專利名稱：用于微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室日常診斷中迅速檢測(cè)和鑒別臨床樣品中普通細(xì)菌病原體和抗生素抗 ...的制作方法
背景技術(shù)：
細(xì)菌的經(jīng)典鑒別細(xì)菌的經(jīng)典鑒別是通過(guò)使用生物化學(xué)方法(如API20ETM系統(tǒng))測(cè)定它們利用不同的底物作為碳源和氮源的能力來(lái)鑒別的。革蘭氏陰性桿菌的敏感性試驗(yàn)發(fā)展到微稀釋試驗(yàn)。盡管API和微稀釋系統(tǒng)費(fèi)用可行，但由于必須進(jìn)行連續(xù)兩個(gè)過(guò)夜培養(yǎng)以從樣品中分離和鑒別細(xì)菌，獲得初步的結(jié)果至少需要兩天。也開發(fā)了一些使用先進(jìn)和昂貴儀器的更快速的檢測(cè)方法。例如，最快的鑒別系統(tǒng)(autoSCAN-Walk-AwayTM系統(tǒng))在2小時(shí)內(nèi)可從分離的細(xì)菌菌落中鑒別出革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，而且僅僅7小時(shí)內(nèi)就能鑒別出對(duì)抗生素的敏感方式。然而，這個(gè)系統(tǒng)的出錯(cuò)幅度使人無(wú)法接受，尤其是鑒別非腸桿菌科的細(xì)菌物種時(shí)(York等，1992，臨床微生物雜志，302903-2910)。但是，即使這種最快速的方法也需要首先把細(xì)菌分離為純培養(yǎng)物，需純培養(yǎng)物時(shí)這一過(guò)程要花費(fèi)至少18小時(shí)，需混合培養(yǎng)物時(shí)這一過(guò)程要花費(fèi)至少2至3天。
尿樣在常規(guī)診斷微生物實(shí)驗(yàn)室接受的用于細(xì)菌鑒別的大部分樣品(40-50％)是尿樣(Pezzlo，1988，臨床微生物學(xué)回顧，1268-280)。尿道感染(UTI)是極其常見的，感染的婦女多達(dá)20％，在住院患者中發(fā)病率很高，死亡率還在增長(zhǎng)(Johnson和Stamm，1989，國(guó)際醫(yī)學(xué)年評(píng)，111906-917)。UTI通常與細(xì)菌病原學(xué)有關(guān)，需要抗微生物治療。到目前為止，革蘭氏陰性大腸桿菌是最流行的泌尿病原體，占UTI的50至60％(Pezzlo，1988，op.cit.)。從最近在“Hospitalier de 1′Universit éLaval中心(CHUL)”觀察到的尿樣中分離的細(xì)菌病原體的分布情況在表1和表2中給出。
尿樣中常見病原體的鑒別對(duì)尿樣中病原體的研究在常規(guī)微生物實(shí)驗(yàn)室占有很大優(yōu)勢(shì)，以致開發(fā)了許多實(shí)驗(yàn)方法。金標(biāo)準(zhǔn)仍然是經(jīng)典的半定量平板培養(yǎng)法，其中在平板上刻劃一個(gè)量好直徑的尿環(huán)，并培養(yǎng)18-24小時(shí)。對(duì)菌落計(jì)數(shù)以確定每升尿樣中菌落形成單位(CFU)的總數(shù)。細(xì)菌UTI通常與尿液中≥107CFU/L細(xì)菌計(jì)數(shù)有關(guān)。然而，尿液中小于107CFU/L的感染也是可能的，尤其是在高發(fā)病率的病人或?qū)Ч懿迦脒^(guò)的(catheterized)病人中(Stark和Maki，1984，英國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)雜志，311560-564)。值得注意的是，所測(cè)的尿樣中接近80％被認(rèn)為是陰性的(＜107CFU/L，表3)。
準(zhǔn)確而快速的尿液細(xì)菌病原體的篩選方法使陰性結(jié)果的快速鑒別以及患者的更有效地臨床檢查患者成為可能。最近，比較了幾種快速鑒別方法(UriscreenTM，UTIscreenTM，F(xiàn)lash TrackTMDNA探針以及其它方法)與較慢的基于細(xì)菌病原體培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)生化方法。這些快速鑒定盡管更快，但靈敏度和特異性較低，而且有許多假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果(Koening等，1992，臨床微生物學(xué)雜志，50342-345，Pezzlo等，1992，臨床微生物學(xué)雜志，30640-684)。
通過(guò)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)為陽(yáng)性的尿樣中使用標(biāo)準(zhǔn)的生化測(cè)定進(jìn)一步確定其特征，這些生化測(cè)定可以鑒別細(xì)菌病原體，尿樣也用來(lái)試驗(yàn)對(duì)抗生素的敏感性。
任何臨床樣品與這里用作例子的尿樣一樣，我們的探針與擴(kuò)增引物也可應(yīng)用于任何其它臨床樣品。根據(jù)快速和準(zhǔn)確的原則，本發(fā)明所用的基于DNA的測(cè)定與當(dāng)前用于常規(guī)診斷的標(biāo)準(zhǔn)方法相比是更好的。當(dāng)尿樣陰性的百分率很高時(shí)，在其它臨床樣品中超過(guò)95％的培養(yǎng)物是陰性的(表4)。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明了通用探針在篩選陰性臨床樣品上的用途。也可以使用非人類的其它有機(jī)體的臨床樣品(如其它靈長(zhǎng)類，哺乳動(dòng)物，家畜或家禽)。
開發(fā)快速的基于DNA之診斷試驗(yàn)的方向快速診斷試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)對(duì)感染控制形成有效的影響。對(duì)臨床樣品中的病原體和抗生素抗性基因的鑒別，DNA探針和DNA擴(kuò)增技術(shù)與常規(guī)方法相比有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。這種方法不需要繼代培養(yǎng)，因此有機(jī)體可以直接在臨床樣品中鑒別，從而減少了與病原體的分離相關(guān)的花費(fèi)和時(shí)間?；贒NA的技術(shù)被證明對(duì)于在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的特別應(yīng)用是極有用的。例如，基于使用雜交探針或DNA擴(kuò)增直接檢測(cè)臨床樣品中的病原體的致命有機(jī)體檢測(cè)的試劑盒是市售的產(chǎn)品(Persing等，1993，診斷分子微生物學(xué)原理和應(yīng)用，美國(guó)微生物學(xué)協(xié)會(huì)，華盛頓特區(qū))。
本發(fā)明對(duì)在醫(yī)院臨床微生物實(shí)驗(yàn)室和常規(guī)診斷的私人診所里常用的培養(yǎng)鑒別法是有優(yōu)勢(shì)的替代方法。除了更快之外，基于DNA的診斷試驗(yàn)比目前用于診斷的標(biāo)準(zhǔn)生化測(cè)定更準(zhǔn)確，因?yàn)榧?xì)菌基因型(如DNA水平)比細(xì)菌表型(如生化特性)更穩(wěn)定。本發(fā)明的創(chuàng)造性是把對(duì)12種常見的細(xì)菌物種的細(xì)菌病原體的特異性基因組DNA片段(大小至少為100個(gè)堿基對(duì))從基因組文庫(kù)或數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇出來(lái)；從物種特異性DNA片段的序列(這些序列通過(guò)與基因組文庫(kù)或所選的數(shù)據(jù)庫(kù)序列雜交鑒別)中衍生的擴(kuò)增引物或寡核苷酸探針(二者長(zhǎng)度均小于100個(gè)核苷酸)用作開發(fā)診斷試驗(yàn)的基礎(chǔ)。用作檢測(cè)常見的和臨床重要的細(xì)菌抗性基因的寡核苷酸引物和探針也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，附錄I和附錄II列出了適當(dāng)?shù)墓押塑账崽结樅蚉CR引物，這些探針和引物均從選自基因組文庫(kù)或數(shù)據(jù)庫(kù)序列的物種特異性DNA片段中衍生出來(lái)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚附錄I和附錄II中未列出的適于上述細(xì)菌物種的特異性檢測(cè)的寡核苷酸序列可以從物種特異性片段或所選的數(shù)據(jù)庫(kù)序列中衍生。例如，寡核苷酸可以比我們所選擇的更短或更長(zhǎng)，也可以在任何其它鑒別的物種特異性序列或選擇的數(shù)據(jù)庫(kù)序列中選擇。另外，可以設(shè)計(jì)寡核苷酸以用于非PCR的擴(kuò)增方法。因而，本發(fā)明的核心是得自細(xì)菌基因組DNA文庫(kù)的物種特異性基因組DNA片段的鑒別和得自數(shù)據(jù)庫(kù)序列的基因組DNA片段的選擇，其中數(shù)據(jù)庫(kù)序列作為物種特異性的(specific)和普遍性的(ubiquitous)寡核苷酸的來(lái)源。盡管從物種特異性片段的序列或選擇的數(shù)據(jù)庫(kù)序列中選擇適合診斷用途的寡核苷酸需要更多的努力，但對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，從我們的片段或選擇的數(shù)據(jù)庫(kù)序列中衍生出不同于我們作為例子選擇和試驗(yàn)的適當(dāng)寡核苷酸片段(附錄I和附錄II的片段)是極可能的。
另有人開發(fā)了基于DNA的用于檢測(cè)和鑒別一些我們已經(jīng)鑒別了物種特異性序列的細(xì)菌病原體(PCT專利申請(qǐng)序列號(hào)WO9303186)的試驗(yàn)方法。然而他們的策略基于高度保守的16S rRNA基因的擴(kuò)增以及與內(nèi)生的物種特異性寡核苷酸雜交。本發(fā)明的方法更簡(jiǎn)單快速，因?yàn)樗梢酝ㄟ^(guò)使用從物種特異性細(xì)菌基因組DNA片段中衍生的寡核苷酸使物種特異性目標(biāo)直接擴(kuò)增。
因?yàn)榕R床樣品陰性的比例較高，為確定臨床樣品感染與否，從高度保守的16S rRNA或23S rRNA基因中選擇寡核苷酸引物和探針以檢測(cè)所有在臨床樣品中可能碰到的細(xì)菌病原體。這種策略使得可以快速篩選出供生物學(xué)試驗(yàn)的大量陰性臨床樣品。
我們也開發(fā)了其它基于DNA的試驗(yàn)方法，與細(xì)菌鑒別同時(shí)完成以通過(guò)定向常見的和臨床有關(guān)的細(xì)菌抗性基因快速確定推定的細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性。盡管可以得到來(lái)自選擇的抗生素抗性基因的序列并用于開發(fā)檢測(cè)這些抗生素抗性基因的基于DNA的試驗(yàn)方法(Ehrlich和Greenberg，1994.基于PCR的傳染病診斷，Blackwell科技出版社，馬薩諸塞州波士頓，Persing等，1993，診斷分子微生物學(xué)原理和應(yīng)用，美國(guó)微生物協(xié)會(huì)，華盛頓特區(qū))，但我們的方法是革新性的，它代表了在通常的基于細(xì)菌培養(yǎng)的“金標(biāo)準(zhǔn)”診斷方法上較大的提高，因?yàn)檫@種方法能夠快速鑒別特異性細(xì)菌病原體的存在以及在一個(gè)小時(shí)內(nèi)評(píng)價(jià)這種病原體對(duì)直接得自臨床樣品的抗生素的敏感性。
我們相信我們開發(fā)的快速而簡(jiǎn)單的診斷試驗(yàn)(不是基于細(xì)菌培養(yǎng))將逐步取代目前在醫(yī)院臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室和私人診所中使用的緩慢的常規(guī)細(xì)菌鑒別方法。就我們看來(lái)，這些對(duì)嚴(yán)重的和普通的細(xì)菌病原體和抗生素抗性的快速的基于DNA的診斷將(I)通過(guò)最優(yōu)處理挽救生命，(II)通過(guò)減少?gòu)V譜抗生素的使用以減少抗生素抗性和(III)通過(guò)預(yù)防或縮短治療期以全面減少健康花費(fèi)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了得自基因組DNA片段的序列(大小至少為100個(gè)堿基對(duì)，所有的均在序列表中描述)，這些基因組DNA片段是通過(guò)雜交從基因組文庫(kù)或數(shù)據(jù)庫(kù)選擇的，它們對(duì)檢測(cè)臨床樣品中常見的細(xì)菌病原體(如大腸桿菌，肺炎克雷伯氏菌，銅綠假單孢菌，奇異變性菌，肺炎鏈球菌，金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌，流感嗜血菌，粘膜炎莫拉氏菌)是特異性的。這些細(xì)菌物種與大約90％的尿道感染和其它嚴(yán)重的感染(包括敗血癥，腦膜炎，肺炎，腹腔內(nèi)感染，皮膚感染以及許多其它嚴(yán)重的呼吸道感染)有關(guān)。總的說(shuō)來(lái)，上述細(xì)菌物種可以占到常規(guī)微生物實(shí)驗(yàn)室分離到的細(xì)菌病原體的80％。
用于雜交(探針)或DNA擴(kuò)增(引物)的合成寡核苷酸是從上述的物種的特異性DNA片段(大小范圍為0.25到5.0千堿基對(duì)(kbp))中或從選擇的數(shù)據(jù)庫(kù)序列(GenBank和EMBL)中衍生得到的。從所選的數(shù)據(jù)庫(kù)序列中衍生的一些寡核苷酸探針和擴(kuò)增引物所適用的細(xì)菌物種為大腸桿菌，糞腸球菌，釀膿鏈球菌和銅綠假單孢菌。本領(lǐng)域的技術(shù)人員明白，在本發(fā)明中重要的創(chuàng)新是鑒別通過(guò)雜交從細(xì)菌基因組文庫(kù)選擇的或從數(shù)據(jù)庫(kù)序列選擇的物種特異性DNA片段。從這些適于診斷用途的片段中選擇寡核苷酸也是創(chuàng)新性的。不同于在實(shí)踐中試驗(yàn)的特異的和普遍的寡核苷酸被作為本發(fā)明的實(shí)施方案。
用于檢測(cè)臨床樣品中病原體的雜交(用片段或寡核苷酸探針)或DNA擴(kuò)增方案的開發(fā)使極快速的細(xì)菌鑒別成為可能。這將極大地減少當(dāng)前在臨床實(shí)驗(yàn)室病原體鑒別所需的時(shí)間。因?yàn)檫@些技術(shù)可以用于直接從臨床樣品中檢測(cè)和鑒別細(xì)菌以釋放細(xì)菌DNA時(shí)對(duì)任何生物樣品需要最少的前處理。此外，由于100％的特異性，探針和擴(kuò)增引物使直接來(lái)自臨床樣品或分離物落中的細(xì)菌物種鑒別成為可能。DNA擴(kuò)增測(cè)定還有比雜交測(cè)定更快速，更靈敏的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)镈NA擴(kuò)增測(cè)定使得得自細(xì)菌基因組和目標(biāo)片段的快速和指數(shù)級(jí)的體外復(fù)制。選自細(xì)菌中高度保守的16S rRNA或23S rRNA基因的通用性的(universal)探針和擴(kuò)增引物(其使得可以檢測(cè)任何病原體)將用于診斷實(shí)驗(yàn)室接受的大量陰性臨床樣品中的篩選方法中。與編碼抗生素抗性的確定特征的細(xì)菌基因互補(bǔ)的寡核苷酸探針或引物在鑒別常見的和臨床重要的抗性基因上的用途也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。發(fā)明的詳盡描述物種特異性DNA探針的開發(fā)開發(fā)了用于下列細(xì)菌物種的DNA片段探針大腸桿菌，肺炎克雷伯氏菌，銅綠假單孢菌，奇異變性菌，肺炎鏈球菌，金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌，流感嗜血菌，粘膜炎莫拉氏菌(唯獨(dú)對(duì)糞腸球菌和釀膿鏈球菌的寡核苷酸序列從選擇的數(shù)據(jù)庫(kù)序列中衍生而來(lái))。這些物種特異性片段是通過(guò)與不同種類的革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌物種(表5)雜交從細(xì)菌基因組文庫(kù)選擇出的。
使用標(biāo)準(zhǔn)方法分離每一細(xì)菌物種的染色體DNA(從中尋找探針)。DNA用高頻切割限制性內(nèi)切酶(如Sau3AI)消化，連接進(jìn)細(xì)菌質(zhì)粒載體pGEM3Zf(Promega)，該載體通過(guò)適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化線性化。重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌菌株DH5α，由此產(chǎn)生基因組文庫(kù)。轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞的質(zhì)粒內(nèi)含物用標(biāo)準(zhǔn)方法分析。靶細(xì)菌的大小在0.25至5.0千堿基對(duì)(kbp)之間的DNA片段通過(guò)用各種限制性內(nèi)切核酸酶消化重組質(zhì)粒從載體切割下來(lái)。插入序列通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳從載體上分離下來(lái)并在低熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠中純化。然后每個(gè)純化的細(xì)菌基因組DNA片段可用作特異性試驗(yàn)的探針。
對(duì)于每個(gè)給定的物種，未知編碼潛力(coding potential)的凝膠純化的限制性片段用放射性核苷酸α-32P(dATP)標(biāo)記，α-32P(dATP)通過(guò)隨機(jī)引物標(biāo)記反應(yīng)摻入DNA片段。非放射性修飾的核苷酸也可以通過(guò)這種方法摻入DNA以用于標(biāo)記。
然后，每個(gè)DNA片段探針(如細(xì)菌基因組文庫(kù)的長(zhǎng)度至少為100bp的片斷，此片段從隨機(jī)選自基因組文庫(kù)的克隆中切割下來(lái))通過(guò)和各種細(xì)菌物種的DNA(表5)雜交試驗(yàn)其特異性。使標(biāo)記的雙鏈DNA探針熱變性以產(chǎn)生標(biāo)記的單鏈DNA。這種單鏈DNA能和任何固定在固體支持物上的或溶液中的單鏈靶DNA雜交。靶DNA由一系列在臨床樣品中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌物種(表5)的細(xì)胞全部DNA組成。每個(gè)靶DNA都可從細(xì)菌細(xì)胞中釋放，用常規(guī)方法變性，然后不可逆地固定到固體支持物上(如尼龍或硝酸纖維素膜)或進(jìn)入溶液中。然后固定的單鏈靶DNA和單鏈探針雜交。預(yù)雜交、雜交、和雜交后的條件如下(i)預(yù)雜交；在65℃下的1M NaCl+10％葡聚糖硫酸酯+1％SDS(十二烷基磺酸鈉)+100μg/ml的鮭精DNA中15分鐘，(II)雜交；在65℃下包含標(biāo)記探針的新鮮預(yù)雜交溶液中過(guò)夜。(III)雜交后；用含有1％SDS的3×SSC(1×SSC為0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉)洗滌兩次；再用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗滌兩次；所有這些洗滌均在65℃下進(jìn)行，每次15分鐘。洗滌后的濾膜的放射自顯影使得可以檢測(cè)選擇性雜交的探針。探針和特異性靶DNA的雜交表明這兩種DNA的核苷酸序列之間高度的相似性。
選自各種細(xì)菌基因組文庫(kù)的物種特異性DNA片段(大小在0.25至5.0kbp之間)是為10種常見的病原體(表6)分離的，如上所述，分離基于和各種細(xì)菌染色體DNA雜交。所有試驗(yàn)的細(xì)菌物種(表5中列出的66個(gè)物種)可能是從臨床樣品中分離出來(lái)的與普通感染或潛在污染有關(guān)的病原體。DNA片段探針只有在只和從中分離出它的病原體單獨(dú)雜交時(shí)，才可認(rèn)為是特異性的。隨后通過(guò)和興趣物種(表6)的大約10到80個(gè)臨床分離物中的細(xì)菌DNA雜交，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)為特異性的DNA片段探針的普遍性(ubiquity)(即識(shí)別靶物種的大多數(shù)分離物的普遍性探針)。使DNA變性，固定在尼龍膜上，如上所述進(jìn)行雜交。
物種特異性片段探針的測(cè)序分離的物種特異性DNA片段的全部或部分核苷酸序列使用雙脫氧末端測(cè)序法來(lái)測(cè)定，這種方法使用測(cè)序酶(USB生物化學(xué))或T7 DNA聚合酶(Pharmacia)進(jìn)行。在序列表中列出了這些核苷酸序列。另外，選自數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank和EMBL)的序列用作診斷大腸桿菌，糞腸球菌，釀膿鏈球菌和銅綠假單孢菌的寡核苷酸的來(lái)源。這種策略需要試驗(yàn)從選自數(shù)據(jù)庫(kù)的各種基因組DNA片段(大小大于100bp)中衍生的一系列合適的核苷酸引物或探針以檢測(cè)它們?cè)谌缦滤龅腜CR和雜交試驗(yàn)中的特異性和普遍性。注意到按照有效的序列信息在序列物種特異性潛能的基礎(chǔ)上選擇數(shù)據(jù)庫(kù)序列是很重要的。本發(fā)明僅僅包括那些能衍生出物種特異性寡核苷酸的數(shù)據(jù)庫(kù)序列。
從選自基因組文庫(kù)或數(shù)據(jù)庫(kù)序列的物種特異性片段中衍生的寡核苷酸探針和擴(kuò)增引物用自動(dòng)化DNA合成儀(Millipore)合成。在合成之前，使用標(biāo)準(zhǔn)程序由計(jì)算機(jī)分析(例如，遺傳計(jì)算機(jī)小組(GCG)和OligoTM4.0(國(guó)家生物科學(xué)))通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)評(píng)價(jià)所有寡核苷酸(用于雜交的探針和用于DNA擴(kuò)增的引物)對(duì)雜交和DNA擴(kuò)增的適合性。PCR引物對(duì)的潛在的適合性也可在合成之前通過(guò)證實(shí)不存在不需要的特征(如一種核苷酸的長(zhǎng)鏈，在3′末端有高比例的G或C殘基以及3′末端T殘基)來(lái)評(píng)價(jià)(Persing等，1993，診斷分子微生物學(xué)原理和應(yīng)用，美國(guó)微生物協(xié)會(huì)，華盛頓特區(qū))。
用寡核苷酸探針雜交在雜交實(shí)驗(yàn)中，寡核苷酸(大小不到100個(gè)核苷酸)用于細(xì)菌檢測(cè)較之DNA片段探針有一些優(yōu)點(diǎn)，如易于大量制備、各批結(jié)果一致和化學(xué)穩(wěn)定。簡(jiǎn)言之，供雜交的寡核苷酸是通過(guò)T4多核苷酸激酶(Pharmacia)用放射性核苷酸32γP(ATP)5′端標(biāo)記的。沒有摻入的放射性核苷酸經(jīng)把標(biāo)記的單鏈寡核苷酸通過(guò)Sephadex葡聚糖凝膠G50柱除去。另外，寡核苷酸通過(guò)在其3′端酶促標(biāo)記或在合成時(shí)直接摻入5′端用生物素標(biāo)記或用洋地黃毒苷標(biāo)記。本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚非上述三種標(biāo)記方法之標(biāo)記方法可以使用。
如上所述，對(duì)DNA探針片段，使靶DNA變性、固定在固體支持物上并進(jìn)行雜交。預(yù)雜交和雜交的條件均如前所述。雜交后洗滌條件如下在包含1％SDS的3×SSC中洗兩次，在包含1％SDS的2×SSC中洗兩次，再在包含1％SDS的1×SSC中洗兩次(所有這些洗滌均在65℃下進(jìn)行15分鐘)，最后在25℃下包含1％SDS的0.1×SSC中洗滌15分鐘。對(duì)于放射性標(biāo)記的探針，雜交體通過(guò)如前所述的放射自顯影檢測(cè)。對(duì)于非放射性標(biāo)記的檢測(cè)可用比色法或化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行。
寡核苷酸探針可從雙螺旋DNA鏈的任何一條鏈衍生。探針由堿基A，G，C，T或類似物組成。探針可以具有任何適合的的長(zhǎng)度，可在選自基因組文庫(kù)或數(shù)據(jù)庫(kù)序列的物種特異性基因組DNA片段內(nèi)任何位置選擇。
DNA擴(kuò)增通過(guò)廣泛應(yīng)用的PCR(聚合酶鏈反應(yīng))方法進(jìn)行DNA擴(kuò)增，引物對(duì)可從測(cè)序的物種特異性DNA片段中或數(shù)據(jù)庫(kù)序列中衍生。另外，引物對(duì)也可以是寡核苷酸探針的縮短的形式。合成之前，通過(guò)使用程序OligoTM4.0(國(guó)家生物科學(xué))分析潛在的引物對(duì)以檢驗(yàn)它們是否可能用于PCR擴(kuò)增。
在通過(guò)PCR的DNA擴(kuò)增期間，分別結(jié)合到得自細(xì)菌基因組的變性雙鏈靶DNA的每一條鏈上的兩條寡核苷酸用于在體外指數(shù)倍地?cái)U(kuò)增靶DNA。這種擴(kuò)增通過(guò)連續(xù)的熱循環(huán)使DNA變性、引物退火、以及合成新靶DNA進(jìn)行(Persing等，1993，診斷分子微生物學(xué)原理和應(yīng)用，美國(guó)微生物學(xué)協(xié)會(huì)，華盛頓特區(qū))。簡(jiǎn)言之，PCR方案如下把臨床樣品或細(xì)菌菌落直接加到50μl的PCR反應(yīng)混合物中(其中包含50mM KCl，pH為8.3的10mM Tris-Hcl，2.5mM MgCl2，兩種引物各0.4μM，四種dNTPs各200μM以及1.25單位的Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer))。PCR反應(yīng)使用Perkin Elmer480TM熱循環(huán)器進(jìn)行熱循環(huán)(95℃下3分鐘，95℃下1秒與55℃下1秒，循環(huán)30次)，隨后用標(biāo)準(zhǔn)的溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠電泳分析。顯然可以使用其它檢測(cè)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的方法(更快速或在常規(guī)診斷中更實(shí)用)。這些方法可以基于擴(kuò)增后熒光檢測(cè)(如得自Perkin Elmer的TaqmanTM系統(tǒng)或Biotronics的AmplisensorTM系統(tǒng))或用結(jié)合到特異性擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)部序列上的寡核苷酸的液相雜交。這些新探針可由我們的物種特異性片段探針產(chǎn)生。事實(shí)上，基于熒光的檢測(cè)方法用于常規(guī)診斷是特別有前途的，這種方法快速、定量并可自動(dòng)化。
為確保PCR效率，甘油、二甲基亞砜(DMSO)或其它有關(guān)的溶劑可用來(lái)增加PCR的靈敏度并能克服與有高GC含量或穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)的靶DNA的擴(kuò)增有關(guān)的問題。甘油和DMSO的濃度范圍分別為5-15％(V/V)和3-10％(V\V)，對(duì)于PCR反應(yīng)混合物，擴(kuò)增引物和MgCl2的濃度分別是0.1-1.0μM和1.5-3.5mM。使用外引物和嵌套引物(即嵌套PCR)或一個(gè)以上的引物對(duì)(即多重PCR)標(biāo)準(zhǔn)PCR的修飾方案也可以使用(Persing等，1993，診斷分子微生物學(xué)原理和應(yīng)用，美國(guó)微生物學(xué)協(xié)會(huì)，華盛頓特區(qū))。關(guān)于PCR方案與擴(kuò)增子檢測(cè)方法的更多細(xì)節(jié)參見實(shí)施例7和實(shí)施例8。
DNA擴(kuò)增領(lǐng)域的技術(shù)人員知道存在其它的快速擴(kuò)增方法(如連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)，自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(3SR)，基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)，鏈置換擴(kuò)增(SDA)以及分支DNA(bDNA)(Persing等，1993，診斷分子微生物學(xué)原理和應(yīng)用，美國(guó)微生物學(xué)協(xié)會(huì)，華盛頓特區(qū))。本發(fā)明的范圍不限于PCR擴(kuò)增的使用，而且包括任何快速核酸擴(kuò)增方法或其它任何可用于增加試驗(yàn)的快速性和敏感性的方法。包括在此申請(qǐng)內(nèi)的任何通過(guò)非PCR的方法適合于核酸擴(kuò)增的寡核苷酸與從物種特異性片斷和抗生素抗性基因序列衍生的寡核苷酸也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
寡核苷酸探針和引物的特異性和普遍性試驗(yàn)從已測(cè)序的物種特異性片段或數(shù)據(jù)庫(kù)序列中衍生的寡核苷酸探針的特異性通過(guò)與前面所述的與表5中列出的細(xì)菌物種中的DNA雜交來(lái)測(cè)試。接著被發(fā)現(xiàn)是特異性的寡核苷酸通過(guò)與靶物種(如有關(guān)片斷探針的所描述的)的大約80個(gè)分離物的細(xì)菌DNA雜交試驗(yàn)其普遍性。當(dāng)探針和至少80％分離物的DNA特異地雜交時(shí)，可以認(rèn)為這些探針是普遍性的(ubiquitous)。在表6中概括了用寡核苷酸探針試驗(yàn)特異性和普遍性的結(jié)果。擴(kuò)增引物對(duì)的特異性和普遍性可直接從同樣細(xì)菌菌株的培養(yǎng)物(見實(shí)施例7)試驗(yàn)。為測(cè)定特異性和普遍性，直接在靶物種的大約80個(gè)分離物的細(xì)菌菌落中進(jìn)行PCR試驗(yàn)。結(jié)果概述于表7。對(duì)研究的12個(gè)細(xì)菌物種中每個(gè)物種的所有特異性和普遍性寡核苷酸探針和擴(kuò)增引物分別列于附錄I和附錄II。已測(cè)序的DNA片段可以出現(xiàn)趨異(divergence)，到目前為止這些序列或其一部分序列趨異并不影響探針或擴(kuò)增引物的特異性，因此變異的細(xì)菌DNA也屬于本發(fā)明的范圍。
通用的細(xì)菌檢測(cè)在常規(guī)微生物實(shí)驗(yàn)室中用于細(xì)菌鑒別的臨床樣品陰性的百分率較高(表4)。如在兩年的一個(gè)時(shí)期內(nèi)，“Hospitalier 1′Universit Laval中心(CHUL)”實(shí)驗(yàn)室接受的大約80％的尿樣品是陰性的(即＜107CFU/l)(表3)。檢測(cè)臨床樣品時(shí)先用通用性探針和通用性擴(kuò)增引物檢測(cè)細(xì)菌的存在，然后進(jìn)行特異性鑒定，篩選出大量的陰性樣品。這種方法是有用的，因?yàn)樗芄?jié)約開支并可迅速確定對(duì)患者的臨床治療。因而可從在數(shù)據(jù)庫(kù)(附錄III和IV)得到的細(xì)菌16S或23S核糖體RNA基因序列高度保守的部分合成幾條寡核苷酸和擴(kuò)增引物。在雜交試驗(yàn)中，一組7個(gè)寡核苷酸(附錄I，表6)強(qiáng)烈地和表5中列出的所有細(xì)菌物種的DNA雜交。因而這種用放射性核苷酸或任何其它修飾核苷酸標(biāo)記的通用性探針對(duì)檢測(cè)尿樣品中的細(xì)菌是很有用的，其敏感性范圍≥107CFU/l。這些探針也適用于其它臨床樣品中的細(xì)菌檢測(cè)。
衍生自高度保守的核糖體RNA基因序列的擴(kuò)增引物也可作為通用的直接從臨床樣品(附錄IV，表7)中檢測(cè)細(xì)菌的替代策略。為提高試驗(yàn)的靈敏性和快速性，開發(fā)了DNA擴(kuò)增策略。因?yàn)檫@種擴(kuò)增試驗(yàn)特異地從臨床樣品中碰到的23種不同細(xì)菌物種中擴(kuò)增DNA，因而是普遍的。
非核糖體RNA基因的高度保守的細(xì)菌基因也是通用的直接從臨床樣品中檢測(cè)細(xì)菌的較好候選者。這些基因可能和一些細(xì)菌存活的必要過(guò)程有關(guān)(如蛋白質(zhì)合成，DNA合成，細(xì)胞分裂或DNA修復(fù))因而在進(jìn)化過(guò)程中是很穩(wěn)定的。我們正在研究候選基因以開發(fā)新的通用的直接檢測(cè)來(lái)自臨床樣品中的細(xì)菌的快速試驗(yàn)方法。
抗生素抗性基因抗微生物抗性使治療復(fù)雜化并常導(dǎo)致治療失敗，而且，使用抗生素過(guò)多不可避免地導(dǎo)致細(xì)菌抗性的出現(xiàn)。我們的目標(biāo)是在一個(gè)小時(shí)內(nèi)提供臨床診斷(clinicians)，即開最優(yōu)治療的藥方所需的信息。除了進(jìn)行通用的細(xì)菌檢測(cè)的基于DNA的試驗(yàn)快速鑒別陰性臨床樣品和陽(yáng)性樣品中特異性病原體的存在之外，臨床診斷也要及時(shí)了解細(xì)菌病原體抵抗抗生素處理的能力。我們認(rèn)為迅速評(píng)價(jià)細(xì)菌對(duì)抗微生物劑抗性最有效的策略是直接從臨床樣品中檢測(cè)最常見的和最重要的抗生素抗性基因(即以DNA為基礎(chǔ)的檢測(cè)抗生素抗性基因的試驗(yàn))。因?yàn)樽钪匾暮妥畛Ｒ姷募?xì)菌抗生素抗性基因的序列可從數(shù)據(jù)庫(kù)得到，我們的策略是用一部分或全部基因的序列設(shè)計(jì)特異的寡核苷酸，這種寡核苷酸可用作開發(fā)基于DNA的快速試驗(yàn)的基礎(chǔ)。以細(xì)菌的臨床相關(guān)性(即高發(fā)病率和重要性)為基礎(chǔ)選擇的細(xì)菌抗生素抗性基因的序列在序列表中給出。表8概述了一些選擇的抗生素抗性基因的特征。
實(shí)施例下面的實(shí)施例旨在說(shuō)明本發(fā)明的各種方法和化合物。實(shí)施例1片斷的分離和克隆。使用標(biāo)準(zhǔn)方法制備大腸桿菌株ATCC25922，肺炎克雷伯氏菌CK2，銅綠假單孢菌株ATCC27853，奇異變形菌株ATCC35657，肺炎鏈球菌株ATCC27336，金黃色葡萄球菌株ATCC25923，表皮葡萄球菌株ATCC12228，腐生葡萄球菌株ATCC15305，流感嗜血菌的相關(guān)菌株Rd和粘膜炎莫拉氏菌ATCC53879的基因組DNA?？梢岳斫饧?xì)菌基因組DNA也可以從不是上述菌株的菌株中分離(對(duì)糞腸球菌和釀膿鏈球菌，寡核苷酸源于數(shù)據(jù)庫(kù))。每一種DNA用經(jīng)常切割DNA的限制性酶(如Sau3AI)消化。形成的DNA片段連接進(jìn)質(zhì)粒載體(pGEM3ZF)以產(chǎn)生重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(DH5α)?？梢岳斫廨d體與相應(yīng)感受態(tài)細(xì)胞不應(yīng)限制在本文作為例子的具體的載體和細(xì)胞。獲得重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的目的是提供易于生產(chǎn)的用作探針的DNA片段的來(lái)源。因此，到目前為止，因?yàn)椴迦肫瑪鄬?duì)于靶細(xì)菌DNA是特異性和選擇性的，任何重組質(zhì)粒和相應(yīng)的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞的質(zhì)粒含量用標(biāo)準(zhǔn)方法分析，大小在0.25至5.0kbp之間的靶細(xì)菌DNA片斷用各種限制性內(nèi)切核酸酶消化重組質(zhì)粒而從載體上切割下來(lái)。用瓊脂糖凝膠電泳把插入序列從載體中分離出來(lái)，再在低熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠中純化。然后用每個(gè)純化片斷進(jìn)行特異性試驗(yàn)。
DNA片段探針的標(biāo)記使用的標(biāo)記是α32P(dATP)，這種放射性核苷酸能通過(guò)酶促反應(yīng)摻入雙鏈DNA分子。興趣片段首先通過(guò)在95℃下加熱5分鐘變性，然后使隨機(jī)引物的混合物退火形成片斷鏈。這些引物一旦退火，就提供一個(gè)DNA合成的起始位點(diǎn)。DNA聚合酶(通常是Klenow片段)與四種核苷酸一起提供，其中一種是放射性的。當(dāng)反應(yīng)終止后，新的DNA分子的混合物再一次變性，產(chǎn)生放射性的單鏈DNA分子(即探針)。如前所述，其它修飾的核苷酸也可用來(lái)標(biāo)記探針。
DNA片斷探針的特異性和普遍性的試驗(yàn)。對(duì)10種(表6)常見細(xì)菌病原體的大小在0.25至5.0kbp之間的物種特異性DNA片斷基于和各種細(xì)菌染色體DNA雜交進(jìn)行分離。使用斑點(diǎn)印跡器把表5中列出的每種細(xì)菌菌株細(xì)胞的完整DNA樣品轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，洗滌并使其變性，然后不可逆地固定。雜交條件如前所述。當(dāng)DNA片斷探針只和從中分離出它的病原體雜交時(shí)才可認(rèn)為是特異性的。只能和靶細(xì)菌物種特異性雜交(即特異性的)的標(biāo)記DNA片斷可通過(guò)和如上所述的興趣物種的大約10-80個(gè)菌落的DNA雜交來(lái)試驗(yàn)其普遍性。預(yù)雜交、雜交、雜交后洗滌的條件如上所述。放射自顯影(或?qū)Ψ欠派湫詷?biāo)記適用的其他檢測(cè)方法)之后，每個(gè)探針的特異性都可以確定。發(fā)現(xiàn)具有特異性(即僅能和從中分離出它的細(xì)菌物種DNA雜交)和普遍性(即和靶物種的大多數(shù)分離物雜交)的每個(gè)探針保留下來(lái)以進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例2除菌株試驗(yàn)是通過(guò)菌落雜交之外和實(shí)施例1相同。細(xì)菌菌株接種到置于營(yíng)養(yǎng)瓊脂中的尼龍膜上，膜在37℃下培養(yǎng)兩小時(shí)，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行細(xì)菌裂解和DNA變性。DNA雜交如前所述進(jìn)行。
實(shí)施例3除直接從臨床樣品中檢測(cè)細(xì)菌外和實(shí)施例1相同。把任何生物學(xué)樣品直接裝載進(jìn)斑點(diǎn)印跡器上，細(xì)胞原位裂解以進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)。使血樣肝素化，以避免干擾方便地裝載到斑點(diǎn)印跡器上的凝結(jié)。
實(shí)施例4測(cè)定DNA片段的核苷酸序列。每個(gè)發(fā)現(xiàn)是特異的和普遍的片斷(實(shí)施例1)的全部或部分的核苷酸序列使用雙脫氧末端測(cè)序法測(cè)定(Sanger等，1977，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)，745463-5467)。這些DNA序列在序列表中給出，從這些核苷酸序列中或者是從選擇的數(shù)據(jù)庫(kù)序列中選擇寡苷酸探針和擴(kuò)增引物，然后用亞磷酰胺化學(xué)法在Biosearch自動(dòng)合成儀(MilliporeTM)上合成。
寡核苷酸標(biāo)記。如前所述，每個(gè)寡核苷酸通過(guò)T4多核苷酸激酶(Pharmacia)用γ32P-ATP在5′-端標(biāo)記。這種標(biāo)記也可以是非放射性的。
寡核苷酸探針的特異性試驗(yàn)。通過(guò)和前面所述的革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌物種的DNA雜交試驗(yàn)所有的標(biāo)記寡核苷酸探針的特異性。物種特異性探針是那些僅能和從中分離這種探針的細(xì)菌物種DNA雜交的探針。對(duì)所發(fā)現(xiàn)的特異性寡核苷酸探針進(jìn)行下述的普遍性試驗(yàn)。
寡核苷酸探針的普遍性試驗(yàn)。在用靶物種的大約80個(gè)種菌株進(jìn)行的普遍性試驗(yàn)中使用特異性寡核苷酸探針。如上述的特異性試驗(yàn)所述，分離物的染色體DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，并用標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交。為每個(gè)靶物種構(gòu)建的約由80個(gè)分離物的小組包含參比ATCC菌株以及許多從各種來(lái)源獲得的臨床分離物。普遍性探針是那些能和靶物種臨床分離物組的至少80％DNA雜交的探針。特異的和普遍的寡核苷酸探針的例子列于附錄I。
實(shí)施例5除了一組特異的寡核苷酸探針用于細(xì)菌鑒別之外與實(shí)施例4相同。這組特異的寡核苷酸可以(I)提高靈敏度并確保100％普遍性或(II)同時(shí)鑒別一種以上細(xì)菌物種。細(xì)菌鑒別可從分離物落或直接從臨床樣品中進(jìn)行。
實(shí)施例6PCR擴(kuò)增。使用PCR技術(shù)可提高試驗(yàn)的靈敏性和快速性。使用的PCR引物通常是先前開發(fā)的用于雜交測(cè)定的很多(extensive)組寡核苷酸的較短衍生物(表6)。此組引物在直接從細(xì)菌菌落或細(xì)菌懸浮液(見實(shí)施例7)中進(jìn)行的PCR測(cè)定中被測(cè)試以確定它們的特異性和普遍性(表7)。特異的和普遍的PCR引物對(duì)的例子列于附錄II。
擴(kuò)增引物的特異性和普遍性試驗(yàn)試驗(yàn)所有選擇的PCR引物對(duì)針對(duì)用于試驗(yàn)寡核苷酸探針的革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌組的特異性(表5)。然后試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)每一物種為特異性的引物對(duì)的普遍性以確保每組引物能從一組靶細(xì)菌的大約80個(gè)分離物中擴(kuò)增至少80％的DNA。為每一物種構(gòu)建的分離物包括參比ATCC菌株以及代表每一物種臨床多樣性的各種臨床分離物。
應(yīng)該采取標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)防方法以避免假陽(yáng)性PCR結(jié)果。滅活PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法(如通過(guò)尿嘧啶-N-糖基化酶)可用于控制PCR遺留。
實(shí)施例7從細(xì)菌菌落或懸浮液中直接擴(kuò)增。PCR測(cè)定可直接從細(xì)菌菌落或細(xì)菌懸浮液中進(jìn)行，把細(xì)菌懸浮液調(diào)整到標(biāo)準(zhǔn)的McFarland 0.5(對(duì)應(yīng)于1.5×108個(gè)細(xì)菌/ml)。在從菌落直接擴(kuò)增的情況下，使用塑料棒把一部分菌落直接轉(zhuǎn)移到50μl的PCR反應(yīng)混合物中(含有50mM KCl，pH為8.3的10mM Tris，2.5mM MgCl2，兩種引物各0.4μM，四種dNTP各200μM以及1.25個(gè)單位的Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer))。對(duì)于細(xì)菌懸浮液，把4μl的細(xì)胞懸浮液加入46μl同樣的PCR反應(yīng)混合物中。兩種策略都把50μl的礦物油加到反應(yīng)混合物上，PCR擴(kuò)增按下列步驟進(jìn)行第一步在95℃下變性3分鐘，然后在95℃下在Perkin Elmer 480TM熱循環(huán)器中進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)由95℃下1秒的變性步驟和在55℃下1秒的退火步驟組成)。然后用標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠(2％)電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。該產(chǎn)物可在254毫微米的紫外線下含有2.5μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中顯示出來(lái)。整個(gè)PCR測(cè)定可在大約一小時(shí)內(nèi)全部完成。
另外，從細(xì)菌培養(yǎng)物的擴(kuò)增除了使用“熱起始”方案外均按如上所述的方法進(jìn)行。在此種情況下，包含靶DNA，引物和dNTPs初始反應(yīng)混合物加熱到85℃，然后再加入PCR反應(yīng)混合物的其它組分。所有試劑的最終濃度如上所述。隨后，按上述的方法進(jìn)行PCR反應(yīng)熱循環(huán)并分析。
實(shí)施例8直接從臨床樣品中擴(kuò)增。對(duì)于從尿樣中的擴(kuò)增，按前述方法把4μl的未稀釋的或稀釋的(1∶10)尿液直接加到46μl的上述PCR反應(yīng)混合物中進(jìn)行擴(kuò)增。
為增強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞裂解并消除臨床樣品中PCR的抑制作用，通常把樣品稀釋在含有去垢劑的裂解緩沖液中。隨后，裂解物直接加到PCR反應(yīng)混合物中。在DNA擴(kuò)增之前，用熱循環(huán)器或微波爐對(duì)裂解液進(jìn)行熱處理以提高細(xì)胞裂解的效率。
我們的策略是開發(fā)快速簡(jiǎn)便的方案以消除臨床樣品和裂解的細(xì)菌細(xì)胞中的PCR抑制效應(yīng)以便直接從各種生物樣品中進(jìn)行DNA擴(kuò)增。PCR有與粗提DNA制品相容的優(yōu)勢(shì)。例如，血液，腦脊液和血清在簡(jiǎn)短的熱處理后可在PCR測(cè)定中直接使用。我們打算用這樣快速而簡(jiǎn)便的策略開發(fā)從各種臨床樣品中快速擴(kuò)增DNA的方法。
實(shí)施例9抗生素抗性基因的檢測(cè)。常見的和臨床有關(guān)的特異性抗生素抗性基因的存在用前面部分所述的PCR擴(kuò)增或雜交方案鑒別。用作基于DNA的試驗(yàn)之基礎(chǔ)的特異性寡核苷酸選自抗生素抗性基因序列。這些試驗(yàn)可直接從臨床樣品或細(xì)菌菌落中進(jìn)行，而且應(yīng)補(bǔ)充特異性細(xì)菌鑒別的診斷試驗(yàn)。
實(shí)施例10除了測(cè)定是通過(guò)多重PCR(即在一個(gè)PCR反應(yīng)中使用幾對(duì)引物)之外與實(shí)施例7和實(shí)施例8相同，使用多重PCR可以(I)達(dá)到對(duì)特異性靶病原體100％的普遍性，(II)同時(shí)檢測(cè)幾種細(xì)菌病原體。
例如，檢測(cè)大腸桿菌需要三對(duì)PCR引物以確保100％的普遍性。因此，開發(fā)了使用三個(gè)引物對(duì)的多重PCR測(cè)定(用“熱起始”方案(實(shí)施例7))。這種策略也可用于其它需要一種以上引物對(duì)以達(dá)到100％普遍性的細(xì)菌病原體。
多重PCR試驗(yàn)也用于(I)同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)細(xì)菌物種或者(II)同時(shí)鑒別細(xì)菌病原體并直接從臨床樣品或細(xì)菌菌落中檢測(cè)特異性抗生素抗性基因。
對(duì)于這些應(yīng)用，擴(kuò)增子檢測(cè)方法應(yīng)適合區(qū)分產(chǎn)生的各種擴(kuò)增子?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠電泳，因?yàn)樗苫跀U(kuò)增子的大小區(qū)分它們。適用于這種用途的另一種有用的策略是使用在不同波長(zhǎng)處激發(fā)的各種熒光染料檢測(cè)，每種熒光染料可與連接到熒光淬滅物上的特異性寡核苷酸相偶聯(lián)，這種熒光淬滅物在擴(kuò)增過(guò)程中降解釋放熒光(如TaqManTM，PerkinElmer)。
實(shí)施例11擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚非標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠電泳(實(shí)施例7)的替代性方法可以用于擴(kuò)增產(chǎn)物的揭示。這類方法可基于擴(kuò)增之后的熒光檢測(cè)(如AmplisensorTM，Biotronics，TaqManTM)或標(biāo)記物如生物素(SHARP SignalTM系統(tǒng)，Digene Diagnostics)的檢測(cè)。這些方法是定量的并易于自動(dòng)化。一個(gè)擴(kuò)增引物或內(nèi)部寡核苷酸探針(其對(duì)從物種特異性片段探針衍生的擴(kuò)增子是特異的)與熒光染料或任何其它標(biāo)記偶聯(lián)?；跓晒鈾z測(cè)的方法特別適用于診斷試驗(yàn)，因?yàn)樵诳梢缘玫桨l(fā)射不同波長(zhǎng)的熒光染料(Perkin Elmer)時(shí)這種方法是快速而靈活的。
實(shí)施例12物種特異的、普遍性和抗生素抗性基因的擴(kuò)增引物可用于其它快速的擴(kuò)增方法(如連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)，自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(3SR)，基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)，鏈置換擴(kuò)增(SDA)，和分支DNA(bDNA)或其它任何用于增加試驗(yàn)靈敏度的方法。擴(kuò)增可從分離的細(xì)菌菌落或者直接從臨床樣品中進(jìn)行。因而本發(fā)明的范圍并不限于PCR的使用，而且包括任何特異性地鑒別細(xì)菌DNA并可增加試驗(yàn)的快速性和靈敏性的方案的使用。
實(shí)施例13
試驗(yàn)試劑盒包括對(duì)每種細(xì)菌特異的探針組以及一組通用探針。試劑盒是以試驗(yàn)組分的形式提供，由一組非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的通用探針和用于臨床樣品中興趣細(xì)菌檢測(cè)的標(biāo)記的特異性探針組成。試劑盒也包括進(jìn)行預(yù)雜交，雜交，洗滌步驟和雜交體檢測(cè)必需的檢試驗(yàn)劑。最后，試劑盒還包括用于檢測(cè)已知的抗生素抗性基因(或它們的衍生物)的試驗(yàn)組分。當(dāng)然，試劑盒也包括用作每次雜交試驗(yàn)陰性和陽(yáng)性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)樣品。
包括在試劑盒中的組分適用于每種樣品類型，并適于檢測(cè)在該樣品中常見的病原體。試劑盒還包括用于細(xì)菌通用性檢測(cè)的試劑。基于感染位點(diǎn)，開發(fā)了用于病原體特異性檢測(cè)的下列試劑盒-通用的檢測(cè)多數(shù)臨床樣品中的細(xì)菌病原體的試劑盒，其中包含對(duì)細(xì)菌基因組高度保守區(qū)特異的探針組。
-用于檢測(cè)從尿樣中取得的細(xì)菌病原體的試劑盒，其中包含八種特異性試驗(yàn)組分(用于試驗(yàn)大腸桿菌，糞腸球菌，肺炎克雷伯氏菌，奇異變性菌，銅綠假單孢菌，腐生葡萄球菌，金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)。
用于檢測(cè)呼吸病原體的試劑盒，其中包含七種特異性試驗(yàn)組分(用于檢測(cè)肺炎鏈球菌，粘膜炎莫拉氏菌，流感嗜血菌，肺炎克雷伯氏菌，銅綠假單孢菌，釀膿鏈球菌和金黃色葡萄球菌的探針組)。
-用于檢測(cè)從血液中取得的病原體的試劑盒，其中包含十一種特異性試驗(yàn)組分(用于檢驗(yàn)肺炎鏈球菌，粘膜炎莫拉氏菌，流感嗜血菌，奇異變性菌，肺炎克雷伯氏菌，銅綠假單孢菌，大腸桿菌，糞腸球菌，金黃色葡萄球菌，釀膿鏈球菌以及表皮葡萄球菌的探針組)。
-用于檢測(cè)引起腦脊膜炎的病原體的試劑盒，其中包含四種特異性試驗(yàn)組分(用于試驗(yàn)流感嗜血菌，肺炎鏈球菌，大腸桿菌和銅綠假單孢菌的探針組)。
-用于檢測(cè)臨床重要的抗生素抗性基因的試劑盒，其中包含用于特異地檢測(cè)以下19種和細(xì)菌抗性相關(guān)的基因中至少一種的探針組blatemblarob，blashv，aadB，aacC1，aacC2，aacC3，aacA4，mecA，vanA，vanH，vanX，satA，aacA-aphD，vat，vga，msrA，sul和int。
-開發(fā)了其它適用于檢測(cè)來(lái)自皮膚，腹部創(chuàng)傷的病原體的試劑盒或任何其它臨床有關(guān)的試劑盒。
實(shí)施例14除了試驗(yàn)試劑盒含有進(jìn)行DNA擴(kuò)增試驗(yàn)的所有試劑和對(duì)照外和實(shí)施例13相同。診斷試劑盒適用于直接從臨床樣品或細(xì)菌菌落中通過(guò)PCR(或其它擴(kuò)增方法)進(jìn)行的擴(kuò)增。在試劑盒中還包括通用的細(xì)菌檢測(cè)、細(xì)菌鑒別和抗生素抗性基因檢測(cè)所需的組分。
擴(kuò)增測(cè)定可在試管中或微滴定板上進(jìn)行。對(duì)微滴定板上的測(cè)定，將孔用特異性擴(kuò)增引物和對(duì)照DNA分子涂覆，擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)可以自動(dòng)化。為從臨床樣品中直接進(jìn)行檢測(cè)，在試劑盒中包含用于通用細(xì)菌檢測(cè)的試劑和擴(kuò)增引物。直接從菌落中試驗(yàn)的試劑盒或直接從臨床樣品中試驗(yàn)的試劑盒中還包括細(xì)菌鑒別和抗生素抗性基因檢測(cè)所需的組分。
如實(shí)施例13所述的基于雜交的診斷試劑盒一樣，該試劑盒適用于每一類型的樣品。
實(shí)施例15可以理解，本發(fā)明所述的用于細(xì)菌檢測(cè)和鑒別的探針和擴(kuò)增引物的使用不限于臨床微生物學(xué)的應(yīng)用。事實(shí)上，我們感到其它部門也能從這些新技術(shù)中受益。例如，這些試驗(yàn)可在工業(yè)上用于食物、水、藥物產(chǎn)品或其它需要微生物控制的產(chǎn)品的質(zhì)量控制。這些試驗(yàn)也可用于檢測(cè)和鑒定來(lái)自非人類的其它有機(jī)體(其它靈長(zhǎng)類，哺乳類，農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，牲畜)的生物樣品中的細(xì)菌。這些診斷工具對(duì)包括臨床試驗(yàn)和流行病學(xué)研究在內(nèi)的研究是十分有用的。
表1. 1992-1994年期間Hospitalier de 1′UniversitéLaval中心(CHUL)陽(yáng)性尿樣(≥107CFU/L)中尿分離物的分布。
分離物百分率(％)有機(jī)體92年11月 93年4月 93年7月 94年1月n＝267an＝265n＝238n＝281大腸桿菌53.2 51.7 53.8 54.1糞腸球菌13.8 12.4 11.7 11.4肺炎克雷伯氏桿菌6.4 6.4 5.5 5.3表皮葡萄球菌7.1 7.9 3.0 6.4奇異變形菌 2.6 3.4 3.8 2.5銅綠假單胞菌3.7 3.0 5.0 2.9腐生葡萄球菌3.0 1.9 5.4 1.4其它b10.2 13.3 11.8 16.0an＝指出的月份內(nèi)分離物的總數(shù)b參見表2
表2. 1992-1994年期間Hospitalier de 1′UniversitéLaval中心(CHUL)陽(yáng)性尿樣(≥107CFU/L)中稀有的a尿分離物的分布。
分離物百分率(％)有機(jī)體a92年11月 93年4月 93年7月 94年1月金黃色葡萄球菌0.41.1 1.3 1.4葡萄球菌屬的幾個(gè)種2.24.9 1.7 6.0微球菌屬的幾個(gè)種 0.00.0 0.4 0.7糞腸球菌 0.40.4 1.3 1.4檸檬酸桿菌屬的幾個(gè)種 1.40.8 0.4 0.7腸桿菌屬的幾個(gè)種 1.51.1 1.3 1.4產(chǎn)酸克雷伯氏菌1.11.5 2.5 1.8沙雷氏桿菌屬的幾個(gè)種 0.80.0 0.5 0.0變形菌屬的幾個(gè)種 0.40.4 0.0 1.1摩根氏菌屬和普羅威登斯菌屬0.40.8 0.4 0.0蜂房哈夫尼菌 0.80.0 0.0 0.0NFBb0.00.4 1.3 1.1假絲酵母屬的幾個(gè)種0.81.9 0.7 0.4a稀有尿分離物是那些在表1中鑒別為“其它”的分離物bNFB非發(fā)酵桿菌(如寡養(yǎng)單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬)表3. 1992-1994年期間Hospitalier de 1′Universite Laval中心(CHUL)測(cè)試的陽(yáng)性(細(xì)菌計(jì)數(shù)≥107CFU/L)和陰性(細(xì)菌計(jì)數(shù)＜107CFU/L)尿樣品的分布。
分離物數(shù)(％)樣品 92年11月93年4月93年7月94年1月接收的1383(100) 1338(100) 1139(100) 1345(100)陽(yáng)性的267(19.3) 265(19.8) 238(20.9) 281(20.9)陰性的1116(80.7) 1073(80.2) 901(79.1) 1064(79.1)a在標(biāo)準(zhǔn)的診斷方法的基礎(chǔ)上，指示尿道感染的尿樣中細(xì)菌病原體的最小數(shù)量通常為107CFU/L。
表4.CHUL的微生物實(shí)驗(yàn)室中檢測(cè)的陽(yáng)性和陰性臨床樣品的分布。臨床樣品a所測(cè)樣品陰性樣品陽(yáng)性樣品的數(shù)目 百分率％百分率％尿 17,981 19.4 80.6血培養(yǎng)物/骨髓 10,010 6.9 93.1唾液1,266 68.4 31.6表面膿液1,136 72.3 27.7腦脊髓液553 1.0 99.0滑液-關(guān)節(jié)液 523 2.7 97.3支氣管/氣管/扁桃體/喉嚨 502 56.6 43.4深部膿液473 56.8 43.2耳朵289 47.1 52.9胸膜和心包液132 1.0 99.0腹膜液 101 28.6 71.4a從1994年2月到1995年1月檢測(cè)的樣品表5. 用于檢測(cè)DNA片段探針、寡核苷酸探針和PCR引物之特異性的細(xì)菌物種(66)細(xì)菌物種檢測(cè)的 細(xì)菌物種 檢測(cè)的菌株數(shù)目菌株數(shù)目革蘭氏陰性菌 革蘭氏陽(yáng)性菌奇異變形菌 5副流感嗜血菌 2肺炎克雷伯氏菌 5百日咳博德氏菌2銅綠假單胞菌 5副泡膜溶血性嗜血菌2大腸桿菌 5溶血性嗜血菌 2粘膜炎莫拉氏菌 5埃及嗜血菌1普通變形菌 2產(chǎn)吲哆薩頓氏菌1摩氏摩根氏菌 2亞特蘭大莫拉氏菌 1陰溝腸桿菌 2豚鼠奈瑟氏球菌1斯氏普羅威登斯菌 1微黃奈瑟氏球菌1普羅威登斯菌屬物種 1尿道莫拉氏菌 1成團(tuán)泛菌 2宋內(nèi)氏志賀氏菌1雷氏普羅威斯登菌 2弗氏志賀氏菌 1粘液奈瑟氏球菌 1產(chǎn)酸克雷伯氏菌屬 2產(chǎn)堿普羅威登斯菌 1粘質(zhì)沙雷氏菌 2拉氏普羅威斯登菌 1鼠傷寒沙門氏菌1洋蔥伯克霍爾德氏菌 2小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌 1產(chǎn)氣腸桿菌 2醋酸鈣不動(dòng)桿菌1嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌 2魯沃夫氏不動(dòng)桿菌 1熒光假單胞菌 1蜂房哈夫尼菌 2食酸叢毛單胞菌 2差異檸檬酸桿菌1惡臭假單胞菌 2弗勞地氏檸檬酸桿菌1流感嗜血菌 5沙門氏菌屬物種1
表5(續(xù)) 用于檢測(cè)DNA片段探針、寡核苷酸探針和PCR引物之特異性的細(xì)菌物種(66)細(xì)菌物種 檢測(cè)的菌株數(shù)目革蘭氏陽(yáng)性菌肺炎鏈球菌 7唾液鏈球菌 2綠色鏈球菌 2釀膿鏈球菌 2金黃色葡萄球菌 2表皮葡萄球菌 2腐生葡萄球菌 5微球菌屬物種 2棒狀桿菌屬物種 2鏈球菌屬B組2模仿葡萄球菌 2路鄧葡萄球菌 2頭狀葡萄球菌 2溶血葡萄球菌 2人葡萄球菌 2糞腸球菌 2屎腸球菌 1沃氏葡萄球菌 1耐久腸球菌 1牛鏈球菌 1Diphteroids1嗜乳酸芽孢桿菌 1
表6.物種特異性DNA片段和用于雜交的寡核苷酸有機(jī)體a片段探針的數(shù)目b寡核苷酸探針的數(shù)目測(cè)試的 特異性的 普遍性的c合成的 特異性的 普遍性的大腸桿菌d- -- 20 12 9f大腸桿菌 14 22e- --肺炎克雷伯氏菌d- -- 15 11肺炎克雷伯氏菌 33 33 18 12 8奇異變形菌d- -- 3 32奇異變形菌 14 33e15 87銅綠假單胞菌d- -- 26 13 9銅綠假單胞菌 6 22e6 00腐生葡萄球菌 7 44 20 97流感嗜血菌d- -- 16 22流感嗜血菌 1 11 20 11肺炎鏈球菌 - -- 6 11肺炎鏈球菌d19 22 4 11粘膜炎莫拉氏菌2 22 9 88表皮葡萄球菌 62 11 - --金黃色葡萄球菌 30 11 - --通用探針d- -- 7 -7ga沒有試驗(yàn)糞腸球菌和釀膿鏈球菌的DNA片段或寡核苷酸。bDNA片段的大小在0.25到5.0之間。c當(dāng)至少80％的目標(biāo)物種分離物(大約80個(gè)分離菌)被每一個(gè)特異性探針識(shí)別時(shí)，這個(gè)探針就被認(rèn)為是普遍性的。兩個(gè)或更多個(gè)探針結(jié)合可識(shí)別100％的分離物。d這些序列選自數(shù)據(jù)庫(kù)。e用大約10個(gè)目標(biāo)物種的分離物試驗(yàn)普遍性。f大多數(shù)探針不能區(qū)分大腸桿菌和志賀氏菌屬的幾個(gè)種。g用檢測(cè)所有表5中列出的66個(gè)細(xì)菌物種的一組7個(gè)探針試驗(yàn)普遍性。
表7. 尿液、唾液、血液、腦脊髓和其它樣品中常見的細(xì)菌病原體的PCR擴(kuò)增。有機(jī)體 引物對(duì)a擴(kuò)增子大 普遍性bDNA擴(kuò)增自小#(SEQ ID NO) (bp) 菌落c樣品d大腸桿菌 1e(55+56) 10775/80 + +2e(46+47) 29777/80 + +3 42+43) 10278/80 + +4(131+132) 13473/80 + +1+3+4 - 80/80 + +糞腸球菌 1e(38+39) 20071/80 + +2e(40+41) 12179/80 + +1+2 - 80/80 + +肺炎克雷伯氏菌 1(67+68) 19876/80 + +2(61+62) 14367/80 + +3h(135+136)148 78/80 + N.T.i4(137+138) 11669/80 + N.T.
1+2+3- 80/80 + N.T.奇異變形菌 1(74+75) 16773/80 + N.T.
2(133+134) 12380/80 + N.T.
表7(續(xù))尿液、唾液、血液、腦脊髓和其它樣品中常見的細(xì)菌病原體的PCR擴(kuò)增有機(jī)體引物對(duì)a擴(kuò)增子大小 普遍性bDNA擴(kuò)增自#(SEQ ID NO) (bp) 菌落c樣品d銅綠假單胞菌1e(83+84)139 79/80 +N.T.
2e(85+86)223 80/80 +N.T.腐生葡萄球菌1(98+99) 126 79/80 ++2 (139+140) 190 80/80 +N.T.粘膜炎莫拉氏菌 1 (112+113) 157 79/80 +N.T.
2 (118+119) 118 80/80 +N.T.
3 (160+119) 137 80/80 +N.T.流感嗜血菌 1e(154+155) 217 80/80 +N.T.肺炎鏈球菌 1e(156+157) 134 80/80 +N.T.
2e(158+159) 197 74/80 +N.T.
3(78+79) 175 67/80 +N.T.
表7(續(xù))尿液、唾液、血液、腦脊髓和其它樣品中常見的細(xì)菌病原體的PCR擴(kuò)增有機(jī)體 引物對(duì)a擴(kuò)增子大小 普遍性bDNA擴(kuò)增自#(SEQ ID NO) (bp) 菌落c樣品d表皮葡萄球菌1(147+148)175 80/80 +N.T.
2(145+146)125 80/80 +N.T.金黃色葡萄球菌 1(152+153)108 80/80 +N.T.
2(149+150)151 80/80 +N.T.
3(149+151)176 80/80 +N.T.釀膿鏈球菌f1e(141+142)213 80/80 +N.T.
2e(143+144)157 24/24 +N.T.通用的 1e(126-127)241 194/195g++a在PCR測(cè)定中所有的引物對(duì)都是特異性的，因?yàn)橛玫米?6個(gè)不同的革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌(表5)而非興趣細(xì)菌的DNA沒有觀察到擴(kuò)增。b普遍性通常用興趣物種的80個(gè)菌株測(cè)試。所有保留的引物對(duì)擴(kuò)增至少90％的分離物。當(dāng)使用引物的組合時(shí)，達(dá)到了100％的普遍性。c對(duì)于所有的引物對(duì)和多重組合，直接從細(xì)菌克隆進(jìn)行的PCR擴(kuò)增是100％物種特異性的。dpCR測(cè)定直接在尿樣中進(jìn)行。e得自數(shù)據(jù)庫(kù)序列的引物對(duì)。沒有“e”的引物對(duì)得自我們的物種特異性片段。f對(duì)于釀膿鏈球菌，引物對(duì)#1對(duì)鏈球菌屬A組(GAS)是特異性的。引物對(duì)#2對(duì)GAS-產(chǎn)生外毒素A基因(SpeA)是特異性的。g用臨床樣品中常見的病原體的23個(gè)物種代表中的195個(gè)分離物試驗(yàn)普遍性。h進(jìn)行優(yōu)化以消除用一些細(xì)菌物種而不是靶物種觀察到的非特異性擴(kuò)增。iN.T.未試驗(yàn)。
表8.選擇的用于診斷的抗生素抗性基因基因 抗生素 細(xì)菌aSEQ ID NO(blatem)TEM-1 β-內(nèi)酰胺 腸桿菌科，假單孢菌科，161嗜血菌屬，巴斯德氏菌屬(blarob)ROB-1 β-內(nèi)酰胺 克雷伯氏菌屬 162(blashv)SHV-1 β-內(nèi)酰胺 和其它腸桿菌科物種163aadB，aacC1，aacC2， 氨基糖苷類 腸桿菌科，假單胞菌科 164，165，166aacC3，aacA4 167，168mecA β-內(nèi)酰胺 葡萄球菌屬169vanH，vanA，vanx 萬(wàn)古霉素 大腸桿菌屬170staA 大環(huán)內(nèi)酯 大腸桿菌屬173aacA-aphvD 氨基糖苷類 大腸桿菌屬，葡萄球菌屬174vat 大環(huán)內(nèi)酯 葡萄球菌屬175vga 大環(huán)內(nèi)酯 葡萄球菌屬176msrA 紅霉素 葡萄球菌屬177Int和Sul β-內(nèi)酰胺類，三甲氯芐二腸桿菌科 171，172保守序列 氨嘧啶，氨基苷類，消毒 假單胞菌科劑，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶a特異的抗生素抗性基因有較高的出現(xiàn)率。并不排除在其它細(xì)菌中存在。
附錄I.用于雜交的特異性和普遍性的寡核苷酸SEQ ID NO核苷酸序列起始DNA片段SEQ ID 核苷酸位置NO細(xì)菌物種 大腸桿菌44 5′-CAC CCG CTT GCG TGG CAA GCT GCC C 5a213-23745 5′-CGT TTG TGG ATT CCA GTT CCA TCC G 5a489-51348 5′-TGA AGC ACT GGC CGA AAT GCT GCG T 6a759-78349 5′-GAT GTA CAG GAT TCG TTG AAG GCT T 6a898-92250 5′-TAG CGA AGG CGT AGC AGA AAC TAA C 7a1264-128851 5′-GCA ACC CGA ACT CAA CGC CGG ATT T 7a1227-125152 5′-ATA CAC AAG GGT CGC ATC TGC GGC C 7a1313-133753 5′-TGC GTA TGC ATT GCA GAC CTT GTG GC 7a111-13654 5′-GCT TTC ACT GGA TAT CGC GCT TGG G 7a373-397細(xì)菌物種 奇異變形菌70b5′-TGG TTC ACT GAC TTT GCG ATG TTT C 12 23-4771 5′-TCG AGG ATG GCA TGC ACT AGA AAA T 12 53-7772b5′-CGC TGA TTA GGT TTC GCT AAA ATC TTA TTA 12 80-10973 5′-TTG ATC CTC ATT TTA TTA ATC ACA TGA CCA 12 174-203a得自數(shù)據(jù)庫(kù)的序列b這些序列得自序列表中給出的序列的相反DNA鏈(opposite DNAstrand)
附錄I.用于雜交的特異性和普遍性的寡核苷酸SEQ ID NO核苷酸序列 起始DNA片段SEQ ID 核苷酸位置NO細(xì)菌物種 奇異變形菌76 5′-CCG CCT TTA GCA TTA ATT GGT GTT TAT AGT 13246-27577 5′-CCT ATT GCA GAT ACC TTA AAT GTC TTG GGC 13291-32080b5′-TTG AGT GAT GAT TTC ACT GAC TCC C 1418-4281 5′-GTC AGA CAG TGA TGC TGA CGA CAC A 15a1185-120982 5′-TGG TTG TCA TGC TGT TTG TGT GAA AAT 15a1224-1250細(xì)菌物種 肺炎克雷伯氏菌57 5′-GTG GTG TCG TTC AGC GCT TTC AC 8 45-6758 5′-GCG ATA TTC ACA CCC TAC GCA GCC A 9 161-18559b5′-GTC GAA AAT GCC GGA AGA GGT ATA CG 9 203-22860b5′-ACT GAG CTG CAG ACC GGT AAA ACT CA 9 233-25863b5′-CGT GAT GGA TAT TCT TAA CGA AGG GC 10250-27564b5′-ACC AAA CTG TTG AGC CGC CTG GA 10201-22365 5′-GTG ATC GCC CCT CAT CTG CTA CT 1077-9966 5′-CGC CCT TCG TTA AGA ATA TCC ATC AC 10249-27469 5′-CAG GAA GAT GCT GCA CCG GTT GTT G 11a296-320a得自數(shù)據(jù)庫(kù)的序列b這些序列得自序列表中給出的序列的相反DNA鏈附錄I.用于雜交的特異性和普遍性的寡核苷酸SEQ ID NO核苷酸序列 起始DNA片段SEQ ID 核苷酸位置NO細(xì)菌物種銅綠假單胞菌87 5′-AAT GCG GCT GTA CCT CGG CGC TGG T 18a2985-300988 5′-GGC GGA GGG CCA GTT GCA CCT GCC A 18a2929-295389 5′-AGC CCT GCT CCT CGG CAG CCT CTG C 18a2821-284590 5′-TGG CTT TTG CAA CCG CGT TCA GGT T 18a1079-110391 5′-GCG CCC GCG AGG GCA TGC TTC GAT G 19a705-72992 5′-ACC TGG GCG CCA ACT ACA AGT TCT A 19a668-69293 5′-GGC TAC GCT GCC GGG CTG CAG GCC G 19a505-52994 5′-CCG ATC TAC ACC ATC GAG ATG GGC G 20a1211-123595 5′-GAG CGC GGC TAT GTG TTC GTC GGC T 20a2111-2135細(xì)菌物種肺炎鏈球菌120 5′-TCT GTG CTA GAG ACT GCC CCA TTT C 30423-447121 5′-CGA TGT CTT GAT TGA GCA GGG TTA T 31a1198-1222a得自數(shù)據(jù)庫(kù)的序列b這些序列得自序列表中給出的序列的相反DNA鏈附錄I.用于雜交的特異性和普遍性的寡核苷酸SEQ ID NO 核苷酸序列 起始DNA片段SEQ ID核苷酸位置NO細(xì)菌物種 腐生葡萄球菌965′-CGT TTT TAC CCT TAC CTT TTC GTA CTA CC 21 45-7397b5′-TCA GGC AGA GGT AGT ACG AAA AGG TAA GGG 21 53-82100 5′-CAC CAA GTT TGA CAC GTG AAG ATT CAT 22 89-115101b5′-ATG AGT GAA GCG GAG TCA GAT TAT GTG CAG 23 105-134102 5′-CGC TCA TTA CGT ACA GTG ACA ATC G24 20-44103 5′-CTG GTT AGC TTG ACT CTT AAC AAT CTT GTC 24 61-90104b5′-GAC GCG ATT GTC ACT GTA CGT AAT GAG CGA 24 19-48細(xì)菌物種 粘膜炎莫拉氏菌108 5′-GCC CCA AAA CAA TGA AAC ATA TGG T28 81-105109 5′-CTG CAG ATT TTG GAA TCA TAT CGC C28 126-150110 5′-TGG TTT GAC CAG TAT TTA ACG CCA T28 165-189111 5′-CAA CGG CAC CTG ATG TAC CTT GTA C28 232-256114 5′-TTA CAA CCT GCA CCA CAA GTC ATC A29 97-121115 5′-GTA CAA ACA AGC CGT CAG CGA CTT A29 139-163116 5′-CAA TCT GCG TGT GTG CGT TCA CT 29 178-200117 5′-GCT ACT TTG TCA GCT TTA GCC ATT CA 29 287-312a得自數(shù)據(jù)庫(kù)的序列b這些序列得自序列表中給出的序列的相反DNA鏈附錄I.用于雜交的特異性和普遍性的寡核苷酸SEQ ID NO 核苷酸序列 起始DNA片段SEQ ID 核苷酸位置NO細(xì)菌物種流感嗜血菌105b5′-GCG TCA GAA AAA GTA GGC GAA ATG AAA G25 138-165106b5′-AGC GGC TCT ATC TTG TAA TGA CAC A26a770-794107b5′-GAA ACG TGA ACT CCC CTC TAT ATA A27a5184-5208通用探針c122b5′-ATC CCA CCT TAG GCG GCT GGC TCC A- -123 5′-ACG TCA AGT CAT CAT GGC CCT TAC GAG TAG G- -124b5′-GTG TGA CGG GCG GTG TGT ACA AGG C- -125b5′-GAG TTG CAG ACT CCA ATC CGG ACT ACG A - -128b5′-CCC TAT ACA TCA CCT TGC GGT TTA GCA GAG AG - -129 5′-GGG GGG ACC ATC CTC CAA GGC TAA ATA C- -130b5′-CGT CCA CTT TCG TGT TTG CAG AGT GCT GTG TT - -a得自數(shù)據(jù)庫(kù)的序列b這些序列得自序列表中給出的序列的相反DNA鏈c通用探針源于不包括在序列表中的16S或23S核糖體RNA基因序列附錄II.用于DNA擴(kuò)增的特異性和普遍性的引物SEQ ID NO核苷酸序列起始DNA片段SEQ ID 核苷酸位置NO細(xì)菌物種 大腸桿菌425′-GCT TTC CAG CGT CAT ATT G 4 177-19543b5′-GAT CTC GAC AAA ATG GTG A 4 260-278465′-TCA CCC GCT TGC GTG GC 5a212-22847b5′-GGA ACT GGA ATC CAC AAA C 5a490-508555′-GCA ACC CGA ACT CAA CGC C 7a1227-124556b 5′-GCA GAT GCG ACC CTT GTG T 7a1315-1333131 5′-CAG GAG TAC GGT GAT TTT TA 3 60-79132b5′-ATT TCT GGT TTG GTC ATA CA 3 174-193細(xì)菌物種 糞腸球菌385′-GCA ATA CAG GGA AAA ATG TC 1a69-8839b5′-CTT CAT CAA ACA ATT AAC TC 1a249-268405′-GAA CAG AAG AAG CCA AAA AA 2a569-58841b5′-GCA ATC CCA AAT AAT ACG GT 2a670-689a得自數(shù)據(jù)庫(kù)的序列b這些序列得自序列表中給出的序列的相反DNA鏈附錄II.用于DNA擴(kuò)增的特異性和普遍性的引物SEQ ID NO核苷酸序列 起始DNA片段SEQ ID核苷酸位置NO細(xì)菌物種 肺炎克雷伯氏菌61 5′-GAC AGT CAG TTC GTC AGC C 9 37-5562b5′-CGT AGG GTG TGA ATA TCG C 9 161-17967 5′-TCG CCC CTC ATC TGC TAC T 1081-9968b5′-GAT CGT GAT GGA TAT TCT T 10260-2781355′-GCA GCG TGG TGT CGT TCA 8 40-57136b5′-AGC TGG CAA CGG CTG GTC 8 170-1871375′-ATT CAC ACC CTA CGC AGC CA 9 166-185138b5′-ATC CGG CAG CAT CTC TTT GT 9 262-281細(xì)菌物種 奇異變形菌74 5′-GAA ACA TCG CAA AGT CAG T 1223-4175b5′-ATA AAA TGA GGA TCA AGT TC 12170-1891335′-CGG GAG TCA GTG AAA TCA TC 1417-36134b5′-CTA AAA TCG CCA CAC CTC TT 14120-139a得自數(shù)據(jù)庫(kù)的序列b這些序列得自序列表中給出的序列的相反DNA鏈附錄II.用于DNA擴(kuò)增的特異性和普遍性的引物SEQ ID NO 核苷酸序列 起始DNA片段SEQ ID 核苷酸位置NO細(xì)菌物種腐生葡萄球菌98 5′-CGT TTT TAC CCT TAC CTT TTC GTA CT21 45-7099b5′-ATC GAT CAT CAC ATT CCA TTT GTT TTT A 21 143-170139 5′-CTG GTT AGC TTG ACT CTT AAC AAT C 24 61-85140b5′-TCT TAA CGA TAG AAT GGA GCA ACT G 24 226-250細(xì)菌物種銅綠假單胞菌83 5′-CGA GCG GGT GGT GTT CAT C 16a554-57284b5′-CAA GTC GTC GTC GGA GGG A 16a674-69285 5′-TCG CTG TTC ATC AAG ACC C 17a1423-144186b5′-CCG AGA ACC AGA CTT CAT C 17a1627-1645細(xì)菌物種粘膜炎莫拉氏菌112 5′-GGC ACC TGA TGT ACC TTG 28 235-252113b5′-AAC AGC TCA CAC GCA TT28 375-391118 5′-TGT TTT GAG CTT TTT ATT TTT TGA 29 41-64119b5′-CGC TGA CGG CTT GTT TGT ACC A 29 137-158160 5′-GCT CAA ATC AGG GTC AGC 29 22-39119b5′-CGC TGA CGG CTT GTT TGT ACC A 29 137-158a得自數(shù)據(jù)庫(kù)的序列b這些序列得自序列表中給出的序列的相反DNA鏈附錄II.用于DNA擴(kuò)增的特異性和普遍性的引物SEQ ID NO 核苷酸序列 起始DNA片段SEQ ID核苷酸位置NO細(xì)菌物種表皮葡萄球菌145 5′-ATC AAA AAG TTG GCG AAC CTT TTC A 3621-45146b5′-CAA AAG AGC GTG GAG AAA AGT ATC A 36 121-145147 5′-TCT CTT TTA ATT TCA TCT TCA ATT CCA TAG 36 448-477148b5′-AAA CAC AAT TAC AGT CTG GTT ATC CAT ATC 36 593-622細(xì)菌物種金黃色葡萄球菌149b5′-CTT CAT TTT ACG GTG ACT TCT TAG AAG ATT 37 409-438150 5′-TCA ACT GTA GCT TCT TTA TCC ATA CGT TGA 37 288-317149b5′-CTT CAT TTT ACG GTG ACT TCT TAG AAG ATT 37 409-438151 5′-ATA TTT TAG CTT TTC AGT TTC TAT ATC AAC 37 263-292152 5′-AAT CTT TGT CGG TAC ACG ATA TTC TTC ACG 37 5-34153b5′-CGT AAT GAG ATT TCA GTA GAT AAT ACA ACA 3783-112a得自數(shù)據(jù)庫(kù)的序列b這些序列得自序列表中給出的序列的相反DNA鏈附錄II.用于DNA擴(kuò)增的特異性和普遍性的引物SEQ ID NO 核苷酸序列 起始DNA片段SEQ ID 核苷酸位置NO細(xì)菌物種 流感嗜血菌154 5′-TTT AAC GAT CCT TTT ACT CCT TTT G 27a5074-5098155b5′-ACT GCT GTT GTA AAG AGG TTA AAA T 27a5266-5290細(xì)菌物種 肺炎鏈球菌78 5′-AGT AAA ATG AAA TAA GAA CAG GAC AG34 164-18979b5′-AAA ACA GGA TAG GAG AAC GGG AAA A 34 314-338156 5′-ATT TGG TGA CGG GTG ACT TT31a1401-1420157b5′-GCT GAG GAT TTG TTC TTC TT31a1515-1534158 5′-GAG CGG TTT CTA TGA TTG TA35a1342-1361159b5′-ATC TTT CCT TTC TTG TTC TT35a1519-1538細(xì)菌物種 化膿鏈球菌141 5′-TGA AAA TTC TTG TAA CAG GC32a286-305142b5′-GGC CAC CAG CTT GCC CAA TA32a479-498143 5′-ATA TTT TCT TTA TGA GGG TG33a966- 985144b5′-ATC CTT AAA TAA AGT TGC CA33a1103-1122a得自數(shù)據(jù)庫(kù)的序列b這些序列得自序列表中給出的序列的相反DNA鏈附錄II.用于DNA擴(kuò)增的特異性和普遍性的引物SEQ ID NO核苷酸序列起始DNA片段SEQ ID 核苷酸位置NO通用引物C126 5′-GGA GGA AGG TGG GGA TGA CG - -127b 5′-ATG GTG TGA CGG GCG GTG TG - -a得自數(shù)據(jù)庫(kù)的序列b這些序列得自序列表中給出的序列的相反DNA鏈c通用探針源于不包括在序列表中的16S或23S核糖體RNA基因序列附錄III.通過(guò)細(xì)菌16S和23S核糖體RNA基因的序列對(duì)比選擇通用探針SEQ ID NO122的相反鏈(Reverse strand) TGGAGCC AGCCGCCTAA GGTGGGAT1461 1510唾液鏈球菌 TGAGGTAACC TTTTGGAGCC AGCCGCCTAA GGTGGGATAG ATGANNGGGG普通變性菌 TAGCTTAACC TTCGGGAGGG CGCTTACCAC TTTGTGATTC ATGACTGGGG銅綠假單胞菌TAGTCTAACC GCAAGGGGGA CGGTTACCAC GGAGTGATTC ATGACTGGGG淋病奈瑟氏球菌 TAGGGTAACC GCAAGGAGTC CGCTTACCAC GGTATGCTTC ATGACTGGGG乳鏈球菌TTGCCTAACC GCAAGGAGGG CGCTTCCTAA GGTAAGACCG ATGACNNGGG
附錄III.通過(guò)細(xì)菌16S和23S核糖體RNA基因的序列對(duì)比選擇通用探針SEQ ID NO123ACGTCAAGTCATCATGGC CCTTACGAGT AGG1251 1300流感嗜血菌GGTNGGGATG ACGTCAAGTC ..ATCATGGC CCTTACGAGT AGGGCTACAC淋病奈瑟氏球菌GGTGGGGATG ACGTCAAGTC ..CTCATGGC CCTTATGACC AGGGCTTCAC蔥頭假單胞菌 GGTNGGGATG ACGTCAAGTC ..CTCATGGC CCTTATGGGT AGGGCTTCAC粘質(zhì)沙雷氏菌 GGTGGGGATG ACGTCAAGTC ..ATCATGGC CCTTACGAGT AGGGCTACAC大腸桿菌 GGTGGGGATG ACGTCAAGTC ..ATCATGGC CCTTACGACC AGGGCTACAC普通變性菌GGTGGGGATG ACGTTAAGTC GTATCATGGC CCTTACGAGT AGGGCTACAC銅綠假單胞菌 GGTGGGGATG ACGTCAAGTC ..ATCATGGC CCTTACGGCN AGGGCTACAC產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌 GGTGGGGATG ACGTNNAATC ..ATCATGCC CNTTATGTGT AGGGCTACAC人形枝原體GGTGGGGATG ACGTCAAATC ..ATCATGCC TCTTACGAGT GGGGCCACAC幽門螺桿菌GGTGGGGACG ACGTCAAGTC ..ATCATGGC CCTTACGCCT AGGGCTACAC肺炎枝原體GGAAGGGATG ACGTCAAATC ..ATCATGCC CCTTATGTCT AGGGCTGCAA
附錄III.通過(guò)細(xì)菌16S和23S核糖體RNA基因的序列對(duì)比選擇通用探針SEQID NO124的相反鏈(Reverse strand)GCCTTGTACA CACCGCCCGTCACAC1451 1490大腸桿菌 ACGTTCCCGGGCCTTGTACA CACCGCCCGTCACACCATGG淋病奈瑟氏球菌 ACGTTCCCNGNNCTTGTACA CACCGCCCGTCACACCATGG蔥頭假單胞菌 ACGTTCCCGGGTCTTGTACA CACNGCCCGTCACACCATGG粘質(zhì)沙雷氏菌 ACGTTCCCGGGCCTTGTACA CACCGCCCGTCACACCATGG普通變性菌 ACGTTCCCGGGCCTTGTACA CACCGCCCGTCACACCATGG流感嗜血菌 ACGTTCCCGGGCNTTGTACA CACCGCCCGTCACACCATGG銅綠假單胞菌 ACGTTCCCGGGCCTTGTACA CACCGCCCGTCACACCATGG產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌 ACGTTCCCNGGTCTTGTACA CACCGCNCGTCACACCATGA人形枝原體 ACGTTCTCGGGTCTTGTACA CACCGCCCGTCACACCATGG幽門螺桿菌 ACGTTCCCGGGTCTTGTACT CACCGCCCGTCACACCATGG肺炎枝原體 ACGTTCTCGGGTCTTGTACA CACCGCCCGTCAAACTATGA
附錄III.通過(guò)細(xì)菌16S和23S核糖體RNA基因的序列對(duì)比選擇通用探針SEQ ID NO125的相反鏈(Reverse strand)TCG TAGTCCGGAT TGGAGTCTGC AACTC1361 1400大腸桿菌 AAGTGCGTCG TAGTCCGGAT TGGAGTCTGC AACTCGACTC淋病奈瑟氏球菌 AAACCGATCG TAGTCCGGAT TGCACTCTGC AACTCGAGTG蔥頭假單胞菌 AAACCGATCG TAGTCCGGAT TGCACTCTGC AACTCGAGTG粘質(zhì)沙雷氏菌 AAGTATGTCG TAGTCCGGAT TGGAGTCTGC AACTCGACTC普通變性菌 AAGTCTGTCG TAGTCCGGAT TGGAGTCTGC AACTCGACTC流感嗜血菌 AAGTACGTCT AAGTCCGGAT TGGAGTCTGC AACTCGACTC銅綠假單胞菌 AAACCGATCG TAGTCCGGAT CGCAGTCTGC AACTCGACTG產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌 AAACCAGTCT CAGTTCGGAT TGTAGGCTGA AACTCGCCTA人形枝原體 AAGCCGATCT CAGTTCGGAT TGGAGTCTGC AATTCGACTC幽門螺桿菌 ACACC..TCT CAGTTCGGAT TGTAGGCTGC AACTCGCCTG肺炎枝原體 AAGTTGGTCT CAGTTCGGAT TGAGGGCTGC AATTCGTCCT
附錄III.通過(guò)細(xì)菌16S和23S核糖體RNA基因的序列對(duì)比選擇通用探針SEQ ID NO128的相反鏈CT CTCTGCTAAA CCGCAAGGTG ATGTATAGGG1991 2040乳酸乳芽孢桿菌AAACACAGCT CTCTGCTAAA CCGCAAGGTG ATGTATAGGG GGTGACGCCT大腸桿菌 AAACACAGCA CTGTGCAAAC ACGAAAGTGG ACGTATACGG TGTGACGCCT銅綠假單胞菌 AAACACAGCA CTCTGCAAAC ACGAAAGTGG ACGTATAGGG TGTGACGCCT蔥頭假單胞菌 AAACACAGCA CTCTGCAAAC ACGAAAGTGG ACGTATAGGG TGTGACGCCT嗜熱脂肪芽孢桿菌 AAACACAGGT CTCTGCGAAG TCGTAAGGCG ACGTATAGGG GCTGACACCT藤黃微球菌AAACACAGGT CCATGCGAAG TCGTAAGACG ATGTATATGG ACTGACTCCTSEQ ID NO129 GGGGGGACC ATCCTCCAAG GCTAAATAC481 530大腸桿菌 TGTCTGAATA TGGGGGGACC ATCCTCCAAG GCTAAATACT CCTGACTGAC銅綠假單胞菌 TGTCTGAACA TGGGGGGACC ATCCTCCAAG GCTAAATACT ACTGACTGAC蔥頭假單胞菌 TGTCTGAAGA TGGGGGGACC ATCCTCCAAG GCTAAATACT CGTGATCGAC乳酸乳芽孢桿菌AGTTTGAATC CGGGAGGACC ATCTCCCAAC CCTAAATACT CCTTAGTGAC藤黃微球菌CGTGTGAATC TGCCAGGACC ACCTGGTAAG CCTGAATACT ACCTGTTGAC
附錄III.通過(guò)細(xì)菌16S和23S核糖體RNA基因的序列對(duì)比選擇通用探針SEQ ID NO130的相反鏈AACACAGCA CTCTGCAAAC ACGAAAGTGG ACG19812030銅綠假單胞菌 TGTTTATTAA AAACACAGCA CTCTGCAAAC ACGAAAGTGG ACGTATAGGG大腸桿菌 TGTTTATTAA AAACACAGCA CTGTGCAAAC ACGAAAGTGG ACGTATACGG蔥頭假單胞菌 TGTTTAATAA AAACACAGCA CTCTGCAAAC ACGAAAGTGG ACGTATAGGG嗜熱脂肪芽孢桿菌 TGTTTATCAA AAACACAGGT CTCTGCGAAG TCGTAAGGCG ACGTATAGGG乳酸乳芽孢桿菌TGTTTATCAA AAACACAGCT CTCTGCTAAA CCGCAAGGTG ATGTATAGGG藤黃微球菌TGTTTATCAA AAACACAGGT CCATGCGAAG TCGTAAGACG ATGTATATGG
附錄IV.通過(guò)細(xì)菌16S核糖體RNA基因的序列對(duì)比選擇通用PCR引物SEQ ID NO126 GGAGGAA GGTGGGGATG ACGSEQ ID NO127的相反鏈 CA CACCGCCCGT CACACCAT12411270......14611490大腸桿菌 ACTGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAGTC......GCCTTGTACA CACCGCCCGT CACACCATGG淋病奈瑟氏球菌GCCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAGTC......NNCTTGTACA CACCGCCCGT CACACCATGG蔥頭假單胞菌 ACCGGAGGAA GGTNGGGATG ACGTCAAGTC......GTCTTGTACA CACNGCCCGT CACACCATGG粘質(zhì)沙雷氏菌 ACTGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAGTC......GCCTTGTACA CACCGCCCGT CACACCATGG普通變性菌ACCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTTAAGTC......GCCTTGTACA CACCGCCCGT CACACCATGG流感嗜血菌ACTGGAGGAA GGTNGGGATG ACGTCAAGTC......GCNTTGTACA CACCGCCCGT CACACCATGG嗜肺軍團(tuán)菌ACCGGAGGAA GGCGGGGATG ACGTCAAGTC......GCCTTGTACA CACCGCCCGT CACACCATGG銅綠假單胞菌 ACCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAGTC......GCCTTGTACA CACCGCCCGT CACACCATGG產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌 CCAGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTNNAATC......GTCTTGTACA CACCGCNCGT CACACCATGA人形枝原體CTGGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAATC......GTCTTGTACA CACCGCCCGT CACACCATGG幽門螺桿菌GGAGGAGGAA GGTGGGGACG ACGTCAAGTC......GTCTTGTACT CACCGCCCGT CACACCATGG肺炎枝原體ATTGGAGGAA GGAAGGGATG ACGTCAAATC......GTCTTGTACA CACCGCCCGT CAAACTATGA
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人BERGERON，Michel G.
OUELLETTE，MarcROY，Paul H.(ii)發(fā)明名稱用于微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室日常診斷中迅速檢測(cè)和鑒別臨床樣品中普通細(xì)菌病原體和抗生素抗性基因之特異性和通用性探針及擴(kuò)增引物(iii)序列數(shù)177(iv)通訊地址(A)聯(lián)系人(B)街道(C)城市(D)州(E)國(guó)家(F)ZIP(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤，800K(B)計(jì)算機(jī)Macintosh IIci(C)操作系統(tǒng)7.0(D)軟件Word 5.la(vi)當(dāng)前申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類號(hào)(vii)在先申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(viii)律師/代理人資料(A)姓名JEAN C.BAKER
(B)登記號(hào)(ix)電信信息(A)電話(B)傳真(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1817個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體糞腸球菌(xi)序列描述SEQ ID NO1ACAGTAAAAAAGTTGTTAAC GAATGAATTT GTTAACAACTTTTTTGCTAT 50GGTATTGAGTTATGAGGGGC AATACAGGGA AAAATGTCGGCTGATTAAGG 100AATTTAGATAGTGCCGGTTA GTAGTTGTCT ATAATGAAAATAGCAACAAA 150TATTTACGCAGGGAAAGGGG CGGTCGTTTA ACGGGAAAAATTAGGGAGGA 200TAAAGCAATACTTTTGTTGG GAAAAGAAAT AAAAGGAAACTGGGGAAGGA 250GTTAATTGTTTGATGAAGGG AAATAAAATT TTATACATTTTAGGTACAGG 300CATCTTTGTTGGAAGTTCAT GTCTATTTTC TTCACTTTTTGTAGCCGCAG 350AAGAACAAGTTTATTCAGAA AGTGAAGTTT CAACAGTTTTATCGAAGTTG 400GAAAAGGAGGCAATTTCTGA GGCAGCTGCT GAACAATATACGGTTGTAGA 450TCGAAAAGAAGACGCGTGGG GGATGAAGCA TCTTAAGTTAGAAAAGCAAA 500CGGAAGGCGTTACTGTTGAT TCAGATAATG TGATTATTCATTTAGATAAA 550AACGGTGCAGTAACAAGTGT TACAGGAAAT CCAGTTGATCAAGTTGTGAA 600AATTCAATCGGTTGATGCAA TCGGTGAAGA AGGAGTTAAAAAAATTGTTG 650CTTCTGATAATCCAGAAACT AAAGATCTTG TCTTTTTAGCTATTGACAAA 700CGTGTAAATAATGAAGGGCA ATTATTTTAT AAAGTCAGAGTAACTTCTTC 750ACCAACTGGTGACCCCGTAT CATTGGTTTA TAAAGTGAACGCTACAGATG 800GAACAATTATGGAAAAACAA GATTTAACGG AACATGTCGGTAGTGAAGTA 850ACGTTAAAAAACTCTTTTCA AGTAACGTTT AATGTACCAGTTGAAAAAAG 900CAATACGGGAATTGCTTTAC ACGGAACGGA TAACACAGGGGTTTACCATG 950CAGTAGTTGA TGGCAAAAATAATTATTCTA TTATTCAAGCGCCATCACTA 1000GCGACATTAA ATCAGAATGCTATTGACGCC TATACGCATGGAAAATTTGT 1050GAAAACATAT TATGAAGATCATTTCCAACG ACACAGTATTGATGATCGAG 1100GGATGCCCAT CTTGTCAGTTGTTGATGAAC AACATCCAGATGCTTATGAC 1150AATGCTTTTT GGGATGGAAAAGCAATGCGT TATGGTGAAACAAGTACACC 1200AACAGGAAAA ACGTATGCTTCCTCTTTAGA TGTAGTTGGTCATGAAATGA 1250CACATGGTGT GACGGAACATACTGCCGGTT TAGAATATTTAGGACAATCA 1300GGTGCCTTGA ATGAATCTTATTCTGATTTG ATGGGTTATATTATTTCGGG 1350TGCATCTAAT CCAGAAATTGGTGCGGATAC TCAGAGTGTTGACCGAAAAA 1400CAGGTATTCG AAATTTACAAACGCCAAGTA AACACGGACAACCAGAAACC 1450ATGGCTCAAT ACGACGATCGAGCACGGTAT AAAGGAACGCCTTATTATGA 1500TCAAGGCGGT GTTCATTATAACAGTGGAAT TATTAATCGGATTGGTTACA 1550CCATTATCCA GAACTTAGGCATTGAAAAAG CACAGACTATTTTCTACAGC 1600TCGTTAGTAA ATTACTTAACACCTAAAGCA CAATTCAGTGATGCTCGTGC 1650TGCGATGCTT GCTGCTGCAAAAGTTCAATA TGGCGATGAAGCAGCTTCAG 1700TGGTGTCAGC AGCCTTTAACTCTGCTGGAA TCGGAGCTAAAGAAGACATT 1750CAGGTAAACC AACCAAGTGAATCTGTTCTG GTCAATGAATGAAAAAAATT 1800CCCCAATTAA ATAAAAA 1817(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2275個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體糞腸球菌(xi)序列描述 SEQ ID NO2GGTACCAAAGAAAAAAACGAACGCCACAAC CAACAGCCTCTAAAGCAACA 50CCTGCTTCTGAAATTGAGGGAGATTTAGCA AATGTCAATGAGATTCTTTT 100GGTTCACGATGATCGTGTCGGGTCAGCAAC GATGGGAATGAAAGTCTTAG 150AAGAAATTTTAGATAAAGAGAAAATTTCAA TGCCGATTCGAAAAATTAAT 200ATTAATGAATTAACTCAACAAACACAGGCT TTAATTGTCACAAAAGCTGA 250ACTAACGGAACAAGCACGTAAAAAAGCACC GAAAGCGACACACTTATCAG 300TAAAAAGTTATGGTTAATCCCCAAAAATAT GAAACAGTGG GTTTCGCTCT 350TAAAAGAAAGTGCCTAGAGAGGAAGAAAAC AATGGAAAAT CTTACGAATA 400TTTCAATTGAATTAAATCAACAGTTTAATA CAAAAGAAGA AGCTATTCGC 450TTTTCCGGCCAGAAACTAGTCGAGGCAGGC TGTGTTGAGC CCGCTTATAT 500CGAAGCAATGATTGAAAGAGACCAATTGCT ATCTGCCCAT ATGGGGAATT 550TTATTGCCATTCCTCATGGAACAGAAGAAG CCAAAAAATT AGTGAAAAAA 600TCAGGAATCTGTGTAGTGCAAGTCCCAGAG GGCGTTAATT TTGGCACCGA 650AGAAGATGAAAAAATTGCTACCGTATTATT TGGGATTGCC GGAGTCGGTG 700AAGAACATTTGCAATTAGTCCAACAAATTG CACTTTATTG TAGTGATATG 750GATAACGTGGTGCAACTTGCCGATGCATTA AGTAAAGAAG AAATAACAGA 800(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度227個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體大腸桿菌(xi)序列描述 SEQ ID NO3GATCCGCCAT GGGTTGTTTT CCGATTGAGG ATTTTATAGA TGGTTTCTGG 50CGACCTGCAC AGGAGTACGG TGATTTTTAA TTATTGCAAT TGCACAAGAG 100TCAGTTCTCC CCCAAAGACA GCACCGGTAT CAATATAATG CAGGTTGCCA 150ATATCCACGC GATGGCGCAA AGGTGTATGA CCAAACCAGA AATGATCGGC 200CACCTGCATC GCCAGTTCGC GAGTCGG 227(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度278個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體大腸桿菌(xi)序列描述SEQ ID NO4GATCTAAATC AAATTAATTGGTTAAAGATA ACCACAGCGGGGCCGACATA 50AACTCTGACA AGAAGTTAACAACCATATAA CCTGCACAGGACGCGAACAT 100GTCTTCTCAT CCGTATGTCACCCAGCAAAA TACCCCGCTGGCGGACGACA 150CCACTCTGAT GTCCACTACCGATCTCGCTT TCCAGCGTCATATTGGGGCG 200CGCTACGTTG GGGCGTGGGCGTAATTGGTC AATCAGGCGCGGGGTCAGCG 250GATAAACATT CACCATTTTGTCGAGATC278(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1596個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體大腸桿菌(xi)序列描述SEQ ID NO5ATGGCTGACA TTCTGCTGCT CGATAATATC GACTCTTTTA CGTACAACCT 50GGCAGATCAG TTGCGCAGCA ATGGGCATAA CGTGGTGATT TACCGCAACC 100ATATACCGGC GCAAACCTTA ATTGAACGCT TGGCGACCAT GAGTAATCCG 150GTGCTGATGC TTTCTCCTGG CCCCGGTGTG CCGAGCGAAG CCGGTTGTAT 200GCCGGAACTC CTCACCCGCT TGCGTGGCAA GCTGCCCATT ATTGGCATTT 250GCCTCGGACA TCAGGCGATT GTCGAAGCTT ACGGGGGCTA TGTCGGTCAG 300GCGGGCGAAA TTCTCCACGG TAAAGCCTCC AGCATTGAAC ATGACGGTCA 350GGCGATGTTT GCCGGATTAA CAAACCCGCT GCCGGTGGCG CGTTATCACT 400CGCTGGTTGG CAGTAACATT CCGGCCGGTT TAACCATCAA CGCCCATTTT 450AATGGCATGG TGATGGCAGT ACGTCACGAT GCGGATCGCG TTTGTGGATT 500CCAGTTCCAT CCGGAATCCA TTCTCACCAC CCAGGGCGCT CGCCTGCTGG 550AACAAACGCTGGCCTGGGCGCAGCATAAAC 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(A)有機(jī)體銅綠假單胞菌(xi)序列描述SEQ ID NO18TCGAGACGGG AAGCCACTCTCTACGAGAAG ACAGAAGCCC CTCACAGAGG 50CCTCTGTCTA CGCCTACTAAAGCTCGGCTT ATTCATATGT ATTTATATTC 100TTTCAATAGA TCACTCAGCGCTATTTTAAG TTCACCCTCT GTAAGTTCAC 150CTGGGCGCTC TTTCTTTCCTTCGGTAAAGC TGTCGGCCAG ACCAAACATT 200AAACTCAAGC ATCTCCCAAGCGATGCATCA TCTTGGGCCA GCATCCCTGA 250ATCGCGCGTC GGACCTCCAAGTCTTAAAAA ATTCTTCGCT GAAGGTTTTC 300CCATCAATCG ATGAGGCTAATAGCTTCTTT GCAATATCTA TCATTTCCAT 350GCTCACCTTA AAGCACCTCATTTTTCATGT AAAAATTGTA TTGATCCGTG 400CCAGACTCAA TCCTCCACCCAGAAACAAAC ATCCCATCCT CTCCAATGAT 450AACAACAATA TTAGTCCTGGCATTGTAATG TACTTTTGAG TTTACTTCGG 500AGTGGTAAGT CCCTTTTTCTACGGTTGCAG GATCAGCAAG GTGCTCAAGA 550ATTTTATCCC TAAACTCTGCAAGCGTTCCA TTGTTGGCGC TTTTTTCACC 600CAGCCCAAAA TCATATTTGTGGCTATCAAA TTTTTTCTGT AGTTGCCTCC 650GTGTGAAGAT ACCACTATCAAGAGGACTAC TGAGCATTAC ATAAACAGGT 700TTGACTCCAG AATCCGCCGGGAAAATCACG ATCAGATCGT TTAGGTCCAG 750TAGCATTCCC GGATAGGACTCCGGGCCGGT CTTCAACGGT GTGAGGGCCG 800CTCCCTCATA TACCGGCACCGGCTTCGGTA TGACCGGAGT GGTACTCGAA 850GGGTTCTGGT TTCCTGGAGGACTCGCCGGC GTCCAAGTCA GGATCAGTGG 900CGGCGCTTCT GCGACCGTAGAGGGAACCGT AACCTCGTAC AGTCCTGTTG 950CGGCGTTATA GGCCCCATCCGGACCGGAAC GCTTTCGGAA CGCTCACACC 1000ATCGGTCTGA CCACCGAAAGGTCGTCGTGT TGCCTCGCGC CTCGTTGGTC 1050AGGCGCATCG GCAGATCGACGGTACCGCTG GCTTTTGCAA CCGCGTTCAG 1100GTTTACGCTT GGGGGAAGCCCCAATTTAGC GGCATCCATG CCCAGGGCGT 1150AACGAACGCT ATCGGGCGTTTGGTCCTGCC ATTGCTCGGC AGTCCGGGAG 1200AGTAGGTCAG ACTGGCAAGCCACGGCCATC ACCGAGGTGC TGAAGCCAGG 1250ACCGCCAGGA CGGCAATCGCATCGGAGATC GCTTGAGCAA GGGATGCGGC 1300GCCTGTGCGA CCTGGATCAGACCCCGCTGC GGCGGTGGCG CACCCGCTGC 1350CATTGGCTGG CATGGCATAAGTATTGGCAG CCCTGATCGC CGCTTGACGA 1400GCGATTTCCT TGCGCCTTGCCGTTTCGGCG TTCAGCTTGT CCAGCCGTGC 1450TTGCAGGCTG GCGATTTCATCCACTAGGTA GGACATCGGC GTTGTAGGTT 1500GCCTTTTGTT TCTCCAGTGCATTGGGTGCC TTGGCAATCA AGGCATTGTT 1550TGCAGTCTGC AATTCTTCTTATTGCGATCG CCTGCGTAAG GAGTTGAGTA 1600GCGCGTTCAA GCCACTGCTCTGGCGTTGGA TTGGTCAGTT GAGGCAAAGC 1650ATTCCCAGCC TGGTCAAGCTCGGACTGCAC TTTTTTCTCG ACATTTGCCT 1700TCCTGGCCTTGTAGTCCGCCTCCACCTCAGCAGCGGCTCGCTGGGCTTCT 1750GCTTCCAATGACCGGGCTTTATTCTCCAGCTCTTGAGACGTTTGTTTCAA 1800GATAGCGATTTGCGCCTTATAGATATCGGCGCTGTACGCTTTGGCCAGCT 1850CACTCATATGGCGATCCAGGAACTCTCCATAGAATTTTCGGCTGGCCAGC 1900AACTGACTCTGGTACATCGACTCTGACTTCTGAGGAAAGTCTGAAGCCGT 1950ATAAAGATTGGCCGGGCGATCCTCAATGACCTTTAGCGATTTTGCTTTGG 2000CATCCATGAGTGCATCAACGATACTCTTTTCATCGCGGATGTCATTGGCA 2050CTGACCGCTTTACCTGGCAACCCCGCTTCACTCTTGAGTTCATCAACCTC 2100CTTCAGGGTTTCATTTTTCAGGTTTTTCTTGAGTTCTGAATGGGACTTAT 2150CAAGCGTACTTCTTAGCTTCCTGTACTCCTGCATTCCAGTACCGACATAC 2200GGACTTGGTCCTGGTGGGACAAATGGTGGAGTACCGTAGCTTGATCGAGC 2250AGGAATATACTGGATTATGTCACGCCCACCACCCTGCACATGTGTAATAA 2300CCATCGAACCAGGTTCGTAATCATTGACAGCCATAGATCGCCCCTACATT 2350AATTTGAAAGTGTAATGTATTGAGCGACTCCCACCTAGAGAACCCTCTCC 2400CAGTCAATAAGCCCCAATGCATCGGCAATACACTGCAATCAACTTCAATA 2450TCCCGTGTTTAGATGATCCAGAAGGTGCGCTCTCTCGCCTCTTATAATCG 2500CGCCTGCGTCAAACGGTCATTTCCTTAACGCACACCTCATCTACCCCGGC 2550CAGTCACGGAAGCCGCATACCTTCGGTTCATTAACGAACTCCCACTTTCA 2600AAATTCATCCATGCCGCCCCTTCGCGAGCTTCCGGACAAAGCCACGCTGA 2650TTGCGAGCCCAGCGTTTTTGATTGCAAGCCGCTGCAGCTGGTCAGGCCGT 2700TTCCGCAACGCTTGAAGTCCTGGCCGATATACCGGCAGGGCCAGCCATCG 2750TTCGACGAATAAAGCCACCTCAGCCATGATGCCCTTTCCATCCCCAGCGG 2800AACCCCGACATGGACGCCAAAGCCCTGCTCCTCGGCAGCCTCTGCCTGGC 2850CGCCCCATTCGCCGACGCGGCGACGCTCGACAATGCTCTCTCCGCCTGCC 2900TCGCCGCCCGGCTCGGTGCACCGCACACGGCGGAGGGCCAGTTGCACCTG 2950CCACTCACCCTTGAGGCCCGGCGCTCCACCGGCGAATGCGGCTGTACCTC 3000GGCGCTGGTGCGATATCGGCTGCTGGCCAGGGGCGCCAGCGCCGACAGCC 3050TCGTGCTTCAAGAGGGCTGCTCGATAGTCGCCAGGACACGCCGCGCACGC 3100TGACCCTGGCGGCGGACGCCGGCTTGGCGAGCGGCCGCGAACTGGTCGTC 3150ACCCTGGGTTGTCAGGCGCCTGACTGACAGGCCGGGCTGCCACCACCAGG 3200CCGAGATGGACGCCCTGCATGTATCCTCCGATCGGCAAGCCTCCCGTTCG 3250CACATTCACCACTCTGCAATCCAGTTCATAAATCCCATAAAAGCCCTCTT 3300CCGCTCCCCGCCAGCCTCCCCGCATCCCGCACCCTAGACGCCCCGCCGCT 3350CTCCGCCGGCTCGCCCGACAAGAAAAACCAACCGCTCGATCAGCCTCATC 3400CTTCACCCATCACAGGAGCCATCGCGATGCACCTGATACCCCATTGGATC 3450C 3451(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度744個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體銅綠假單胞菌(xi)序列描述SEQ ID NO19GGGTTCAGCA AGCGTTCAGG GGCGGTTCAG TACCCTGTCCGTACTCTGCA 50AGCCGTGAAC GACACGACTC TCGCAGAACG GAGAAACACCATGAAAGCAC 100TCAAGACTCT CTTCATCGCC ACCGCCCTGC TGGGTTCCGCCGCCGGCGTC 150CAGGCCGCCG ACAACTTCGT CGGCCTGACC TGGGGCGAGACCAGCAACAA 200CATCCAGAAA TCCAAGTCGC TGAACCGCAA CCTGAACAGCCCGAACCTCG 250ACAAGGTGAT CGACAACACC GGCACCTGGG GCATCCGCGCCGGCCAGCAG 300TTCGAGCAGG GCCGCTACTA CGCGACCTAC GAGAACATCTCCGACACCAG 350CAGCGGCAAC AAGCTGCGCC AGCAGAACCT GCTCGGCAGCTACGACGCCT 400TCCTGCCGAT CGGCGACAAC AACACCAAGC TGTTCGGCGGTGCCACCCTC 450GGCCTGGTCA AGCTGGAACA GGACGGCAAG GGCTTCAAGCGCGACAGCGA 500TGTCGGCTAC GCTGCCGGGC TGCAGGCCGG TATCCTGCAGGAGCTGAGCA 550AGAATGCCTC GATCGAAGGC GGCTATCGTT ACCTGCGCACCAACGCCAGC 600ACCGAGATGA CCCCGCATGG CGGCAACAAG CTGGGCTCCCTGGACCTGCA 650CAGCAGCTCG CAATTCTACC TGGGCGCCAA CTACAAGTTCTAAATGACCG 700CGCAGCGCCC GCGAGGGCAT GCTTCGATGG CCGGGCCGGAAGGT744(2)SEQ ID 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2150AGTCAACTTTTTAAACGCTC AGATTTAGAAAAAAAACTAC CTGAAGGAGC 2200GGCTTTAACAGAGAAAACGG ACATATTCGAAAGCGGGCGT AACGGTAAAC 2250CAAATAAAGATGGAATCAAG AGTTATCGTATTCCAGCACT TCTCAAGACA 2300GATAAAGGAACTTTGATCGC AGGTGCAGATGAACGCCGTC TCCATTCGAG 2350TGACTGGGGTGATATCGGTA TGGTCATCAGACGTAGTGAA GATAATGGTA 2400AAACTTGGGGTGACCGAGTA ACCATTACCAACTTACGTGA CAATCCAAAA 2450GCTTCTGACCCATCGATCGG TTCACCAGTGAATATCGATA TGGTGTTGGT 2500TCAAGATCCTGAAACCAAAC GAATCTTTTCTATCTATGAC ATGTTCCCAG 2550AAGGGAAGGGAATCTTTGGA ATGTCTTCACAAAAAGAAGA AGCCTACAAA 2600AAAATCGATGGAAAAACCTA TCAAATCCTCTATCGTGAAG GAGAAAAGGG 2650AGCTTATACCATTCGAGAAA ATGGTACTGTCTATACACCA GATGGTAAGG 2700CGACAGACTATCGCGTTGTT GTAGATCCTGTTAAACCAGC CTATAGCGAC 2750AAGGGGGATC TATACAAGGGTAACCAATTA CTAGGCAATA TCTACTTCAC 2800AACAAACAAA ACTTCTCCATTTAGAATTGC CAAGGATAGC TATCTATGGA 2850TGTCCTACAG TGATGACGACGGGAAGACAT GGTCAGCGCC TCAAGATATT 2900ACTCCGATGG TCAAAGCCGATTGGATGAAA TTCTTGGGTG TAGGTCCTGG 2950AACAGGAATT GTACTTCGGAATGGGCCTCA CAAGGGACGG ATTTTGATAC 3000CGGTTTATAC GACTAATAATGTATCTCACT TAAATGGCTC GCAATCTTCT 3050CGTATCATCT ATTCAGATGATCATGGAAAA ACTTGGCATG CTGGAGAAGC 3100GGTCAACGAT AACCGTCAGGTAGACGGTCA AAAGATCCAC TCTTCTACGA 3150TGAACAATAG ACGTGCGCAAAATACAGAAT CAACGGTGGT ACAACTAAAC 3200AATGGAGATG TTAAACTCTTTATGCGTGGT TTGACTGGAG ATCTTCAGGT 3250TGCTACAAGT AAAGACGGAGGAGTGACTTG GGAGAAGGAT ATCAAACGTT 3300ATCCACAGGT TAAAGATGTCTATGTTCAAA TGTCTGCTAT CCATACGATG 3350CACGAAGGAA AAGAATACATCATCCTCAGT AATGCAGGTG GACCGAAACG 3400TGAAAATGGG ATGGTCCACTTGGCACGTGT CGAAGAAAAT GGTGAGTTGA 3450CTTGGCTCAA ACACAATCCAATTCAAAAAG GAGAGTTTGC CTATAATTCG 3500CTCCAAGAAT TAGGAAATGGGGAGTATGGC ATCTTGTATG AACATACTGA 3550AAAAGGACAA AATGCCTATACCCTATCATT TAGAAAATTT AATTGGGACT 3600TTTTGAGCAA AGATCTGATTTCTCCTACCG AAGCGAAAGT GAAGCGAACT 3650AGAGAGATGG GCAAAGGAGTTATTGGCTTG GAGTTCGACT CAGAAGTATT 3700GGTCAACAAG GCTCCAACCCTTCAATTGGC AAATGGTAAA ACAGCACGCT 3750TCATGACCCA GTATGATACAAAAACCCTCC TATTTACAGT GGATTCAGAG 3800GATATGGGTC AAAAAGTTACAGGTTTGGCA GAAGGTGCAA TTGAAAGTAT 3850GCATAATTTA CCAGTCTCTGTGGCGGGCAC TAAGCTTTCG AATGGAATGA 3900ACGGAAGTGA AGCTGCTGTTCATGAAGTGC CAGAATACAC AGGCCCATTA 3950GGGACATCCG GCGAAGAGCCAGCTCCAACA GTCGAGAAGC CAGAATACAC 4000AGGCCCACTA GGGACATCCGGCGAAGAGCC AGCCCCGACA GTCGAGAAGC 4050CAGAATACAC AGGCCCACTAGGGACAGCTG GTGAAGAAGC AGCTCCAACA 4100GTCGAGAAGC CAGAATTTACAGGGGGAGTT AATGGTACAG AGCCAGCTGT 4150TCATGAAATC GCAGAGTATAAGGGATCTGA TTCGCTTGTA ACTCTTACTA 4200CAAAAGAAGA TTATACTTACAAAGCTCCTC TTGCTCAGCA GGCACTTCCT 4250GAAACAGGAA ACAAGGAGAGTGACCTCCTA GCTTCACTAG GACTAACAGC 4300TTTCTTCCTT GGTCTGTTTACGCTAGGGAA AAAGAGAGAA CAATAAGAGA 4350AGAATTCTAA ACATTTGATTTTGTAAAAAT AGAAGGAGAT AGCAGGTTTT 4400CAAGCCTGCT ATCTTTTTTTGATGACATTC AGGCTGATAC GAAATCATAA 4450GAGGTCTGAA ACTACTTTCAGAGTAGTCTG TTCTATAAAA TATAGTAGAT 4500(2)SEQ ID NO36的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度705個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體表皮葡萄球菌(xi)序列描述SEQ ID NO36GATCCAAGCTTATCGATATC ATCAAAAAGT TGGCGAACCT TTTCAAATTT 50TGGTTCAAATTCTTGAGATG TATAGAATTC AAAATATTTA CCATTTGCAT 100AGTCTGATTGCTCAAAGTCT TGATACTTTT CTCCACGCTC TTTTGCAATT 150TCCATTGAACGTTCGATGGA ATAATAGTTC ATAATCATAA AGAATATATT 200AGCAAAGTCTTTTGCTTCTT CAGATTCATA GCCAATTTTA TTTTTAGCTA 250GATAACCATGTAAGTTCATT ACTCCTAGTC CAACAGAATG TAGTTCACTA 300TTCGCTTTTTTTACACCTGG TGCATTTTGA ATATTTGCTT CATCACTTAC 350AACTGTAAGAGCATCCATAC CTGTGAACAC AGAATCTCTG AATTTACCTG 400ATTCCATAACATTCACTATA TTCAATGAGC CTAAGTTACA TGAAATATCT 450CTTTTAATTTCATCTTCAAT TCCATAGTCG TTAATTACTG ATGTCTCTTG 500TAATTGGAAAATTTCAGTAC ATAAATTACT CATTTTAATT TGCCCAATAT 550TTGAATTCGCATGTACTTTG TTTGCATTAT CTTTAAACAT AAGATATGGA 600TAACCAGACTGTAATTGTGT TTGTGCAATC ATATTTAACA TTTCACGTGC 650GTCTTTTTTCTTTTTATCGA TTTCGAACCC GGGGTACCGA ATTCCTCGAG 700TCTAG705(2)SEQ ID NO37的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度442個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體金黃色葡萄球菌(xi)序列描述 SEQ ID NO37GATCAATCTTTGTCGGTACA CGATATTCTTCACGACTAAATAAACGCTCA 50TTCGCGATTTTATAAATGAA TGTTGATAACAATGTTGTATTATCTACTGA 100AATCTCATTACGTTGCATCG GAAACATTGTGTTCTGTATGTAAAAGCCGT 150CTTGATAATCTTTAGTAGTA CCGAAGCTGGTCATACGAGAGTTATATTTT 200CCAGCCAAAACGATATTTTT ATAATCATTACGTGAAAAAGGTTTCCCTTC 250ATTATCACACAAATATTTTA GCTTTTCAGTTTCTATATCAACTGTAGCTT 300CTTTATCCATACGTTGAATA ATTGTACGATTCTGACGCACCATCTTTTGC 350ACACCTTTAATGTTATTTGT TTTAAAAGCA TGAATAAGTT TTTCAACACA 400ACGATGTGAATCTTCTAAGA AGTCACCGTA AAATGAAGGA TC 442(2)SEQ ID NO38的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體糞腸球菌(xi)序列描述SEQ ID NO38GCAATACAGG GAAAAATGTC20(2)SEQ ID NO39的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源
(A)有機(jī)體糞腸球菌(xi)序列描述 SEQ ID NO39CTTCATCAAA CAATTAACTC 20(2)SEQ ID NO40的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體糞腸球菌(xi)序列描述 SEQ ID NO40GAACAGAAGA AGCCAAAAAA 20(2)SEQ ID NO41的信息(i)列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體糞腸球菌(xi)序列描述SEQ ID NO41GCAATCCCAA ATAATACGGT20(2)SEQ ID NO42的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體大腸桿菌(xi)序列描述SEQ ID NO42CTTTCCAGC GTCATATTG 19(2)SEQ ID NO43的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體大腸桿菌(xi)序列描述SEQ ID NO43GATCTCGACA AAATGGTGA 19(2)SEQ ID NO44的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源
(A)有機(jī)體大腸桿菌(xi)序列描述SEQ ID NO44CACCCGCTTG CGTGGCAAGC TGCCC25(2)SEQ ID NO45的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體大腸桿菌(xi)序列描述SEQ ID NO45CGTTTGTGGA TTCCAGTTCC ATCCG 25(2)SEQ ID NO46的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體大腸桿菌(xi)序列描述SEQ ID NO46TCACCCGCTT GCGTGGC 17(2)SEQ ID NO47的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體大腸桿菌(xi)序列描述SEQ ID NO47GGAACTGGAA TCCACAAAC192)SEQ ID NO48的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體大腸桿菌(xi)序列描述SEQ ID NO48TGAAGCACTG GCCGAAATGC GT 25(2)SEQ ID NO49的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體大腸桿菌(xi)序列描述SEQ ID NO49GATGTACAGG ATTCGTTGAATT25(2)SEQ ID NO50的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體大腸桿菌(xi)序列描述SEQ ID NO50TAGCGAAGGC GTAGCAGAAA CTAAC25(2)SEQ ID NO51的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體大腸桿菌(xi)序列描述SEQ ID NO51GCAACCCGAA CTCAACGCCG GATTT25(2)SEQ ID NO52的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體大腸桿菌(xi)序列描述SEQ ID NO52ATACACAAGG GTCGCATCTG CGGCC 25(2)SEQ ID NO53的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體大腸桿菌(xi)序列描述SEQ ID NO53TGCGTATGCA TTGCAGACCT TGTGGC26(2)SEQ ID NO54的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體大腸桿菌(xi)序列描述SEQ ID NO54GCTTTCACTG GATATCGCGC TTGGG 25(2)SEQ ID NO55的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體大腸桿菌(xi)序列描述SEQ ID NO55GCAACCCGAA CTCAACGCC 19(2)SEQ ID NO56的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體大腸桿菌(xi)序列描述SEQ ID NO56GCAGATGCGA CCCTTGTGT 19(2)SEQ ID NO57的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體肺炎克雷伯氏菌(xi)序列描述SEQ ID NO57GTGGTGTCGT TCAGCGCTTT CAC23(2)SEQ ID NO58的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體肺炎克雷伯氏菌(xi)序列描述SEQ ID NO58GCGATATTCA CACCCTACGC CA 25(2)SEQ ID NO59的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體肺炎克雷伯氏菌(xi)序列描述SEQ ID NO59GTCGAAAATG CCGGAAGAGG G 26(2)SEQ ID NO60的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體 肺炎克雷伯氏菌(xi)序列描述SEQ ID NO60ACTGAGCTGC AGACCGGTAA AACTC 26(2)SEQ ID NO61的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體肺炎克雷伯氏菌(xi)序列描述SEQ ID NO61GACAGTCAGT TCGTC 19(2)SEQ ID NO62的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體肺炎克雷伯氏菌(xi)序列描述SEQ ID NO62CGTAGGGTGT ATCGC19(2)SEQ ID NO63的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體肺炎克雷伯氏菌(xi)序列描述SEQ ID NO63CGTGATGGAT ATTCTTAACG C 26(2)SEQ ID NO64的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體肺炎克雷伯氏菌(xi)序列描述SEQ ID NO64ACCAAACTGT TGAGCCGCCT GGA 23(2)SEQ ID NO65的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體肺炎克雷伯氏菌(xi)序列描述SEQ ID NO65GTGATCGCCC CTCATCTGCT ACT23(2)SEQ ID NO66的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體肺炎克雷伯氏菌(xi)序列描述SEQ ID NO66CGCCCTTCGT TAAGAATATC CATCA26(2)SEQ ID NO67的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體肺炎克雷伯氏菌(xi)序列描述SEQ ID NO67TCGCCCCTCA GCTACT 19(2)SEQ ID NO68的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體肺炎克雷伯氏菌(xi)序列描述SEQ ID NO68GATCGTGATG GATATTCTT19(2)SEQ ID NO69的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體肺炎克雷伯氏菌(xi)序列描述SEQ ID NO69CAGGAAGATG CTGCACCGGTTTG 25(2)SEQ ID NO70的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體奇異變形菌(xi)序列描述SEQ ID NO70TGGTTCACTG ACTTTGCGAT GTTTC 25(2)SEQ ID NO71的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體奇異變形菌(xi)序列描述SEQ ID NO71TCGAGGATGG CATGCACTAG AAAAT25(2)SEQ ID NO72的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體奇異變形菌(xi)序列描述SEQ ID NO72CGCTGATTAG GTTTCGCTAA AATCTTATTA 30(2)SEQ ID NO73的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體奇異變形菌(xi)序列描述SEQ ID NO73TTGATCCTCA TTTTATTAAT CACATGACCA 30(2)SEQ ID NO74的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體奇異變形菌(xi)序列描述SEQ ID NO74GAAACATCGC AAAGTCAGT 19(2)SEQ ID NO75的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體奇異變形菌(xi)序列描述SEQ ID NO75ATAAAATGAG GATCAAGTTC20(2)SEQ ID NO76的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體奇異變形菌(xi)序列描述SEQ ID NO76CCGCCTTTAG CATTAATTGG TGTTTATAGT 30(2)SEQ ID NO77的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體奇異變形菌(xi)序列描述SEQ ID NO77CCTATTGCAG ATACCTTAAA TGTCGGC 30(2)SEQ 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NO153的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體金黃色葡萄球菌(xi)序列描述SEQ ID NO153CGTAATGAGA TTTCAGTAGA TAATACAACA30(2)SEQ ID NO154的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體流感嗜血菌(xi)序列描述SEQ ID NO154TTTAACGATC CTTTTACTCC TTTTG 25(2)SEQ ID NO155的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體流感嗜血菌(xi)序列描述SEQ ID NO155ACTGCTGTTG TAAAGAGGTT AAAAT25(2)SEQ ID NO156的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體肺炎鏈球菌(xi)序列描述SEQ ID NO156ATTTGGTGAC GGGTGACTTT 20(2)SEQ ID NO157的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體肺炎鏈球菌(xi)序列描述SEQ ID NO157GCTGAGGATT TGTTCTTCTT20(2)SEQ ID NO158的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體肺炎鏈球菌(xi)序列描述SEQ ID NO158GAGCGGTTTC TATGATTGTA 20(2)SEQ ID NO159的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體肺炎鏈球菌(xi)序列描述SEQ ID NO159ATCTTTCCTT TCTTGTTCTT20(2)SEQ ID NO160的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體粘膜炎莫拉氏菌(xi)序列描述SEQ ID NO160GCTCAAATCA GGGTCAGC 18(2)SEQ ID NO161的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度861個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO161ATGAGTATTCAACATTTCCG TGTCGCCCTT ATTCCCTTTTTTGCGGCATT 50TTGCCTTCCTGTTTTTGCTC ACCCAGAAAC GCTGGTGAAAGTAAAAGATG 100CTGAAGATCAGTTGGGTGCA CGAGTGGGTT ACATCGAACTGGATCTCAAC 150AGCGGTAAGATCCTTGAGAG TTTTCGCCCC GAAGAACGTTTTCCAATGAT 200GAGCACTTTTAAAGTTCTGC TATGTGGCGC GGTATTATCCCGTGTTGACG 250CCGGGCAAGAGCAACTCGGT CGCCGCATAC ACTATTCTCAGAATGACTTG 300GTTGAGTACTCACCAGTCAC AGAAAAGCAT 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AACTTGTGTACTACTATATGGGAAATTGAC 450GAGGGAAGAATAACTGAATA TAAGGGGAATTATAGTAACTATGTTGAACA 500AAAAGAATTAGAAAGACATC GAGAAGAATTAGAATATGAAAAATATGAAA 550AAGAAAAGAAACGATTGGAA AAAGCTATAAATATAAAAGAACAGAAAGCT 600CAACGAGCAACTAAAAAACC GAAAAACTTAAGTTTATCTGAAGGCAAAAT 650AAAAGGAGCAAAGCCATACT TTGCAGGTAAGCAAAAGAAGTTACGAAAAA 700CTGTAAAATCTCTAGAAACC AGACTAGAAAAACTTGAAAGCGTCGAAAAG 750AGAAACGAACTTCCTCCACT TAAAATGGATTTAGTGAACTTAGAAAGTGT800AAAAAATAGAACTATAATAC GTGGTGAAGATGTCTCGGGTACAATTGAAG850GACGGGTATTGTGGAAAGCA AAAAGTTTTAGTATTCGCGGAGGAGACAAG900ATGGCAATTATCGGATCTAA TGGTACAGGAAAGACAACGTTTATTAAAAA950AATTGTGCATGGGAATCCTG GTATTTCATTATCGCCATCTGTCAAAATCG1000GTTATTTTAGCCAAAAAATA GATACATTAGAATTAGATAAGAGCATTTTA1050GAAAATGTTCAATCTTCTTC ACAACAAAATGAAACTCTTATTCGAACTAT1100TCTAGCTAGAATGCATTTTT TTAGAGATGATGTTTATAAACCAATAAGTG1150TCTTAAGTGGTGGAGAGCGA GTTAAAGTAGCACTAACTAAAGTATTCTTA1200AGTGAAGTTAATACGTTGGT ACTAGATGAACCAACAAACTTTCTTGATAT1250GGAAGCTATAGAGGCGTTTG AATCTTTGTTAAAGGAATATAATGGCAGTA1300TAATCTTTGTATCTCACGAT CGTAAATTTATCGAAAAAGTAGCCACTCGA1350ATAATGACAATTGATAATAA AGAAATAAAAATATTTGATGGCACATATGA1400ACAATTTAAACAAGCTGAAA AGCCAACAAGGAATATTAAAGAAGATAAAA1450AACTTTTACTTGAGACAAAA ATTACAGAAGTACTCAGTCGATTGAGTATT1500GAACCTTCGGAAGAATTAGA ACAAGAGTTTCAAAACTTAATAAATGAAAA1550AAGAAATTTGGATAAATAA1569(2)SEQ ID NO177的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1467個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO177ATGGAACAATATACAATTAA ATTTAACCAA ATCAATCATAAATTGACAGA 50TTTACGATCACTTAACATCG ATCATCTTTA TGCTTACCAATTTGAAAAAA 100TAGCACTTATTGGGGGTAAT GGTACTGGTA AAACCACATTACTAAATATG 150ATTGCTCAAAAAACAAAACC AGAATCTGGA ACAGTTGAAACGAATGGCGA 200AATTCAATATTTTGAACAGC TTAACATGGA TGTGGAAAATGATTTTAACA 250CGTTAGACGGTAGTTTAATG AGTGAACTCC ATATACCTATGCATACAACC 300GACAGTATGAGTGGTGGTGA AAAAGCAAAA TATAAATTACGTAATGTCAT 350ATCAAATTATAGTCCGATAT TACTTTTAGA TGAACCTACAAATCACTTGG 400ATAAAATTGGTAAAGATTATCTGAATAATA TTTTAAAATA TTACTATGGT 450ACTTTAATTATAGTAAGTCACGATAGAGCA CTTATAGACC AAATTGCTGA 500CACAATTTGGGATATACAAGAAGATGGCAC AATAAGAGTG TTTAAAGGTA 550ATTACACACAGTATCAAAATCAATATGAAC AAGAACAGTT AGAACAACAA 600CGTAAATATGAACAGTATATAAGTGAAAAA CAAAGATTGT CCCAAGCCAG 650TAAAGCTAAACGAAATCAAGCGCAACAAAT GGCACAAGCA TCATCAAAAC 700AAAAAAATAAAAGTATAGCACCAGATCGTT TAAGTGCATC AAAAGAAAAA 750GGCACGGTTGAGAAGGCTGCTCAAAAACAA GCTAAGCATA TTGAAAAAAG 800AATGGAACATTTGGAAGAAGTTGAAAAACC ACAAAGTTAT CATGAATTCA 850ATTTTCCACAAAATAAAATTTATGATATCC ATAATAATTA TCCAATCATT 900GCACAAAATCTAACATTGGTTAAAGGAAGT CAAAAACTGC TAACACAAGT 950ACGATTCCAAATACCATATGGCAAAAATAT AGCGCTCGTA GGTGCAAATG 1000GTGTAGGTAAGACAACTTTACTTGAAGCTA TTTACCACCA AATAGAGGGA 1050ATTGATTGTTCTCCTAAAGTGCAAATGGCA TACTATCGTC AACTTGCTTA 1100TGAAGACATGCGTGACGTTTCATTATTGCA ATATTTAATG GATGAAACGG 1150ATTCATCAGAATCATTCAGTAGAGCTATTT TAAATAACTT GGGTTTAAAT 1200GAAGCACTTGAGCGTTCTTGTAATGTTTTG AGTGGTGGGG AAAGAACGAA 1250ATTATCGTTAGCAGTATTATTTTCAACGAA AGCGAATATG TTAATTTTGG 1300ATGAACCAACTAATTTTTTAGATATTAAAA CATTAGAAGC ATTAGAAATG 1350TTTATGAATAAATATCCTGGAATCATTTTG TTTACATCAC ATGATACAAG 1400GTTTGTTAAACATGTATCAGATAAAAAATG GGAATTAACA GGACAATCTA 1450TTCATGATATAACTTAA146權(quán)利要求
1.一種在懷疑包含有細(xì)菌核酸的任何樣品中使用探針(片段和/或寡核苷酸)和/或擴(kuò)增引物的方法，所述探針和/或擴(kuò)增引物對(duì)檢測(cè)核酸的存在和/或其量而言是特異的、普遍的和敏感的，所述核酸得自選自下組的細(xì)菌物種大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌、奇異變形菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、腐生葡萄球菌、釀膿鏈球菌、流感嗜血菌和粘膜炎莫拉氏菌，其中所說(shuō)的細(xì)菌核酸或其變體或部分包含可與所說(shuō)的探針或引物雜交的選擇的靶區(qū)，該方法包括以下步驟使所說(shuō)的樣品與所述的探針或引物接觸，并檢測(cè)指示所說(shuō)的任何細(xì)菌物種的存在和/或其量的雜交探針或擴(kuò)增產(chǎn)物的存在和/或其量。
2.一種如權(quán)利要求1限定的方法，該方法是在懷疑包含有細(xì)菌核酸的任何樣品中使用探針(片段和/或寡核苷酸)和/或擴(kuò)增引物的方法，所述探針和/或擴(kuò)增引物對(duì)檢測(cè)任何細(xì)菌核酸的存在和/或其量而言是通用的和敏感的，其中所說(shuō)的核酸或其變體或部分包含可與所說(shuō)的探針或引物雜交的選擇的靶區(qū)，該方法包括以下步驟使所說(shuō)的樣品與所述的探針或引物接觸，并檢測(cè)指示所說(shuō)的任何細(xì)菌的存在和/或其量的雜交探針或擴(kuò)增產(chǎn)物的存在和/或其量。
3.一種如權(quán)利要求1限定的方法，該方法是在懷疑包含有細(xì)菌核酸的任何樣品中使用探針(片段和/或寡核苷酸)和/或擴(kuò)增引物的方法，所述探針和/或擴(kuò)增引物對(duì)檢測(cè)核酸的存在和/或其量而言是特異的、普遍的和敏感的，所說(shuō)的核酸得自選自下組抗生素抗性基因blatem、blarob、blashv、aadB、aacC1、aacC2、aacC3、aacA4、mecA、vanA-vanH-vanX、satA、aacA-aphD、vat、vga、msrA、sul和int。其中所說(shuō)的核酸或其變體或部分包含可與所說(shuō)的探針或引物雜交的選擇的靶區(qū)，該方法包括以下步驟使所說(shuō)的樣品與所述的探針或引物接觸，并檢測(cè)指示所說(shuō)的抗生素抗性基因的存在和/或其量的雜交探針或擴(kuò)增產(chǎn)物的存在和/或其量。
4.權(quán)利要求1、2和3任一之方法，該方法在從人類患者、動(dòng)物、環(huán)境或食品獲得的樣品上直接進(jìn)行。
5.權(quán)利要求1、2和3任一之方法，該方法在由一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌菌落組成的樣品上直接進(jìn)行。
6.權(quán)利要求1至5任一之方法，其中所說(shuō)的細(xì)菌核酸由選自下組的方法擴(kuò)增a)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，b)連接酶鏈反應(yīng)，c)基于核酸序列的擴(kuò)增，d)自動(dòng)維持序列復(fù)制，e)鏈置換擴(kuò)增，f)分支DNA信號(hào)擴(kuò)增，g)嵌套式PCR，和h)多重PCR。
7.權(quán)利要求6的方法，其中由PCR擴(kuò)增所說(shuō)的核酸。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所說(shuō)的PCR方案被修改來(lái)在一個(gè)小時(shí)內(nèi)測(cè)定出所說(shuō)核酸的存在，該方案通過(guò)對(duì)各擴(kuò)增循環(huán)進(jìn)行55℃下僅1秒鐘的退火步驟和95℃下僅一秒鐘的變性步驟，而不進(jìn)行任何延伸步驟。
9.一種用于直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落檢測(cè)、鑒別和/或定量分析大腸桿菌的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO3、SEQ IDNO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地和普遍地退火結(jié)合到大腸桿菌菌株或代表物上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上或在所說(shuō)溶液中的指示所說(shuō)樣品中大腸桿菌的存在和/或其量之所說(shuō)標(biāo)記的存在或其強(qiáng)度。
10.一種如權(quán)利要求9限定的方法，其中所說(shuō)的探針選自下組1)長(zhǎng)度為12-227個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO3或其互補(bǔ)序列中，2)長(zhǎng)度為12-278個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO4或其互補(bǔ)序列中，3)長(zhǎng)度為12-1596個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO5或其互補(bǔ)序列中，4)長(zhǎng)度為12-2703個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO6或其互補(bǔ)序列中，5)長(zhǎng)度為12-1391個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO7或其互補(bǔ)序列中，和它們的特異性地和普遍地退火結(jié)合到大腸桿菌菌株和代表物上的變體。
11.權(quán)利要求10的方法，其中用于檢測(cè)大腸桿菌核酸序列的所說(shuō)的探針選自下組SEQ ID NO44、SEQ ID NO45、SEQ ID NO48、SEQID NO49、SEQ ID NO50、SEQ ID NO51、SEQ ID NO52、SEQ IDNO53、SEQ ID NO54和它們的互補(bǔ)序列。
12.一種檢測(cè)試驗(yàn)樣品中大腸桿菌存在和/或其量的方法，該方法包括下列步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的大腸桿菌DNA的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自以下序列之一SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)指示所說(shuō)試驗(yàn)樣品中大腸桿菌的存在和/或其量的所說(shuō)擴(kuò)增的靶序列的存在和/或其量。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自下組a)SEQ ID NO42和SEQ ID NO43，b)SEQ ID NO46和SEQ ID NO47，c)SEQ ID NO55和SEQ ID NO56，以及d)SEQ ID NO131和SEQ ID NO132。
14.一種用于直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落檢測(cè)、鑒別和/或定量分析肺炎克雷伯氏菌的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO8、SEQ IDNO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地和普遍地退火結(jié)合到肺炎克雷伯氏菌菌株或代表物上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上或在所說(shuō)溶液中的指示所說(shuō)樣品中肺炎克雷伯氏菌的存在和/或其量之所說(shuō)標(biāo)記的存在或其強(qiáng)度。
15.一種如權(quán)利要求14限定的方法，其中所說(shuō)的探針選自下組1)長(zhǎng)度為12-238個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO8或其互補(bǔ)序列中，2)長(zhǎng)度為12-385個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO9或其互補(bǔ)序列中，3)長(zhǎng)度為12-462個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO10或其互補(bǔ)序列中，4)長(zhǎng)度為12-730個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO11或其互補(bǔ)序列中，和它們的特異性地和普遍地退火結(jié)合到大腸桿菌菌株和代表物上的變體。
16.權(quán)利要求15的方法，其中用于檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌核酸序列的所說(shuō)的探針選自下組SEQ ID NO57、SEQ ID NO58、SEQ ID NO59、SEQ ID NO60、SEQ ID NO63、SEQ ID NO64、SEQ ID NO65、SEQ ID NO66、SEQ ID NO69和它們的互補(bǔ)序列。
17.一種檢測(cè)試驗(yàn)樣品中肺炎克雷伯氏菌存在和/或其量的方法，該方法包括下列步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的肺炎克雷伯氏菌DNA的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自以下序列之一SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ IDNO10、SEQ ID NO11；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)指示所說(shuō)試驗(yàn)樣品中肺炎克雷伯氏菌的存在和/或其量的所說(shuō)擴(kuò)增的靶序列的存在和/或其量。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自下組a)SEQ ID NO61和SEQ ID NO62，b)SEQ ID NO67和SEQ ID NO68，c)SEQ ID NO135和SEQ ID NO136，以及d)SEQ ID NO137和SEQ ID NO138。
19.一種用于直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落檢測(cè)、鑒別和/或定量分析奇異變形菌的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO12、SEQ IDNO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地和普遍地退火結(jié)合到奇異變形菌菌株或代表物上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上或在所說(shuō)溶液中的指示所說(shuō)樣品中奇異變形菌的存在和/或其量之所說(shuō)標(biāo)記的存在或其強(qiáng)度。
20.一種如權(quán)利要求19限定的方法，其中所說(shuō)的探針選自下組1)長(zhǎng)度為12-225個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO12或其互補(bǔ)序列中，2)長(zhǎng)度為12-402個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO13或其互補(bǔ)序列中，3)長(zhǎng)度為12-157個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO14或其互補(bǔ)序列中，4)長(zhǎng)度為12-1348個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO15或其互補(bǔ)序列中，和它們的特異性地和普遍地退火結(jié)合到奇異變形菌菌株和代表物上的變體。
21.權(quán)利要求10的方法，其中用于檢測(cè)奇異變形菌核酸序列的所說(shuō)的探針選自下組SEQ ID NO70、SEQ ID NO71、SEQ ID NO72、SEQ ID NO73、SEQ ID NO76、SEQ ID NO77、SEQ ID NO80、SEQ ID NO81、SEQ ID NO82和它們的互補(bǔ)序列。
22.一種檢測(cè)試驗(yàn)樣品中奇異變形菌存在和/或其量的方法，該方法包括下列步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的奇異變形菌DNA的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自以下序列之一SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ IDNO14、SEQ ID NO15；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)指示所說(shuō)試驗(yàn)樣品中奇異變形菌的存在和/或其量的所說(shuō)擴(kuò)增的靶序列的存在和/或其量。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自下組a)SEQ ID NO74和SEQ ID NO75，和b)SEQ ID NO133和SEQ ID NO134。
24.一種用于直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落檢測(cè)、鑒別和/或定量分析腐生葡萄球菌的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO21、SEQ IDNO22、SEQ ID NO23、SEQ ID NO24、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地和普遍地退火結(jié)合到腐生葡萄球菌菌株或代表物上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上或在所說(shuō)溶液中的指示所說(shuō)樣品中腐生葡萄球菌的存在和/或其量之所說(shuō)標(biāo)記的存在或其強(qiáng)度。
25.一種如權(quán)利要求24限定的方法，其中所說(shuō)的探針選自下組1)長(zhǎng)度為12-172個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO21或其互補(bǔ)序列中，2)長(zhǎng)度為12-155個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO22或其互補(bǔ)序列中，3)長(zhǎng)度為12-145個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO23或其互補(bǔ)序列中，4)長(zhǎng)度為12-265個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO24或其互補(bǔ)序列中，和它們的特異性地和普遍地退火結(jié)合到腐生葡萄球菌菌株和代表物上的變體。
26.權(quán)利要求25的方法，其中用于檢測(cè)腐生葡萄球菌核酸序列的所說(shuō)的探針選自下組SEQ ID NO96、SEQ ID NO97、SEQ ID NO100、SEQ ID NO101、SEQ ID NO102、SEQ ID NO103、SEQ ID NO104和它們的互補(bǔ)序列。
27.一種檢試驗(yàn)驗(yàn)樣品中腐生葡萄球菌存在和/或其量的方法，該方法包括下列步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的腐生葡萄球菌DNA的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自以下序列之一SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ IDNO23、SEQ ID NO24、；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)指示所說(shuō)試驗(yàn)樣品中腐生葡萄球菌的存在和/或其量的所說(shuō)擴(kuò)增的靶序列的存在和/或其量。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自下組a)SEQ ID NO98和SEQ ID NO99，和b)SEQ ID NO139和SEQ ID NO140。
29一種用于直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落檢測(cè)、鑒別和/或定量分析粘膜炎莫拉氏菌的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO28、SEQ IDNO29、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地和普遍地退火結(jié)合到粘膜炎莫拉氏菌菌株或代表物上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上或在所說(shuō)溶液中的指示所說(shuō)樣品中粘膜炎莫拉氏菌的存在和/或其量之所說(shuō)標(biāo)記的存在或其強(qiáng)度。
30.一種如權(quán)利要求29限定的方法，其中所說(shuō)的探針選自下組1)長(zhǎng)度為12-526個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO28或其互補(bǔ)序列中，2)長(zhǎng)度為12-466個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO29或其互補(bǔ)序列中，和它們的特異性地和普遍地退火結(jié)合到粘膜炎莫拉氏菌株和代表物上的變體。
31.權(quán)利要求30的方法，其中用于檢測(cè)粘膜炎莫拉氏菌核酸序列的所說(shuō)的探針選自下組SEQ ID NO108、SEQ ID NO109、SEQ IDNO110、SEQ ID NO111、SEQ ID NO114、SEQ ID NO115、SEQID NO116、SEQ ID NO117和它們的互補(bǔ)序列。
32.一種檢測(cè)試驗(yàn)樣品中粘膜炎莫拉氏菌存在和/或其量的方法，該方法包括下列步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的粘膜炎莫拉氏菌DNA的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自以下序列之一SEQ ID NO28和SEQ ID NO29；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)指示所說(shuō)試驗(yàn)樣品中粘膜炎莫拉氏菌的存在和/或其量的所說(shuō)擴(kuò)增的靶序列的存在和/或其量。
33.權(quán)利要求13的方法，其中所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自下組a)SEQ ID NO112和SEQ ID NO113，b)SEQ ID NO118和SEQ ID NO119，以及c)SEQ ID NO160和SEQ ID NO119。
34.一種用于直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落檢測(cè)、鑒別和/或定量分析銅綠假單胞菌的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO16、SEQ IDNO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地和普遍地退火結(jié)合到銅綠假單胞菌菌株或代表物上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上或在所說(shuō)溶液中的指示所說(shuō)樣品中銅綠假單胞菌的存在和/或其量之所說(shuō)標(biāo)記的存在或其強(qiáng)度。
35.一種如權(quán)利要求35限定的方法，其中所說(shuō)的探針選自下組1)長(zhǎng)度為12-2167個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO16或其互補(bǔ)序列中，2)長(zhǎng)度為12-1872個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO17或其互補(bǔ)序列中，3)長(zhǎng)度為12-3451個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO18或其互補(bǔ)序列中，4)長(zhǎng)度為12-744個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO19或其互補(bǔ)序列中，5)長(zhǎng)度為12-2760個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO20或其互補(bǔ)序列中，和它們的特異性地和普遍地退火結(jié)合到銅綠假單胞菌菌株和代表物上的變體。
36.權(quán)利要求35的方法，其中用于檢測(cè)銅綠假單胞菌核酸序列的所說(shuō)的探針選自下組SEQ ID NO87、SEQ ID NO88、SEQ ID NO89、SEQ ID NO90、SEQ ID NO91、SEQ ID NO92、SEQ ID NO93、SEQ ID NO94、SEQ ID NO95和它們的互補(bǔ)序列。
37.一種檢測(cè)試驗(yàn)樣品中銅綠假單胞菌存在和/或其量的方法，該方法包括下列步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的銅綠假單胞菌DNA的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自以下序列之一SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ IDNO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)指示所說(shuō)試驗(yàn)樣品中銅綠假單胞菌的存在和/或其量的所說(shuō)擴(kuò)增的靶序列的存在和/或其量。
38.權(quán)利要求12的方法，其中所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自下組a)SEQ ID NO83和SEQ ID NO84，以及b)SEQ ID NO85和SEQ ID NO86，
39.一種用于直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落檢測(cè)、鑒別和/或定量分析表皮葡萄球菌的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO36其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地和普遍地退火結(jié)合到表皮葡萄球菌菌株或代表物上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上或在所說(shuō)溶液中的指示所說(shuō)樣品中表皮葡萄球菌的存在和/或其量之所說(shuō)標(biāo)記的存在或其強(qiáng)度。
40.一種如權(quán)利要求9限定的方法，其中所說(shuō)的探針選自長(zhǎng)度為12-705個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO36中，和其特異性地和普遍地退火結(jié)合到表皮葡萄球菌菌株和代表物上的變體。
41.一種檢測(cè)試驗(yàn)樣品中表皮葡萄球菌存在和/或其量的方法，該方法包括下列步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的表皮葡萄球菌DNA的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自SEQ ID NO36；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)指示所說(shuō)試驗(yàn)樣品中表皮葡萄球菌的存在和/或其量的所說(shuō)擴(kuò)增的靶序列的存在和/或其量。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自下組a)SEQ ID NO145和SEQ ID NO146，以及b)SEQ ID NO147和SEQ ID NO148。
43.一種用于直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落檢測(cè)、鑒別和/或定量分析金黃色葡萄球菌的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO37、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地和普遍地退火結(jié)合到金黃色葡萄球菌菌株或代表物上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上或在所說(shuō)溶液中的指示所說(shuō)樣品中金黃色葡萄球菌的存在和/或其量之所說(shuō)標(biāo)記的存在或其強(qiáng)度。
44.一種如權(quán)利要求9限定的方法，其中所說(shuō)的探針選自長(zhǎng)度為12-442個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO37中，和其特異性地和普遍地退火結(jié)合到表皮葡萄球菌菌株和代表物上的變體。
45.一種檢測(cè)試驗(yàn)樣品中金黃色葡萄球菌存在和/或其量的方法，該方法包括下列步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的金黃色葡萄球菌DNA的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自SEQ ID NO37；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)指示所說(shuō)試驗(yàn)樣品中金黃色葡萄球菌的存在和/或其量的所說(shuō)擴(kuò)增的靶序列的存在和/或其量。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自下組a)SEQ ID NO149和SEQ ID NO150，b)SEQ ID NO149和SEQ ID NO151，以及c)SEQ ID NO152和SEQ ID NO153，
47.一種用于直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落檢測(cè)、鑒別和/或定量分析流感嗜血菌的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO25、SEQ IDNO26、SEQ ID NO27、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地和普遍地退火結(jié)合到流感嗜血菌菌株或代表物上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上或在所說(shuō)溶液中的指示所說(shuō)樣品中流感嗜血菌的存在和/或其量之所說(shuō)標(biāo)記的存在或其強(qiáng)度。
48.一種如權(quán)利要求47限定的方法，其中所說(shuō)的探針選自下組1)長(zhǎng)度為12-845個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO25或其互補(bǔ)序列中，2)長(zhǎng)度為12-1598個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO26或其互補(bǔ)序列中，3)長(zhǎng)度為12-9100個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ IDNO27或其互補(bǔ)序列中，它們的特異性地和普遍地退火結(jié)合到流感嗜血菌菌株和代表物上的變體。
49.權(quán)利要求48的方法，其中用于檢測(cè)流感嗜血菌核酸序列的所說(shuō)的探針選自下組SEQ ID NO105、SEQ ID NO106、SEQ ID NO107和它們的互補(bǔ)序列。
50.一種檢測(cè)試驗(yàn)樣品中流感嗜血菌存在和/或其量的方法，該方法包括下列步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的流感嗜血菌DNA的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自以下序列之一SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ IDNO27；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)指示所說(shuō)試驗(yàn)樣品中流感嗜血菌的存在和/或其量的所說(shuō)擴(kuò)增的靶序列的存在和/或其量。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自SEQ ID NO154和SEQ ID NO155。
52.一種用于直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落檢測(cè)、鑒別和/或定量分析肺炎鏈球菌的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO30、SEQ IDNO31、SEQ ID NO34、SEQ ID NO35、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地和普遍地退火結(jié)合到肺炎鏈球菌菌株或代表物上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上或在所說(shuō)溶液中的指示所說(shuō)樣品中肺炎鏈球菌的存在和/或其量之所說(shuō)標(biāo)記的存在或其強(qiáng)度。
53.一種如權(quán)利要求52限定的方法，其中所說(shuō)的探針選自下組1)長(zhǎng)度為12-631個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO30或其互補(bǔ)序列中，2)長(zhǎng)度為12-3754個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO31或其互補(bǔ)序列中，3)長(zhǎng)度為12-841個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO34或其互補(bǔ)序列中，4)長(zhǎng)度為12-4500個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO35或其互補(bǔ)序列中，和它們的特異性地和普遍地退火結(jié)合到肺炎鏈球菌菌株和代表物上的變體。
54.權(quán)利要求53的方法，其中用于檢測(cè)肺炎鏈球菌核酸序列的所說(shuō)的探針選自下組SEQ ID NO120、SEQ ID NO121和它們的互補(bǔ)序列。
55.一種檢測(cè)試驗(yàn)樣品中肺炎鏈球菌存在和/或其量的方法，該方法包括下列步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的肺炎鏈球菌DNA的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自以下序列之一SEQ ID NO30、SEQ ID NO31、SEQ IDNO34、SEQ ID NO35；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)指示所說(shuō)試驗(yàn)樣品中肺炎鏈球菌的存在和/或其量的所說(shuō)擴(kuò)增的靶序列的存在和/或其量。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自下組a)SEQ ID NO78和SEQ ID NO79，b)SEQ ID NO156和SEQ ID NO157，以及c)SEQ ID NO158和SEQ ID NO159。
57.一種用于直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落檢測(cè)、鑒別和/或定量分析釀膿鏈球菌的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO32、SEQ IDNO33、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地和普遍地退火結(jié)合到釀膿鏈球菌菌株或代表物上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上或在所說(shuō)溶液中的指示所說(shuō)樣品中釀膿鏈球菌的存在和/或其量之所說(shuō)標(biāo)記的存在或其強(qiáng)度。
58.一種如權(quán)利要求57限定的方法，其中所說(shuō)的探針選自下組1)長(zhǎng)度為12-1337個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO32或其互補(bǔ)序列中，2)長(zhǎng)度為12-1837個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO33或其互補(bǔ)序列中，和它們的特異性地和普遍地退火結(jié)合到釀膿鏈球菌菌株和代表物上的變體。
59.一種檢測(cè)試驗(yàn)樣品中釀膿鏈球菌存在和/或其量的方法，該方法包括下列步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的釀膿鏈球菌DNA的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自以下序列之一SEQ ID NO32、SEQ ID NO33；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)指示所說(shuō)試驗(yàn)樣品中釀膿鏈球菌的存在和/或其量的所說(shuō)擴(kuò)增的靶序列的存在和/或其量。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自下組a)SEQ ID NO141和SEQ ID NO142，以及b)SEQ ID NO143和SEQ ID NO144，
61.一種用于直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落檢測(cè)、鑒別和/或定量分析糞腸球菌的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地和普遍地退火結(jié)合到糞腸球菌菌株或代表物上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上或在所說(shuō)溶液中的指示所說(shuō)樣品中糞腸球菌的存在和/或其量之所說(shuō)標(biāo)記的存在或其強(qiáng)度。
62.一種如權(quán)利要求61限定的方法，其中所說(shuō)的探針選自下組1)長(zhǎng)度為12-1817個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO1或其互補(bǔ)序列中，2)長(zhǎng)度為12-2275個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該序列包含在SEQ ID NO2或其互補(bǔ)序列中，和它們的特異性地和普遍地退火結(jié)合到糞腸球菌菌株和代表物上的變體。
63.一種檢測(cè)試驗(yàn)樣品中糞腸球菌存在和/或其量的方法，該方法包括下列步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的糞腸球菌DNA的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自以下序列之一SEQ ID NO1、SEQ ID NO2；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)指示所說(shuō)試驗(yàn)樣品中糞腸球菌的存在和/或其量的所說(shuō)擴(kuò)增的靶序列的存在和/或其量。
64.權(quán)利要求63的方法，其中所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自下組a)SEQ ID NO38和SEQ ID NO39，以及b)SEQ ID NO40和SEQ ID NO41。
65.一種用于直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落檢測(cè)任何細(xì)菌物種的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與通用探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針的序列選自下組SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ IDNO6、SEQ ID NO7和其互補(bǔ)序列，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上或在所說(shuō)溶液中的指示所說(shuō)樣品中的所說(shuō)任何細(xì)菌物種的存在和/或其量之所說(shuō)標(biāo)記的存在或其強(qiáng)度。
66.一種檢測(cè)試驗(yàn)樣品中任何細(xì)菌物種存在和/或其量的方法，該方法包括下列步驟a)用包含一對(duì)通用引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的所說(shuō)任何細(xì)菌物種DNA的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)引物的序列是SEQ ID NO126和SEQ IDNO127所限定的；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)指示所說(shuō)試驗(yàn)樣品中所說(shuō)任何細(xì)菌物種的存在和/或其量的所說(shuō)擴(kuò)增的靶序列的存在和/或其量。
67.一種直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因blatem(TEM-1)介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO161、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地退火結(jié)合到編碼β-內(nèi)酰胺酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因TEM-1介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)標(biāo)記的存在和/或其強(qiáng)度。
68.一種如權(quán)利要求67限定的方法，其中所說(shuō)的探針包含與SEQ IDNO161雜交的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
69.一種在試驗(yàn)樣品中估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因blatem(TEM-1)介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的編碼β-內(nèi)酰胺酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自SEQ ID NO161；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因TEM-1介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)擴(kuò)增靶序列的存在和/或其量。
70.一種直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因blarob(ROB-1)介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO162、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地退火結(jié)合到編碼β-內(nèi)酰胺酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因ROB-1介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)標(biāo)記的存在和/或其強(qiáng)度。
71.一種如權(quán)利要求70限定的方法，其中所說(shuō)的探針包含與SEQ IDNO162雜交的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
72.一種在試驗(yàn)樣品中估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因blarob(ROB-1)介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的編碼β-內(nèi)酰胺酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自SEQ ID NO162；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因ROB-1介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)擴(kuò)增靶序列的存在和/或其量。
73.一種直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因blaSHV(SHV-1)介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO163、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地退火結(jié)合到編碼β-內(nèi)酰胺酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因SHV-1介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)標(biāo)記的存在和/或其強(qiáng)度。
74.一種如權(quán)利要求73限定的方法，其中所說(shuō)的探針包含與SEQ IDNO163雜交的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
75.一種在試驗(yàn)樣品中估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因blashv(SHV-1)介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的編碼β-內(nèi)酰胺酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自SEQ ID NO163；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因SHV-1介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)擴(kuò)增靶序列的存在和/或其量。
76.一種直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因aadB介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO164、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地退火結(jié)合到編碼氨基苷腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因aadB介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)標(biāo)記的存在和/或其強(qiáng)度。
77.一種如權(quán)利要求76限定的方法，其中所說(shuō)的探針包含與SEQ ID NO164雜交的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
78.一種在試驗(yàn)樣品中估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因aadB介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的編碼氨基苷腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自SEQ ID NO164；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因aadB介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)擴(kuò)增靶序列的存在和/或其量。
79.一種直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因aacC1介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO165、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地退火結(jié)合到編碼氨基苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因aacC1介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)標(biāo)記的存在和/或其強(qiáng)度。
80.一種如權(quán)利要求79限定的方法，其中所說(shuō)的探針包含與SEQ ID NO165雜交的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
81.一種在試驗(yàn)樣品中估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因aacC1介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的編碼氨基苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自SEQ ID NO165；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因aacC1介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)擴(kuò)增靶序列的存在和/或其量。
82.一種直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因aacC2介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO166、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地退火結(jié)合到編碼氨基苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因aacC2介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)標(biāo)記的存在和/或其強(qiáng)度。
83.一種如權(quán)利要求82限定的方法，其中所說(shuō)的探針包含與SEQ ID NO166雜交的長(zhǎng)度至少為1 2個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
84.一種在試驗(yàn)樣品中估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因aacC2介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的編碼氨基苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自SEQ ID NO166；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因aacC2介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)擴(kuò)增靶序列的存在和/或其量。
85.一種直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因aacC3介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO167、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地退火結(jié)合到編碼氨基苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因aacC3介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)標(biāo)記的存在和/或其強(qiáng)度。
86.一種如權(quán)利要求87限定的方法，其中所說(shuō)的探針包含與SEQ ID NO167雜交的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
87.一種在試驗(yàn)樣品中估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因aacC3介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的編碼氨基苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自SEQ ID NO167；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因aacC3介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)擴(kuò)增靶序列的存在和/或其量。
88.一種直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因aacA4介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO168、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地退火結(jié)合到編碼氨基苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因aacA4介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)標(biāo)記的存在和/或其強(qiáng)度。
89.一種如權(quán)利要求88限定的方法，其中所說(shuō)的探針包含與SEQ ID NO168雜交的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
90.一種在試驗(yàn)樣品中估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因aacA4介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的編碼氨基苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自SEQ ID NO168；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因aacA4介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)擴(kuò)增靶序列的存在和/或其量。
91.一種直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因mecA介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO169、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地退火結(jié)合到編碼青霉素結(jié)合蛋白的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因mecA介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)標(biāo)記的存在和/或其強(qiáng)度。
92.一種如權(quán)利要求91限定的方法，其中所說(shuō)的探針包含與SEQ ID NO169雜交的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
93.一種在試驗(yàn)樣品中估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因mecA介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的編碼青霉素結(jié)合蛋白的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自SEQ ID NO169；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因mecA介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)擴(kuò)增靶序列的存在和/或其量。
94.一種直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因vanH、vanA和vanX介導(dǎo)的對(duì)萬(wàn)古霉素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO170、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地退火結(jié)合到編碼萬(wàn)古霉素-抗性蛋白質(zhì)的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因vanH、vanA和vanX介導(dǎo)的對(duì)萬(wàn)古霉素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)標(biāo)記的存在和/或其強(qiáng)度。
95.一種如權(quán)利要求94限定的方法，其中所說(shuō)的探針包含與SEQ ID NO170雜交的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
96.一種在試驗(yàn)樣品中估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因vanH、vanA和vanX介導(dǎo)的對(duì)萬(wàn)古霉素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的編碼萬(wàn)古霉素-抗性蛋白質(zhì)的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自SEQ ID NO170；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因vanH、vanA和vanX介導(dǎo)的對(duì)萬(wàn)古霉素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)擴(kuò)增靶序列的存在和/或其量。
97.一種直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因satA介導(dǎo)的對(duì)鏈霉殺陽(yáng)菌素A的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO173、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地退火結(jié)合到編碼鏈霉殺陽(yáng)菌素A乙酰轉(zhuǎn)移酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因satA介導(dǎo)的對(duì)鏈霉殺陽(yáng)菌素A的細(xì)菌抗性之所說(shuō)標(biāo)記的存在和/或其強(qiáng)度。
98.一種如權(quán)利要求97限定的方法，其中所說(shuō)的探針包含與SEQ ID NO173雜交的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
99.一種在試驗(yàn)樣品中估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因satA介導(dǎo)的對(duì)鏈霉殺陽(yáng)菌素A的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的編碼鏈霉殺陽(yáng)菌素A乙酰轉(zhuǎn)移酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自SEQ ID NO173；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因satA介導(dǎo)的對(duì)鏈霉殺陽(yáng)菌素A的細(xì)菌抗性之所說(shuō)擴(kuò)增靶序列的存在和/或其量。
100.一種直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因aacA-aphD介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO174、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地退火結(jié)合到編碼氨基苷乙酰轉(zhuǎn)移酶-磷酸轉(zhuǎn)移酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因aacA-aphD介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)標(biāo)記的存在和/或其強(qiáng)度。
101.一種如權(quán)利要求100限定的方法，其中所說(shuō)的探針包含與SEQ IDNO174雜交的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
102.一種在試驗(yàn)樣品中估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因aacA-aphD介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的編碼氨基苷乙酰酰轉(zhuǎn)移酶-磷酸轉(zhuǎn)移酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自SEQ ID NO174；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因aacA-aphD介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)擴(kuò)增靶序列的存在和/或其量。
103.一種直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因vat介導(dǎo)的對(duì)virginiamycin的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO175、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地退火結(jié)合到編碼virginiamycin乙酰轉(zhuǎn)移酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因vat介導(dǎo)的對(duì)virginiamycin的細(xì)菌抗性之所說(shuō)標(biāo)記的存在和/或其強(qiáng)度。
104.一種如權(quán)利要求103限定的方法，其中所說(shuō)的探針包含與SEQ IDNO175雜交的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
105.一種在試驗(yàn)樣品中估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因vat介導(dǎo)的對(duì)氨基苷類抗生素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的編碼virginiamycin乙酰轉(zhuǎn)移酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自SEQ ID NO175；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因vat介導(dǎo)的對(duì)virginiamycin的細(xì)菌抗性之所說(shuō)擴(kuò)增靶序列的存在和/或其量。
106.一種直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因vga介導(dǎo)的對(duì)virginiamycin的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO176、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地退火結(jié)合到編碼ATP-結(jié)合蛋白的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因vga介導(dǎo)的對(duì)virginiamycin的細(xì)菌抗性之所說(shuō)標(biāo)記的存在和/或其強(qiáng)度。
107.一種如權(quán)利要求106限定的方法，其中所說(shuō)的探針包含與SEQ IDNO176雜交的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
108.一種在試驗(yàn)樣品中估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因vga介導(dǎo)的對(duì)virginiamycin的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的編碼ATP-結(jié)合蛋白的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自SEQ ID NO176；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因vga介導(dǎo)的對(duì)virginiamycin的細(xì)菌抗性之所說(shuō)擴(kuò)增靶序列的存在和/或其量。
109.一種直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因nsrA介導(dǎo)的對(duì)紅霉素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO177、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地退火結(jié)合到編碼紅霉素抗性蛋白質(zhì)的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因msrA介導(dǎo)的對(duì)紅霉素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)標(biāo)記的存在和/或其強(qiáng)度。
110.一種如權(quán)利要求109限定的方法，其中所說(shuō)的探針包含與SEQ IDNO177雜交的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
111.一種在試驗(yàn)樣品中估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因msrA介導(dǎo)的對(duì)紅霉素的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的編碼紅霉素抗性蛋白質(zhì)的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自SEQ ID NO177；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因msrA介導(dǎo)的對(duì)紅霉素的細(xì)菌抗性之所說(shuō)擴(kuò)增靶序列的存在和/或其量。
112.一種直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因int介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素、氨基苷類抗生素、氯霉素和/或甲氧芐啶的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO171、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地退火結(jié)合到編碼整合酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因int介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素、氨基苷類抗生素、氯霉素和/或甲氧芐啶的細(xì)菌抗性之所說(shuō)標(biāo)記的存在和/或其強(qiáng)度。
113.一種如權(quán)利要求112限定的方法，其中所說(shuō)的探針包含與SEQ IDNO171雜交的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
114.一種在試驗(yàn)樣品中估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因int介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素、氨基苷類抗生素、氯霉素和/或甲氧芐啶的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的編碼整合酶的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自SEQ ID NO171；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因int介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素、氨基苷類抗生素、氯霉素和/或甲氧芐啶的細(xì)菌抗性之所說(shuō)擴(kuò)增靶序列的存在和/或其量。
115.一種直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌菌落估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因sul介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素、氨基苷類抗生素、氯霉素和/或甲氧芐啶的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品的或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者將所說(shuō)的樣品或從這一樣品分離的實(shí)質(zhì)上均一的細(xì)菌群體接種到惰性支持物上，并原位溶解所說(shuō)的接種的樣品或分離的細(xì)菌，以釋放細(xì)菌DNA，所說(shuō)細(xì)菌DNA實(shí)質(zhì)上是單鏈形式；b)在可以使探針核苷酸與所說(shuō)細(xì)菌DNA選擇性雜交的條件下，把所說(shuō)的單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，所說(shuō)的探針包含至少一種單鏈核酸，該核酸的核苷酸序列選自下組SEQ ID NO172、其互補(bǔ)序列、其部分和其變體，所說(shuō)探針特異性地退火結(jié)合到編碼磺胺抗性蛋白質(zhì)的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因上，所說(shuō)的復(fù)合物由標(biāo)記方法檢測(cè)，標(biāo)記存在于所說(shuō)探針上或者標(biāo)記存在于所說(shuō)標(biāo)記方法的第一反應(yīng)成員上，所說(shuō)第一反應(yīng)成員與存在于所說(shuō)探針上的第二反應(yīng)成員反應(yīng)；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因sul介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素、氨基苷類抗生素、氯霉素和/或甲氧芐啶的細(xì)菌抗性之所說(shuō)標(biāo)記的存在和/或其強(qiáng)度。
116.一種如權(quán)利要求115限定的方法，其中所說(shuō)的探針包含與SEQ IDNO172雜交的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
117.一種在試驗(yàn)樣品中估價(jià)由細(xì)菌抗生素抗性基因sul介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素、氨基苷類抗生素、氯霉素和/或甲氧芐啶的細(xì)菌抗性的方法，該方法包括以下步驟a)用包含至少一對(duì)長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物之水溶液處理所說(shuō)的樣品，所說(shuō)引物之一能夠選擇性地與含有靶序列的編碼磺胺抗性蛋白質(zhì)的所說(shuō)細(xì)菌抗生素抗性基因的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一雜交，所說(shuō)引物的另一個(gè)能夠與所說(shuō)鏈的另一條雜交，以致形成延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有作為模板的靶序列，所說(shuō)的至少一對(duì)引物選自SEQ ID NO172；b)合成各所說(shuō)引物的含靶序列的延伸產(chǎn)物，并擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列(如果存在的話)至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)在所說(shuō)惰性支持物上的或在所說(shuō)溶液中的指示由細(xì)菌抗生素抗性基因sul介導(dǎo)的對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素、氨基苷類抗生素、氯霉素和/或甲氧芐啶的細(xì)菌抗性之所說(shuō)擴(kuò)增靶序列的存在和/或其量。
118.一種核酸，該核酸具有SEQ ID NO1-37、SEQ ID NO161-177、其部分和其變體任一之核苷酸序列，當(dāng)以單鏈形式時(shí)，所述核酸作為探針或引物普遍地和特異性地與靶細(xì)菌DNA雜交。
119.一種具有SEQ ID NO38-160任一之核苷酸序列的寡核苷酸。
120.一種重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含如權(quán)利要求118所限定的核酸。
121.一種重組宿主，該宿主由按照權(quán)利要求120的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過(guò)。
122.一種按照權(quán)利要求121的重組宿主，其中所說(shuō)的宿主是大腸桿菌。
123.一種診斷試劑盒，其用于檢測(cè)和/或定量分析權(quán)利要求9、14、19、24、29、34、39、43、47、52、57和61之任一限定的任何組合的細(xì)菌物種的核酸，該試劑盒包含本文所限定的任何組合的探針。
124.一種診斷試劑盒，其用于檢測(cè)和/或定量分析權(quán)利要求10、11、15、16、20、21、25、26、30、31、35、36、40、44、48、49、53、54、58、62和65之任一限定的任何組合的細(xì)菌物種的核酸，該試劑盒包含本文所限定的任何組合的寡核苷酸探針。
125.一種診斷試劑盒，其用于檢測(cè)和/或定量分析權(quán)利要求12、13、17、18、22、23、27、28、32、33、37、38、41、42、45、46、50、51、55、56、59、60、63、64和66之任一限定的任何組合的細(xì)菌物種的核酸，該試劑盒包含本文所限定的任何組合的引物。
126.一種診斷試劑盒，其用于檢測(cè)和/或定量分析權(quán)利要求67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106和109之任一限定的任何組合的細(xì)菌抗性基因的核酸，該試劑盒包含本文所限定的任何組合的探針。
127.一種診斷試劑盒，其用于檢測(cè)和/或定量分析權(quán)利要求68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107和110之任一限定的任何組合的細(xì)菌抗性基因的核酸，該試劑盒包含本文所限定的任何組合的寡核苷酸探針。
128.一種診斷試劑盒，其用于檢測(cè)和/或定量分析權(quán)利要求69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、111之任一限定的任何組合的細(xì)菌抗性基因的核酸，該試劑盒包含本文所限定的任何組合的引物。
129.一種診斷試劑盒，其用于同時(shí)檢測(cè)和/或定量分析權(quán)利要求123限定的任何組合的細(xì)菌物種的核酸，該試劑盒包含本文限定的任何組合的細(xì)菌探針和SEQ ID NO161-177之任一限定的抗生素抗性基因的任何組合的全部或部分探針。
130.一種診斷試劑盒，其用于同時(shí)檢測(cè)和/或定量分析權(quán)利要求124限定的任何組合的細(xì)菌物種的核酸，該試劑盒包含本文限定的任何組合的細(xì)菌寡核苷酸探針和雜交到SEQ ID NO161-177之任一限定的抗生素抗性基因上的任何組合的寡核苷酸探針。
131.一種診斷試劑盒，其用于同時(shí)檢測(cè)和/或定量分析權(quán)利要求125限定的任何組合的細(xì)菌物種的核酸，該試劑盒包含本文限定的任何組合的引物和退火到SEQ ID NO161-177之任一限定的抗生素抗性基因上的任何組合的引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于DNA的通用的細(xì)菌檢測(cè)方法，用于直接從臨床樣品或者從細(xì)菌菌落特異性地檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌、奇異變形菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、腐生葡萄球菌、釀膿鏈球菌、流感嗜血菌和粘膜炎莫拉氏菌以及特異性地檢測(cè)通常遇到的和與臨床有關(guān)的細(xì)菌抗生素抗性基因。上述細(xì)菌物種總共可以占到常規(guī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離到的細(xì)菌病原體的80％。本發(fā)明的核心內(nèi)容主要包括得自所有物種特異性基因組DNA片段的DNA序列以及源于這些序列的任何寡核苷酸序列，所述的片段是經(jīng)雜交從基因組文庫(kù)選擇的或從數(shù)據(jù)庫(kù)選擇的，所述的寡核苷酸序列可以用作PCR或任何其它核苷酸擴(kuò)增方法的探針或擴(kuò)增引物。本發(fā)明也包括選擇的臨床相關(guān)抗生素抗性基因的DNA序列。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1161060SQ95195699
公開日1997年10月1日 申請(qǐng)日期1995年9月12日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月12日
發(fā)明者M·G·伯杰龍, M·奎爾特, P·H·羅伊 申請(qǐng)人:M·G·伯杰龍, M·奎爾特, P·H·羅伊