專利名稱：用于dna測(cè)序的具有修飾的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)的dna聚合酶的制作方法
本申請(qǐng)是1994年10月17日提交的Tabor和Richardson的標(biāo)題為“用于DNA測(cè)序的具有修飾的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)的DNA聚合酶”的申請(qǐng)的部分繼續(xù)，后者全文(包括附圖)在此引入作為參考。發(fā)明背景本發(fā)明是在政府的支持下(包括美國(guó)能源部合同號(hào)DE-FG02-88ER60688的資助下)完成的。美國(guó)政府對(duì)本發(fā)明享有某些權(quán)利。
本發(fā)明涉及適于DNA測(cè)序的DNA聚合酶和DNA測(cè)序的自動(dòng)與手工方法。
下面是與DNA測(cè)序技術(shù)相關(guān)領(lǐng)域的簡(jiǎn)述。它僅為閱讀本申請(qǐng)者提供一般指導(dǎo)，并不意味著本文所引用的或直接或間接涉及的任何技術(shù)對(duì)所附權(quán)利要求而言是現(xiàn)有技術(shù)。
DNA測(cè)序一般涉及生成四種具有一個(gè)確定末端和一個(gè)可變末端的單鏈DNA片段的群體?？勺兡┒送ǔＴ谔囟ê塑账釟埢?鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C))終止。四組不同的片段根據(jù)其長(zhǎng)度而被分開，一種方法是用高分辨率聚丙烯酰胺凝膠；膠上每條帶共線性地對(duì)應(yīng)DNA序列中一個(gè)特定核苷酸，由此鑒定給定核苷酸殘基在序列中的位置。見Tabor和Richardson，美國(guó)專利4,942,130和4,962,020。
DNA測(cè)序有兩種一般方法。一種方法(Maxam和Gilbert測(cè)序)涉及分離的DNA片段的化學(xué)降解，每個(gè)片段在其確定末端用單個(gè)放射性標(biāo)記物標(biāo)記，每種反應(yīng)特異性地在4種殘基(G、A、T或C)的一種或多種得到有限的切割。另一種方法(雙脫氧或鏈終止測(cè)序)涉及一條DNA帶的酶促合成。Sanger等(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，745463,1977)。通常進(jìn)行四種獨(dú)立的合成，每個(gè)反應(yīng)通過加入適當(dāng)?shù)逆溄K止核苷酸，如雙脫氧核苷酸，在特定殘基(G、A、T或C)處終止。優(yōu)選后一種方法，因?yàn)镈NA片段通過加入放射性標(biāo)記的核苷三磷酸可被均一地標(biāo)記(而非末端標(biāo)記)，因此大的DNA片段含有更多的放射性。進(jìn)一步可不用32P標(biāo)記的核苷酸而用35S標(biāo)記的核苷酸，以提高分辨率；由于每泳道只對(duì)應(yīng)G、A、T或C而更容易解釋反應(yīng)產(chǎn)物。常用于雙脫氧法測(cè)序的酶有T7 DNA聚合酶和分離自嗜熱生物體的DNA聚合酶如Taq、Vent、Tth等。其它的較少用的聚合酶包括AMV反轉(zhuǎn)錄酶和大腸桿菌聚合酶I的Klenow片段。
在雙脫氧鏈終止法中一段短的單鏈引物退火到單鏈模板上。摻入脫氧核苷酸(dNMP)將模板3′端延長(zhǎng)直到摻入雙脫氧核苷酸(ddNMP)為止。摻入ddNMP則延長(zhǎng)終止于該殘基?？刹挥胐dNTP而用其它鏈終止劑，并且ddNTP可如下述標(biāo)記。
用上述方法已研制出DNA序列分析用的自動(dòng)系統(tǒng)。EG&G制造的一種儀器利用放射性標(biāo)記的核苷酸的常規(guī)雙脫氧鏈終止反應(yīng)。用凝膠電泳分離得到的DNA產(chǎn)物，Toneguzzo等，生物技術(shù)，6，460，1988。放射性物質(zhì)通過凝膠底部時(shí)由檢測(cè)儀掃描。每個(gè)待測(cè)序模板需要4種合成反應(yīng)以及每塊膠上4條泳道，每種特定鏈終止劑的終止產(chǎn)物用單獨(dú)的一條泳道。
Kambara等，生物工程6，816，1988，使用了熒光標(biāo)記的引物。得到的熒光標(biāo)記產(chǎn)物在凝膠底部用激光激發(fā)，用CRT監(jiān)測(cè)儀檢測(cè)熒光。該方法對(duì)每個(gè)待測(cè)序引物也需要4種合成反應(yīng)和凝膠上的4條泳道。
應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制造一種采用4種不同引物的儀器，每種引物用一種不同的熒光標(biāo)記物標(biāo)記。Smith等，核酸研究，13，2399，1985；自然，321，674，1986。每種不同反應(yīng)用的引物含有四種核苷酸之一。
4種反應(yīng)完成后將混合物合并到一起，DNA片段在凝膠上的一條泳道上分級(jí)。在凝膠底部用一束激光來檢測(cè)在凝膠上電泳過的熒光產(chǎn)物。該系統(tǒng)對(duì)每個(gè)模板需要4種不同的退火反應(yīng)和4種不同的合成反應(yīng)，但在凝膠上僅需一條泳道。一條泳道上有4種帶使序列更容易用計(jì)算機(jī)分析。
杜邦公司曾經(jīng)提供一種儀器，其中四種雙脫氧核苷三磷酸上各連上一種不同的熒光標(biāo)記。Prober等，科學(xué)，238，336，1987。需要單一的退火步驟，單一的聚合酶反應(yīng)(含有4種被標(biāo)記的雙脫氧核苷三磷酸)和測(cè)序凝膠上單一泳道。DNA產(chǎn)物的4種不同的熒光標(biāo)記當(dāng)其在凝膠上電泳后分別被檢測(cè)。
Englert等，美國(guó)專利4,707,235(1987)描述一種多道電泳儀，它具有一種基本上跨越凝膠全長(zhǎng)的檢測(cè)裝置，當(dāng)4條泳道上的標(biāo)記的DNA產(chǎn)物通過檢測(cè)裝置時(shí)它們可以被檢測(cè)到，并且鑒定出樣品所處通道或泳道。優(yōu)選地用放射性同位素標(biāo)記。
當(dāng)前所用的DNA序列分析方法本質(zhì)上必需用凝膠滲透如聚丙烯酰胺凝膠電泳將放射性或熒光標(biāo)記的DNA產(chǎn)物分開，然后確定在沿通過凝膠的軸上它們之間的相對(duì)位置。該方法的準(zhǔn)確度部分地取決于在凝膠上遷移了大約相等的距離的帶上信號(hào)的均一程度。相鄰帶之間信號(hào)強(qiáng)度區(qū)別或差異造成幾種問題。首先，這降低該方法的敏感性，而該敏感性受檢測(cè)含最小信號(hào)的帶的能力的限制。第二，這在確定一條信號(hào)弱的帶是加入鏈終止劑的真實(shí)信號(hào)，還是DNA上聚合酶解離的停頓位點(diǎn)造成的偽跡時(shí)會(huì)產(chǎn)生困難。第三，由于一條帶的強(qiáng)信號(hào)會(huì)屏蔽相鄰帶的弱信號(hào)而降低確定緊鄰帶上DNA序列的準(zhǔn)確度。見Tabor和Richardson，引文見上。
帶的強(qiáng)度的差別可能源于多數(shù)DNA聚合酶的內(nèi)在性質(zhì)。多數(shù)DNA聚合酶對(duì)用于DNA序列分析的鏈終止雙脫氧核苷酸區(qū)別對(duì)待(discriminate)。T4DNA聚合酶對(duì)ddNTP區(qū)別對(duì)待太強(qiáng)，不能用于DNA測(cè)序。大腸桿菌DNA聚合酶I Taq和Vent DNA聚合酶也對(duì)ddNTP強(qiáng)烈地區(qū)別對(duì)待，各酶摻入ddNMP的能力比摻入相應(yīng)的dNTP少一千倍。Tabor和Richardson，引文見上(均在此引入作為參考)顯示T7 DNA聚合酶處于另一極端，它對(duì)ddNTP的區(qū)別對(duì)待僅有幾倍。如果DNA聚合酶在所有序列對(duì)ddNTP均以同樣程度區(qū)別對(duì)待，調(diào)整ddNTP對(duì)dNTP的比例即可簡(jiǎn)單地解決這個(gè)問題。這種方法已用于大腸桿菌DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶。但是區(qū)別對(duì)待的程度隨相鄰DNA序列而變，導(dǎo)致相鄰放射性片段的強(qiáng)度差別很大。對(duì)大腸桿菌DNA聚合酶I，具體的片段強(qiáng)度可相差50倍，而對(duì)T7 DNA聚合酶僅相差幾倍。因而DNA測(cè)序膠上T7 DNA聚合酶產(chǎn)生的帶的強(qiáng)度相似，可以方便地用自動(dòng)方法來檢測(cè)與分析。另外有描述進(jìn)一步降低T7 DNA聚合酶對(duì)雙脫氧核苷酸區(qū)別對(duì)待程度的方法，能平等地?fù)饺腚p脫氧核苷酸和脫氧核苷酸。這些方法也減少其它DNA聚合酶如Klenow和Taq DNA聚合酶的區(qū)別對(duì)待程度，但不能完全消除區(qū)別對(duì)待。例如在反應(yīng)混合液中用錳而不用鎂或既用鎂又用錳可以降低或消除對(duì)雙脫氧核苷酸的區(qū)別對(duì)待。這種條件下，T7 DNA聚合酶不對(duì)兩種分子進(jìn)行區(qū)分而其它DNA聚合酶如Klenow片段，Taq和Vent仍在一定程度上區(qū)別對(duì)待。例如當(dāng)錳存在時(shí)，Klenow仍對(duì)ddNTP區(qū)別對(duì)待4倍。更為重要的是，盡管這些酶如Klenow和Taq DNA聚合酶的區(qū)別對(duì)待的整體程度降低了，但由于在DNA中特定序列上高的區(qū)別對(duì)待使特定片段強(qiáng)度相差4倍以上。如今這些聚合酶和操作方法廣泛用于手工DNA測(cè)序(即，不借助上述測(cè)序儀器)和普遍用于自動(dòng)方法。使用錳以及在所有位點(diǎn)對(duì)ddNTP不再區(qū)別對(duì)待可以得到統(tǒng)一強(qiáng)度的帶，使得手工或自動(dòng)操作方法中閱讀測(cè)序膠更加便利。而且由于不再區(qū)別對(duì)待，可以用新操作方法來做序列分析(Tabor和Richardson，引文見上)。提供一種基于該發(fā)現(xiàn)的方法，在含有不同比例的所有4種ddNTP的一個(gè)反應(yīng)中，通過測(cè)量凝膠電泳后每個(gè)峰的相對(duì)強(qiáng)度來確定DNA序列。作者們指出本發(fā)明的DNA聚合酶對(duì)雙脫氧核苷酸類似物和正常核苷酸區(qū)別不大。即摻入類似物的機(jī)率與摻入正常核苷酸的幾率近乎相等，或摻入類似物的幾率至少是摻入正常核苷酸的幾率的1/10。本發(fā)明的聚合酶對(duì)某些其它類似物區(qū)別也不大。因?yàn)槌怂姆N正常的脫氧核苷三磷酸(dGTP，dATP，dTTP和dCTP)，測(cè)序反應(yīng)要摻入其它類型的核苷衍生物如通常用來用35S，32P標(biāo)記合成鏈的放射性或熒光標(biāo)記的核苷三磷酸，或其它化學(xué)試劑，故而這一點(diǎn)很重要。若DNA聚合酶不對(duì)類似物區(qū)別對(duì)待，則摻入類似物與摻入正常的核苷酸有相同的幾率。對(duì)于標(biāo)記的核苷三磷酸，為了用最小量的放射性有效地標(biāo)記合成的DNA鏈[4,942,130，COL 55]，這一點(diǎn)很重要。
他們還指出能夠得到強(qiáng)度近似相等的相鄰帶十分有用，因?yàn)檫@樣可以更方便地讀出任何測(cè)序反應(yīng)的結(jié)果并且把握更大。此外，由于測(cè)序反應(yīng)中帶有特定鏈終止劑的DNA產(chǎn)物形成的帶與附近帶強(qiáng)度幾乎相同，則帶強(qiáng)度本身為這樣形成的一系列帶提供了一種特定的標(biāo)記。某一給定鏈終止劑得到的分子量幾乎相同的DNA產(chǎn)物數(shù)目依鏈終止劑的濃度而改變。因此在合成中4種鏈終止劑的濃度不同，摻入一種鏈終止劑的DNA產(chǎn)物同摻入其它鏈終止劑的分子量幾乎相同的DNA產(chǎn)物因其數(shù)目或量不同而區(qū)分開來；因而只需簡(jiǎn)單地將DNA產(chǎn)物的帶與附近帶的強(qiáng)度對(duì)比就可鑒定出它的鏈終止劑。結(jié)果是每一系列含有一種不同的鏈終止劑的兩種或多種系列的DNA產(chǎn)品可加到一條泳道上做凝膠擴(kuò)散，將每條帶與附近帶的強(qiáng)度進(jìn)行而鑒定出來。而且合成摻入不同鏈終止劑的DNA產(chǎn)物不需要在單獨(dú)的容器中分別進(jìn)行，可以在一個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)進(jìn)行，并且如果需要，同一種標(biāo)記物如放射性同位素或熒光等標(biāo)記物可用于所有的鏈終止劑而不是每個(gè)鏈終止劑用一種不同的標(biāo)記物，從而簡(jiǎn)化了操作過程。[4,962,020，COL 31-35]也可以見Tabor和Richardson，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊86，4076-4080(1989)，該文指出T7 DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶催化過程中用錳離子代替鎂離子能將這些聚合酶對(duì)ddNTP的區(qū)別對(duì)待降低4-100倍。也可以見Tabor和Richardson，生物化學(xué)雜志，265,8322-8328(1990)，該文描述用T7 DNA聚合酶、焦磷酸酶和錳離子得到強(qiáng)度一致的雙脫氧終止片段。發(fā)明概述申請(qǐng)人相信，某些DNA聚合酶較少用于雙脫氧DNA測(cè)序，部分地是由于這些聚合酶摻入ddNMP(或其它核苷酸類似物)代替dNMP的能力較低。如上面提到的，若能夠不區(qū)別對(duì)待，則比區(qū)別對(duì)待的酶可以用更低濃度的ddNTP，更重要的是，在測(cè)序膠上能提供沿其長(zhǎng)度方向強(qiáng)度更統(tǒng)一的成帶模式。這些結(jié)果使得用該酶自動(dòng)測(cè)序更容易也更有利，因?yàn)榭梢愿邪盐盏卮_定更長(zhǎng)的DNA序列。
本發(fā)明提供一種方法，將原本有區(qū)別對(duì)待性質(zhì)的DNA聚合酶改變后，與相應(yīng)的天然存在的酶相比對(duì)ddNTP的區(qū)別對(duì)待更小。該方法涉及遺傳修飾該聚合酶，在關(guān)鍵位置得到能夠增強(qiáng)該聚合酶摻入dNMP類似物的能力的氨基酸殘基。申請(qǐng)人已確定DNA聚合酶特定區(qū)域的氨基酸變化對(duì)這些DNA聚合酶摻入雙脫氧核苷酸的能力有極大影響；插入的特定氨基酸殘基決定該聚合酶對(duì)ddNTP區(qū)別對(duì)待得更大還是更小。申請(qǐng)人已確定修飾DNA聚合酶使之更有效地?fù)饺腚p脫氧核苷酸對(duì)其在DNA測(cè)序中的應(yīng)用影響極大。有可能這種修飾的DNA聚合酶在其它常見的分子生物學(xué)方法如DNA擴(kuò)增(例如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、體外誘變和填補(bǔ)DNA片段末端中也很有用。該技術(shù)與改變DNA聚合酶(例如T7 DNA聚合酶，描述見Tabor和Richardson，引文見上)的3′-5′外切酶活性的現(xiàn)有技術(shù)，測(cè)序反應(yīng)中錳和焦磷酸酶的應(yīng)用相結(jié)合將會(huì)生產(chǎn)出比已知酶要優(yōu)越得多的酶。修飾DNA聚合酶優(yōu)選地替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，但也可以是插入一個(gè)或多個(gè)另外的氨基酸或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
在一特定方面，即DNA測(cè)序方面，具有在DNA測(cè)序條件下于50℃，特別是60℃，70℃，甚至是80℃以上的溫度下催化核苷酸聚合的能力的嗜熱酶在本領(lǐng)域廣為人知。這些酶通常存在于在這些溫度下生長(zhǎng)的生物中。而且申請(qǐng)人認(rèn)為許多這樣的酶存在不足之處，包括摻入雙脫氧核苷酸的能力有限。通過用下述方法修飾這些酶，本領(lǐng)域的專業(yè)人員可以修飾任一所需的嗜熱DNA聚合酶，使之更有效地?fù)饺腚p脫氧核苷酸。在自動(dòng)儀器和手工測(cè)序中，特別是在循環(huán)測(cè)序操作中，這樣的酶要比當(dāng)前用于DNA測(cè)序的酶要優(yōu)越得多。在循環(huán)測(cè)序中，對(duì)同一模板進(jìn)行多輪DNA合成，每輪用熱變性除去合成鏈；這樣在測(cè)序反應(yīng)中可用更小量的DNA模板。
申請(qǐng)人通過實(shí)驗(yàn)確定在相對(duì)來說不區(qū)別對(duì)待的酶(T7 DNA聚合酶)中氨基酸殘基526使酶具有這種性質(zhì)。申請(qǐng)人已確定，通過修飾526號(hào)殘基有可能使T7 DNA聚合酶區(qū)別對(duì)待的能力增加許多倍?；赥7DNA聚合酶和其它DNA聚合酶的氨基酸同源性，申請(qǐng)人已確定改變其它DNA聚合酶上同源位點(diǎn)的殘基可類似地影響其區(qū)別對(duì)待雙脫氧核苷酸的能力。這種同源位點(diǎn)的例子有大腸桿菌DNA聚合酶I的762號(hào)殘基和Taq DNA聚合酶的667號(hào)殘基。在所有這3個(gè)例子中，申請(qǐng)人表明重要的是該位點(diǎn)的殘基不是苯丙氨酸(F)，例如可以在T7 DNA聚合酶中為酪氨酸(Y)。令人驚奇的是，修飾這一個(gè)氨基酸殘基，甚至是僅僅加入一個(gè)羥基基團(tuán)，就能使區(qū)別對(duì)待的水平變化很大(250-8,000倍)。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于這一個(gè)位點(diǎn)的變化，用常規(guī)實(shí)驗(yàn)可方便地找出其它位點(diǎn)上降低聚合酶區(qū)別對(duì)待能力的變化。例如，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)在其它13個(gè)位點(diǎn)修飾T7 DNA聚合酶能增強(qiáng)其區(qū)別對(duì)待ddNTP的能力，但在這些位點(diǎn)上改變的效果要小得多，僅為5-20倍。用類似的方法可在其它DNA聚合酶中方便地鑒定出影響對(duì)ddNTP的區(qū)別對(duì)待的位點(diǎn)，使這些酶在DNA測(cè)序中用處更大。這些其它的位點(diǎn)包括大腸桿菌DNA聚合酶I和T7 DNA聚合酶之間高度同源區(qū)域的氨基酸殘基，因?yàn)檫@些區(qū)域有可能部分地構(gòu)成ddNTP的結(jié)合區(qū)；在大腸桿菌DNA聚合酶I中，這些區(qū)域包括與T7 DNA聚合酶類似區(qū)域中的氨基酸，如區(qū)域665-681和754-783中的保守或非保守的氨基酸，并也可能在709-734，794-866和913-927區(qū)域。提供所需功能的氨基酸變化可選作與非區(qū)別對(duì)待酶T7 DNA聚合酶中對(duì)應(yīng)的氨基酸相同，或是其它可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)選出的功能對(duì)應(yīng)的氨基酸。通過改變非保守氨基酸可以更深入地改變區(qū)別對(duì)待的能力。非保守氨基酸是在一種聚合酶與另一種聚合酶中互不相同的氨基酸(即存在于不足50％的聚合酶中)。術(shù)語“類似的”用其常用含義。因此Pol I聚合酶類似物是具有Braithwaite和Ito(引文見下)描述的氨基酸序列的酶，它優(yōu)選地與Pol I聚合酶家族其它成員，本文稱為Spo2 DNA聚合酶，有親緣關(guān)系。可用Felsenstein的PHYLIP程序進(jìn)行這種分析。同前。
因此本發(fā)明一方面涉及編碼修飾的DNA聚合酶的被修飾的基因。該基因經(jīng)修飾能夠生產(chǎn)與相應(yīng)天然存在的或未修飾的DNA聚合酶相比，結(jié)合雙脫氧核苷酸與結(jié)合脫氧核苷酸相比的能力有增加的修飾DNA聚合酶。
“能力增加”指該DNA聚合酶能更好地?fù)饺腚p脫氧核苷酸。即與相應(yīng)天然存在的DNA聚合酶相比，該酶對(duì)雙脫氧核苷酸比對(duì)脫氧核苷酸區(qū)別對(duì)待的程度更小。測(cè)量這種區(qū)別對(duì)待的特定方法由下文描述。術(shù)語“增加”指在摻入這種雙脫氧核苷酸的能力上有能夠測(cè)量的差別。在優(yōu)選實(shí)施方案中是比天然存在的酶至少增加10％，盡管優(yōu)選地對(duì)雙脫氧核苷酸區(qū)別對(duì)待的程度降低至少10到100倍，優(yōu)選的是100-500倍。一個(gè)這樣的酶的例子是大腸桿菌DNA合成酶I，它(如本文所述)摻入雙脫氧核苷酸比摻入脫氧核苷酸的區(qū)別對(duì)待約大140-1,100倍。用本發(fā)明的方法可得到一種酶(僅改變一或兩個(gè)氨基酸)，它相對(duì)dNTP更優(yōu)選ddNTP，即該聚合酶摻入雙脫氧核苷酸的能力平均提高了1,000倍。
術(shù)語“相應(yīng)的天然存在的DNA聚合酶”在本領(lǐng)域?yàn)槿耸熘?，指的是在大自然中存在的聚合酶，并且?yōu)選地不受實(shí)驗(yàn)室中體外或體內(nèi)操作的改變。類似地，相應(yīng)的核酸指的是編碼天然存在的DNA聚合酶的核酸。這只是簡(jiǎn)單地用做比較編碼這種聚合酶的修飾的核酸的基線。因此，水生棲熱菌(又稱“Taq”)DNA聚合酶的基線是天然編碼細(xì)菌水生棲熱菌中Taq DNA聚合酶的核酸。申請(qǐng)人提供這種聚合酶中至少一個(gè)位點(diǎn)，改變這個(gè)位點(diǎn)可以改變聚合酶摻入雙脫氧核苷酸的能力。這些位點(diǎn)只是示例性的，并不限制本發(fā)明，因?yàn)楸绢I(lǐng)域?qū)I(yè)人員知道DNA聚合酶的能力在該性質(zhì)方面可以改變得更加有用，現(xiàn)在又知道在這些特異位點(diǎn)或在其它相當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)來改變這些酶的方法。
在本文描述的本發(fā)明實(shí)施方案中，通過替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸來修飾DNA聚合酶。但也可以通過插入一個(gè)或多個(gè)附加的氨基酸或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸來修飾。
本發(fā)明的DNA聚合酶也可經(jīng)修飾去掉或改變一個(gè)外切酶結(jié)構(gòu)域，例如3′-5′外切酶活性，描述見Tabor和Richardson，引文見上，或Taq中的5′-3′外切酶活性，描述見Barnes(WO 92/06188)。改變本發(fā)明中DNA聚合酶區(qū)別對(duì)待ddNTP能力的突變優(yōu)選地基本不影響外切酶活性；這是指突變位于酶的聚合酶結(jié)構(gòu)域，靠近聚合活性位點(diǎn)，不只是通過降低聚合酶以其外切酶活性去除摻入的類似物的能力而降低區(qū)別對(duì)待。本發(fā)明特別適用的DNA聚合酶是Pol I型聚合酶，描述見Braithwaite和Ito，核酸研究，21，787，1993，在此引入作為參考，并稱為A家族，和聚合酶α或聚合酶II型DNA聚合酶，描述見Braithwaite和Ito，稱為B家族。Braithwaite和Ito描述的其它聚合酶家族也可用于本發(fā)明。特別是申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)在dNTP底物結(jié)合位點(diǎn)附近一個(gè)位置存在一個(gè)極性含羥基的氨基酸對(duì)于聚合酶有效地?fù)饺腚p脫氧核苷酸很重要。不受理論的束縛，申請(qǐng)人認(rèn)為該發(fā)現(xiàn)與所期望的結(jié)果，即對(duì)于在核糖部分3′位置無羥基基團(tuán)的核苷酸(即ddNTP)區(qū)別對(duì)待必須在該關(guān)鍵位置的氨基酸殘基同時(shí)缺少羥基，正好相反。換句話說，兩個(gè)羥基均不存在所產(chǎn)生的間隙或空間導(dǎo)致對(duì)類似物的區(qū)別對(duì)待。知道這一結(jié)果就擁有一種在即使親緣關(guān)系很遠(yuǎn)的DNA聚合酶中找到關(guān)鍵殘基的方法；在dNTP結(jié)合區(qū)域非極性殘基處添加一有極性基團(tuán)的殘基，是降低該聚合酶區(qū)別對(duì)待ddNTP能力的有用的候選氨基酸變化。例如大鼠DNA聚合酶b(一種與A或B家族聚合酶同源性很小的DNA聚合酶)的272位苯丙氨酸，用X射線衍射研究顯示與引物-模板的三級(jí)復(fù)合物中ddCTP殘基3′位置相接觸(Pelletier等，科學(xué)，264，189，1994)。知道了本發(fā)明描述的結(jié)果則會(huì)順理成章地將該殘基修飾成酪氨酸來篩選能更有效地?fù)饺腚p脫氧核苷酸的大鼠DNA聚合酶b突變體。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員因而可能用這里提供的信息來改變?nèi)魏蜠NA聚合酶的區(qū)別對(duì)待表型。
本發(fā)明某些聚合酶更有效地?fù)饺腚p脫氧核苷酸的能力可能是特異性的(即對(duì)雙脫氧核苷酸類似物的效果比對(duì)其它類似物的效果大得多)。但某些聚合酶也可用于幫助摻入其它堿基修飾類似物(例如，脫氧肌苷三磷酸(dITP)和2′-脫氧-7-deaza鳥苷5′-三磷酸(dC7GTP)來去除電泳中的帶抑制，以及熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸或雙脫氧核苷酸用于自動(dòng)過程)。另外這種聚合酶能更有效地?fù)饺牒颂呛怂?，因而可以不需要啟?dòng)子就合成RNA。具體來說，單亞基DNA依賴型RNA聚合酶如T7 RNA聚合酶和A家族的DNA聚合酶(Pol I型DNA聚合酶)之間的保守超二級(jí)結(jié)構(gòu)(motif)提示該區(qū)域的突變(大腸桿菌DNA聚合酶I的758至767號(hào)殘基)可能改變其對(duì)rNTP的特異性。這樣可以設(shè)計(jì)制造出能有效地從引物起始合成的RNA聚合酶，使RNA合成不再需要啟動(dòng)子。類似地，這里提供的數(shù)據(jù)提示修飾T7 RNA聚合酶的631至640號(hào)殘基將改變其對(duì)dNTP的特異性。這樣可以設(shè)計(jì)制造出一種新的DNA聚合酶，能從啟動(dòng)子序列起始DNA的從頭合成，而不用引物。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾的DNA聚合酶有足夠的DNA聚合酶活性(例如至少是用于標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序反應(yīng)的聚合酶活性，優(yōu)選的至少是本領(lǐng)域定義的100單位每毫克酶；優(yōu)選地聚合酶中突變對(duì)先前水平的改變不超過5-10倍)用于DNA測(cè)序(與DNA聚合酶活性必需的任何宿主因子合用)；并且外切酶活性足夠低(例如低于500單位/毫克，見Tabor和Richardson，引文見上)使聚合酶能用于DNA測(cè)序；該DNA聚合酶在T7型DNA聚合酶(例如選自T7，T3，_I，_II H，W31，gh-1，Y，A1122，和SP6)雙脫氧核苷酸結(jié)合位點(diǎn)具有一個(gè)或多個(gè)這樣的氨基酸。優(yōu)選地修飾的DNA聚合酶是對(duì)熱穩(wěn)定性酶如水生棲熱菌，嗜熱棲熱菌，黃棲熱菌，甾類嗜熱芽孢桿菌(Bacillus sterothermophilus)和Vent細(xì)菌編碼的DNA聚合酶的修飾；并通過例如只改變一個(gè)氨基酸，該聚合酶與相應(yīng)的天然存在的DNA聚合酶相比，摻入雙脫氧核苷酸的能力提高至少10倍，50倍或更優(yōu)選地至少100倍。
另一方面，本發(fā)明涉及一種方法，用于生產(chǎn)一種修飾的DNA聚合酶，它與相應(yīng)的天然存在的DNA聚合酶相比摻入雙脫氧核苷酸的能力更強(qiáng)。該方法包括提供一種編碼DNA聚合酶的核酸分子，誘變或用其它方式改變核酸分子的核苷酸序列，在核苷酸堿基序列的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)摻入一個(gè)或多個(gè)堿基變化，從而顯著(即至少10倍，50倍，或更優(yōu)選地100-500倍)改變?cè)摵怂峋幋a的聚合酶摻入雙脫氧核苷酸的能力。
第三方面，本發(fā)明涉及一種確定DNA分子核苷酸堿基序列的方法。該方法包括提供一種DNA分子，與能與之雜交的引物分子退火；將退火的分子在容器中溫育，容器中含有至少一種脫氧核苷三磷酸，一種由天然存在的DNA聚合酶修飾得來并且與天然存在的DNA聚合酶相比摻入雙脫氧核苷酸的能力增強(qiáng)的DNA聚合酶。(該聚合酶有足夠的DNA聚合酶活性且外切酶活性足夠低，可用于DNA測(cè)序。)還提供至少一種在特定核苷酸殘基處終止DNA合成的DNA合成終止劑。該方法進(jìn)一步包括根據(jù)大小將溫育反應(yīng)的DNA產(chǎn)物分開并且DNA分子的至少一部分核苷酸殘基序列可被確定。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA聚合酶是熱穩(wěn)定性DNA聚合酶并且測(cè)序在高于50℃，60℃或70℃的溫度下進(jìn)行，該DNA聚合酶來源于(即在氨基酸殘基上至少50％相同)水生棲熱菌，嗜熱棲熱菌，黃棲熱菌，甾類嗜熱芽孢桿菌，海濱熱球菌(Thermococcus litoralis)(Vent)，強(qiáng)烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)或硫氣孔硫化葉菌(SulfolobusSolfataricus)編碼的DNA聚合酶。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA聚合酶具有每毫克聚合酶小于1000，250，100，50，10甚至2單位的外切酶活性，并且能夠利用僅含4、6或10個(gè)殘基的引物；而且在溫育步驟開始時(shí)所有4種脫氧核苷三磷酸的濃度足以使DNA合成進(jìn)行到被試劑(例如ddNTP)終止為止。
對(duì)于循環(huán)測(cè)序，本發(fā)明的聚合酶與其它酶相比可使用測(cè)序利用量低得多的雙脫氧核苷酸。即該方法涉及提供在循環(huán)測(cè)序反應(yīng)中對(duì)所有4種雙脫氧核苷酸都過量的脫氧核苷酸，然后進(jìn)行循環(huán)測(cè)序反應(yīng)。對(duì)于其它酶，有必要在該反應(yīng)中添加至少一種過量的ddNTP。例如Sears等，生物技術(shù)13，626，1992描述對(duì)Vent聚合酶用對(duì)dNTP約過量10倍的ddNTP，Carothers等，生物技術(shù)7，494，1989描述對(duì)Taq聚合酶用對(duì)dNTP過量至少2倍的ddNTP。本發(fā)明不需要這種過量。優(yōu)選地，對(duì)相應(yīng)的ddNTP提供過量2，5甚至10倍的dNTP。在一特定實(shí)施例中對(duì)本發(fā)明的修飾Taq用低于10M的ddNTP。
在一相關(guān)方面，本發(fā)明涉及一種DNA測(cè)序用的試劑盒或溶液，它包括上述的修飾DNA聚合酶和測(cè)序必需的選自dITP，deaza GTP，鏈終止劑如ddNTP的試劑以及含錳的溶液或粉末。
另一方面，本發(fā)明涉及一種方法，提供一種與相應(yīng)的天然存在的DNA聚合酶相比摻入雙脫氧核苷酸的能力加強(qiáng)的修飾DNA聚合酶，其步驟包括提供編碼修飾DNA聚合酶的核酸序列，在宿主細(xì)胞中表達(dá)核酸和從宿主細(xì)胞中純化DNA聚合酶。
在另一相關(guān)方面，本發(fā)明涉及一種基本上如上述的用一種或多種(優(yōu)選的是2，3或4)脫氧核苷三磷酸，一種上述的DNA聚合酶和第一種鏈終止劑測(cè)序一段DNA的方法。DNA聚合酶使引物延伸形成一系列區(qū)別在于延伸引物的長(zhǎng)度的第一DNA產(chǎn)物，每種第一DNA產(chǎn)物在其延伸端有鏈終止試劑，而且每種第一DNA產(chǎn)物的分子數(shù)對(duì)于長(zhǎng)度差別小于20個(gè)堿基的幾乎所有DNA產(chǎn)物基本相同。該方法還在雜交的混合物中以與第一種鏈終止劑濃度不同的濃度加入第二鏈終止劑，其中DNA聚合酶生產(chǎn)出第二系列的差別在于延伸引物的長(zhǎng)度的第二DNA產(chǎn)物，每種第二DNA產(chǎn)物在其延伸端有第二鏈終止劑。每一種第二DNA產(chǎn)物的分子數(shù)對(duì)于長(zhǎng)度差別在1到20殘基之間的基本上所有的第二DNA產(chǎn)物幾乎相同，而且與跟該第二DNA產(chǎn)物長(zhǎng)度差別不大于20個(gè)堿基的所有第一DNA產(chǎn)物分子數(shù)顯著不同。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，用3或4種這樣的鏈終止劑得到不同的產(chǎn)物，描述見Tabor和Richardson，引文見上；并且測(cè)序反應(yīng)中有鎂離子，或者有錳離子或鐵離子(例如濃度在0.05至100mM之間，優(yōu)選的在1到10mM之間)；在不多于4條凝膠泳道上根據(jù)分子量將DNA產(chǎn)物分開。
在另一相關(guān)的方面，本發(fā)明涉及一種核酸測(cè)序方法，步驟是將寡聚核苷酸引物，待測(cè)序的核酸，二到四種脫氧核苷三磷酸，一種上述聚合酶，和至少兩種不同量的鏈終止劑，在利于寡聚核苷酸引物延伸形成與待測(cè)序的核酸互補(bǔ)的核酸片段的條件下混合起來。該方法進(jìn)一步包括根據(jù)大小將核酸片段分開以及確定核酸序列。這些試劑根據(jù)引物延伸產(chǎn)物中標(biāo)記物強(qiáng)度而相互區(qū)分。
盡管常用凝膠電泳來分開DNA測(cè)序反應(yīng)的DNA產(chǎn)物，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)明了也可用其它方法。因此有可能用以下方法如飛行時(shí)間質(zhì)譜，電鏡方法和單分子檢測(cè)方法檢測(cè)每種不同的片段。
本發(fā)明還涉及一種自動(dòng)DNA測(cè)序儀，它具有含有試劑的反應(yīng)器并且從單一的引物和一段DNA形成至少兩套DNA產(chǎn)物。每套中的每個(gè)DNA產(chǎn)物分子量不同而且在一端含有一個(gè)鏈終止劑。試劑包括上述的聚合酶。該儀器包括一種分離裝置，沿分離器(Separator)的一條軸將DNA產(chǎn)物分離形成一套帶。它還包括一種讀帶的裝置，在各帶沿軸分開后確定其位置和強(qiáng)度，以及一種計(jì)算機(jī)裝置，僅根據(jù)沿軸向帶的位置與強(qiáng)度而不根據(jù)分離裝置中可能存在的任何標(biāo)記物的發(fā)射光波長(zhǎng)來確定DNA帶的DNA序列。
在其它方面，本發(fā)明涉及(a)一種將克隆的DNA片段體外誘變的方法，包括提供克隆片段和一種上述DNA聚合酶，在用片段合成一段DNA的條件下將聚合酶與克隆的片段相接觸。這種條件下，通過摻入一系列能與該片段堿基配對(duì)的單個(gè)相鄰的堿基和一個(gè)不能與該片段堿基配對(duì)的核苷酸堿基形成一段DNA；(b)一種將模板DNA片段體外誘變的方法，包括提供引物和模板，引物具有能與模板上相鄰的堿基殘基配對(duì)的毗連堿基和至少一個(gè)不能與模板堿基配對(duì)的堿基。該方法涉及用一種上述DNA聚合酶將引物延伸；(c)一種從5′端有單鏈區(qū)的線性DNA分子制造平末端雙鏈DNA的方法。該分子的3′端為雙鏈，沒有3′突出末端。該方法包括將該DNA分子與一種上述DNA聚合酶溫育，該DNA聚合酶作用于單鏈區(qū)域產(chǎn)生平末端雙鏈DNA分子；(d)一種標(biāo)記DNA片段3′端的方法，包括將該DNA片段與一種上述DNA聚合酶，一種標(biāo)記的脫氧核苷酸在DNA片段3′端被聚合酶延伸的條件下溫育，從而將標(biāo)記的脫氧核苷酸加到DNA片段上實(shí)現(xiàn)標(biāo)記；(e)一種擴(kuò)增DNA序列的方法，包括將第一和第二引物退火到雙鏈DNA序列上相對(duì)的鏈上，將退火的混合物與一種上述DNA聚合酶溫育。第一和第二引物退火到DNA序列的相對(duì)兩條鏈上，退火后其3′端互對(duì)，待擴(kuò)增的DNA序列位于兩段退火的引物之間。
在另一些方面，本發(fā)明還涉及特定的DNA聚合酶，如第667位殘基為酪氨酸的水生棲熱菌DNA聚合酶，第762位殘基為酪氨酸的大腸桿菌DNA聚合酶I，以及在與大腸桿菌DNA聚合酶762位殘基同源的位置有酪氨酸殘基的任一種Pol I型DNA聚合酶，例如在氨基酸序列KN1N2N3N4N5N6N7Y G的N4位置，其中每個(gè)N可為任一種氨基酸。另外，本發(fā)明描述DNA聚合酶α家族的具有K N1N2N3N4N5N6N7G/Q序列的特定聚合酶，其中每個(gè)N可為任一種氨基酸，并且N1到N7殘基中有一個(gè)經(jīng)突變得到一個(gè)聚合酶，它對(duì)ddNTP的區(qū)別對(duì)待降低(優(yōu)選地比非突變序列降低至少20倍)。本發(fā)明還描述編碼任一種這樣的DNA聚合酶的核酸。
在相關(guān)的方面，本發(fā)明涉及非逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA聚合酶，它在僅有鎂作為二價(jià)陽(yáng)離子存在時(shí)平均持續(xù)合成能力(processivity)小于100并且摻入ddNMP比摻入dNMP的區(qū)別對(duì)待程度小于100倍，或是在二價(jià)陽(yáng)離子僅有鎂存在時(shí)平均持續(xù)合成能力小于50并且摻入ddNMP比摻入dNMP的區(qū)別對(duì)待程度小于50倍或5倍。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)當(dāng)明了持續(xù)合成能力可用任何標(biāo)準(zhǔn)操作方法來測(cè)量，這些方法將會(huì)顯示T7 DNA聚合酶的平均持續(xù)合成能力至少為500，Klenow片段的約為4-40，逆轉(zhuǎn)錄酶的約為150-200。可根據(jù)Tabor等，生物化學(xué)雜志26216212，1987的描述進(jìn)行這種測(cè)量，該描述在此引入作為參考。在這種條件下預(yù)計(jì)Taq DNA聚合酶的平均持續(xù)合成能力小于100。
在特別優(yōu)選的方面，本發(fā)明描述嗜熱DNA聚合酶，它當(dāng)鎂存在時(shí)對(duì)ddNMP的區(qū)別對(duì)待程度與dNMP相比小100倍，并且優(yōu)選地平均持續(xù)合成能力小于100，每秒甚至每10秒鐘從一輪引物-模板到另一輪引物-模板循環(huán)多于一次?？捎脴?biāo)準(zhǔn)操作方法測(cè)量這種循環(huán)。
本發(fā)明還描述一種用上述DNA聚合酶循環(huán)測(cè)序的方法，還描述細(xì)胞內(nèi)(與病毒或線粒體的相對(duì)照)DNA聚合酶，它在某一位置沒有天然存在的氨基酸而是有一個(gè)酪氨酸，從而使該聚合酶對(duì)ddNMP的區(qū)別對(duì)待程度比dNMP小50倍。
另一些方面，在所述位點(diǎn)作氨基酸替換會(huì)造成相應(yīng)天然聚合酶其它性質(zhì)的改變。另外本發(fā)明的聚合酶在此處描述的各種方法中可以與其它聚合酶合起來用，從而在混合物中利用每種聚合酶的優(yōu)秀性質(zhì)。
從下述優(yōu)選實(shí)施方案描述及權(quán)利要求中可明顯看出本發(fā)明的其它特征與優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)選實(shí)施方案描述首先簡(jiǎn)述附圖。附1是噬菌體T7的基因5編碼的DNA聚合酶氨基酸序列的圖示，指出了手掌和手指結(jié)構(gòu)域以及各種雙脫氧抗性(DR)突變體的位置，標(biāo)記為A-E的區(qū)域的位置以及涉及ddNTP區(qū)別對(duì)待的一個(gè)位點(diǎn)的位置；圖2是DNA聚合酶I結(jié)構(gòu)的三維圖示，顯示了A-E區(qū)的位置；圖3是pol I型DNA聚合酶核酸選擇性(riboselectivity)區(qū)域的圖示，各氨基酸由通用的單字母代碼標(biāo)出。起始氨基酸標(biāo)號(hào)在圖左標(biāo)出，與脫氧核苷酸相比對(duì)雙脫氧核苷酸區(qū)別對(duì)待的程度數(shù)值在圖右標(biāo)出；
圖4，5，6是分別顯示大腸桿菌DNA聚合酶I，T7 DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶的核酸選擇性區(qū)域修飾的圖示。脫氧抗性突變體下面是相關(guān)文獻(xiàn)簡(jiǎn)述。各文獻(xiàn)均非后面的權(quán)利要求的現(xiàn)有技術(shù)，而僅供幫助對(duì)本發(fā)明的理解。
Reha-Krantz等在1989年9月24-29日北卡羅來納州Beaufort召開的題為“DNA合成的確限度結(jié)構(gòu)與機(jī)理觀點(diǎn)”的大會(huì)上發(fā)表的供海報(bào)用的提要中《噬菌體T4 DNA聚合酶的誘變分析》一文描述了C末端突變體，能增加對(duì)ddNTP的使用。但Reha-Krantz等，病毒學(xué)雜志67，60-66(1993)指出雖然突變體L412M與野生型T4 DNA聚合酶相比對(duì)ddGTP的Ki低50倍，但在突變體和野生型T4 DNA聚合酶之間未發(fā)現(xiàn)其摻入ddGTP的效率有何區(qū)別。在63頁(yè)，文中說“盡管L412MDNA聚合酶對(duì)ddGTP敏感，未發(fā)現(xiàn)野生型和L412M DNA聚合酶摻入ddNTP時(shí)有何區(qū)別。”文中又說“看起來沒有任何單一的區(qū)域是PPi或核苷酸的唯一結(jié)合位點(diǎn)?！绷硗釸eha-Krantz和Nonay，生物化學(xué)雜志269，5635-5643(1994)提供了關(guān)于突變體L412M和其它突變體T4 DNA聚合酶的研究。
Gibbs等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊85，6672-6676(1988)和Larder等，EMBO雜志6，169-1975(1987)描述了皰疹DNA聚合酶中對(duì)一些核苷酸類似物焦磷酸，膦酰乙酸，膦酰甲酸，無環(huán)鳥苷，vidarabine，9-(1，3-二羥-2-丙氧(甲基)鳥嘌呤(ganciclovir)和溴乙烯脫氧尿苷篩選抗性得到的一系列突變。該文顯示許多對(duì)一種藥物有抗性的突變體對(duì)其它藥物也有抗性，雖然這些藥物是底物不同區(qū)域的類似物。
Derse等，生物化學(xué)雜志257，10251-10260(1982)描述通過篩選在膦酰甲酸(一種焦磷酸抑制物)存在下的生長(zhǎng)分離到單純皰疹DNA聚合酶中5類突變體。對(duì)每類突變體，他們比較了其對(duì)ddGTP的抗性(10256頁(yè)，表III)。所有突變體對(duì)ddGTP的Ki都增大了20到100倍。
Prasad等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊88，11363-11367(1991)用直接篩選策略顯示HIV逆轉(zhuǎn)錄酶中單個(gè)突變(Glu 89突變成甘氨酸)使聚合酶對(duì)ddGTP抗性更強(qiáng)(需要多10倍的ddGTP才能得到同樣程度的抑制)。該突變對(duì)許多類似物，包括膦酰甲酸(一種焦磷酸類似物)有廣泛抗性。雖然該突變體對(duì)ddTTP，ddCTP和ddGTP抗性相似，但對(duì)ddATP抗性小得多。
Song等，病毒學(xué)雜志66，7568-7571(1992)將人免疫缺陷病毒I型逆轉(zhuǎn)錄酶的glu-89誘變成9種不同的氨基酸殘基，并測(cè)量每種突變體酶對(duì)ddGTP和膦酰甲酸，一種焦磷酸類似物的抗性。突變合成兩類；用丙氨酸，纈氨酸或蘇氨酸替換Glu-89得到對(duì)ddGTP和膦酰甲酸抗性與野生型酶相比高得多的酶，而突變成絲氨酸，谷酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸和賴氨酸得到的酶對(duì)ddGTP抗性小或沒有抗性。沒有突變使酶與野生型酶相比對(duì)ddGTP的抗性降低(表I，7569頁(yè))。作者根據(jù)他們的結(jié)果和逆轉(zhuǎn)錄酶的晶體結(jié)構(gòu)推測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶的第89和90個(gè)殘基構(gòu)成dNTP結(jié)合口袋的一部分。
具有在導(dǎo)致ddNTP選擇性的突變附近的突變的大腸桿菌DNA聚合酶I突變體蛋白性質(zhì)的有關(guān)文獻(xiàn)如下Carroll等，生化30，804-813(1991)研究?jī)煞N突變體Tyr 766 Ser和Tyr 766 Phe對(duì)正常脫氧核苷酸的錯(cuò)誤摻入。Polesky等，生物化學(xué)雜志265，14579-14591(1990)對(duì)具有兩種不同特性的突變確定了性質(zhì)(1)酪氨酸766，精氨酸841，和天冬酰胺845；作者提示這些殘基接觸進(jìn)入的dNTP。(2)谷酰胺849，精氨酸668和天冬氨酸882，作者提示它們參與催化。Polesky等，生物化學(xué)雜志2678417(1992)進(jìn)一步對(duì)精氨酸668，谷酰胺849和天冬氨酸882的突變，以及天冬氨酸705和谷氨酸710的突變確定了性質(zhì)。本研究中作者觀察了α-硫取代的dNTP即磷酸部分的類似物的摻入。Pandey等，生物化學(xué)雜志269，13259-13265(1994)觀察了大腸桿菌聚合酶I的兩個(gè)突變體，它們分別把賴氨酸758變成丙氨酸和精氨酸。作者們指出Basu等，生化26，1704-1709(1987)提示用一個(gè)賴氨酸758參與dNTP結(jié)合。這是用化學(xué)方法給出的；用吡哆醛5′-磷酸一種核酸類似物，共價(jià)修飾DNA聚合酶I，據(jù)說賴氨酸758是被修飾的殘基。
Beese等，生化32114095-14101(1993)描述了DNA聚合酶I與dNTP或與焦磷酸的復(fù)合物的共晶結(jié)構(gòu)。作者們宣稱dNTP結(jié)合處靠近螺旋O。作者們作了下列陳述(a)“在Mg-dCTP復(fù)合物中，胞苷與His 881相互作用，而糖與Phe 764相互作用(Sic.762)(圖3和5)?！?b)“但是，我們的結(jié)論是至少二級(jí)復(fù)合物中dNTP的dNMP部分不大可能與其跟引物-模板DNA形成的催化相關(guān)復(fù)合物中位置相同?！?c)“由于dNTP的殘基的整個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是由其模板鏈Watson-Crick氫鏈和其在引物鏈3′殘基上的堆積形成的，故而二級(jí)復(fù)合物中殘基的結(jié)合位點(diǎn)不大可能完全隨機(jī)，與我們的觀察相一致，根據(jù)條件它可以結(jié)合上幾個(gè)位置?！?d)“在二級(jí)復(fù)合體晶體中觀察到的dNTP結(jié)合位點(diǎn)與在溶液中的研究觀察到的相同。不過從該二級(jí)復(fù)合物外推出當(dāng)引物和模板DNA存在時(shí)的與dNTP形成的復(fù)合物模型要謹(jǐn)慎從事。我們假定dNTP的糖和殘基部分需要引物-模板DNA才能以正確的構(gòu)象結(jié)合?！盝oyce和Steitz，生化年度綜述(Ann.Rev.Bioc.)63，777，1994(不作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)(prior art))討論了多種DNA和RNA聚合酶的相互關(guān)系。它顯示DNA聚合酶I的“手掌”亞結(jié)構(gòu)域(而非“手指”)有3個(gè)功能即催化中心，引物3′末端的結(jié)合位點(diǎn)和dNTP結(jié)合位點(diǎn)。在HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶中顯示影響DNA聚合酶抑制物結(jié)合的突變?cè)?7-70號(hào)殘基附近。文中還宣稱“雖然從核苷糖基的位置不能得出有用的結(jié)論，但有可能晶體的二級(jí)復(fù)合物提供信息能確定Klenow片段與dNTP磷酸基團(tuán)的接觸。在前面一段里，該文宣稱“雖然能形成聚合酶-dNTP二級(jí)復(fù)合物，但這樣的復(fù)合物沒有催化能力?！痹撐倪M(jìn)一步指出數(shù)據(jù)“表明脫氧核糖靠近Phe 782”以及“位于按模型構(gòu)造的模板鏈的附近手指結(jié)構(gòu)域中的Tyr 766[位于Klenow片段螺旋O]的突變影響對(duì)脫氧和雙脫氧核苷酸底物的區(qū)別…”不過該文又宣稱“在Klenow片段中，已發(fā)現(xiàn)影響dNTP在三級(jí)復(fù)合物中結(jié)合的突變(反映在Km(dNTP)位于靠近手指亞結(jié)構(gòu)域或其中的聚合酶裂隙的一例。如此鑒定出的位置包括了螺旋O的N末端(Arg 841和Asn 845)，O螺旋的暴露面(Tyr 766，Phe 762和Arg 754)及靠近催化中心的鄰近殘基(Asp 705和Glu 710)…動(dòng)力學(xué)方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能研究三級(jí)結(jié)構(gòu)，但如上述，在沒有其它結(jié)構(gòu)證據(jù)時(shí)不可能將直接效應(yīng)與模板相互作用介導(dǎo)的效應(yīng)分開來。而且上面列出的側(cè)鏈包涵的區(qū)域比dNTP分子大得多，因而不能全與之直接相互作用。因于據(jù)認(rèn)為這些研究涉及的Klenow片段區(qū)域與模板鏈廣泛接觸，合理的解釋是上述殘基的一部分與dNTP直接接觸，而其它與模板DNA結(jié)合?！盤elletier等，科學(xué)264，1891和Sawaya等，科學(xué)264，1930，1994(不作為后面的權(quán)利要求的現(xiàn)有技術(shù))與之相反，提出Polβ的M-N螺旋(與Klenow的J-K螺旋類似)中271-273號(hào)殘基“執(zhí)行普通的功能，核苷酸的區(qū)別對(duì)待”。
Sousa等，364自然593，1993(不作為后面的權(quán)利要求的現(xiàn)有技術(shù))描述了T7 DNA聚合酶的三維結(jié)構(gòu)及其與大腸桿菌DNA聚合酶I的同源性。它們宣稱他們的觀察結(jié)果提示“KF[Klenow片段]的C末端元件(b鏈14[916至928號(hào)殘基]和C末端)在聚合過程中接觸dNTP的脫氧核糖部分以區(qū)分rNTP和dNTP底物。”雙脫氧核苷如雙脫氧胸苷是T7噬菌體生長(zhǎng)的強(qiáng)力抑制物。實(shí)驗(yàn)顯示DNA合成的抑制是雙脫氧核苷酸摻入T7 DNA的結(jié)果。雙脫氧核苷對(duì)未受感染的大腸桿菌無抑制作用。我們尚不能解釋為什么對(duì)大腸桿菌DNA合成不抑制，但有可能是細(xì)胞攝取，大腸桿菌DNA聚合酶III對(duì)其摻入的高水平排斥，三磷酸的磷酸化不是或有效的消除。無論哪種情況我們都發(fā)現(xiàn)能在含雙脫氧核苷的瓊脂平板上得到正常噬菌斑的T7突變體噬菌體的發(fā)生頻率約為10-3。

圖1給出許多這樣的突變的位置。它們位于基因5的蛋白上。突變體基因5的蛋白比天然基因5蛋白的對(duì)ddNTP區(qū)別對(duì)待的程度更大(幾倍)。這類突變體的某些成員可能描畫出聚合酶中對(duì)識(shí)別dNTP的核糖部分重要的區(qū)域。
必須注意用雙脫氧核苷以該篩選方法得到的突變是基于基因5蛋白識(shí)別部分區(qū)域的改變。但不可能這些突變對(duì)其它核苷酸類似物也有顯著效應(yīng)。另外也可能用相同的操作方法，以噬菌體在其它類似物存在時(shí)的生長(zhǎng)為基礎(chǔ)，篩選對(duì)其它核苷酸類似物強(qiáng)烈地區(qū)別對(duì)待的其它T7突變體。
參照表I，對(duì)各種DR突變體指出的表中提到的氨基酸替換的性質(zhì)進(jìn)一步在表的右手端標(biāo)出。圖1給出T7 DNA聚合酶整個(gè)手掌和手指區(qū)域的這些突變體的位置。大拇指區(qū)域是與產(chǎn)物雙螺旋DNA水溝相互作用的柔性區(qū)域；手掌區(qū)域是催化中心，引物3′端的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)dNTP結(jié)合有貢獻(xiàn)；四指區(qū)域與單鏈模板靠近合成的位點(diǎn)處相互作用，對(duì)dNTP結(jié)合有貢獻(xiàn)。這些突變體在聚合酶上分布分散，各自對(duì)雙脫氧核苷酸摻入的影響相對(duì)較小，僅使摻入雙脫氧核苷酸的能力降低5-20倍。另外有些突變體位于跟DNA聚合酶I相對(duì)來說之同源性的區(qū)域。因此它們不能提示其它Pol I酶參于ddNTP區(qū)別對(duì)待的位點(diǎn)的位置。
表1T7 DNA聚合酶雙脫氧抗性突變體一覽突變體分離物數(shù)目修飾DR1 1Ala 425 Thr斥水極性DR2 1Phe 434 Ser斥水極性Gly 442 Ser斥水極性DR3 1Val 443 Ile斥水 斥水DR4 2Arg 444 His強(qiáng)堿性 弱堿性DR5 1Arg 444 Cys強(qiáng)堿性 中性，極性DR6 8Ser 477 Phe極性 斥水DR7 4Asp 504 Asn堿性 中性DR8 2Ala 513 Thr斥水 極性DR9 2Thr 517 Ile極性 斥水DR10 1Ala 532 Ser斥水 極性DR11 1Arg 566 Cys強(qiáng)堿性 中性，極性DR12 1Ala 619 Thr斥水 極性DR13 3Ala 700 Thr斥水 極性總結(jié)7斥水 極性3強(qiáng)堿 性中性，極性或弱堿性2極性 斥水1斥水 斥水體外誘變T7的克隆基因5的體外誘變用于構(gòu)建基因5蛋白，其中大腸桿菌DNA聚合酶I中不同區(qū)域被T7基因5蛋白中類似區(qū)域或同源區(qū)域所取代。如討論，我們特別感興趣的是確定這些酶摻入核苷酸類似物的能力以及它們對(duì)這些類似物區(qū)別對(duì)待的程度。參照?qǐng)D2，T7 DNA聚合酶和大腸桿菌DNA聚合酶I雜交的區(qū)域標(biāo)成區(qū)域A-E。
參照?qǐng)D3，申請(qǐng)人已確定C區(qū)域是提供了核糖選擇性的區(qū)域，其效應(yīng)比聚合酶中其它區(qū)域的效應(yīng)大得多。某些其它區(qū)域在圖3中特意標(biāo)出。
參照?qǐng)D4-6(和表2)，已確定將該區(qū)域的氨基酸替換可實(shí)現(xiàn)大腸桿菌DNA pol I型聚合酶核糖選擇性向T7 DNA聚合酶型核糖選擇性或相反的轉(zhuǎn)變。因此通過將pol I型聚合酶該區(qū)域定向誘變可顯著改變聚合酶的核糖選擇性。效應(yīng)的水平至少是50-100倍，通常大于500倍。DNA聚合酶用于本發(fā)明的DNA聚合酶包括屬于“pol I型DNA聚合酶”的一類同源聚合酶如T7型DNA聚合酶，大腸桿菌DNA聚合酶I的大片段和Taq聚合酶。
用于本發(fā)明的DNA聚合酶包括一類同源聚合酶如T7型DNA聚合酶(如T7，T3，_I，_II，H W31，gh-1，Y，A1122或SP6)。同源聚合酶指的是如Delarue等，蛋白工程3，461-467(1990)描述的具有Pol I家族DNA聚合酶排列的酶。它還具有(見后)表2大腸桿菌DNA聚合酶I，T7 DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶O螺旋中結(jié)構(gòu)域互換對(duì)ddNTP區(qū)別對(duì)待的效果。上端給出三種聚合酶的序列，指出了第一個(gè)殘基的位置。在3種聚合酶的一致序列下給出在T7DNA聚合酶(T7)，大腸桿菌DNA聚合酶(Pol)和Taq DNA聚合酶(Taq)中鑒定到的突變體，突變的殘基有下劃線。如實(shí)施例2描述對(duì)每個(gè)突變體用SDS活性凝膠分析法檢查其摻入ddNMP比摻入dNMP的相對(duì)速率，并標(biāo)在右邊。突變體T7C-T8，Pol IC-K6和TaqC-Q5同野生型蛋白一道純化，用于進(jìn)一步分析。ddNTP酶序列區(qū)別對(duì)待Pol I 754 R R S A K A I N F G L I Y G 高Taq658 R R A A K T I N F G V L Y G 高T7 517 R D N A K T F I Y G F L Y G 低一致 R A K G Y GT7WTR D N A K T F I Y G F L Y G 低T7C-T2 R R S A K A I N F G L I Y G 高T7C-T3 R R S A K T F I Y G F L Y G 低T7C-T4 R D N A K A I N F G F L Y G 高T7C-T5 R D N A K A I I Y G F L Y G 低T7C-T6 R D N A K T F N F G F L Y G 高T7C-T7 R D N A K T F N Y G F L Y G 低T7C-T8 R D N A K T F I F G F L Y G 高Pol I WTR R S A K A I N F G L I Y G 高Pol IC-K1 R D N A K T F I Y G F L Y G 低Pol IC-K2 R R S A K T F I Y G L I Y G 低Pol IC-K3 R R S A K T F N F G L I Y G 高Pol IC-K4 R R S A K A I I Y G L I Y G 低Pol IC-K5 R R S A K A I I F G L I Y G 高Pol IC-K6 R R S A K A I N Y G L I Y G低Taq WT R R A A K T I N F G V L Y G高Taq C-Q1R D N A K T I N F G V L Y G高Taq C-Q2R R A A K T F I Y G F L Y G低Taq C-Q3R R A A K T I I Y G V L Y G低Taq C-Q4R R A A K T I I F G V L Y G高Taq C-Q5R R A A K T I N Y G V L Y G低特異性殘基6個(gè)聚合酶家族Pol I，Polα和Polβ家族的DNA聚合酶，DNA依賴性RNA聚合酶，反轉(zhuǎn)錄酶和RNA依賴性RNA聚合酶的保守序列超二級(jí)結(jié)構(gòu)；其結(jié)果顯示所有聚合酶之間有一些殘基是保守的。根據(jù)其排列(圖3，463頁(yè))，此處鑒定的選擇性殘基(大腸桿菌DNA聚合酶I的762號(hào)苯丙氨酸)位于“B超二級(jí)結(jié)構(gòu)”。除了polI家族的DNA聚合酶，B超二級(jí)結(jié)構(gòu)還見于polα家族的DNA聚合酶以及T7家族的DNA依賴性RNA聚合酶；因此該排列強(qiáng)烈提示了在其它聚合酶家族中，包括74 DNA聚合酶，皰疹DNA聚合酶，_29 DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶中應(yīng)當(dāng)誘變的殘基。
另外Joyce，結(jié)構(gòu)生物學(xué)當(dāng)前觀點(diǎn)1,123-129(1991)比較了許多聚合酶的DNA序列，提示少量重要的活性位點(diǎn)殘基是保守的。特別地討論了polI家族(T7，polI，Taq)和polα家族(T4，_29，皰疹)的聚合酶的相似性。在圖1(124頁(yè))中Joyce指出發(fā)現(xiàn)于這兩個(gè)家族中5個(gè)不變殘殘基的位置，這包括賴氨酸758，酪氨酸766和甘氨酸767；它們都十分接近這里鑒別的選擇性殘基，苯丙氨酸762。
這些聚合酶用于DNA測(cè)序反應(yīng)，反應(yīng)條件設(shè)計(jì)得使測(cè)序反應(yīng)的DNA產(chǎn)物在膠上相鄰帶強(qiáng)度幾乎一致(強(qiáng)度差別1.5至2.0倍)。相鄰指分子量相差約6000，即20個(gè)殘基的DNA產(chǎn)物的帶。該強(qiáng)度的實(shí)際值會(huì)沿膠遞減，描述見Tabor和Richardson，引文見上。帶強(qiáng)度反映一條帶中DNA產(chǎn)物的數(shù)目。用標(biāo)記物如熒光生色團(tuán)或放射性同位素產(chǎn)生可以方便地檢測(cè)的帶，其強(qiáng)度反應(yīng)DNA產(chǎn)物的數(shù)目。因此在本發(fā)明中得自一個(gè)測(cè)序反應(yīng)具有一種鏈終止劑的相鄰帶有大致相同數(shù)目的DNA產(chǎn)物數(shù)目，因而有均一的帶強(qiáng)度。測(cè)序條件包括聚合酶溫育時(shí)存在特定的二價(jià)或三價(jià)陽(yáng)離子如錳(II和III)離子，鐵離子和亞鐵離子；效應(yīng)檢測(cè)不出來或者對(duì)DNA合成有害的單價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子包括K，Na，Ba，Be，Ca，Cc，Cr，Co，Cu，Ni，Si和Zn。陰離子不重要，例如氯離子，乙酸根和硫酸根均適用。本發(fā)明在這些條件下酶對(duì)鏈終止劑如雙脫氧核苷酸的需求可以小幾倍。溶液中已可以有螯合劑來幫助調(diào)節(jié)可用的二價(jià)金屬離子的濃度。例如可用檸檬酸或異檸檬酸。這些螯合物能將例如游離錳離子的水平在相對(duì)廣泛范圍的錳離子濃度下維持在10到100μM之間。即螯合劑作緩沖物用。
本發(fā)明的DNA聚合酶在DNA模板的全長(zhǎng)對(duì)雙脫氧核苷酸類似物和脫氧核苷酸區(qū)別并不顯著。即這些聚合酶對(duì)含3′羥基的核苷酸和不含3′羥基的核苷酸(即在核糖的3′位置含有兩個(gè)氫)區(qū)別并不顯著。但是即使有錳或鐵存在這些聚合酶也可能對(duì)核苷酸其它位置的修飾區(qū)別對(duì)待程度很大。例如與脫氧核苷酸相比這些聚合酶可能對(duì)某些連上熒光基團(tuán)的雙脫氧核苷酸類似物區(qū)別對(duì)待。但是這些聚合酶不會(huì)因?yàn)殡p脫氧核苷酸是否存在修飾而對(duì)相鄰或附近的核苷酸區(qū)別對(duì)待程度有所不同。因此，雖然這些聚合酶對(duì)這些類似物強(qiáng)烈地區(qū)別對(duì)待，與未修飾的雙脫氧核苷酸相比在DNA測(cè)序反應(yīng)中需要更高濃度的類似物，但其附近的帶的強(qiáng)度仍然均一。
因此，本發(fā)明的聚合酶雖然對(duì)摻入鏈終止劑整體上區(qū)別對(duì)待，但摻入的效率仍然均一。另外本發(fā)明的其它聚合酶比相應(yīng)的天然存在的酶能得到更均一的含熒光ddNTP的帶，盡管不比未標(biāo)記的或用放射性標(biāo)記的ddNTP帶均一。
本發(fā)明用的鏈終止劑包括具有2′，3′-雙脫氧結(jié)構(gòu)的雙脫氧核苷酸。用于本發(fā)明的其它試劑是能在特定堿基特異性終止DNA測(cè)序反應(yīng)，并且在上述條件下不被聚合酶區(qū)別對(duì)待的試劑。
為了確定是否任一特定的DNA聚合酶與任一特定的鏈終止劑或其它測(cè)序反應(yīng)混合物組分組合起來可用于本發(fā)明，根據(jù)Tabor和Richardson，引述見上的描述進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序反應(yīng)，并且對(duì)帶形成的程度和測(cè)序膠中附近帶的均一性作了考察。如果聚合酶反應(yīng)不能將引物至少延伸20個(gè)堿基，則不適用于所用的條件。相鄰帶均一性在2倍以內(nèi)范圍可用于本發(fā)明，優(yōu)選的均一性在1.0-1.5倍范圍。相似地用該測(cè)序反應(yīng)在不同條件下進(jìn)行，確定最優(yōu)陽(yáng)離子濃度或其它可用于測(cè)序反應(yīng)的陽(yáng)離子。例如陽(yáng)離子的檢測(cè)范圍是0.005-100mM。這種實(shí)驗(yàn)的一個(gè)例子如下
測(cè)量任一種酶摻入一特定ddNMP相比于相應(yīng)dNMP的能力時(shí)用能使DNA合成終止于一個(gè)固定范圍的ddNTP與dNTP的比值，檢測(cè)時(shí)即產(chǎn)生不超過某一固定分子量的帶的ddNTP與dNTP比值。也就是說，反應(yīng)產(chǎn)生的帶在測(cè)序膠上終止于一個(gè)特定范圍。因此，若相對(duì)于另一種酶，某酶對(duì)給定ddNTP的區(qū)別對(duì)待程度要大1000倍，就必須1000倍高的ddNTP與dNTP的比值才能得到終止于凝膠相同范圍內(nèi)對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的帶。外切核酸酶活性本發(fā)明的DNA聚合酶具有正?；蛱烊幌嚓P(guān)外切核酸酶水平(每聚合酶分子的活性量)的優(yōu)選不足50％，優(yōu)選的不足1％，最優(yōu)選的不足0.1％。正常或天然相關(guān)水平指例如未修飾的T7型聚合酶的外切核酸酶活性。用下述Chase等(249，生物化學(xué)雜志4545，1974)的操作方法的一種修飾法來測(cè)量，正常的相關(guān)活性為每毫克聚合酶約5,000單位的外切核酸酶活性。外切核酸酶通過切除與模板不正確配對(duì)的新合成堿基而增大了DNA合成的確限度。這種相關(guān)外切核酸酶活性對(duì)DNA測(cè)序反應(yīng)的質(zhì)量有損。它們升高了必須加到反應(yīng)中的核苷酸前體的最低需要濃度，因?yàn)槿艉塑账釢舛冉档?，聚合酶活性降到與外切核酸酶活性相當(dāng)，得不到DNA凈合成，甚至合成的DNA降解。
更重要的是，相關(guān)的外切核酸酶活性可能使DNA聚合酶在模板上有二級(jí)結(jié)構(gòu)障礙處停滯不前。當(dāng)聚合酶達(dá)到該結(jié)構(gòu)處試圖越過時(shí)其合成速率降低。聚合酶停滯時(shí)相關(guān)的外切核酸酶會(huì)切除新合成的DNA，后果是發(fā)生許多輪的合成與切除。結(jié)果可能是聚合酶最終合成通過了發(fā)夾結(jié)構(gòu)(對(duì)測(cè)序反應(yīng)的質(zhì)量無損)；或是聚合酶從合成鏈上解離(在所有4個(gè)測(cè)序反應(yīng)的同一位置得到一偽跡條帶)；或是鏈終止劑以高頻率摻入，在凝膠上得到的不同帶強(qiáng)度差別很大。發(fā)生這種情況是因?yàn)樵谌魏挝稽c(diǎn)若聚合酶摻入鏈終止核苷酸的機(jī)會(huì)變大，則鏈終止劑的摻入頻率也變大。
理想的測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)生的片段應(yīng)在膠上給出強(qiáng)度均一的帶。這對(duì)于每個(gè)放射性片段都使X光底片最優(yōu)曝光至關(guān)重要。如果放射性帶強(qiáng)度不同，則弱的帶會(huì)檢測(cè)不到。為了使所有片段得到均一的放射性強(qiáng)度，DNA聚合酶應(yīng)當(dāng)在DNA每一個(gè)位置耗費(fèi)相等的時(shí)間，在任何位點(diǎn)應(yīng)即不傾向于添加，也不傾向于去除核苷酸。如果DNA聚合酶不含任何相關(guān)的外切酶就是這樣，因?yàn)樵谀０迳厦恳粋€(gè)位置它將只有一次機(jī)會(huì)摻入鏈終止核苷酸。短引物本發(fā)明的DNA聚合酶優(yōu)選地能夠利用10個(gè)殘基或更短的引物，以及長(zhǎng)引物，最優(yōu)選的引物為4-20個(gè)殘基，例如6個(gè)殘基(可以3個(gè)為一組形成18聚體的等效物)。能利用短引物會(huì)給DNA測(cè)序帶來許多重要的優(yōu)點(diǎn)。短引物比常用的17聚體引物便宜且更易于合成。它在DNA模板上互補(bǔ)位點(diǎn)退火更快，因而使測(cè)序反應(yīng)更快。進(jìn)一步，能利用小的(例如6或7個(gè)殘基)寡聚核苷酸引物來DNA測(cè)序就可用原本不可能的策略來對(duì)長(zhǎng)DNA片段測(cè)序。例如可生成含80-4000個(gè)隨機(jī)六聚體的試劑盒，任何一個(gè)都不和克隆載體上任意位點(diǎn)互補(bǔ)。統(tǒng)計(jì)來說，沿待測(cè)序的DNA片段平均每50個(gè)殘基就會(huì)出現(xiàn)80個(gè)六聚體序列中的一個(gè)。確定3,000殘基的序列僅需5個(gè)測(cè)序循環(huán)。首先，用1個(gè)“普適”引物(例如新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室#1211，序列5′GTAAAACGAACGGCCAGT3′)對(duì)插入序列一端的約600個(gè)殘基測(cè)序。用該測(cè)序反應(yīng)的結(jié)果，從試劑盒中挑出一個(gè)與已確定序列末端附近一個(gè)區(qū)域同源的新引物。第二輪用這個(gè)引物確定下600個(gè)殘基的序列。重復(fù)該過程5次會(huì)確定整個(gè)3000個(gè)殘基的完整序列，不需任何亞克隆，不需化學(xué)合成任何新的寡聚核苷酸引物。在測(cè)序反應(yīng)中包括T7的基因25蛋白和基因4蛋白可以更好地應(yīng)用這些短引物。體外誘變用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法進(jìn)行聚合酶基因的誘變(見下)。對(duì)ddNTP區(qū)別對(duì)待存在唯一的二價(jià)陽(yáng)離子鎂時(shí)，T7 DNA聚合酶對(duì)ddNTP區(qū)別對(duì)待約3-4倍，比任何其它已知聚合酶都小。與之相近的是逆轉(zhuǎn)錄酶，它對(duì)ddTNP區(qū)別對(duì)待約10-50倍(比T7 DNA聚合酶大3-10倍)。除此二者外，文獻(xiàn)中已知性質(zhì)的所有其它DNA聚合酶對(duì)ddNTP區(qū)別對(duì)待至少100倍，經(jīng)常是10,000倍或更多。
錳存在時(shí)T7 DNA聚合酶和大腸桿菌DNA聚合酶I的區(qū)別對(duì)待降低；T7 DNA聚合酶從3.7降至1，大腸桿菌DNA聚合酶I從550降到3.9(對(duì)于ddATP)。申請(qǐng)人首先提供一種DNA聚合酶，當(dāng)二價(jià)陽(yáng)離子僅有鎂離子存在時(shí)持續(xù)合成能力小于100(定義為從引物-模板上解離下來之前從給定引物延伸的平均長(zhǎng)度)按此定義逆轉(zhuǎn)錄酶的持續(xù)合成能力為約150-200，T7 DNA聚合酶的持續(xù)合成能力比這大。并且對(duì)ddNMP摻入的區(qū)別對(duì)待小于100倍。與之對(duì)照，大多數(shù)已知的DNA聚合酶如Taq，持續(xù)合成能力小于100，對(duì)ddNMP摻入的區(qū)別對(duì)待大于100倍。
以前認(rèn)為高持續(xù)合成能力的聚合酶如T7 DNA合成酶結(jié)合引物-模板高大幾分鐘，低持續(xù)合成能力的聚合酶如大腸桿菌DNA聚合酶I從一個(gè)引物-模板到另一個(gè)幾秒鐘一輪(或頻率還要大100多倍)。見例如Tabor等，生物化學(xué)雜志262，16212-16223(1987)。雖然持續(xù)合成能力對(duì)DNA測(cè)序有利，因?yàn)檫@能降低由于不是因雙脫氧摻入而終止所造成的背景，但循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)并非優(yōu)點(diǎn)。例如，如果聚合酶真的在特定序列解離，則除非存在過量很多的聚合酶，測(cè)序膠上會(huì)出現(xiàn)強(qiáng)的偽跡帶。另一方面若聚合酶循環(huán)快，聚合酶用得就會(huì)少得多，因?yàn)橐粋€(gè)酶分子在測(cè)序反應(yīng)過程中，就會(huì)延伸許多不同的引物，并且任一給定引物端都有機(jī)會(huì)被許多不同聚合酶分子延伸，從而減少發(fā)生強(qiáng)的特定終止的機(jī)會(huì)。
但更好的是循環(huán)快的聚合酶也能有效地?fù)饺雂dNMP，以得到均一強(qiáng)度的帶并且少用ddNMP。更加優(yōu)選的是這樣的聚合酶外切核酸酶活性低或沒有，并且加入焦磷酸酶通過焦磷酸水解阻止帶的降解。
還優(yōu)選地能以鎂作唯一的二價(jià)陽(yáng)離子(即無錳)進(jìn)行DNA測(cè)序反應(yīng)。首先，聚合酶與錳比聚合酶與鎂活性低(見例如Tabor和Richardson美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊86，4076-4080(1989))。第二，聚合酶在大范圍的鎂濃度菌傾向于有活性，而大多數(shù)情況下要得到最優(yōu)活性，最優(yōu)錳濃度范圍窄且濃度低(同前)。并且在最優(yōu)錳濃度處，降低對(duì)ddNTP區(qū)別對(duì)待程度的效果地高濃度錳處低得多而高濃度錳處聚合酶活性又低。第三，錳用作試劑盒中的金屬離子不太方便；它容易形成沉淀，特別是當(dāng)pH高時(shí)。第四，還不清楚錳是否對(duì)任何嗜熱性聚合酶都作為一種有效降低對(duì)ddNTP區(qū)別對(duì)待程度的金屬離子(例如在高溫下)。
在本發(fā)明之前，我們宣稱(Tabor和Richardson美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，86，4076-4086(19889))區(qū)別對(duì)待與持續(xù)合成能力相關(guān)聯(lián)“DNA聚合酶I持續(xù)合成能力低，摻入少于10個(gè)核苷酸后就解離。
無ddNTP時(shí)DNA合成過程中酶從一個(gè)位點(diǎn)解離的頻率與該位點(diǎn)處對(duì)ddNMP摻入的區(qū)別對(duì)待程度有很強(qiáng)的相關(guān)性(未發(fā)表的結(jié)果)。這提示DNA聚合酶I在持續(xù)合成時(shí)以相似的速率摻入ddNMP和dNMP；但當(dāng)合成非持續(xù)時(shí)，相對(duì)于ddNMP更傾向于摻入dNMP。
該模型可解釋為什么與T7 DNA聚合酶相比DNA聚合酶插入
ddNMP的可變性大，因?yàn)榍罢叩某掷m(xù)合成能力比后者大兩個(gè)數(shù)量級(jí)?！盵引用文獻(xiàn)從略。]因此本發(fā)明對(duì)大腸桿菌DNA聚合酶I和TaqDNA聚合酶的結(jié)果令人吃驚，因?yàn)槲覀兾窗l(fā)現(xiàn)證據(jù)表明此處描述的突變體使突變體酶的持續(xù)合成能力增加。嗜熱性聚合酶對(duì)ddNTP區(qū)別對(duì)待小于100倍的嗜熱性聚合酶在本發(fā)明中尤其有用。另外當(dāng)二價(jià)陽(yáng)離子僅有鎂存在時(shí)對(duì)ddNMP區(qū)別對(duì)待小于100倍且從一個(gè)引物-模板循環(huán)到另一引物-模板每秒鐘不止一次的嗜熱性聚合酶也很有用。嗜熱性聚合酶定義為在15分鐘的反應(yīng)中在高于60℃的溫度獲得最優(yōu)DNA聚合酶活性的聚合酶。均一的帶強(qiáng)度雖然錳將Klenow片段對(duì)ddATP的區(qū)別對(duì)待從550倍降到3.9倍，Tabor和Richardson(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊86，4076-4080(1989))顯示各帶之間強(qiáng)度相差仍很大(見圖2，同上)。因此，除了T7 DNA聚合酶，本發(fā)明第一個(gè)提供了能與Klenow片段循環(huán)得一樣快的聚合酶以及來源于嗜熱性生物并且在二價(jià)離子僅有鎂存在的適于大多數(shù)聚合酶活性的條件(見上)下能得到均一強(qiáng)度條帶的聚合酶。用下述本領(lǐng)域已知方法可以確定循環(huán)快的酶。特定的聚合酶從上述資料有可能方便地得到具有上述所需性質(zhì)的聚合酶。如果外切核酸酶水平足夠低且聚合酶活性足夠(二者在本領(lǐng)域廣為人知)則每種這樣的聚合酶均可用于測(cè)序操作。各氨基酸位點(diǎn)參見Braithwaite和Ito，引文見上。1.PolI家族大腸桿菌DNA聚合酶I，Phe 762改變(改變指用例如酪氨酸或相當(dāng)?shù)陌被崽鎿Q得到不區(qū)別的特征)。
肺炎鏈球菌DNA聚合酶I，Phe 711改變。
水生棲熱菌DNA聚合酶I，Phe 667改變。
黃棲熱菌DNA聚合酶I，Phe 666改變。
噬菌體T5 DNA聚合酶，Phe 570改變。
噬菌體Spo1 DNA聚合酶，Leu 526改變。
噬菌體Spo2 DNA聚合酶，Phe 690改變。
線粒體DNA聚合酶，帶有天然的Tyr 753或在此位點(diǎn)改變但不降低不區(qū)別對(duì)待的活性。這樣的聚合酶以前沒有用于DNA測(cè)序。申請(qǐng)人認(rèn)為由于其預(yù)計(jì)的ddNTP區(qū)別對(duì)待水平低，它將可以用于這樣的操作。需要的話可將其修飾以降低與聚合酶活性相關(guān)的外切核酸酶活性。2.聚合酶α家族(又稱為聚合酶II家族)Delarue等，蛋白工程3，461-467(1990)兩個(gè)聚合酶家族(聚合酶I家族和聚合酶α家族)有三個(gè)公共的超二級(jí)結(jié)構(gòu)(motifs)。稱為“B超二級(jí)結(jié)構(gòu)”的區(qū)域含有經(jīng)我們鑒定對(duì)雙脫氧核糖部分有特異性的殘基。在聚合酶I家族中該區(qū)域特征是有序列KN1N2N3N4N5N6N7Y G，其中N4是特異性殘基若N4是苯丙氨酸，則區(qū)別對(duì)待程度高，若N4是酪氨酸，則區(qū)別對(duì)待程度低。在聚合酶α家族中，該序列為KN1N2N3N4N5N6YG(在保守殘基之間少一個(gè)殘基)。我們根據(jù)聚合酶I型酶推測(cè)，該超二級(jí)結(jié)構(gòu)中殘的變化(在賴氨酸(K)和酪氨酸(Y)之間)將會(huì)降低這些聚合酶對(duì)ddNTP的區(qū)別對(duì)待程度。這些殘基有大腸桿菌DNA聚合酶IIIle494-Phe499PRD1 DNA聚合酶 Leu341-Ser346_29 DNA聚合酶 Leu384-Leu389M2 DNA聚合酶 Leu381-Leu386T4 DNA聚合酶 Ile558-Leu563海濱熱球菌(Vent)DNA聚合酶 Leu492-Tyr497強(qiáng)烈火球菌DNA聚合酶Leu489-Phe494硫氣孔硫化葉菌DNA聚合酶Val604-Thr609人DNA聚合酶α Leu951-His956釀酒酵母DNA聚合酶I(α) Leu945-His950粟酒裂殖酵母DNA聚合酶I(α) Leu931-His936黑腹果蠅DNA聚合酶α Leu960-His965布魯氏錐蟲DNA聚合酶α Leu845-His850人DNA聚合酶δ Val695-Val700牛DNA聚合酶δ Val694-Val699釀酒酵母DNA聚合酶II(δ)Ile702-Val707粟酒裂殖酵母DNA聚合酶III(δ) Val681-Val686Plasmodium falciparum DNA聚合物δ Ile692-Val697釀酒酵母DNA聚合酶II(ε) Val82-Phe830釀酒酵母DNA聚合酶Rev3Leu1087-Thr1092皰疹單倍體病毒1型DNA聚合酶 Val812-Val817馬皰疹病毒1型DNA聚合酶 Val813-Val818Varicella-Zoster病毒DNA聚合酶Val776-Val781Epstein-Barr病毒DNA聚合酶Cys682-Val687皰疹病毒Saimiri DNA聚合酶Val671-Val676人細(xì)胞肥大病毒DNA聚合酶 Val811-Phe816鼠細(xì)胞胞大病毒DNA聚合酶 Val717-Phe722人皰疹病毒6型DNA聚合酶 Ile667-Val672Channel Catfish病毒DNA聚合酶 Ile750-His755小球藻病毒DNA聚合酶 Ile586-Val591雞天花病毒DNA聚合酶 Ile648-Val653牛痘病毒DNA聚合酶Ile637-Val642biennis卷蛾DNA聚合酶 Ile669-Leu674苜蓿銀紋夜蛾核多面體病毒 Arg606-Ile611(AcMNPV)DNA聚合酶舞毒蛾核多面體病毒DNA聚合酶 Arg624-Ile629腺病毒-2 DNA聚合酶 Leu696-Leu701腺病毒-7 DNA聚合酶 Leu762-Leu767腺病毒-12 DNA聚合酶 Leu694-Leu699S-1玉米DNA聚合酶 Leu6l8-Leu623Kalilo中間型鏈孢霉DNA聚合酶 Leu776-Leu777pAI2彈囊菌immersus DNA聚合酶 Leu951-Leu956pCLK1紫瘢麥角菌DNA聚合酶 Leu831-Leu836Maranhar粗糙鏈孢霉DNA聚合酶 Leu752-Leu757pEM肥大蘑菇DNA聚合酶 Leu573-Leu578pGKL1乳酸克魯維霉菌DNA聚合酶 Ile785-Leu790PGKL2乳酸克魯維霉菌DNA聚合酶 Ile770-Gly776pSKL克魯維氏酵母DNA聚合酶Ile775-Gly781實(shí)施例下列是確定各種聚合酶的持續(xù)合成能力和循環(huán)時(shí)間的方法的實(shí)施例，還提供了確定聚合酶區(qū)別對(duì)待水平的實(shí)施例及其它用于本發(fā)明的方法。實(shí)施例1 DNA聚合酶基因的誘變和突變體DNA聚合酶的過量生產(chǎn)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)克隆和表達(dá)突變體DNA聚合酶基因。生成大腸桿菌DNA聚合酶I和Taq DNA聚合酶的突變體的起始材料-編碼大腸桿菌DNA聚合酶I的大片段(Klenow片段)和Taq DNA聚合酶的大片段(KlenTaq或Taq DNA聚合酶，見Barnes 112基因29，1992或Stoffel片段，見Lawyer等2PCR方法應(yīng)用275，1993)的基因在T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子控制下表達(dá)。生成T7 DNA聚合酶的突變體的起始材料-編碼T7 DNA聚合酶的28氨基酸缺失的基因(見Tabor和Richardson，264生物化學(xué)雜志6447，1989)在一種生產(chǎn)T7 DNA聚合酶持續(xù)DNA合成的必需因子大腸桿菌硫氧還蛋白(Tabor和Richardson，引文見上)的菌株中在lac啟動(dòng)子控制下表達(dá)。Taq DNA聚合酶突變體F667 Y的基因從生產(chǎn)_Taq DNA聚合酶的基因轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)全長(zhǎng)Taq DNA聚合酶的基因上，所用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是PCR，限制性消化，然后再連接。
用與Sarkar和Sommer 8生物技術(shù)404，1990所描述的方法相似的PCR標(biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)誘變以構(gòu)建突變體DNA聚合酶。為了構(gòu)建至少互換了4個(gè)氨基酸殘基的雜合體，先構(gòu)建兩個(gè)雜合體引物，先在供體DNA上進(jìn)行PCR，將所得產(chǎn)物用于在受體DNA上進(jìn)行PCR，從而得到雜合體分子。為了構(gòu)建其中結(jié)果域交換小于等于4個(gè)氨基酸殘基的雜合體，先合成含有整個(gè)待轉(zhuǎn)移區(qū)域以及適當(dāng)?shù)氖荏w兩側(cè)序列的單個(gè)PCR引物，采用該引物直接構(gòu)建雜合體分子。
用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行突變體DNA聚合酶的過量生產(chǎn)(見例如《當(dāng)代分子生物學(xué)方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，Ausubel等編，第16章，1994)。用包括離子交換層析在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)操作純化突變體蛋白。大腸桿菌DNA聚合酶I突變體的純化見例如Joyce和Grindley 80美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊1830，1983。Taq DNA聚合酶的突變體的純化見例如Engelke等，191，分析生化396，1990。T7 DNA聚合酶的突變體的純化見例如Tabor和Richardson 264，生物化學(xué)雜志6447，1989。用這些參考文獻(xiàn)中描述的標(biāo)準(zhǔn)操作確定各純化突變體蛋白的聚合酶比活。實(shí)施例2 從DNA聚合酶中快速篩選出摻入雙脫氧核苷酸的效率比摻入脫氧核苷酸的效率提高的突變體用SDS活性凝膠分析法對(duì)突變體DNA聚合酶篩選其摻入雙脫氧核苷酸的能力。該操作是對(duì)Spanos和Hübscher 91酶學(xué)方法和Karawya等135分析生化318，1983中描述的方法的修飾。簡(jiǎn)言之，將10ml細(xì)胞誘導(dǎo)4到6小時(shí)然后沉淀。細(xì)胞沉淀重懸于0.3ml 25mM Tris Hcl，pH7.0，5mM EDTA.將20μl的重懸細(xì)胞與40μl的1％SDS(十二烷基磺酸鈉)，2％巰基乙醇，30％甘油，0.04％溴酚藍(lán)和100mM Tris HCl，pH6.8溶液混合。混合液于37℃溫育5分鐘，再將兩個(gè)20μl小份分別加到兩塊SDS聚丙烯酰胺凝膠上。SDS聚丙烯酰胺的分離膠含8％聚丙烯酰胺，0.27％雙丙烯酰胺，190mM Tris HCl，pH8.8，0.05％SDS和25μg/ml變性鮭精DNA，濃縮膠含5％聚丙烯酰胺0.17％雙丙烯酰胺，150mMTris HCl，pH6.8和0.1％SDS。兩塊凝膠于恒溫13℃在100V電泳13小時(shí)，電泳緩沖液含190mM Tris HCl，pH8.8和0.05％SDS。
電泳后于4℃用4次500ml的復(fù)性緩沖液(50mM Tris HCl，pH7.5，5mM乙酸鎂，1mM二硫蘇糖醇，40mM KCl，400μg/ml牛血清清蛋白。16％甘油和0.95mM EDTA)洗8小時(shí)。
將兩塊膠各自在6ml復(fù)性緩沖液，1.5μM 4dNTP，4μl[α-32P]dATP 1800μCi/mmol，10Ci/ml和80μg純化的硫氧還蛋白中溫育。對(duì)復(fù)性的蛋白檢測(cè)其聚合酶活性。其中一種混合液中還含有30μM ddTTP(對(duì)dTTP過量20倍)?；旌弦涸?7℃溫育4小時(shí)(對(duì)于嗜熱性DNA聚合酶是于70℃溫育2小時(shí))。
溫育后用5％三氯乙酸和1％焦磷酸鈉換液4次，洗膠8小時(shí)。然后將凝膠干燥并做發(fā)射自顯影。
為了確定一種突變體DNA聚合酶對(duì)ddTTP區(qū)別對(duì)待程度的大小，將兩塊有與沒有ddTTP存在時(shí)溫育的凝膠上放射性帶的強(qiáng)度相比較，并且將未修飾的DNA聚合酶的兩條帶上信號(hào)比與每種突變體的兩條帶上信號(hào)比相比較。如果一種突變導(dǎo)致DNA聚合酶對(duì)ddTTP區(qū)別對(duì)待程度降低，則與未修飾的DNA聚合酶相比，突變體DNA聚合酶的當(dāng)ddTTP存在時(shí)的帶上放射性會(huì)減少很多。例如，在這種條件下對(duì)含有受誘導(dǎo)的大腸桿菌DNA聚合酶I或T7 DNA聚合酶突變體Y526F觀察到在ddTTP存在或不存在時(shí)進(jìn)行的反應(yīng)中放射性帶的強(qiáng)度幾乎相同(在2倍之內(nèi))。與之對(duì)照，對(duì)于含有受誘導(dǎo)的大腸桿菌DNA聚合酶I突變體F762Y或T7DNA聚合酶，反應(yīng)在ddTTP存在時(shí)進(jìn)行的膠上條帶，其強(qiáng)度比相應(yīng)的當(dāng)ddTTP不存在時(shí)進(jìn)行的膠上條帶的強(qiáng)度的5％還要小。
該檢測(cè)是對(duì)大量DNA聚合酶突變體篩選其對(duì)雙脫氧核苷酸區(qū)別對(duì)待能力的快速方法。它可以檢測(cè)到區(qū)別對(duì)待相對(duì)率至少5倍的變化。不過該檢測(cè)還可接下去做可能感興趣的突變體DNA的純化以及對(duì)純化的蛋白用與上述相似的方法做更嚴(yán)格的檢測(cè)以精確確定各突變體對(duì)于雙脫氧核苷酸區(qū)別對(duì)待程度的效果。
下列實(shí)施例是確定各種聚合酶的持續(xù)合成能力和循環(huán)時(shí)間，確定聚合酶對(duì)ddNTP區(qū)別對(duì)待水平，確定DNA測(cè)序膠上由雙脫氧終止片段產(chǎn)生的帶的均一性以及本發(fā)明的DNA聚合酶做DNA序列分析的方法。實(shí)施例3 單鏈M13 DNA-5′32P-標(biāo)記的40聚體引物復(fù)合物的制備與純化模板是長(zhǎng)9950個(gè)核苷酸的M13 mGP1-2單鏈DNA，描述見美國(guó)專利4,795,699(圖9)。噬菌體M13 mGP1-2在ATCC的保藏號(hào)是40303。根據(jù)Tabor等262生物化學(xué)雜志，16212，1987的描述來純化M13 mGP1-2單鏈DNA。簡(jiǎn)而言之，通過兩次CsCl梯度離心純化噬菌體，透析除去CsCl，用酚∶氯仿和0.1％十二烷基磺酸鈉將DNA(人噬菌體中抽取出來，將抽提到的DNA對(duì)20mM Tris HCl，pH7.5，2mMEDTA充分透析，貯于4℃。用光度計(jì)確定M13 mGP 1-2單鏈DNA的濃度，消光系數(shù)8.1，A260單位等于1mg/ml或每微升0.3pmol M13 mGP1-2模板分子。
引物是用標(biāo)準(zhǔn)方法合成的40聚體，序列為5′d(TTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCA)3′。它與M13 mGP1-29031至8992號(hào)核苷酸互補(bǔ)(序列見′699專利，引述見上)。該引物用離子交換層析或變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化后做末端標(biāo)記。
基本按Tabor等所述(引述見上)將引物標(biāo)記并退火到模板上。引物5′末端標(biāo)記用的反應(yīng)混合液(15μl)含有40mM Tris·HCl，pH7.5，10mMMgCl25mM二硫蘇糖醇，100mM NaCl，50μg/ml BSA，50μCi[g32P]ATP，6000Ci/mmol，5pmol引物和從磷酸酶活性缺陷的PseT1突變體制備的10單位的T4多聚核苷酸激酶?；旌弦河?7℃溫育15分鐘，再于70℃溫育15分鐘使激酶失活。加入60μl單鏈M13 mGP1-2DNA(0.25mg/ml)6μl 1M NaCl和3μl 0.2M MgCl2，混合液緩慢地從70℃降至室溫(約20-25℃)共30分鐘。然后用1∶1的苯酚氯仿混合液抽提混合液一次，用離心管離心30秒后，將水相(70μl)加樣到用20mMTris HCl，pH7.5，2mM EDTA和100mM NaCl平衡的1ml Sepharose CL-6B柱上。用平衡用的緩沖液將標(biāo)記的引物-模板復(fù)合物從柱上洗脫；標(biāo)記的復(fù)合物從外小體積中洗脫出來。洗脫后復(fù)合物濃度約為50μg/ml(每μl 0.015pmol分子)，比活約為200,000cpm/μl。實(shí)施例4 用稀釋實(shí)驗(yàn)確定DNA聚合酶的持續(xù)合成能力基本上按Tabor等(引述見上)和Tabor和Richardson，84，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊4767，1987所述用酶稀釋法確定持續(xù)合成能力，反應(yīng)條件與DNA測(cè)序中的延伸/終止(Tabor和Richardson引述見上)條件相同，只是沒有ddNTP并且聚合酶濃度降低以使某些反應(yīng)中引物-模板分子比聚合酶分子過量。如實(shí)施例3所述，引物-模板包括退火到單鏈M13 DNA分子上的單個(gè)5′末端標(biāo)記的引物。
基本上按Tabor等(引述見上)所述配制延伸反應(yīng)混合液。每種反應(yīng)混合液(18μl)含1.0μl實(shí)施例3所述的退火32P標(biāo)記引物-M13 DNA(～0.015pmol，～200,000cpm)、40mM Tris·HCl，pH8.0，5mM MgCl2，5mM二硫蘇糖醇和300μm 4dNTP。加入2μl用20mM Tris·HCl，pH7.5，10mM2-巰基乙醇和0.05％牛血清清蛋白稀釋的待分析DNA聚合酶稀釋液小份起始反應(yīng)。反應(yīng)混合液進(jìn)一步于37℃(對(duì)嗜熱性DNA聚合酶是70℃)溫育30秒或3分鐘。在指定的時(shí)間取出8μl水份，在其中加入8μl的90％甲醛，20mM EDTA，0.05％溴酚藍(lán)用于變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，或加入2μl的100mM EDTA，2％十二烷基磺酸鈉用于堿性瓊脂糖凝膠電泳。
用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳或堿性瓊脂糖凝膠電泳分析樣品。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳最適于分析平均持續(xù)合成能力小于500個(gè)核苷酸的聚合酶，而堿性瓊脂糖凝膠電泳對(duì)平均持續(xù)合成能力大于500個(gè)核苷酸的DNA聚合酶能給出更敏感的估計(jì)，不過任一種方法均可成功地用于確定任一種DNA聚合酶的平均持續(xù)合成能力。
為了用變性聚丙烯脫胺凝膠電泳確定持續(xù)合成能力，將溶于甲醛的小份于90℃加熱2分鐘，迅速將每個(gè)樣品6μl加樣到含8％聚丙烯酰胺，0.4％N，N1-甲叉雙丙烯酰胺，7μM豚，100mM Tris·硼酸，pH8.3，1mM EDTA的凝膠上。電泳2000伏90分鐘(直到溴酚藍(lán)剛好走到膠底部為止)適當(dāng)?shù)?′32P末端標(biāo)記的分子量標(biāo)記物也加樣到凝膠上次確定長(zhǎng)100至500核苷酸的片段的大小。一種這樣的適當(dāng)標(biāo)記物是用標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook)等，1989《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約，6.20-6.21頁(yè)次及Ausubel等1989《當(dāng)代分子生物學(xué)方法》Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience，紐約)用堿性磷酸酶去磷酸化后用[g-32P]ATP和T4多聚核苷酸激酶5′32P末端標(biāo)記的T7 HpaI片段，電泳后凝膠真空干燥并放射自顯影。放射自顯影后用Phosphorimager分析(Molecular Dynamics)確定放射性標(biāo)記片段的分布。
用堿性瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物的描述見(1)Villani等，256生物化學(xué)雜志8202，1981，(2)Sabatino等27生化2998，1988和(3)Sambrook等，引述見上。制備瓊脂糖凝膠時(shí)，250ml含2mM EDTA，pH8.0的1.5％瓊脂糖溶液在微波爐中加熱，使瓊脂糖溶解，然后冷卻至60℃，加入8.75ml的1N NaOH(終濃度為35mM NaOH)，將熔膠倒入瓊脂糖凝膠電泳模中。膠凝定型2小時(shí)后再用。電泳緩沖液是35mM NaOH和2mMEDTA。制備樣品時(shí)取10μl上述小份(含20mM EDTA，0.4％十二烷基磺酸鈉)，加入1μl 1N NaOH，于60℃加熱10分鐘使之變性。每個(gè)樣品中加7μl 75％甘油和0.2％溴甲酚綠，然后樣品加樣到堿性瓊脂糖凝膠上。于4℃恒流150mA電泳15小時(shí)(直到溴甲酚綠遷移了約14cm)。電泳槽尺寸是20cm(長(zhǎng))×20cm(寬)×2cm(高)。電泳后凝膠在10％三氯乙酸中浸泡2小時(shí)，真空干燥并放射自顯影。然后用phosphorimager分析(Molecular Dynamics)確定放射性標(biāo)記片段的分布。
為了檢測(cè)給定DNA聚合酶的持續(xù)合成能力，將反應(yīng)混合液中聚合酶濃度二倍遞減地稀釋直到僅有一部分(例如25％)引物被延伸，而大多數(shù)(例如75％)不變，引物長(zhǎng)40個(gè)核苷酸，在這些條件下，DNA聚合酶濃度增減兩倍應(yīng)相應(yīng)使被延伸的引物分?jǐn)?shù)增減兩倍。用目測(cè)放射自顯影圖或用phosphoimager定量來確定標(biāo)記的片段的平均長(zhǎng)度。例如用該檢測(cè)法，外切酶缺失的T7 DNA聚合酶與其持續(xù)合成因子硫氧還蛋白的復(fù)合體(例如SEQUENASE_2.0版，美國(guó)生物化學(xué)品公司)的平均持續(xù)合成能力大于500個(gè)核苷酸。而大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段的持續(xù)合成能力小于50個(gè)核苷酸。實(shí)施例5 確定DNA聚合酶的循環(huán)速率基本上按Tabor等(引文見上)的描述確定循環(huán)速率。反應(yīng)條件與DNA測(cè)序中的延伸/終止反應(yīng)條件(Tabor和Richardson引文見上)相同，只是ddNTP沒有并且聚合酶濃度降低以使引物-模板分子對(duì)聚合酶分子過量。如實(shí)施例3所述引物-模板含有退火到單鏈M13 DNA分子上的5′[32P]末端標(biāo)記的引物。
首先做試驗(yàn)確定引物-模板分子對(duì)聚合酶分子的功能比，例如用大腸桿菌DNA聚合酶I的大片段(Klenow片段)。如實(shí)施例4所述進(jìn)行稀釋實(shí)驗(yàn)以確定在10秒內(nèi)將標(biāo)記的引物-模板分子延伸20％所必需的聚合酶分子濃度。該聚合酶與引物-模板的比值定義為小于等于1∶5，并用于確定聚合酶最大循環(huán)速率，描述如下。
如實(shí)施例4所述用上段定義的小于等于1∶5的DNA聚合酶對(duì)引物-模板的比進(jìn)行延伸反應(yīng)。反應(yīng)在所檢查聚合酶的最優(yōu)條件下(即緩沖液，pH，鹽，溫度)進(jìn)行。如實(shí)施例4所述在10秒，20秒，40秒和80秒取出小份，終止反應(yīng)并分析產(chǎn)物。對(duì)持續(xù)合成能力低的DNA聚合酶(小于100個(gè)核苷酸)，如大腸桿菌DNA聚合酶大片段，優(yōu)選地用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析樣品。對(duì)于持續(xù)合成能力高(大于100個(gè)核苷酸的DNA聚合酶，例如T7 DNA聚合酶，優(yōu)選地用堿性瓊脂糖凝膠電泳分析樣品。電泳后凝膠真空干燥，用放射性自顯影或磷成像儀分析。
若反應(yīng)進(jìn)行時(shí)聚合酶循環(huán)得很慢，例如T7 DNA聚合酶，則在10秒和80秒之間未被延伸的引物數(shù)減少不顯著(即小于2倍)。因此若未被延伸的被標(biāo)記引物數(shù)在10秒和80秒兩個(gè)時(shí)刻減少不超過2倍，則DNA聚合酶循環(huán)得比70秒一次要慢。對(duì)于循環(huán)快的聚合酶，在10秒和80秒兩個(gè)時(shí)刻之間未被延伸的引物數(shù)會(huì)減少很多(即大于2倍)。用下列方程確定這些聚合酶的循環(huán)速率R＝N1×L(t2)/{L(t1)×(t2-t1)}其中R＝循環(huán)最低速率，單位為循環(huán)每秒N1＝引物-模板分子對(duì)有功能的DNA聚合酶分子的比例(上例中N1＝5)L(t1)＝待檢測(cè)DNA聚合酶的最大持續(xù)合成能力，單位為核苷酸，定義為在限制性DNA聚合酶條件下(10秒時(shí)刻僅有20％引物被延伸)從標(biāo)記的引物延伸的最大核苷酸數(shù)，描述見實(shí)施例3。
L(t2)＝在t2時(shí)刻標(biāo)記引物的最大延伸長(zhǎng)度(以核苷酸為單位)，本例中為80秒。
t1取出小份的最短時(shí)間，本例為10秒。
t2取出小份前反應(yīng)進(jìn)行的最長(zhǎng)時(shí)間，本例為80秒。
對(duì)大腸桿菌DNA聚合酶I的大片段做試驗(yàn)得到值為大于0.2輪每秒。
實(shí)施例6和7給出用退火到單鏈M13 DNA模板上的5′32P標(biāo)記40聚體引物確定未知DNA聚合酶摻入雙脫氧核苷酸效率的試驗(yàn)以及基于凝膠電泳的分析。實(shí)施例6最適于有效地?fù)饺腚p脫氧核苷酸的DNA聚合酶(例如野生型T7 DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶F667Y)，而實(shí)施例7最適用于對(duì)雙脫氧核苷酸摻入強(qiáng)烈地區(qū)別對(duì)待的DNA聚合酶(例如T7DNA聚合酶Y526F和野生型Taq DNA聚合酶)。實(shí)施例6 基于凝膠電泳用1∶1比例的dNTP與ddNTP確定雙脫氧核苷酸相對(duì)于脫氧核苷酸摻入的速率本試驗(yàn)的主要應(yīng)用是對(duì)于能有效摻入雙脫氧核苷酸的DNA聚合酶如T7 DNA聚合酶，大腸桿菌DNA聚合酶I突變體F762Y或Taq DNA聚合酶突變體F667Y確定其ddNMP對(duì)dNMP的摻入絕對(duì)比值。本試驗(yàn)也可顯示任一DNA聚合酶對(duì)ddNTP區(qū)別對(duì)待的水平；不過對(duì)于那些對(duì)ddNTP強(qiáng)烈地區(qū)別對(duì)待的DNA聚合酶，如T7 DNA聚合酶突變體Y526F，大腸桿菌DNA聚合酶I或Taq DNA聚合酶，必需用高比值的ddNTP對(duì)dNTP以精確確定其區(qū)別對(duì)待的水平，詳細(xì)描述見實(shí)施例7。
用根據(jù)實(shí)施例3描述制備的32P末端標(biāo)記40聚體-M13 mGP1-2DNA模板復(fù)合物進(jìn)行DNA合成反應(yīng)。反應(yīng)條件是對(duì)所試驗(yàn)的DNA聚合酶的緩沖液，pH，鹽和溫度的最優(yōu)條件。選用的DNA聚合酶濃度使大多數(shù)引物在10分鐘反應(yīng)內(nèi)被延伸并被雙脫氧核苷酸的摻入所終止。反應(yīng)混合液含100μM 4dNTP和100μM的一種ddNTP。
我們用本試驗(yàn)比較6種DNA聚合酶摻入每種ddNMP的能力。所檢測(cè)的DNA聚合酶是(1)T7 DNA聚合酶，在外切酶結(jié)構(gòu)域有26個(gè)氨基酸的缺失并次1∶1的比例與硫氧還蛋白形成復(fù)合物(Tabor和Richardson264生物化學(xué)雜志6447，1989)(此處稱為“T7 DNA聚合酶”)，(2)大腸桿菌DNA聚合酶I的大片段，通常稱為Klenow片段(此處稱為“大腸桿菌DNA聚合酶I”，(3)水生棲熱菌的未修飾的DNA聚合酶(本文稱為“Taq DNA聚合酶”)，(4)上述T7 DNA聚合酶其中526號(hào)殘基酪氨酸換成苯丙氨酸(本文稱為“T7 DNA聚合酶Y526F”)，(5)上述大腸桿菌DNA聚合酶I，其中762號(hào)殘基苯丙氨酸換成酪氨酸(本文稱為“大腸桿菌DNA聚合酶I F762Y”)和(6)上述Taq DNA聚合酶，其中667號(hào)殘基苯丙氨酸換成酪氨酸(本文稱為“Taq DNA聚合酶F667Y”)。
對(duì)每種上述DNA聚合酶為了檢測(cè)每種ddNTP與相應(yīng)dNTP相比較的相對(duì)利用率，反應(yīng)混合液中含有如實(shí)施例3描述的1.0μl退火的32P標(biāo)記引物-M13 DNA(～0.015pmol，～200,000cpm)，40mM Tirs·HCl，pH8.0，5mM MgCl2，5mM二硫蘇糖醇，50mM NaCl，100μM4dNTP，和100μM ddCTP。反應(yīng)混合液中還含有10ng酵母無機(jī)焦磷酸酶以抑制焦磷酸水解，否則會(huì)增加DNA聚合酶的表現(xiàn)區(qū)別對(duì)待(Tabor和Richardson 265生物化學(xué)雜志8322，1990)。將各種DNA聚合酶用20mM Tris·HCl，pH7.5，10mM 2-巰基乙醇和0.05％牛血清清蛋白稀釋至濃度約0.025單位/l，然后各取20μl加入反應(yīng)體系以起始反應(yīng)。各DNA聚合酶濃度是以當(dāng)ddNTP不存在時(shí)在15分鐘的反應(yīng)中將大多數(shù)標(biāo)記的引物延伸多于500個(gè)核苷酸。反應(yīng)混合液于37℃(T7 DNA聚合酶，T7 DNA聚合酶Y526F，大腸桿菌DNA聚合酶I和大腸桿菌聚合酶I F762Y)或70℃(Taq DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶F767Y)溫育15分鐘。加入10μl 90％甲醛，20mM EDTA，0.05％溴酚藍(lán)終止反應(yīng)。每個(gè)樣品于90℃(加熱2分鐘后迅速用6μl加樣到含有8％聚丙烯酰胺，0.4％N，N′-甲叉雙丙烯酰胺，7M豚，100mM Tris·硼酸，pH8.3，1mM EDTA的凝膠上。電泳2000伏90分鐘(直到溴酚藍(lán)剛走出凝膠底部)。電泳后凝膠真空干燥并放射自顯影。用磷成像儀分析(MolecularDynamics)確定放射性標(biāo)記片段的分布。備選地可用如SciScan 5000成像密度儀(美國(guó)生物化學(xué)品公司)等儀器掃描放射自顯影圖確定雙脫氧終止帶的相對(duì)強(qiáng)度。
如上述用6種DNA聚合酶每一種均做過4個(gè)一組的實(shí)驗(yàn)(每個(gè)實(shí)驗(yàn)含有與dNTP摩爾濃度相等的一種ddNTP)后，其中3種DNA聚合酶(T7DNA聚合酶Y526F，大腸桿菌DNA聚合酶I和Taq DNA聚合酶)的反應(yīng)得到被延伸的引物中大多數(shù)(＞50％)放射性遷移到凝膠的頂部，對(duì)應(yīng)于長(zhǎng)度大于300個(gè)堿基的片段。根據(jù)信號(hào)隨片段大小增加指數(shù)衰減，該結(jié)果對(duì)應(yīng)于這三種DNA聚合酶對(duì)所有4種ddNTP區(qū)別對(duì)待均大于100倍。用下面實(shí)施例7的檢測(cè)可更精確地測(cè)量這三種DNA聚合酶對(duì)ddNTP區(qū)別對(duì)待的程度。
對(duì)另3種DNA聚合酶(T7 DNA聚合酶，大腸桿菌DNA聚合酶IF762Y和Taq DNA聚合酶F667Y)放射自顯影圖顯示所有反應(yīng)均有一系列雙脫氧終止的片段。通常對(duì)Taq DNA聚合酶F667Y標(biāo)記的合成片段的平均長(zhǎng)度最短，即使曝光幾天也只能看到6條放射性標(biāo)記的雙脫氧終止的片段。大腸桿菌DNA聚合酶I F762Y的標(biāo)記片段的平均長(zhǎng)度比TaqDNA聚合酶F667Y的稍長(zhǎng)，T7 DNA聚合酶的標(biāo)記片段的平均長(zhǎng)度最長(zhǎng)。用大腸桿菌DNA聚合酶I F762Y和Taq DNA聚合酶F667Y合成的片段比T7 DNA聚合酶的強(qiáng)度更均一。
片段放射性的分布用磷成像儀分析(Molecular Dynamics)定量。用3個(gè)不含DNA聚合酶的對(duì)照反應(yīng)走膠確定每條泳道上標(biāo)記的引物的總量。并且確定凝膠上在未延伸的引物位置上每條相應(yīng)放射性帶的放射性。對(duì)某些放射性標(biāo)記引物的制備物，無論所用DNA聚合酶濃度多大，總有一定百分比的引物不會(huì)被任何DNA聚合酶延伸。通過測(cè)量含有ddNTP的一套4個(gè)反應(yīng)中在未被延伸的引物位置留下的放射性百分比，從中減去以前確定的總計(jì)數(shù)量中這四個(gè)值的平均值可以確定該背景水平。該值定義為引物中能被DNA聚合酶延伸的總計(jì)數(shù)量。
在4個(gè)ddNTP反應(yīng)的每一個(gè)中對(duì)T7 DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I F762Y和Taq DNA聚合酶F667Y確定頭3個(gè)雙脫氧終止片段的總計(jì)數(shù)量(即放射性)。在下表中以前3個(gè)雙脫氧終止片段的計(jì)數(shù)可能被DNA聚合酶延伸的引物的總計(jì)數(shù)量的百分比給出這些數(shù)值。
聚合酶反應(yīng)ddGTP ddATP ddTTP ddCTPT7 DNA聚合酶67％ 66％ 76％ 61％大腸桿菌DNA聚合酶 95％ 92％ 96％ 92％I F762YTaq DNA聚合酶F667Y 97％ 95％ 95％ 99％為進(jìn)一步確定各DNA聚合酶摻入雙脫氧核苷酸的效率，對(duì)每個(gè)反應(yīng)確定每條信號(hào)強(qiáng)的片段的計(jì)數(shù)量，用Macintosh程序Kaleidograph3.0版(Synergy Software)將所得數(shù)據(jù)作成片段數(shù)目的函數(shù)。用Kaleidograph中指數(shù)衰減函數(shù)的庫(kù)子程序?qū)⑺们€擬合成指數(shù)衰減曲線。衰減曲線由下列方程給出Y=eM*X]]>其中Y＝1-(片段1至X中被標(biāo)記的引物還可延伸引物總數(shù)的比值)X＝片段數(shù)(第一個(gè)雙脫氧終止片段是1)M＝用Kaleidograph庫(kù)子程序?qū)?shù)據(jù)計(jì)算得的指數(shù)衰減函數(shù)在下表中，對(duì)利用T7 DNA聚合酶，大腸桿菌DNA聚合酶I F762Y和Taq DNA聚合酶F667Y的4種ddNTP反應(yīng)中每一個(gè)給出下列數(shù)據(jù)N，用于擬合每一條指數(shù)曲線的片段數(shù)。
M，如上述計(jì)算得的指數(shù)衰減函數(shù)。
D，區(qū)別對(duì)待因子，即某種dNTp與其相應(yīng)ddNTP濃度相同時(shí)，利用前看的量與利用后者的量的比值。用M的計(jì)算值確定當(dāng)X＝1時(shí)Y值，將D，即dNTP對(duì)ddNTP的優(yōu)先比，定義為Y/(1-Y)，則可由上述方程計(jì)算得D。
用Kaleidograph庫(kù)子程序計(jì)算得數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)R2。它量度條帶強(qiáng)度的差異或DNA聚合酶摻入特定雙脫氧核苷酸的序列特異性差異。
聚合酶 ddNTP N M D R2T7 DNA聚合酶 ddGTP 8-0.3752.2 0.813ddATP 6-0.3562.3 0.996ddTTP 5-0.4501.8 0.997ddCTP 8-0.3172.7 0.889大腸桿菌DNA聚合酶 ddGTP 5-1.03 0.560.999I F762YddATP 5 -0.860 0.720.998ddTTP 5 -1.060.541.000ddCTP 6 -0.842 0.751.000Taq DNA聚合酶F667Y ddGTP 5 -1.180.450.995ddATP 6 -0.997 0.590.997ddTTP 6 -1.010.560.996ddCTP 4 -1.440.320.996平均值T7 DNA聚合酶4 ddNTP2.3 0.924大腸桿菌DNA聚合酶 4 ddNTP 0.640.999F762YTaq DAN聚合酶F667Y 4 ddNTP 0.480.996總之，T7 DNA聚合酶對(duì)ddNTP區(qū)別對(duì)待2.3倍，而大腸桿菌DNA聚合酶I F762Y和Taq DNA聚合酶F667Y實(shí)際上對(duì)ddNTP利用程度分別為對(duì)dNTP利用度的1.6倍(1/0.64)和2.1倍(1/0.48)。比較R2可發(fā)現(xiàn)大腸桿菌DNA聚合酶I F762Y和Taq DNA聚合酶F667Y與T7 DNA聚合酶相比，相鄰片段的強(qiáng)度更加均一。為了更準(zhǔn)確地測(cè)量均一程度，降低每個(gè)反應(yīng)中ddNTP水平(例如降低5倍)。減少每個(gè)位置上的強(qiáng)度衰減(見實(shí)施例13)則可在分析中包括更多的片段。
為確定一種新的DNA聚合酶對(duì)ddNTP區(qū)別對(duì)待的倍數(shù)，可進(jìn)行與上述相似的反應(yīng)并且同時(shí)進(jìn)行用T7 DNA聚合酶(SEQUENASE 2.0版，美國(guó)生物化學(xué)品公司)的平行反應(yīng)，所有反應(yīng)都在同一塊膠上分析。將新DNA聚合酶得到的雙脫氧終止帶的分布與T7 DNA聚合酶得到的帶分布相比可顯示新DNA聚合酶對(duì)ddNTP區(qū)別對(duì)待程度比T7 DNA聚合酶大還是小。例如對(duì)大腸桿菌DNA聚合酶I F762Y目測(cè)清楚地顯示對(duì)含每種ddNTP的反應(yīng)，用大腸桿菌DNA聚合酶I F762Y的反應(yīng)其凝膠上可見片段數(shù)目比用T7 DNA聚合酶的反應(yīng)的少(且平均長(zhǎng)度小)。可以與上述類似地做更加定量的分析，對(duì)上述新DNA聚合酶計(jì)算其指數(shù)衰減因子(M)，ddNTP相對(duì)于dNTP的平均相對(duì)利用率(D)和強(qiáng)度差異(R2)。
本試驗(yàn)DNA聚合酶有相關(guān)的外切酶活性，如與Taq DNA聚合酶相關(guān)的5′至3′外切酶活性和與大腸桿菌DNA聚合酶I及天然T7 DNA聚合酶(而非上述實(shí)驗(yàn)中用的_28 T7 DNA聚合酶缺失突變體)相關(guān)的3′至5′外切酶活性則會(huì)出現(xiàn)問題。5′至3′外切酶活性有害是因?yàn)樗艹ヒ?′端的標(biāo)記，減少可檢測(cè)到的放射性信號(hào)。減少反應(yīng)混合液中DNA聚合酶量可部分地避免這個(gè)問題。在上例中，用0.025單位的Taq DNA聚合酶幾乎使所有的引物都得到延伸，直到摻入雙脫氧核苷酸為止，而不因5′至3′外切酶活性使放射性明顯降低，而當(dāng)Taq DNA聚合酶活性增加40倍，即每反應(yīng)1單位時(shí)，幾乎所有引物5′端的32P都失去。測(cè)量具有5′至3′外切酶活性的DNA聚合酶區(qū)別對(duì)待程度的另一種方法是利用如實(shí)施例8-10所述的不同的試驗(yàn)。
3′至5′外切酶活性使上述試驗(yàn)出現(xiàn)的問題是DNA聚合酶看上去的對(duì)ddNTP區(qū)別對(duì)待程度比實(shí)際的大(例如見Tabor和Richardson，86美國(guó)國(guó)家科學(xué)院進(jìn)展，4076，1987)，這是因?yàn)橐坏饺胍粋€(gè)雙脫氧核苷酸，外切酶活性會(huì)傾向于除去該雙脫氧核苷酸使DNA合成繼續(xù)，造成片段長(zhǎng)度變大。優(yōu)選地，上述試驗(yàn)中檢測(cè)的酶不含這種3′至5′外切酶活性；例如修飾的T7 DNA聚合酶(Sequenase_美國(guó)生物化學(xué)品公司)，Taq DNA聚合酶，外切酶缺陷的Vent(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶(NewEngland Biolabs目錄號(hào)257)，外切酶缺陷的Deep Vent(Pyrococcus GB-1)DNA聚合酶(New England Biolabs目錄號(hào)259)，外切酶缺陷的pfu(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶(Stratagene目錄號(hào)600103)和外切酶缺陷的Klenow片段(大腸桿菌DNA聚合酶，美國(guó)生物化學(xué)品公司，目錄號(hào)70057)。某些情況下，例如大腸桿菌DNA聚合酶I(Klenow片段)，3′至5′外切酶活性弱，對(duì)本試驗(yàn)干擾不大(見例如Tabor和Richardson 264生物化學(xué)雜志6447，1989)。確定一種待檢測(cè)的新DNA聚合酶是否有干擾對(duì)ddNTP區(qū)別對(duì)待能力的精確測(cè)量的3′至5′外切酶活性的一種方法是進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，在不同時(shí)刻取出小份，最長(zhǎng)時(shí)間為60分鐘。如果雙脫氧終止片段的大小分布隨時(shí)間而增加，則有可能這種3′至5′外切酶活性干擾檢測(cè)。而如果片段分布不隨時(shí)間變化則這種活性效果不大。如果平均片段長(zhǎng)度隨時(shí)間增加，則溫育時(shí)間應(yīng)縮短和/或?qū)NA聚合酶濃度降低到片段大小不隨隨時(shí)間變化。
焦磷酸水解，即聚合酶反應(yīng)的逆過程，會(huì)有跟3′至5′外切酶活性相似的效果，使DNA聚合酶除去鏈終止雙脫氧核苷酸進(jìn)而增大片段長(zhǎng)度(見Tabor和Richardson，265生物化學(xué)雜志8322，1990)。在反應(yīng)混合液中加入焦磷酸酶，除去DNA合成過程中積累的焦磷酸水解必需底物焦磷酸可以方便地避開該活性。實(shí)施例7 基于凝膠電泳用不同比例的dNTP與ddNTP確定雙脫氧核苷酸相對(duì)于脫氧核苷酸的摻入速率本實(shí)施例與實(shí)施例6相似。雖然本實(shí)施例是對(duì)摻入雙脫氧核苷酸強(qiáng)烈區(qū)別對(duì)待的DNA聚合酶(例如T7 DNA聚合酶Y526F，大腸桿菌DNA.聚合酶I和Taq DNA聚合酶)的優(yōu)選試驗(yàn)，它對(duì)能有效摻入ddNMP的DNA聚合酶(例如T7 DNA聚合酶，大腸桿菌DNA聚合酶I突變體F762Y和Taq DNA聚合酶突變體F667Y)等給出好的結(jié)果。本試驗(yàn)中兩個(gè)不同的DNA聚合酶制備物的ddNTP與dNTP比值不同，而所有其它反應(yīng)條件相同，然后比較雙脫氧終止，放射性標(biāo)記的片段的分布來確定兩種待檢測(cè)DNA聚合酶要得到可比的平均長(zhǎng)度的片段所需的比值。
用兩種方法中任一種確定一系列片段的平均長(zhǎng)度。第一種方法最適于有效摻入ddNTP的DNA聚合酶，我們檢查放射自顯影圖，確定用一種DNA聚合酶和含2倍遞增的ddNTP∶dNTP比的一系列反應(yīng)中曝光一定時(shí)間后最大可見帶的位置，將該位置與用第二種DNA聚合酶的相似的一系列反應(yīng)的帶位置相比較，以確定對(duì)于兩種DNA聚合酶要得到可比大小的片段所需的比值。標(biāo)志著有可見放射性帶出現(xiàn)的前端位置通常相對(duì)較清晰，可方便地目測(cè)。不過也可以用磷成像儀從膠頂部掃到膠底部，將每條泳道上達(dá)到某一每單位面積放射性閾值的各位置定位來精確地確定這些位置。
某些DNA聚合酶對(duì)雙脫氧核苷酸摻入的區(qū)別對(duì)待非常強(qiáng)烈，這時(shí)很難向反應(yīng)中加入足夠量的ddNTP以清楚地檢測(cè)到變性聚丙烯酰胺凝膠上最大的雙脫氧終止片段的位置。對(duì)這種DNA聚合酶，可以用堿性瓊脂糖凝膠電泳比較不同系列中雙脫氧終止片段的長(zhǎng)度。若用變性聚丙烯酰胺凝膠，則對(duì)兩種待檢測(cè)的DNA聚合酶確定其產(chǎn)生可比平均長(zhǎng)度的雙脫氧終止片段所需的ddNTP∶dNTP比值的另一方法是將注意力集中于一條或幾條帶上，用磷或像儀確定在這些帶上得到特定放射性水平所需的ddNTP∶dNTP比值。
用實(shí)施例6描述的6種DNA聚合酶進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)條件除了ddNTP和dNTP的濃度與實(shí)施例6的條件相同。所有反應(yīng)混合液均含10μM 4dNTP對(duì)下列3種DNA聚合酶T7 DNA聚合酶，大腸桿菌DNA聚合酶I F762Y和Taq DNA聚合酶F667Y在0.02M至1M范圍內(nèi)將4種ddNTP的濃度2倍遞增，下列3種DNA聚合酶T7 DNA聚合酶Y526F，大腸桿菌DNA聚合酶I和Taq DNA聚合酶F667Y在100至2，000M范圍內(nèi)將4種ddNTP的濃度2倍遞增。如實(shí)施例6所述進(jìn)行反應(yīng)并用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析樣品，干燥凝膠，放射自顯影和磷成像儀分析。下表總結(jié)了實(shí)驗(yàn)結(jié)果；對(duì)T7 DNA聚合酶，大腸桿菌DNA聚合酶F762Y和Taq DNA聚合酶F667Y給出的數(shù)值是實(shí)施例6中對(duì)用1∶1dNTP與ddNTP比得到的雙脫氧終止片段的強(qiáng)度用統(tǒng)計(jì)方法分析其指數(shù)衰減速率得出的絕對(duì)比值。對(duì)T7 DNA聚合酶Y526F，大腸桿菌DNA聚合酶I和Taq DNA聚合酶得出的數(shù)值是通過確定要得到一系列雙脫氧終止的片段，其平均長(zhǎng)度與分別利用T7 DNA聚合酶，大腸桿菌DNA聚合酶IF762Y和Taq DNA聚合酶F667Y得到的雙脫氧終止片段平均長(zhǎng)度相當(dāng)時(shí)所需的ddNTP與dNTP比值得到的。也就是說，對(duì)每對(duì)野生型和突變體DNA聚合酶確定要得到雙脫氧終止片段的可比分布所需的ddNTP∶dNTP比值。用強(qiáng)烈區(qū)別對(duì)待的酶(即在關(guān)鍵位置含苯丙氨酸的酶的反應(yīng)中所用ddNTP∶dNTP比值除以在相對(duì)非區(qū)別對(duì)待的酶(即在關(guān)鍵位置含酪氨酸的酶)的反應(yīng)要得到可比的雙脫氧終止片段分布所用的ddNTP∶dNTP比值除以片段分布所用的ddNTP∶dNTP比值得到一個(gè)因數(shù)，它對(duì)應(yīng)于兩種DNA聚合酶利于ddNTP相對(duì)于利用相應(yīng)dNTP的效率之差。該因數(shù)乘以在實(shí)施例6中對(duì)T7 DNA聚合酶，大腸桿菌DNA聚合酶IF762Y和Taq DNA聚合酶F667Y得到的絕對(duì)比值，則得到下列對(duì)T7 DNA聚合酶Y526F，大腸桿菌DNA聚合酶I和Taq DNA聚合酶分別給出的數(shù)值。
聚合酶 摻入速率比dG/ddGdA/ddA dT/ddT dC/ddCT7 DNA聚合酶 3.2 3.3 2.8 3.7T7 DNA聚合酶 6,4007,3008,40011,000Y526F大腸桿菌DNA聚合酶I 140 720 1,100250大腸桿菌DNA聚合酶I 0.56 0.72 0.54 0.75F762YTaq DNA聚合酶 1,400 4,7004,5002,600Taq DNA聚合酶F667Y0.45 0.59 0.56 0.32下表總結(jié)了T7 DNA聚合酶，大腸桿菌DNA聚合酶I和Taq DNA聚合酶在關(guān)鍵選擇性殘基處有酪氨酸而非苯丙氨酸對(duì)ddNTP相對(duì)dNTP利用的影響。
殘基 平均速率對(duì)dN/ddN的改善 對(duì)ddNTP的利用T7 DNA聚合酶酪氨酸(野生型) 3.0 3,000X苯丙氨酸8,000大腸桿菌DNA 苯丙氨酸(野生型) 600聚合酶I 酪氨酸0.6 1000XTaq DNA聚合酶苯丙氨酸(野生型) 3,000酪氨酸0.5 6,000X為了用本試驗(yàn)確定一種新DNA聚合酶區(qū)別對(duì)待程度，如上述進(jìn)行反應(yīng)，首先用大范圍的ddNTP對(duì)dNTP比值，然后將變性聚丙烯酰胺凝膠上雙脫氧終止片段的分布與標(biāo)準(zhǔn)(例如T7 DNA聚合酶的片段分布相對(duì)照。將含有可比平均長(zhǎng)度的DNA片段的泳道相匹配，新DNA聚合酶的ddNTP∶dNTP比值除以T7 DNA聚合酶所用比值得到新DNA聚合酶相對(duì)于T7 DNA聚合酶的區(qū)別對(duì)待水平。
為了用本試驗(yàn)確定一種DNA聚合酶的修飾是否降低其對(duì)ddNTP的區(qū)別對(duì)待能力(即更有效地?fù)饺腚p脫氧核苷酸)如上述將單位數(shù)相同的修飾與未修飾的DNA聚合酶用于一系列含不同ddNTP對(duì)dNTP比值的反應(yīng)中。對(duì)于兩種酶比較其ddNTP比dNTP比值相同時(shí)雙脫氧終止片段的平均長(zhǎng)度。如果該修飾造成DNA聚合酶更有效地?fù)饺雂dNTP，則在同樣的ddNTP∶dNTP比值時(shí)，用修飾DNA聚合酶的反應(yīng)比用未修飾DNA的反應(yīng)得到的雙脫氧終止片段平均長(zhǎng)度要短，而若修飾使DNA聚合酶對(duì)ddNTP的區(qū)別對(duì)待程度更大則用修飾DNA聚合酶的反應(yīng)得到的平均長(zhǎng)度要長(zhǎng)。
本試驗(yàn)也可用來確定DNA聚合酶的修飾是否導(dǎo)致它對(duì)ddNTP類似物，例如熒光加尾的ddNTP的區(qū)別對(duì)待能力降低。即使不知道待檢測(cè)的類似物濃度也可以這樣做。舉例來說，比較Taq DNA聚合酶和TaqDNA聚合酶F667Y利用Applied Biosystems(部分號(hào)401150)生產(chǎn)的四種DyeDeoxy終止物的能力。這些DyeDeoxy終止物各自共價(jià)連接不同的熒光部分(詳情見實(shí)施例12)。對(duì)于每種DyeDeoxy終止物，dNTP與DyeDeoxy終止物比值在16,000供范圍內(nèi)按2倍遞變，比較放射自顯影圖上雙脫氧終止片段的模式確定兩種酶各自要得到相同平均長(zhǎng)度的雙脫氧終止片段所需的比值。下表總結(jié)了這些結(jié)果。對(duì)于每種終止物，“比值”欄表示Taq DNA聚合酶對(duì)Taq DNA聚合酶F667Y要得到相同平均長(zhǎng)度的片段需要的ddNTP對(duì)dNTP比值。對(duì)正常的ddNTP，Taq DNA聚合酶F667Y對(duì)未修飾的Taq DNA聚合酶更有效地?fù)饺霟晒鈊dNTP衍生物，至少400倍。DyeDeoxy終止物比值G終止物 ＞400A終止物 ＞2,000T終止物 ＞2,000C終止物 ＞2,000如前面討論，用本試驗(yàn)若待檢測(cè)DNA聚合酶有相關(guān)的外切酶活性則可能出現(xiàn)問題，5′至3′和3′至5′外切酶能造成的問題和減小其影響的方法已在實(shí)施例6中討論過。當(dāng)做試驗(yàn)確定一種DNA聚合酶的修飾是否降低其摻入雙脫氧核苷酸的能力時(shí)，一類有該效果的突變體是使正常情況下有的3′至5′外切酶活性失活的突變體(例如見Tabor和Richardson美國(guó)科學(xué)院進(jìn)展84，4767，1987)。這類突變體不包涵于本發(fā)明的權(quán)利要求。如果一種修飾的DNA聚合酶其摻入雙脫氧核苷酸能力明顯升高，要想確定突變?cè)诰酆厦附Y(jié)構(gòu)域還是在外切酶結(jié)構(gòu)域，則有必要對(duì)該酶的修飾與未修飾形式做外切酶試驗(yàn)；主要影響酶的外切酶活性的突變體對(duì)酶的外切酶活性的作用比對(duì)其聚合酶活性的作用要大。優(yōu)選地可以對(duì)3′端用32P-ddAMP標(biāo)記的DNA底物測(cè)量其外切酶活性(見實(shí)施例21)如實(shí)施例6，在這些反應(yīng)中必須抑制焦磷酸水解以避免該作用增加一種DNA聚合酶對(duì)ddNTP的表現(xiàn)區(qū)別對(duì)待能力。在反應(yīng)中加入焦磷酸酶可方便地實(shí)現(xiàn)此目的。實(shí)施例8 通過抑制單鏈M13 DNA-未標(biāo)記40聚體引物復(fù)合物的DNA合成確定雙脫氧核苷酸的摻入效率本實(shí)施例中通過測(cè)量不同濃度ddNTP抑制標(biāo)準(zhǔn)DNA合成反應(yīng)的能力來確定DNA聚合酶對(duì)ddNTP的敏感性。DNA合成試驗(yàn)是Tabor和Richardson264生物化學(xué)雜志6447，1989中描述的方法的修飾。40聚體引物和M13 mGP1-2模板的有關(guān)描述見實(shí)施例3。反應(yīng)混合液(1X＝25μ1)中DNA模板含2μg M13 mGP1-2 DNA，6pmol引物(對(duì)模板過量10倍)，40mM Tris·HCl，pH8.0，10mM MgCl2和100mMNaCl。混合物于65℃溫育2分鐘后在30分鐘內(nèi)冷卻至溫室，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物(45μl)含22mM Tris·HCl，pH8.0，5.5mM MgCl2，55mMNaCl，300μM dGTP，dATP，dCTP和[3H]TTP(30cpm/pmol)和不同濃度的各種ddNTP或全部4種ddNTP。反應(yīng)混合液中還含有10ng酵母無機(jī)焦磷酸酶來抑制焦磷酸水解，否則會(huì)增加DNA聚合酶的表現(xiàn)區(qū)別對(duì)待能力(Tabor和Richardson 265生物化學(xué)雜志8322，1990)。反應(yīng)混合液于37℃溫育1分鐘(對(duì)嗜熱性DNA聚合酶是70℃)，加入5μl用20mMTris·HCl，pH7.5，10mM 2-巰基乙醇和0.05％牛血清清蛋白稀釋的稀釋液小份(0.01至1單位)起始反應(yīng)。反應(yīng)混合液進(jìn)一步于37℃溫育10分鐘(對(duì)嗜熱性DNA聚合酶是70℃)。加入5μl 100mM EDTA終止反應(yīng)，將45μl印到(spotted)Whatman DE81濾器盤上。用150ml 0.3M甲酸銨pH8.0換4次液，再用150ml 90％乙醇換2次液洗濾器盤，每次5到10分鐘。濾器盤然后在加熱燈下干燥，用閃爍計(jì)數(shù)器在加熱燈下干燥，用閃爍計(jì)數(shù)器在5ml fluor (Opti-Fluor O，Packard)存在時(shí)計(jì)數(shù)。從每盤上放射性量計(jì)算總的DNA合成量。
特定的待檢測(cè)DNA聚合酶的最優(yōu)緩沖液，pH，鹽或溫度條件可能與上述不同。每種DNA聚合酶應(yīng)當(dāng)在使該酶有最優(yōu)聚合酶比活的條件下檢測(cè)。
為確定一種給定DNA聚合酶的修飾是否導(dǎo)致其對(duì)雙脫氧核苷酸區(qū)別對(duì)待能力的降低，首先在ddNTP不存在時(shí)進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)，改變DNA聚合酶濃度以確定對(duì)酶的修飾和未修飾形式活性均隨酶濃度幾乎線性變化的濃度范圍。從兩種酶形式的線性范圍選取一個(gè)酶濃度；例如在10分鐘內(nèi)約30％的模板被復(fù)制的酶濃度就很可能位于該線性范圍。
一旦選定一個(gè)適當(dāng)?shù)拿笣舛?，進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)，改變一種ddNTP的量，或優(yōu)選地改變混合液中所有4種ddNTP的量來確定50％的DNA合成被抑制時(shí)的濃度。例如在上述條件(300μM 4dNTP)，對(duì)于下列6種DNA聚合酶需要下列濃度的4種ddNTP的混合液以抑制50％的DNA合成。
聚合酶50％抑制時(shí)的[4ddNTP]T7 DNA聚合酶 0.1μMT7 DNA聚合酶Y526F300μM大腸桿菌DNA聚合酶I 20μM大腸桿菌DNA聚合酶I F762Y 0.04μMTaq DNA聚合酶150μMTaq DNA聚合酶F667Y 0.4μM本試驗(yàn)可用于確定一種新DNA聚合酶的修飾是否降低其區(qū)別對(duì)待ddNTP的能力，如果該突變確實(shí)具有該效應(yīng)，則上述試驗(yàn)需要更高濃度的4ddNTP來抑制50％的DNA合成。實(shí)施例9 通過測(cè)量[a-32P]dAMP摻入合成的引物-模板復(fù)合體確定雙脫氧核苷酸摻入的效率本實(shí)施例中檢測(cè)合成的引物-模板中單個(gè)位點(diǎn)上dNTP與ddNTP的競(jìng)爭(zhēng)。該試驗(yàn)與其它試驗(yàn)不同之處在于它將兩種底物利用程度的比較限于單個(gè)位點(diǎn)，避免了序列特異性差異對(duì)區(qū)別對(duì)待能力的干擾。盡管這個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)單的試驗(yàn)適于對(duì)DNA聚合酶初步篩選其區(qū)別對(duì)待ddNTP的能力，但它不應(yīng)該與實(shí)施例6-8介紹的試驗(yàn)脫離開來應(yīng)用，因?yàn)閷?duì)ddNTP的區(qū)別對(duì)待能力受鄰近序列影響很大，這是DNA測(cè)序分析中一個(gè)重要問題(見例如Tabor和Richardson 265生物化學(xué)雜志8322，1990)。
本實(shí)施例用下面給出的兩個(gè)引物-模板。前一個(gè)用于確定對(duì)dNTP及ddATP的區(qū)別對(duì)待能力。后一個(gè)用于確定對(duì)dCTP及ddCTP，dTTP及ddTTP，和dGTP及ddGTP的區(qū)別對(duì)待能力。
引物-模板A5′GGCGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCA 3′3′GCTGCAACATTTTGCTGCCGGTCACGGTTCCCC 5′引物-模板B5′GGCGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCA 3′3′GCTGCAACATTTTGCTGCCGGTCACGGTCAGTTTT5′每種反應(yīng)混合液含25pmol的每種模板和引物。引物和模板混合在含40mM Tris·HCl，pH8.0，10mM MgCl2，和100mM NaCl的反應(yīng)混合液(1X＝10μl)中退火。混合液于65℃溫育2分鐘，然后在30分鐘內(nèi)冷卻至室溫。用引物-模板A進(jìn)行反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合液(45μl)含22mMTris·HCl，pH8.0，5.5mM MgCl2，55mM NaCl，25pmol引物-模板復(fù)合物，5μM[a-32P]dGTP(4,000cpm/pmol)和不同濃度的dATP和ddATP。反應(yīng)混合液還含有l(wèi)ong的酵母無機(jī)焦磷酸酶以抑制焦磷酸水解，否則DNA聚合酶的表現(xiàn)區(qū)別對(duì)待能力會(huì)變大(Tabor和Richardson 265生物化學(xué)雜志8322，1990)?；旌弦河?7℃溫育1分鐘(對(duì)嗜熱型DNA聚合酶是70℃)，然后加入用20mM Tris·HCl，pH7.5，10mM 2-巰基乙醇和0.05％牛血清清蛋白稀釋的待檢測(cè)DNA聚合酶5μl小份(0.01至1單位)起始反應(yīng)。反應(yīng)混合液進(jìn)一步于37℃溫育10分鐘(對(duì)嗜熱型DNA聚合酶是70℃)。加入5μl 100mM EDTA終止反應(yīng)。將45μl印到Whatman DE81濾器盤上。用150ml 0.3M甲酸銨pH8.0換4次液，再用150ml 90％乙醇換2次液洗濾器盤，每次5到10分鐘。濾器盤然后在加熱燈下干燥，用閃爍計(jì)數(shù)器在5ml Fluor (Opti-Fluor O，Packard)中計(jì)數(shù)。從每盤上放射性的量確定摻入的[32P]dGMP量。假定前提是一旦單個(gè)dAMP殘基摻入以去除對(duì)dGMP殘基摻入的阻礙，則4[32P]dGMP將會(huì)摻入到每個(gè)引物中，因而摻入的dAMP數(shù)是摻入的dGMP數(shù)的四分之一。
用恒定量的待分析DNA聚合酶進(jìn)行所有反應(yīng)；DNA聚合酶的量應(yīng)足以在10M dATP存在而ddATP不存在時(shí)10分鐘溫育過程中在模板的單鏈區(qū)域復(fù)制總dCMP殘基的50％。特令的待檢測(cè)DNA聚合酶的最優(yōu)緩沖液，pH，鹽或溫度條件可能與上述不同。每種DNA聚合酶應(yīng)當(dāng)在使該酶有最優(yōu)聚合酶比活的條件下檢測(cè)。還應(yīng)當(dāng)進(jìn)行dATP或ddATP均不存在的對(duì)照反應(yīng)。這樣可以確定DNA合成背景，將該背景從每個(gè)樣品中減去。通常該背景小于dATP存在時(shí)的DNA合成的10％。
然后用10μM dATP和不同濃度ddATP進(jìn)行反應(yīng)，以確定DNA合成50％被抑制所需的ddATP量。下表給出10μM dATP存在時(shí)DNA合成50％受抑制所需的ddATP濃度的例子。聚合酶由實(shí)施例6定義。
聚合酶 50％抑制時(shí)的[ddATP]T7 DNA聚合酶30μMT7 DNA聚合酶Y526F＞500μM大腸桿菌DNA聚合酶I＞500μM大腸桿菌DNA聚合酶I F762Y6μMTaq DNA聚合酶 ＞500μMTaq DNA聚合酶F667Y 5μM為了做相似的試驗(yàn)測(cè)量對(duì)ddGTP，ddTTP或ddCTP的區(qū)別對(duì)待程度，進(jìn)行與上述相同的試驗(yàn)，不過用引物-模板B而非引物-模板A，并且反應(yīng)含有10M dGTP，dTTP和dCTP，5M[a-32P]dATP(4,000cpm/pmol)以及不同濃度的ddGTP，ddTTP或ddCTP。
如同其它實(shí)施例一樣，DNA聚合酶具有3′至5′外切酶活性會(huì)干擾本試驗(yàn)，使酶對(duì)ddNTP區(qū)別對(duì)待的程度大于因類似物摻入而區(qū)別對(duì)待的水平。另外，酶的外切酶活性高，會(huì)用盡反應(yīng)液中的dNTP(尤其是當(dāng)這些反應(yīng)中dNTP水平相對(duì)低時(shí))，造成沒有凈DNA合成(例如天然T7 DNA聚合酶，見Tabor和Richardson 264生物化學(xué)雜志，6447，1989)。這種情況下應(yīng)調(diào)整DNA聚合酶的濃度和反應(yīng)的溫育時(shí)間，使得當(dāng)ddNTP不存在時(shí)得到最高水平的DNA合成。實(shí)施例10確定[a-32P]ddNMP摻入合成的引物-模板復(fù)合物中的效率本實(shí)施例中檢測(cè)dNMP和ddNMP摻入合成的引物-模板中單個(gè)位點(diǎn)的竟?fàn)?。該試?yàn)與實(shí)施例9的區(qū)別在于標(biāo)記物是[α-32P]ddATP，因此測(cè)量的是ddAMP的摻入。該試驗(yàn)可檢測(cè)一種ddNTP是否作為鏈終止物抑制DNA聚合酶，或摻入引物3′端，或是簡(jiǎn)單地結(jié)合上DNA聚合酶不摻入引物就阻止DNA進(jìn)一步合成。
下面的實(shí)驗(yàn)例中用[a-32P]ddATP和引物-模板A(實(shí)施例9)測(cè)量ddAMP的摻入引物-模板A5′GGCGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCA 3′3′GCTGCAACATTTTGCTGCCGGTCACGGTTCCCC 5′可見在適當(dāng)?shù)哪０迳?例如實(shí)施例9的引物-模板B)類似地檢測(cè)[a-32P]ddGMP，[a-32P]ddCMP和[a-32P]ddTMP的摻入。
每種反應(yīng)混合液含25pmol的每種引物和模板(引物-模板 A，見上)。引物與模板混合，在含有40mM Tris·HCl，pH8.0，10mM Mgch2和100mM NaCl的反應(yīng)混合液(1X＝101)中退火?；旌弦河?5℃溫育2分鐘，在30分鐘內(nèi)冷卻至室溫。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合液(45μl)含22mMTris·HCl，pH8.0，5.5mM MgCl2，55mM NaCl，25pmol引物-模板A復(fù)合物，2.5M[a-32P]ddATP(Amersham PB 10235，＞5000Ci/mmol，同冷的ddATP稀釋至比活為4,000 cpm/pmole)和不同濃度的dATP。反應(yīng)混合液還含有10ng酵母無機(jī)焦磷酸酶以抑制焦磷酸水解，否則會(huì)增加DNA聚合酶的表現(xiàn)區(qū)別對(duì)待能力(Tabor和Richardson，265，生物化學(xué)雜志，8322，1990)?；旌弦河?7℃溫育1分鐘(對(duì)嗜熱性DNA聚合酶是70℃)，然后加入51用20mM Tris·HCl，pH7.5，10mM 2-巰基乙醇和0.05％牛血清蛋白稀釋的待檢測(cè)DNA聚合酶小份(0.01至1單位)起始反應(yīng)。加入51100mM EDTA終止反應(yīng)，取451印到Whatman DE81濾器盤上。用150ml 0.3M甲酸銨，pH8.0換液4次，150ml 90％乙醇換液2次洗濾器盤，每次10-15分鐘。然后將盤在加熱燈下干燥，在5ml熒石中(Opti-Ftuor O，Packard)用閃爍計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。從每盤上放射性的量確定摻入的[32P]ddAMP量。
所有反應(yīng)均用恒量的待檢測(cè)DNA聚合酶進(jìn)行；DNA聚合酶量應(yīng)使當(dāng)dATP不存在時(shí)10分鐘溫育過程中[32P]ddAMP摻入水平最高。特定的待檢測(cè)DNA聚合酶的最優(yōu)緩沖液，pH，鹽或溫度條件可能與上述不同。每種DNA聚合酶應(yīng)當(dāng)在使該酶具有最優(yōu)聚合酶比活的條件下檢測(cè)。
為了用本試驗(yàn)確定對(duì)ddNTP的區(qū)別對(duì)待水平，反應(yīng)用恒量DNA聚合酶和[32P]ddATP，當(dāng)2.5M dATP(與[32P]ddATP等摩爾濃度)存在或不存在時(shí)進(jìn)行并確定dATP的存在對(duì)于[32P]ddAMP摻入的影響。如果DNA聚合酶對(duì)ddAMP和dAMP的摻入不加區(qū)分且沒有3至5外切酶活性，則加入dATP令抑制[32P]ddAMP摻入的50％。
本試驗(yàn)最適用于有效摻入ddNMP的DNA聚合酶例如Taq DNA聚合酶F667Y。對(duì)于強(qiáng)烈區(qū)別對(duì)待ddNMP的DNA聚合酶，優(yōu)選前一種試驗(yàn)，其中標(biāo)記物在不與某ddNTP竟?fàn)幍牧硪环NdNTP中，這樣采用的ddNTP的濃度可更高。不過對(duì)于強(qiáng)烈區(qū)別對(duì)待ddNMP的DNA聚合酶，如果我們有只趣檢測(cè)一種給定的突變是否降低對(duì)ddNMP區(qū)別對(duì)待的水平，則本試驗(yàn)可用來當(dāng)dATP不存在時(shí)檢測(cè)該底物上的未修飾DNA聚合酶(測(cè)量[32P]ddAMP插入作為DNA聚合酶濃度的函數(shù))，然后將其摻入速率與突變體酶的相比較。如果突變降低對(duì)ddATP的區(qū)別對(duì)待程度，則突變體酶摻入[32P]ddAMP的比活要高。
如同其它實(shí)施例一樣，DNA聚合酶具有3′至5′外切酶活性會(huì)干擾本試驗(yàn)，使酶對(duì)ddNTP的區(qū)別對(duì)待程度大于因類似物摻入而區(qū)別對(duì)待的水平。如實(shí)施例9中所說，酶的外切酶活性高，會(huì)耗盡所有dNTP，造成沒有[32P]ddAMP凈摻入。這種情況下應(yīng)調(diào)整DNA聚合酶的濃度和反應(yīng)的溫育時(shí)間，使待檢測(cè)DNA聚合酶摻入[32P]ddAMP的水平最高。
所有上述方法均基于放射性，檢測(cè)延伸的引物的長(zhǎng)度或引物上DNA合成的量。也可用非放射性的裝置測(cè)量DNA聚合酶摻入雙脫氧核苷酸的效率。下面給出兩個(gè)利用熒光引物或熒光dye-dideoxy終止物的實(shí)例例，檢測(cè)用Applied Biosystems 373A型DNA測(cè)序系統(tǒng)。實(shí)施例11用退火到單鏈DNA上的熒光引物和凝膠電泳確定雙脫氧核苷酸摻入效率本實(shí)施例中熒光標(biāo)記的引物退火到單鏈DNA上，用不同比例的dNTP和ddNTP進(jìn)行DNA合成反應(yīng)。樣品然后加樣到Applied Biosystems373A型DNA測(cè)序系統(tǒng)中，凝膠電泳直接檢測(cè)熒光確定各熒光片段的長(zhǎng)度。反應(yīng)如Tabor和Richardson 265生物化學(xué)雜志8322，1990的指述進(jìn)行。熒光引物是“Fam”引物(Applied Biosystems)。所用DNA是實(shí)施例3所述的單鏈M13 mGPI-2 DNA。引物在含有2g MI3 mGP 1-2DNA，5ng引物，40mM Tris·HCl，pH8.0，10mM MgCl2和100mMNaCl的反應(yīng)混合液中(1X＝101)退火到M13 mGP1-2單鏈DNA模板上?；旌弦河?5℃溫育2分鐘，然后在30分鐘內(nèi)冷卻至室溫。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合液(18 l)含22mM Tris·HCl，pH8.0，5.5mM MgCl2，55mMNaCl和不同濃度的4dNTP以及一種ddNTP。反應(yīng)混合液還含有10ng酵母無機(jī)焦磷酸酶以抑制焦磷酸水解，否則會(huì)增加DNA聚合酶的表現(xiàn)區(qū)別對(duì)待能力(Tabor和Richardson，265生物化學(xué)雜志8322，1990)?；旌弦河?7℃溫育1分鐘(對(duì)嗜熱性DNA聚合酶是70℃)，然后加入21用20mM Tris·HCl，pH7.5，10mM 2-巰基乙醇和0.05％牛白清清蛋白稀釋的待檢測(cè)DNA聚合酶小份(0.01至1單位)起始反應(yīng)。反應(yīng)混合液進(jìn)一步于37℃溫育10分鐘(對(duì)嗜熱性DNA聚合酶是70℃)。加入81的20mM EDTA，1M乙酸鉀，pH5.0，和601的乙醇終止反應(yīng)。離心后DNA重懸于61的80％甲醛，10mM Tris·HCl，pH8.0和1mM EDTA，于80℃加熱2分鐘，立即根據(jù)制造商的操作指南加樣到AppliedBiosystems 373A型DNA測(cè)序系統(tǒng)中。特定的待檢測(cè)DNA聚合酶的最優(yōu)緩沖液，pH，鹽或溫度條件可能與上述不同。每種DNA聚合酶應(yīng)當(dāng)在聚合酶比活最優(yōu)的條件下檢測(cè)。DNA聚合酶的濃度應(yīng)是以在10分鐘的反應(yīng)中將大部分引物延伸至少幾百個(gè)核苷酸或直至雙脫氧核苷酸摻入為止。
調(diào)整dNTP對(duì)ddNTP的比值以得到約300個(gè)堿基的最優(yōu)峰強(qiáng)度。例如Taq DNA聚合酶約10M 4dNTP和200-600M ddNTP最優(yōu)，而TaqDNA聚合酶F667Y約300M 4dNTP和0.5-5M ddNTP最優(yōu)。
為確定一種給定DNA聚合酶的修飾是否使其區(qū)別對(duì)待雙脫氧核苷酸的能力降低，反應(yīng)應(yīng)對(duì)未修飾的和修飾的DNA聚合酶以不同的dNTP對(duì)ddNTP比值進(jìn)行，比較不同長(zhǎng)度的雙脫氧終止片段的強(qiáng)度以確定修飾的DNA聚合酶是否比未修飾的酶更有效地利用ddNTP。實(shí)施例12 凝膠電泳確定熒光雙脫氧核苷酸的摻入效率本實(shí)施例中非熒光引物退火到單鏈DNA上，用不同的dNTP對(duì)單個(gè)熒光標(biāo)記的ddNTP比值進(jìn)行DNA合成反應(yīng)。然后樣品加樣到AppliedBiosystems 373A型DNA測(cè)序系統(tǒng)中，在凝膠電泳時(shí)直接檢測(cè)熒光確定每個(gè)熒光片段的長(zhǎng)度。本實(shí)施例用的引物是實(shí)施例3中指述的40聚體，模板是實(shí)施例3指述的單鏈M13 mGP5-2。引物在含有2g M13 MGP1-2 DNA，6pmol引物(對(duì)模板過量10倍)，40mM Tris·HCl，pH8.0，10mM MgCl2和100mM NaCl的反應(yīng)混合液(1X＝101)中退火到M13 MGP1-2單鏈DNA模板上?；旌弦河?5℃溫育2分鐘，然后在30分鐘內(nèi)冷卻至室溫。標(biāo)準(zhǔn)DNA混合液(181)令22mM Tris·HCl，pH8.0，5.5mM MgCl2，55mM NaCl，和不同濃度的4dNTP以及一種熒光標(biāo)記的ddNTP。4種熒光標(biāo)記的ddNTP購(gòu)自Applied Biosystems(TaqDyeDeoxy終止物循環(huán)測(cè)序試劑盒，部分號(hào)401150)，并稱為G，A，T或C“DyeDeoxy終止物”(Taq DyeDeoxy終止物循環(huán)測(cè)序試劑盒的手冊(cè)，部分號(hào)901497，Rev.E)。反應(yīng)混合液還含有10ng酵母無機(jī)焦磷酸酶以抑制焦磷酸水解，否則會(huì)增加DNA聚合酶的表現(xiàn)區(qū)別對(duì)待能力(Tabor和Richardson 265生物化學(xué)雜志8322，1990)。反應(yīng)混合液于37℃溫育1分鐘(對(duì)嗜熱性DNA聚合酶是70℃)，加入21用20mMTris·HCl，pH7.5，10mM2-巰基乙醇和0.05％牛血清清蛋白稀釋的待分析DNA聚合酶小份(0.01至1單位)起始反應(yīng)。反應(yīng)混合液進(jìn)一步于37℃溫育10分鐘(對(duì)嗜熱性DNA聚合酶是70℃)。加入81的20mMEDTA，1M乙酸鉀，pH5.0和601的乙醇終止反應(yīng)。離心后，DNA懸浮于61的80％甲醛，10mM Tris·HCl，pH8.0和1mM DTPA中，于80℃加熱2分鐘，迅速按制造商的操作指南加樣到Applied Biosystems373A型DNA測(cè)序系統(tǒng)中。
特定的DNA聚合酶的最優(yōu)緩沖液，pH，鹽或溫度條件可能與上述不同。每種DNA聚合酶均在其聚合酶比活最優(yōu)的條件下測(cè)量。用于本反應(yīng)的DNA聚合酶濃度應(yīng)是以在10分鐘的反應(yīng)中將大部分引物延伸至少幾百個(gè)核苷酸或直到雙脫氧核苷酸摻入為止。對(duì)于具有5′至3′外切酶活性的DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶，DNA聚合酶濃度應(yīng)保持足夠低以避免該活性降解掉相當(dāng)大百分比的片段5′端。
為確定一種DNA聚合酶對(duì)熒光ddNTP區(qū)別對(duì)待的強(qiáng)弱，用20M4dNTP和0.011各種DyeDeoxy終止物(購(gòu)自Applied Biosystems部分號(hào)401150)進(jìn)行反應(yīng)。若在這種條件下用Taq DNA聚合酶，則大部分熒光在凝膠前端的未摻入的染料ddNTP上或是在長(zhǎng)度大于幾百堿基的片段中。而這種條件下用Taq DNA聚合酶突變體F667Y，則大部分熒光在長(zhǎng)度小于幾百堿基的片段中，在凝膠前端未摻入的染料-ddNTP中的熒光占總熒光的百分比小得多。
為確定一種給定的DNA聚合酶的修飾是否導(dǎo)致該酶區(qū)別對(duì)待雙脫氧核苷酸能力的降低，對(duì)未修飾的和修飾的DNA聚合酶用不同的dNTP對(duì)DyeDeoxy終止物比值進(jìn)行反應(yīng)，比較所得到的熒光片段的平均長(zhǎng)度來確定修飾的DNA聚合酶是否地未修飾的酶更有效地利用DyeDeoxy終止物。
下列實(shí)施例提供一些試驗(yàn)，確定不同DNA聚合酶合成的雙脫氧終止片段的帶強(qiáng)度的均一程度。實(shí)施例13 用單鏈M13 DNA 5′32P標(biāo)記的40聚體復(fù)合物和凝膠電泳確定雙脫氧核苷酸摻入的均一程度。
本實(shí)施例中在于單鏈M13 DNA模板上延伸的5′32P末端標(biāo)記的引物上測(cè)量雙脫氧核苷磷摻入的均一程度。三種活性可造成雙脫氧終止片段的帶強(qiáng)度差異。其一是特別針對(duì)某些序列的外切酶活性，用化學(xué)或遺傳的方法選擇性地除去該活性可避免它(見例如Tabor和Richardson，264生物化學(xué)雜志6447，1989)。其二是焦磷酸水解，在及應(yīng)混合液中加入焦磷酸酶可方便地避免它，該酶可降解DNA合成時(shí)積累的焦磷酸，而焦磷酸是焦磷酸水解的必需底物。其三是雙脫氧核苷酸摻入的序列特異性差異。帶強(qiáng)度差異對(duì)DNA序列分析有害，降低所確定的DNA序列的準(zhǔn)確度。設(shè)計(jì)本試驗(yàn)以確定不同DNA聚合酶，包括可能更有效地?fù)饺腚p脫氧核苷酸的突變體DNA聚合酶，分成的帶的強(qiáng)度差異。
本實(shí)施例的引物，模板和反應(yīng)條件與實(shí)施例6和7所述相同。模板是實(shí)施例3所述的M13 mGP1-2單鏈DNA，引物是實(shí)施例3所述的40聚體。所用的反應(yīng)條件如反應(yīng)的緩沖液，pH，鹽和溫度對(duì)所檢測(cè)的DNA聚合酶最優(yōu)。優(yōu)選地鎂是反應(yīng)混合液中唯一的金屬離子(即反應(yīng)進(jìn)行時(shí)無附加的錳離子)。選擇DNA聚合酶濃度，使引物在10分鐘反應(yīng)中被延伸并摻入雙脫氧核苷酸而終止。對(duì)特定待檢測(cè)DNA聚合酶調(diào)整dNTP對(duì)ddNTP的比值，使平均片段大小約為100-300核苷酸。ddCTP是用于檢測(cè)均一程度的優(yōu)選ddNTP，因?yàn)橛稍撾p脫氧核苷酸終止的片段傾向于強(qiáng)度差異最多(見例如Tabor和Richardson 86美國(guó)科學(xué)院進(jìn)展4076，1989)。凝膠電泳，放射自顯影，以用通過掃描凝膠或磷成像儀分析法分析帶強(qiáng)度的描述見實(shí)施例6。電泳進(jìn)行到凝膠底部的片段大約55核苷酸長(zhǎng)為止(溴酚藍(lán)已走出凝膠底部，染料二甲苯藍(lán)(cyanol)距凝膠底部約8cm)。
對(duì)一給定的ddNMP終止片段系列，例如一系列ddCMP終止片段，確定距凝膠底部的前20個(gè)片段，優(yōu)選用磷成像儀分析。備選地用成像密度儀掃描放射自顯影圖，確定前20個(gè)片段的相對(duì)強(qiáng)度。然后如實(shí)施例6對(duì)這些強(qiáng)度作數(shù)值分析確定其差異。例如可用Macintosh程序Kaleidograph 3.0版(Synergy Software)用數(shù)值作圖。得到的圖用Kaleidograph中指數(shù)衰減線庫(kù)子程序擬合成指數(shù)衰減曲線。數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)R2用Kaleidograph庫(kù)子程序計(jì)算。這樣測(cè)量帶強(qiáng)度的差異。將用新DNA聚合酶得到的R2與用已知DNA聚合酶得到的R2相比，已知DNA聚合酶例如有鎂或錳存在的-28 T7 DNA聚合酶(Sequenase 2.0版，美國(guó)生物化學(xué)品公司)(見Tahor和Richardson 265生物化學(xué)雜志8322，1990)，大腸桿菌DNA聚合酶I(Klenow片段或有F762Y突變的Klenow片段)或Taq DNA聚合酶(野生型或突變體F667Y)。用這些已知DNA聚合酶得到的R2值作標(biāo)準(zhǔn)，來比較新DNA聚合酶的均一程度。實(shí)施例14 用單鏈M13 DNA-未標(biāo)記引物復(fù)合物和凝膠電泳確定[a-32P]ddNMP摻入的均一程度本實(shí)施例中用退火到單鏈M13 DNA模板上的未標(biāo)記引物和在[a-32p]ddATP存在下進(jìn)行DNA合成來測(cè)量雙脫氧核苷酸摻入的均一程度。測(cè)量雙脫氧核苷酸終止的片段時(shí)實(shí)施例13描述的試驗(yàn)比本試驗(yàn)要好，因?yàn)榍罢吒m于用高濃度的ddNTP，而高濃度ddNTP為強(qiáng)烈區(qū)別對(duì)待ddNTP的酶，如大腸桿菌DNA聚合酶I，Taq DNA聚合酶和T7 DNA聚合酶Y526F所必需。本試驗(yàn)最適用于有效摻入雙脫氧核苷酸的酶，如T7 DNA聚合酶，大腸桿菌DNA聚合酶I F762Y和Taq DNA聚合酶F667Y。本實(shí)施例的引物，模板和一般反應(yīng)條件與實(shí)施例8所述相同，但有下列不同。模板是實(shí)施例3括述的M13 mGP1-2單鏈DNA，引物是實(shí)施例3描述的40聚體。所用的反應(yīng)條件如反應(yīng)的緩沖液，pH，鹽和濃度對(duì)所檢測(cè)的DNA聚合酶最優(yōu)。優(yōu)選地鎂是反應(yīng)混合液中唯一的金屬離子(即反應(yīng)進(jìn)行時(shí)無外加的錳離子)。反應(yīng)用50M dGTP，dCTP和dTTP以及不同濃度的dATP和[a-32P]ddATP進(jìn)行。選擇dATP和[a-32P]ddATP的濃度，使約100核苷酸長(zhǎng)的片段放射性最強(qiáng)。其它方面如凝膠電泳和放射性片段的分析均與實(shí)施例13的描述相同。實(shí)施例15 用單鏈M13 DNA-熒光標(biāo)記的引物復(fù)合物和凝膠電泳確定雙脫氧核苷酸摻入的均一程度本實(shí)施例中反應(yīng)如實(shí)施例11所述進(jìn)行。模板是實(shí)施例3描述的M13mGP1-2單鏈DNA，引物是實(shí)施例3描述的40聚體。所用反應(yīng)條件如反應(yīng)緩沖液，pH，鹽和溫度對(duì)所檢測(cè)的DNA聚合酶最優(yōu)。優(yōu)選地鎂是反應(yīng)混合液中唯一的金屬離子(即反應(yīng)進(jìn)行時(shí)無附加的錳離子)。選擇DNA濃度使在10分鐘反應(yīng)中大多數(shù)引物被延伸并且摻入雙脫氧核苷酸終止。對(duì)特定的DNA聚合酶調(diào)節(jié)dNTP對(duì)ddNTP的比值使平均片段長(zhǎng)度約為100-200核苷酸。ddCTP是優(yōu)選的ddNTP，因?yàn)樵撾p脫氧核苷酸終止的片段傾向于強(qiáng)度差別最多(見例如Tabor和Richardson 86美國(guó)科學(xué)院進(jìn)展4076，1989)。確定引物的前50個(gè)雙脫氧終止片段的強(qiáng)度(約200核苷酸長(zhǎng))，如實(shí)施例13所述做數(shù)值分析。對(duì)所檢測(cè)的DNA聚合酶確定其相關(guān)系數(shù)R2，與由實(shí)施例13所述的已知DNA聚合酶得到的R2相比較。備選地，確定前50條帶的高度，計(jì)算相鄰帶的高度比用作差異的量度；將用所檢測(cè)的DNA聚合酶進(jìn)行的反應(yīng)得到的這些比值的最大值與平均值同用實(shí)施例13指述的已知DNA聚合酶進(jìn)行的反應(yīng)得到的相應(yīng)值做比較。實(shí)施例16 凝膠電泳確定熒光雙脫氧核苷酸的摻入的均一程度本實(shí)施例中如實(shí)施例12所述進(jìn)行反應(yīng)。為確定某一特定DNA聚合酶DyeDeoxy終止物的摻入均一程度，選擇dNTP濃度和特定的DyeDeoxy終止物，得到平均長(zhǎng)100-200核苷酸的熒光標(biāo)記的片段。對(duì)引物的10至40片段確定熒光強(qiáng)度(靠近熒光標(biāo)記的引物的前10個(gè)片段忽略)。然后如實(shí)施例13所述對(duì)片段做數(shù)值分析，數(shù)據(jù)擬分成指數(shù)衰減曲線的相關(guān)系數(shù)R2定義3平均差異。所得R2值與用實(shí)施例13所述的已知DNA聚合酶得到的R2值相比較。為確定DNA聚合酶中特定突變是否導(dǎo)致該DNA聚合酶產(chǎn)生的帶差異變小，將該突變體DNA聚合酶得到的R2值與未修飾DNA聚合酶得到的R2值相比較。實(shí)施例17 用有效摻入雙脫氧核苷酸DNA聚合酶作DNA序列分析以標(biāo)準(zhǔn)操作步驟用本發(fā)明的DNA聚合酶作DNA序列分析，調(diào)整dNTP對(duì)ddNTP的比值使得到的雙脫氧終止片段的平均長(zhǎng)度適于電泳分離。對(duì)于大腸桿菌DNA聚合酶I大片段的突變體，“Klenow片段F762Y”，反應(yīng)基本按修飾T7 DNA聚合酶的反應(yīng)進(jìn)行，描述見Tabor和Richardson美國(guó)專利4,795,699號(hào)，Tabor和Richardson，84美國(guó)科學(xué)院進(jìn)展4767，1987和SEQUENASE手冊(cè)，“SEQUENASE DNA測(cè)序詳細(xì)操作規(guī)程”第三版，美國(guó)生物化學(xué)品公司。由于Klenow片段F762Y摻入雙脫氧核苷酸的效率比修飾的T7 DNA聚合酶約高5倍，因而與對(duì)修飾T7 DNA聚合酶推薦的標(biāo)準(zhǔn)混合液(Sequenase手冊(cè)，引述見上)相比，其延伸一終止混合液中ddNTP的濃度石降5倍。
用熱穩(wěn)定性DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶F667Y作DNA序列分析的描述見Innis等85，美國(guó)科學(xué)院進(jìn)展，9436，1988，作下列修飾。雖然lnnis等推薦dNTP/ddNTP比值為1∶6 dGTP∶ddGTP，1∶32dATP∶ddATP，1∶48 dTTP∶ddTTP和1∶16 dCTP∶ddCTP，孝慮到Taq DNA聚合酶F667Y比野生型Taq DNA聚合酶更有效地利用4種ddNTP約3,000～8,000倍，這些比值應(yīng)作調(diào)整。因此Taq DNA聚合酶F667Y的延伸一終止反應(yīng)應(yīng)含有100M 4dNTP和0.1-5M每種ddNTP，應(yīng)根據(jù)DNA序列測(cè)定最優(yōu)時(shí)所需的平均片段長(zhǎng)度調(diào)整每種ddNTP的精確量。DNA測(cè)序及應(yīng)和變性凝膠電泳的其它方面描述見lnnis等(引述見上)。實(shí)施例18 用有效摻入雙脫氧核苷酸的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶做循環(huán)DNA序列分析用熱穩(wěn)定性DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶667Y進(jìn)行循環(huán)DNA測(cè)序的描述見Carothers等，7生物技術(shù)494，1989，只是(1)4種脫氧/雙脫氧NTP混合物含250M的所有4種dNTP和0.1-10M的ddGTP，ddATP，ddTTP，或ddCTP，根據(jù)最優(yōu)確定DNA序列所需平均片段長(zhǎng)度實(shí)施確定每種ddNTP的精確值。(2)用Taq DNA聚合酶F667Y而非TaqDNA聚合酶，DNA聚合酶的單位數(shù)與Carothers等(引述見上)推薦的相同。(3)反應(yīng)混合液含10ng無機(jī)焦磷酸酶以抑制焦磷水解，否則DNA聚合酶在特定序列處的表現(xiàn)區(qū)別對(duì)待能力增加，降低帶強(qiáng)度的均一程度(Tabor和Richardson，265生物化學(xué)雜志8322，1990)。優(yōu)選地該焦磷酸酶純化自嗜熱生物，如Thermus thermophilus(Hohne等，47，生物醫(yī)學(xué)和生化學(xué)報(bào)(Biomed.Biochim.Acta)941，1988)。實(shí)施例19 用修飾的Taq DNA聚合酶和熒光引物自動(dòng)循環(huán)DNA測(cè)序用熱穩(wěn)定性DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶F667Y和AppliedBiosystems Dye引物循環(huán)DNA測(cè)序是Applied Biosystems手冊(cè)(部分號(hào)901482，Rev.B)描述方法的修飾。本方法與手冊(cè)中的描述相同，但有下列修飾(1)孝慮到Taq DNA聚合酶F667Y比Taq DNA聚合酶更有效地利用ddNTP，必須修飾dNTP/ddNTP混合物。用于Applied Biosystems列出的混合物處的新混合物如下dG/ddG混合物＝100M C7dGTP，dATP，dTTP和dCTP，以及0.05M ddGTPdA/ddA混合物＝100M C7dGTP，dATP，dTTP和dCTP，以及0.3MddATPdT/ddT混合物＝100M C7dGTP，dATP，dTTP和dCTP，以及0.25M ddTTPdC/ddC混合物＝100M C7dGTP，dATP，dTTP和dCTP，以及0.15M ddCTP應(yīng)根據(jù)應(yīng)用改變ddNTP的濃度使特定大小范圍的片段熒光強(qiáng)度最優(yōu)。例如增大ddNTP的濃度會(huì)增大短片段的熒光。(2)用Taq DNA聚合酶F667Y而非Taq DNA聚合酶。在標(biāo)準(zhǔn)DNA聚合酶檢測(cè)條件下兩種酶的單位數(shù)相同。備選地可用相同數(shù)目的DNA聚合酶分子。(3)反應(yīng)混合液含10ng無機(jī)焦磷酸酶以抑制焦磷水解，否則DNA聚合酶在特定序列的表現(xiàn)區(qū)別對(duì)待能力會(huì)增加，降低帶強(qiáng)度的均一程度(Tabor和Richardson265生物化學(xué)雜志8322，1990)。優(yōu)選地該焦磷酸酶純化自嗜熱生物如Thermus thermophilus(Hohne等，47生物醫(yī)學(xué)和生化學(xué)報(bào)941，1988)。操作的其它方面與Applied Biosystems手冊(cè)所述相同(引述見上)實(shí)施例20 用修飾的Taq DNA聚合酶和熒光染料終止物自動(dòng)循環(huán)DNA測(cè)序用熱穩(wěn)定性DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶F667Y和AppliedBiosystems DyeDeoxy終止物循環(huán)DNA測(cè)序是Applied Biosystems手冊(cè)(部分號(hào)901497，Rev.E)中方法的修飾。本方法與手冊(cè)中的描述相同，但有下列修飾(1)手冊(cè)中要求每個(gè)測(cè)序反應(yīng)(201反應(yīng))中不稀釋用11每種DyeDeoxy終止物。本實(shí)施例中終止物先稀釋再加入測(cè)序反應(yīng)混合液中，因?yàn)門aq DNA聚合酶F667Y將其摻入的效率比Taq DNA聚合酶高幾百倍。在每個(gè)測(cè)序反應(yīng)中加入11的各個(gè)下列溶液，而非11不稀釋的終止物溶液DyeDeoxy G終止物 水中1至500倍稀釋DyeDeoxy A終止物 水中1至1,500倍稀釋DyeDeoxy T終止物 水中1至1,500倍稀釋DyeDeoxy C終止物 水中1至1,000倍稀釋這些稀釋只是近似；每種DyeDeoxy終止物的精確稀釋應(yīng)依照引物待確定的DNA序列堿基數(shù)實(shí)驗(yàn)確定。(2)用Taq DNA聚合酶F667Y而非Taq DNA聚合酶。在標(biāo)準(zhǔn)DNA聚合酶檢測(cè)條件下兩種酶的單位數(shù)相同。備選地可用相同數(shù)目的DNA聚合酶分子。(3)反應(yīng)混合液含10ng無機(jī)焦磷酸酶以抑制焦磷水解，否則DNA聚合酶在特定序列的表現(xiàn)區(qū)別對(duì)待能力會(huì)增加，降低帶強(qiáng)度的均一程度(Tabor和Richardson 265生物化學(xué)雜志8322，1990)。優(yōu)選地該焦磷酸酶純化自嗜熱生物如Thermusthermophilus(Hohne等，47生物醫(yī)學(xué)和生化學(xué)報(bào)941，1988)。
由于本方法比以前的操作方法用的DyeDeoxy終止物少500倍，反應(yīng)完全后DyeDeoxy終止物未摻入的問題不大。因此不必象AppliedBiosystems手冊(cè)(引述見上)推薦得那樣將樣品過離心柱除去未摻入的DyeDeoxy終止物。而是樣品乙醇沉淀，用5l去離子的甲醛和1l50mMEDTA，pH8.0懸浮起(taken up)，于90℃加熱2分鐘，根據(jù)373A的用戶手冊(cè)指導(dǎo)加樣到Applied Biosystems 373A DNA測(cè)序系統(tǒng)中。有可能對(duì)于有效摻入DeyDeoxy終止物的DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶F667Y)，用乙醇沉淀來濃縮DNA測(cè)序反應(yīng)不必要；優(yōu)選地用高濃度引物和dNTP(見下)進(jìn)行的DNA循環(huán)測(cè)序反應(yīng)通過加入等體積去離子甲醛終止反應(yīng)，于90℃加熱2分鐘，立即加樣到Applied Biosystems 373A測(cè)序系統(tǒng)中。這樣研究人員制備樣品作DNA序列測(cè)定時(shí)就可省下大量時(shí)間。
上述操作方法起始時(shí)用相對(duì)低濃度的dNTP(7.5M dATP，dTTP，dCTP和37.5M dTTP)。循環(huán)DNA測(cè)序反應(yīng)中dNTP用掉則dNTP濃度降低。這時(shí)dNTP濃度(小于7.5M)對(duì)大多數(shù)DNA聚合酶不能使DNA聚合酶活性最高。這樣低濃度對(duì)以前的方法很必要，因?yàn)樗鼈冇玫腄NA聚合酶強(qiáng)烈地區(qū)別對(duì)待ddNTP，因而需要ddNTP對(duì)dNTP地值高。本發(fā)明用的DNA聚合酶對(duì)DyeDeoxy終止物區(qū)別對(duì)待要弱得多，因而可用高濃度的dNTP。例如在上述方法中用的dNTP和DyeDeoxy終止物的濃度可高10倍；即75M dATP，dTTP和dCTP，375M dITP，并如下稀釋每種Dye Deoxy終止物DeyDeoxy G終止物，水中1至50倍；DeyDeoxy A終止物，水中1至150倍；DeyDeoxy T終止物，水中1至150倍；DeyDeoxy C終止物，水中1至100倍。因而本實(shí)施例中DeyDeoxy終止物濃度仍比以前方法的低至少50倍。實(shí)施例21 用[32P]ddAMP終止的DNA底物作外切酶檢測(cè)用HindIII消化天然(native)小牛胸腺DNA制備3′[32P]ddAMP終止的DNA底物，反應(yīng)混合液(50 l)含10g雙鏈小牛胸腺DNA，40mMTris·HCl，pH7.5，10mM MgCl2，5mM二硫蘇糖醇，50mM NaCl，50g/ml牛血清清蛋白和10單位HindIII。于37℃溫育60分鐘后加入5l[a-32P]ddATP(Amersham PB10235，＞5000Ci/mmol)和5單位Sequenase 2.0版(美國(guó)生物化學(xué)品公司，索引號(hào)(catalog number)70775)，混合液于20℃溫育15分鐘。反應(yīng)混合液然后用等體積的苯酚∶氯仿∶異或醇(24∶24∶1)抽提一次，在1ml含20mM Tris·HCl pH7.5，2mM EDTA，100mMNaCl的Sephadex G loo柱(pharmaci)中分級(jí)分離，由外水體積洗脫的3′32P標(biāo)記的DNA比活約為500cpm/ng總DNA。
外切酶檢測(cè)的反應(yīng)混合液(901)含40mM Tris·HCl，pH7.5，10mM MgCl2，10mM二硫蘇糖醇，50mM KCl和1nmol 3′32P標(biāo)記的DNA。反應(yīng)混合液還含有10ng酵母無機(jī)焦磷酸酶以去除痕量的焦磷酸因而阻止焦磷酸水解(pyrophosphorolysis)(Tabor和Richardson 265生物化學(xué)雜志8322，1990)。該混合液于20℃預(yù)溫育1分鐘，然后加入101適當(dāng)?shù)拿赶♂屢?。?7℃溫育指定時(shí)間后，加入301中白清清蛋白(10mg/ml)和30l三氯乙酸(100％w/v)終止反應(yīng)。沉淀的DNA于0℃溫育15分鐘，然后離心12,000g 30分鐘沉淀。測(cè)量100 l上清中的酸溶性放射性。一單位的3′[32P]ddAMP-DNA外切酶活性在15分鐘內(nèi)催化1pmol[32P]ddAMP酸溶解。
其它實(shí)施方案由下列權(quán)利要求包涵。
序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人(A)姓名President&Fellows of Harvard College(B)街道17 Quincy Street(C)城市Cambridge(D)州 Massachusetts(E)國(guó)家United States of America(F)郵編02138(ii)相關(guān)地址(A)收信人Richard J.Warburg Lyon&Lyon(B)街道 633 West Fifh Street Suite 4700(C)城市 Los Angeles，CA 90071(D)國(guó)家 USA(E)郵編 90071(A)電話(213)955-0440(B)電傳(213)489-1600(C)電報(bào)67-3510(iii)序列數(shù)24(iv)發(fā)明名稱用于測(cè)序的具有修飾的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)的DNA聚合酶(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型3.5″盤，1.44Mb存貯量(B)計(jì)算機(jī) IBM PS/2 Model 50Z or 55SX(C)操作系統(tǒng)IBM P.C.DOS(Version 3.30)(D)軟件WordPerfect(Version 5.0)(vi)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)栁唇o出(B)提交日(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)在先申請(qǐng)全部包括下述申請(qǐng)TWO(A)申請(qǐng)?zhí)? 08/324,437
(B)提交日17-OCT-1994(A)申請(qǐng)?zhí)柮绹?guó)未給出(B)提交日10-NOV-1994(2)SEQ ID NO 1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO1Arg Arg Ser Ala Lys Ala Ile Asn Phe Gly Leu Ile Tyr Gly5 10(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO2Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly510(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO3Arg Asp Asn Ala Lys Thr Phe Ile Tyr Gly Phe Leu Tyr Gly510(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO4Arg Asp Asn Ala Lys Thr Phe Ile Tyr Gly Phe Leu Tyr Gly5 10(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO5Arg Arg Ser Ala Lys Ala Ile Asn Phe Gly Leu Ile Tyr Gly5 10(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO6Arg Arg Ser Ala Lys Thr Phe Ile Tyr Gly Phe Leu Tyr Gly5 10(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO7Arg Asp Asn Ala Lys Ala Ile Asn Phe Gly Phe Leu Tyr Gly5 10(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO8Arg Asp Asn Ala Lys Ala Ile Ile Tyr Gly Phe Leu Tyr Gly5 10(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO9Arg Asp Asn Ala Lys Thr Phe Asn Phe Gly Phe Leu Tyr Gly5 10(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO10Arg Asp Asn Ala Lys Thr Phe Asn Tyr Gly Phe Leu Tyr Gly5 10(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14
(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO11Arg Asp Asn Ala Lys Thr Phe Ile Phe Gly Phe Leu Tyr Gly5 10(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO12Arg Arg Ser Ala Lys Ala Ile Asn Phe Gly Leu Ile Tyr Gly5 10(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO13Arg Asp Asn Ala Lys Thr Phe Ile Tyr Gly Phe Leu Tyr Gly5 10(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO14Arg Arg Ser Ala Lys Thr Phe Ile Tyr Gly Leu Ile Tyr Gly
5 10(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO15Arg Arg Ser Ala Lys Thr Phe Asn Phe Gly Leu Ile Tyr Gly5 10(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO16Arg Arg Ser Ala Lys Ala Ile Ile Tyr Gly Leu Ile Tyr Gly5 10(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO17Arg Arg Ser Ala Lys Ala Ile Ile Phe Gly Leu Ile Tyr Gly5 10(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO18Arg Arg Ser Ala Lys Ala Ile Asn Tyr Gly Leu Ile Tyr Gly5 10(2)SEQ ID NO19的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO19Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly5 10(2)SEQ ID NO20的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO20Arg Asp Asn Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly5 10(2)SEQ ID NO21的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO21Arg Arg Ala Ala Lys Thr Phe Ile Tyr Gly Phe Leu Tyr Gly5 10(2)SEQ ID NO22的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO22Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Ile Tyr Gly Val Leu Tyr Gly5 10(2)SEQ ID NO23的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO23Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Ile Phe Gly Val Leu Tyr Gly5 10(2)SEQ ID NO24的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)序列描述SEQ ID NO24Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Tyr Gly Val Leu Tyr Gly5 10
權(quán)利要求
1.編碼被修飾的DNA聚合酶的被修飾的基因，其中該被修飾的基因經(jīng)修飾，其編碼的聚合酶與相應(yīng)天然存在的DNA聚合酶相比，摻入雙脫氧核苷酸的能力比摻入相應(yīng)脫氧核苷酸的能力提高至少20倍。
2.權(quán)利要求1的被修飾的基因，其中所說的被修飾的DNA聚合酶有足夠的DNA聚合酶活性，當(dāng)它與任何該DNA聚合酶活性所必需的因子結(jié)合時(shí)，可以用于DNA測(cè)序。
3.權(quán)利要求1或2的被修飾的基因，其中所說的被修飾的DNA聚合酶的外切酶活性足夠低，使得所說的聚合酶可用于DNA測(cè)序。
4.權(quán)利要求1至3中任一權(quán)項(xiàng)的被修飾的基因，其中所說的被修飾的DNA聚合酶具有一個(gè)含酪氨酸殘基的雙脫氧核苷酸結(jié)合位點(diǎn)。
5.權(quán)利要求4的被修飾的基因，其中該聚合酶是T7型DNA聚合酶，它選自T7，T3，_I，_II，H，W31，gh-1，Y，A1122和SP6。
6.被權(quán)利要求1至5中任一權(quán)項(xiàng)的被修飾的基因編碼的被修飾的DNA聚合酶。
7.權(quán)利要求6的被修飾的DNA聚合酶，其中所說的聚合酶是Pol I型聚合酶，其被修飾的氨基酸位點(diǎn)所處的區(qū)域選自對(duì)應(yīng)于大腸桿菌DNA聚合酶I的區(qū)域666-682，710-755，755-784，798-867和914-928。
8.權(quán)利要求1至4中任一權(quán)項(xiàng)的被修飾的基因，其中所說的被修飾的DNA聚合酶是熱穩(wěn)定性酶。
9.權(quán)利要求8的被修飾的基因，其中所說的熱穩(wěn)定性酶選自水生棲熱菌，嗜熱棲熱菌，黃棲熱菌，甾類嗜熱芽孢桿菌，海濱熱球菌和強(qiáng)烈火球菌編碼的DNA聚合酶。
10.權(quán)利要求1至5或8和9中任一權(quán)項(xiàng)的被修飾的基因，其中所說的聚合酶與相應(yīng)天然存在的DNA聚合酶相比，其摻入雙脫氧核苷酸的能力比摻入相應(yīng)脫氧核苷酸的能力提高至少25倍。
11.權(quán)利要求10的被修飾的基因，其中所說的能力提高至少50倍。
12.權(quán)利要求10的被修飾的基因，其中所說的能力提高至少100倍。
13.權(quán)利要求10的被修飾的基因，其中所說的能力提高至少500倍。
14.生產(chǎn)一種被修飾的DNA聚合酶的方法，該酶與相應(yīng)的天然存在的DNA聚合酶相比，摻入雙脫氧核苷酸的能力比摻入相應(yīng)脫氧核苷酸的能力要高，該方法包括提供一種編碼DNA聚合酶的核酸分子，將該核酸分子誘變以便在核苷酸堿基序列的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)摻入一個(gè)或多個(gè)堿基變化，將該核酸編碼的聚合酶的摻入雙脫氧核苷酸的能力改變至少20倍。
15.確定DNA分子的核苷酸堿基序列的方法，其包括如下步驟在一容器中將同能與該DNA分子雜交的引物分子退火的DNA分子溫育，該容器含有至少一種脫氧核苷三磷酸，DNA聚合酶和至少一種在特定核苷酸堿基處終止DNA合成的DNA合成終止劑；該DNA聚合酶從天然存在的DNA聚合酶修飾而來并且與天然存在的聚合酶相比摻入雙脫氧核苷酸的能力增強(qiáng)，而且有足夠的DNA聚合酶活性以及外切酶活性足夠低，可用于DNA測(cè)序；根據(jù)大小將溫育反應(yīng)的DNA產(chǎn)物分開，由此確定所說的DNA分子的至少一部分核苷酸堿基序列。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所說的DNA聚合酶是熱穩(wěn)定性DNA聚合酶且測(cè)序在大于50℃溫度下進(jìn)行。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所說的DNA聚合酶是熱穩(wěn)定性DNA聚合酶且測(cè)序在大于60℃溫度下進(jìn)行。
18.權(quán)利要求17的方法，其中該熱穩(wěn)定性DNA聚合酶選自由水生棲熱菌，嗜熱棲熱菌，黃棲熱菌，甾類嗜熱芽孢桿菌，海濱熱球菌和強(qiáng)烈火球菌編碼的DNA聚合酶。
19.權(quán)利要求15至17中任一權(quán)項(xiàng)的方法，其中該DNA聚合酶對(duì)脫氧核苷酸和雙脫氧核苷酸的區(qū)分程度小于100倍。
20.權(quán)利要求15至17中任一權(quán)項(xiàng)的方法，其中該DNA聚合酶對(duì)脫氧核苷酸和雙脫氧核苷酸的區(qū)分程度小于50倍。
21.權(quán)利要求15至20中任一權(quán)項(xiàng)的方法，其中該DNA聚合酶的外切酶活性小于1000單位每毫克聚合酶。
22.一種DNA測(cè)序試劑盒，其包含一種被修飾的DNA聚合酶，它經(jīng)修飾后與相應(yīng)天然存在的DNA聚合酶相比，摻入雙脫氧核苷酸的能力提高至少20倍；和測(cè)序所必需的一種試劑，它選自dITP，鏈終止劑，deaza-GTP和含錳化合物。
23.一種對(duì)DNA一條鏈測(cè)序的方法，其包括如下步驟提供與能與該鏈雜交的引物雜交的DNA鏈，得到雜交混合物，將該雜交混合物與一種或多種脫氧核苷三磷酸，一種經(jīng)修飾與相應(yīng)天然存在的DNA聚合酶相比摻入雙脫氧核苷酸的能力增強(qiáng)的被修飾的DNA聚合酶和第一鏈終止劑共溫育，其中DNA聚合酶使該引物延伸以形成一系列第一DNA產(chǎn)物，產(chǎn)物的差別在于延伸的引物的長(zhǎng)度，各第一DNA產(chǎn)物在其延伸的末端都有一個(gè)所說的鏈終止劑，并且對(duì)于長(zhǎng)度差別不大于20個(gè)堿基的基本上所有DNA產(chǎn)物的每個(gè)第一DNA產(chǎn)物的分子數(shù)近乎相同，在所說的雜交混合物中還提供第二鏈終止劑，其濃度與第一鏈終止劑不同，其中該DNA聚合酶生產(chǎn)出第二系列的第二DNA產(chǎn)物，產(chǎn)物的差別在于延伸的引物的長(zhǎng)度，各第二DNA產(chǎn)物在其延伸的末端都有第二鏈終止劑，對(duì)于相互之間長(zhǎng)度差別在1和20個(gè)殘基之間的基本上所有第二DNA產(chǎn)物的每個(gè)第二DNA產(chǎn)物的分子數(shù)近乎相同，但跟與第二DNA產(chǎn)物的長(zhǎng)度差別不大于20個(gè)堿基的所有第一DNA產(chǎn)物相比，二者分子數(shù)明顯不同。
24.核酸測(cè)序的方法，其包括(a)將一種寡聚核苷酸引物，待測(cè)序核酸，1至4種脫氧核苷三磷酸，一種經(jīng)修飾與相應(yīng)天然存在的DNA聚合酶相比摻入雙脫氧核苷酸的能力增強(qiáng)的被修飾的DNA聚合酶，以及至少2種不同量的鏈終止劑，在適于該寡聚核苷酸引物延伸以形成與待測(cè)序核酸互補(bǔ)的核酸片段的條件下混合；根據(jù)大小將核酸片段分開；確定核酸序列，其中所說的鏈終止劑依據(jù)引物延伸產(chǎn)物中標(biāo)記物的強(qiáng)度不同而相互不同。
25.一種自動(dòng)DNA測(cè)序儀，其包括一種反應(yīng)器，其含有能從單個(gè)引物和一條DNA鏈形成至少兩個(gè)系列的DNA產(chǎn)物的試劑，其中所說的試劑包括一種經(jīng)修飾與相應(yīng)天然存在的DNA聚合酶相比摻入雙脫氧核苷酸的能力增強(qiáng)的被修飾的DNA聚合酶，各系列的每個(gè)DNA產(chǎn)物的分子量不同但在一端均含有鏈終止劑；分離裝置，可以將所說的DNA產(chǎn)物沿分離器的一條軸分離形成一系列條帶，一系列中的幾乎所有相鄰條帶的強(qiáng)度基本相同，而一系列中的幾乎所有相鄰條帶的強(qiáng)度與其它系列的相鄰條帶的強(qiáng)度不同；條帶閱讀裝置，在沿軸將每條帶分開后確定每條帶的位置與強(qiáng)度；以及計(jì)算裝置，僅根據(jù)沿軸的各帶的位置與強(qiáng)度而不是跟據(jù)分離裝置中可能存在的任何標(biāo)記物的發(fā)射光波長(zhǎng)確定該DNA鏈的DNA序列。
26.一種體外誘變克隆的DNA片段的方法，其包括提供該克隆的片段和一種經(jīng)修飾與相應(yīng)天然存在的DNA聚合酶相比摻入雙脫氧核苷酸的能力增強(qiáng)的被修飾的DNA聚合酶，在適于從該片段合成DNA鏈的條件下將該克隆的片段與該DNA聚合酶接觸，所說的條件使得可以通過摻入一些能與該片段堿基配對(duì)的單個(gè)相鄰的堿基以及一個(gè)不能與該片段堿基配對(duì)的核苷酸堿基形成所說的DNA鏈。
27.一種體外誘變模板DNA片段的方法，其包括提供引物和所述模板，所述引物含有能與該模板上相鄰堿基進(jìn)行堿基配對(duì)的相鄰堿基但至少一個(gè)堿基不與該模板堿基配對(duì)；用一種經(jīng)修飾與相應(yīng)天然存在的DNA聚合酶相比摻入雙脫氧核苷酸的能力增強(qiáng)的被修飾的DNA聚合酶延伸該引物。
28.一種從5′端含一單鏈區(qū)域的線性DNA分子生產(chǎn)平末端雙鏈DNA的方法，其中所述分子的3′端為雙鏈且不含3′突出端，該方法包括將DNA分子與一種經(jīng)修飾與相應(yīng)天然存在的DNA聚合酶相比摻入雙脫氧核苷酸的能力增強(qiáng)的被修飾的DNA聚合酶共溫育，其中該聚合酶作用于單鏈區(qū)域得到平末端雙鏈DNA分子。
29.一種標(biāo)記DNA片段3′末端的方法，其包括將該DNA片段與一種重組DNA生產(chǎn)的經(jīng)修飾與相應(yīng)天然存在的DNA聚合酶相比摻入雙脫氧核苷酸的能力增強(qiáng)的被修飾的DNA聚合酶，以及一種標(biāo)記的脫氧核苷酸在一定條件下共溫育，使得該DNA片段的3′末端被聚合酶延伸，由此通過加入標(biāo)記的脫氧核苷酸而將該DNA片段標(biāo)記。
30.一種擴(kuò)增DNA序列的方法，其包括將第一和第二引物退火到雙鏈DNA序列相對(duì)的兩條鏈上，將退火混合物與一種經(jīng)修飾與相應(yīng)的天然存在的DNA聚合酶相比摻入雙脫氧核苷酸的能力增強(qiáng)的被修飾的DNA聚合酶共溫育，其中第一和第二引物退火到該DNA序列的相對(duì)的鏈上，退火后它們的3′端彼此相向并且待擴(kuò)增的DNA序列位于兩段退火的引物之間。
31.水生棲熱菌DNA聚合酶，其667號(hào)殘基為酪氨酸。
32.大腸桿菌DNA聚合酶I，其762號(hào)殘基為酪氨酸。
33.Pol I型DNA聚合酶，其與大腸桿菌DNA聚合酶762號(hào)殘基類似的位置為酪氨酸殘基。
34.權(quán)利要求33的Pol I型DNA聚合酶，其中所說的位置包括氨基酸序列K N1N2N3N4N5N6N7Y G/Q，其中每個(gè)N為獨(dú)立的任意氨基酸。
35.一種具有序列K N1N2N3N4N5N6Y G的DNA聚合酶α，其中每個(gè)N為獨(dú)立的任意氨基酸，且其中一個(gè)N是突變的，從而得到一種聚合酶，其對(duì)摻入ddNMP的不區(qū)別對(duì)待程度比對(duì)摻入dNMP的大50倍。
36.編碼權(quán)利要求31-35中任一權(quán)項(xiàng)的DNA聚合酶的核酸。
37.一種DNA聚合酶，當(dāng)鎂為所添加的唯一二價(jià)陽(yáng)離子時(shí)，其平均持續(xù)合成能力小于100且對(duì)摻入ddNMP的區(qū)別對(duì)待程度比對(duì)dNMP的小100倍，其中該聚合酶不是逆轉(zhuǎn)錄酶。
38.DNA聚合酶，當(dāng)二價(jià)陽(yáng)離子僅有鎂存在時(shí)其平均持續(xù)合成能力小于50并且對(duì)摻入ddNMP的區(qū)別對(duì)待程度比對(duì)摻入dNMP的小100倍。
39.DNA聚合酶，當(dāng)二價(jià)陽(yáng)離子僅有鎂存在時(shí)其平均持續(xù)合成能力小于50且對(duì)摻入ddNMP的區(qū)別對(duì)待程度比對(duì)摻入dNMP的小5倍。
40.嗜熱性DNA聚合酶，其對(duì)摻入ddNMP的區(qū)別對(duì)待程度比對(duì)摻入dNMP的小100倍。
41.嗜熱性DNA聚合酶，當(dāng)鎂為唯一二價(jià)陽(yáng)離子時(shí)其對(duì)摻入ddNMP的區(qū)別對(duì)待程度比對(duì)摻入dNMP的小100倍。
42.權(quán)利要求41的DNA聚合酶，其平均持續(xù)合成能力小于100。
43.權(quán)利要求42的DNA聚合酶，其從一個(gè)引物-模板到另一引物-模板的循環(huán)多于每5秒一次。
44.編碼權(quán)利要求37-43中任一權(quán)項(xiàng)的聚合酶的核酸。
45.用權(quán)利要求31-35和37-43中任一權(quán)項(xiàng)的DNA聚合酶循環(huán)測(cè)序的方法。
46.在某一位置由酪氨酸替代天然存在的氨基酸的細(xì)胞DNA聚合酶，該位置的替代使得該聚合酶對(duì)ddNMP的區(qū)別對(duì)待程度比對(duì)dNMP的小50倍。
47.權(quán)利要求35的DNA聚合酶α，其在N1至N6中任一處發(fā)生突變，得到的聚合酶摻入ddNMP的效率比非突變的聚合酶的效率至少提高20倍。
48.循環(huán)測(cè)序的方法，其包括在循環(huán)測(cè)序反應(yīng)中提供比4種ddNTP中每一種均過量或等量的4種dNTP，并進(jìn)行循環(huán)測(cè)序反應(yīng)。
49.循環(huán)測(cè)序的方法，其包括在循環(huán)測(cè)序反應(yīng)中提供小于相應(yīng)脫氧核苷酸10倍量的全部4種熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸，并進(jìn)行循環(huán)測(cè)序反應(yīng)。
50.編碼被修飾的DNA聚合酶的被修飾的基因，其中被該修飾的基因經(jīng)修飾使該聚合酶與相應(yīng)天然存在的DNA聚合酶相比，其摻入雙脫氧核苷酸或其它脫氧核苷酸類似物的能力比摻入相應(yīng)脫氧核苷酸的能力增強(qiáng)。
51.被權(quán)利要求50的被修飾的基因編碼的被修飾的DNA聚合酶。
52.一種被修飾的DNA聚合酶，它經(jīng)修飾與相應(yīng)的天然存在的DNA聚合酶相比，摻入雙脫氧核苷酸或其它脫氧核苷酸類似物的能力比摻入相應(yīng)脫氧核苷酸的能力增強(qiáng)。
全文摘要
編碼被修飾的DNA聚合酶的被修飾的基因,其中被修飾的聚合酶與相應(yīng)的天然存在的DNA聚合酶相比,結(jié)合雙脫氧核苷酸的能力比相應(yīng)的脫氧核苷酸至少增強(qiáng)20倍。
文檔編號(hào)C12N9/12GK1170439SQ95196829
公開日1998年1月14日 申請(qǐng)日期1995年10月16日 優(yōu)先權(quán)日1994年10月17日
發(fā)明者S·泰伯, C·C·里查爾德森 申請(qǐng)人:哈佛大學(xué)校長(zhǎng)及研究員協(xié)會(huì)