙酯，其中對映體富集的羧酸酯是(+)對映體，其中生物催化劑選自假單胞菌屬NRRL-B-11330，馬紅球菌ATCC 13556，熱帶假絲酵母ATCC 46491，白色曲霉ATCC 20022，蠶白僵菌ATCC 26851，蠶白僵菌ATCC 38657，微孢藻真菌ATCC 89821，同心發(fā)癬菌ATCC 74293，IM60酯酶，SP524脂酶，SF526脂酶，酯酶脂酶和CR脂酶。
6.權(quán)利要求2的方法，其中式I的對映體酯混合物是α-羥基-α-甲基-4-苯氧基苯乙酸乙酯，其中對映體富集的羧酸酯是(-)對映體，其中生物催化劑選自Amycolatopsis rugosa NRRL-B-2295和內(nèi)涂鏈霉菌NRRL-B-2339。
7.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括從生物催化反應(yīng)混合物中分離出對映體富集的羧酸酯的步驟。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述分離是用萃取或相分離實現(xiàn)的。
9.一種制備對映體富集的羧酸酯的方法，它包括將5-氯-2，3-二氫-2-羥基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的對映體酯混合物接觸生物催化劑，其中對映體富集的羧酸酯是(+)對映體，其中生物催化劑選自α-糜蛋白酶，β-糜蛋白酶，γ-糜蛋白酶和δ-糜蛋白酶。
10.權(quán)利要求9的方法，其進(jìn)一步包括從生物催化反應(yīng)混合物中分離出對映體富集的羧酸酯的步驟。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述分離是用萃取或相分離實現(xiàn)的。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用含有微生物細(xì)胞或部分或高度純化的酶制劑的生物催化劑從α叔羧酸酯混合物中富集相應(yīng)酯的對映體的方法。對映體酯產(chǎn)物可用作制備藥物和農(nóng)業(yè)活性化合物的中間體。
文檔編號C12R1/645GK1160421SQ9519559
公開日1997年9月24日 申請日期1995年10月4日 優(yōu)先權(quán)日1994年10月12日
發(fā)明者F·S·沙利斯蘭尼, B·斯蒂格利茨, V·G·維特豪特 申請人:納幕爾杜邦公司