專利名稱：：組織蛋白酶o2蛋白酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)、核酸和抗體。組織蛋白酶屬于半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶超家族。半胱氨酸或巰基蛋白酶在負(fù)責(zé)蛋白酶解活性的位點(diǎn)有一個(gè)半胱氨酸殘基，以及一個(gè)組氨酸和一個(gè)天冬酰胺。這個(gè)超家族在其氧陰離子洞還有一個(gè)谷氨酰胺。最近的工作涉及到與DNA結(jié)合的半胱氨酸蛋白酶，其具有推斷的轉(zhuǎn)錄因子活性(Xu等，“生物化學(xué)雜志”(J.Biol.Chem.)269(33)21177-21183(1994))，以及作為一種長(zhǎng)期的免疫抑制物(Hamajima等，“寄生物免疫學(xué)”(ParasiteImmunology)16261(1994))。到目前為止，已從許多動(dòng)物中對(duì)很多種組織蛋白酶進(jìn)行了鑒定和測(cè)序。例如，已從大鼠(Petanceska等，“生物化學(xué)雜志”(J.Biol.Chem.)26726038-20643(1992))、牛(Wiederanders等，“歐洲生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)快報(bào)”(FEBSLett.)286189-192(1991))和人(Wideranders等，“生物化學(xué)雜志”(J.Biol.Chem.)26713708-13713(1992)；和Shi等，“生物化學(xué)雜志”(J.Biol.Chem.)2677258-7262(1992))中克隆了組織蛋白酶S。從人、大鼠、小鼠和雞中克隆了組織蛋白酶L(Gal等，“生物化學(xué)雜志”(Biochem.J.)253303-306(1988)；Ishidoh等，“歐洲生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)快報(bào)”(FEBSLett.)22369-73(1987)；Joseph等，“臨床研究雜志”(J.Clin.Invest.)811621-1629(1988)；Ritonja等，“歐洲生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)快報(bào)”(FEBSLett.)283329-331(1991))。組織蛋白酶H從人和大鼠中得到了克隆(Fuchs等，“Hoppe-Seyler生物化學(xué)”(Biol.Chem.Hoppe-Seyler)369-375(1988)；Fuchs等，“核酸研究”(NucleicAcidRes.)179471(1989)；Whittier等，“核酸研究”(NucleicAcidRes.)152515-2535(1987))。從人和小鼠中已克隆了組織蛋白酶B(Ferrara等，“歐洲生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)快報(bào)”(FEBSLett.)273195-199(1990))；Chan等，“美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊”(Proc.Natl.Acad.SciUSA)837721-7725(1986))。最近從免破骨細(xì)胞克隆了半胱氨酸蛋白酶，它與組織蛋白酶L和S結(jié)構(gòu)上相關(guān)(Tezuka等，“生物化學(xué)雜志”(J.Biol.Chem.)269(2)1106(1994))。組織蛋白酶天然地存在于各類組織中。例如，組織蛋白酶L存在于心、腦、胎盤、肺、骨胳肌、腎、肝、睪丸和胰腺組織中。組織蛋白酶S存在于肺、肝、脾和骨胳肌中。組織蛋白酶與許多疾病狀況相關(guān)。例如，從腫瘤中釋放出與組織蛋白酶B和L相似的酶，它們可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。組織蛋白酶L出現(xiàn)在病人滑液和轉(zhuǎn)化的組織中。同樣地，在損傷和炎癥部位觀察到來(lái)自多形核粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的組織蛋白酶B和其他溶酶體蛋白酶的釋放。組織蛋白酶牽涉到關(guān)節(jié)炎，此外還發(fā)現(xiàn)在幾種腫瘤細(xì)胞系中組織蛋白酶的含量異常高。半胱氨酸蛋白酶還被認(rèn)為與骨的重建有關(guān)。骨重建是骨形成和骨吸收相結(jié)合的一個(gè)過(guò)程，是骨生長(zhǎng)的一部分。骨吸收包括胞外基質(zhì)蛋白的脫礦化和降解(Delaisse等，“生物化學(xué)雜志”(Biochem.J.)279167-174(1991))。I型膠原構(gòu)成了有機(jī)基質(zhì)的95％(Krane等，在“科學(xué)的美國(guó)醫(yī)學(xué)”(ScientificAmericanMedicine)，Rubensttein，E.和Federman，D.D.編，Vol.3，“XI骨形成和吸收·15·風(fēng)濕病”(15Rheumatism，XIBoneFormationandResorption)，PP.1-26，ScientificAmerican，Inc.NewYork)。除了中間膠原酶，溶酶體半胱氨酸蛋白酶中的組織蛋白酶B和L也被認(rèn)為與破骨細(xì)胞的骨吸收有關(guān)(Delaisse等，1991，同上)。這兩種酶都存在于溶酶體和酸化的破骨細(xì)胞的胞外吸收腔隙中(Goto等“組織化學(xué)”(Histochemistry)99，411-414(1993))，并且兩種蛋白酶在體外酸性pH下都表現(xiàn)出降解I型膠原的能力(Maciewicz等，“膠原相關(guān)研究”(CollagenRel.Res.)7，295-304(1987)，Delaisse等(1991)，同上)。半胱氨酸蛋白酶抑制劑，如E-64和亮抑蛋白酶肽顯示出能防止破骨細(xì)胞的骨吸收(Delaisse等“骨”(Bone)8，305-313(1987)，Everts等“鈣化組織研究”43，172-178(1988))。組織蛋白酶L被認(rèn)為是骨中與膠原降解相關(guān)的一種主要的蛋白酶(Maciewiecz等“生物化學(xué)雜志”(Biochem.J.)256，433-440(1988)；Kakegawa等”歐洲生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)快報(bào)”(FEBSLett.)321，247-250(1993))。骨質(zhì)的堅(jiān)硬是由于羥基磷灰石和其他的磷酸鈣骨鹽在生理pH下的低溶解度造成的，但在酸性pH下骨會(huì)降解。破骨細(xì)胞是在骨吸收中起關(guān)鍵作用的多核細(xì)胞。破骨細(xì)胞附著在骨表面，在特殊的破骨細(xì)胞界膜和骨基質(zhì)緊密圍成的關(guān)節(jié)內(nèi)產(chǎn)生一個(gè)酸性微環(huán)境，因而可產(chǎn)生骨基質(zhì)的局部溶解。這又加速了脫礦化的骨膠原的蛋白酶解。半胱氨酸蛋白酶的膠原溶解作用被認(rèn)為優(yōu)先產(chǎn)生于pH3.5-4.5左右、靠近皺緣的骨吸收腔隙的酸性最強(qiáng)部分，而含Zn膠原酶在位于脫礦化和礦化基質(zhì)之間界面的中性環(huán)境中較為活躍(Delaisse等，同上，(1991))。除了組織蛋白酶L和B之外，在膠原溶解性骨降解中還有許多組織蛋白酶L和B類似的作用參加。Page等(“生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào)”(Biochim.Biophys.Acta)1116，57-66(1992))從破骨細(xì)胞瘤中分離到組織蛋白酶B的多種形式，它們最適pH為酸性，并能降解可溶的和不可溶的I型膠原。Delaisse等，1991(同上)。鑒定了骨組織中一種70KDa的巰基依賴的蛋白酶，它也能降解I型膠原。半胱氨酸蛋白酶抑制劑已被證實(shí)可通過(guò)抑制膠原纖維的降解而抑制破骨細(xì)胞的骨吸收。組織蛋白酶B、L、N和S能在酸性pH條件下降解I型膠原。已從小鼠顱蓋中分離到三種組織蛋白酶型的蛋白酶推斷的組織蛋白酶B和L，以及一種類組織蛋白酶L蛋白酶(Delaisse等，“生物化學(xué)雜志”(Biochem.J.)279167(1991))。但至于破骨細(xì)胞實(shí)際產(chǎn)生的是什么樣的半胱氨酸蛋白酶仍不清楚。最近有幾個(gè)研究小組獨(dú)立克隆了編碼一種新的人半胱氨酸蛋白酶的cDNA(Shi等“歐洲生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)快報(bào)”(FEBSLett.)357，129-134(1995)，Inaoka等“生物化學(xué)與生物物理研究通訊”(Biochem.Biophys.Res.Commun.)206，89-96(1995)；Bromme和Okamoto，“Hoppe-Seyler生物化學(xué)”376，379-384(1995))，并且分別命名為組織蛋白酶O、組織蛋白酶K和組織蛋白酶O2。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一類新的重組組織蛋白酶——組織蛋白酶O2和其變體，以及用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生有用量的組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供編碼組織蛋白酶O2蛋白的重組核酸，以及含有編碼這種組織蛋白酶O2蛋白的核酸的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目的是為組織蛋白酶O2存在的檢測(cè)和與組織蛋白酶O2相關(guān)疾病的診斷，提供多克隆抗體和單克隆抗體。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供生產(chǎn)組織蛋白酶O2蛋白的方法。根據(jù)前述目的，本發(fā)明提供了重組的組織蛋白酶O2蛋白，以及編碼本發(fā)明組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)的分離的或重組的核酸。本發(fā)明還提供了包括編碼組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)的DNA的表達(dá)載體和含有這些表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其中所述編碼組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)的DNA可操作地連接到轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)DNA上。本發(fā)明的其他方面提供了生產(chǎn)組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)的方法，其中包括培養(yǎng)用一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化過(guò)的宿主細(xì)胞，使編碼這一組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)的核酸進(jìn)行表達(dá)，以產(chǎn)生重組的組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)。本發(fā)明還有一個(gè)方面是提供組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)的多克隆抗體和單克隆抗體。圖1A和1B示人組織蛋白酶O2cDNA的核苷酸序列(序列1)和推斷的氨基酸序列(序列2)。氨基酸序列(序列2)以單個(gè)字母密碼列于核苷酸序列(序列1)下面。活性位點(diǎn)的殘基(C25，H159和N175；以木瓜蛋白酶編號(hào))用黑體表示，潛在的N-糖基化位點(diǎn)下劃線一次。箭頭指示的是位于前信號(hào)(presignal)和原區(qū)域(proregion)之間以及位于原區(qū)域和成熟酶之間的推定的翻譯后切割位點(diǎn)。通過(guò)蛋白質(zhì)測(cè)序驗(yàn)證位于原區(qū)域和成熟蛋白之間的切割(雙劃線)。圖2A和2B示人的組織蛋白酶O2(序列2)同人組織蛋白酶S(序列4)和L(序列5)和兔0C2(序列3)的多個(gè)氨基酸序列比較。*為活性位點(diǎn)殘基；黑體打印的為木瓜蛋白酶家族中所有已知半胱氨酸蛋白酶中保守的殘基。在所有6種蛋白酶中相同的氨基酸用大寫字母在共有序列中指出，而6種蛋白酶中有5種相同的氨基酸用小寫字母表示?？杖碧幰赃B字符表示。數(shù)字指每一行中最后一個(gè)氨基酸的位置，箭頭示推斷的翻譯后的酶切位點(diǎn)。圖3示原組織蛋白酶O2與胃蛋白酶一起的成熟。將含原組織蛋白酶O2的小份培養(yǎng)物上清液同胃蛋白酶(0.4mg/ml)一起在40℃下溫育于pH4.0的100mM乙酸鈉緩沖液中。加入樣品緩沖液以終止溫育，消化時(shí)間如圖所示，分子量標(biāo)準(zhǔn)(KDa)示于左側(cè)。圖4示純化的重組人組織蛋白酶O2的SDS-PAGE(考馬斯藍(lán)染色)。泳道1，粗提的Sf9組份；泳道2，經(jīng)過(guò)n-丁基快速流；泳道3，經(jīng)MonoS，分子量標(biāo)準(zhǔn)示于右側(cè)泳道。圖5示重組人組織蛋白酶O2的pH活性曲線。Kcat/Km值是通過(guò)測(cè)定Z-FR-MCA水解的起始速度，并除以酶和底物的濃度而獲得。圖6示用組織蛋白酶O2、S、L和B水解Z-X-R-MCA的Kcat/Km值(使標(biāo)準(zhǔn)化至最佳底物＝1)。組織蛋白酶O2(Z-LR-MCA)257,900M-1s-1；組織蛋白酶S(Z-LR-MCA)243,000M-1s-1；組織蛋白酶L(Z-FR-MCA)5,111,000M-1s-1；組織蛋白酶B(Z-FR-MCA)460,000M-1s-1(組織蛋白酶S，L和B的資料來(lái)自Bromme等，1994)。圖7示重組的人組織蛋白酶O2的彈性蛋白水解活性在pH4.5、5.5和7.0下與組織蛋白酶S和L以及胰彈性蛋白酶相比較。底物為3H標(biāo)記的不溶性彈生蛋白。圖8示在破骨細(xì)胞瘤制劑中人組織蛋白酶O2、L和S的Northern印跡分析。泳道1，患者(纖維性和細(xì)胞組織)；泳道2，患者2(細(xì)胞組織)；泳道3，患者2(纖維性組織)。用32P標(biāo)記的人組織蛋白酶O2、L和S的探針進(jìn)行硝酸纖維素雜交。圖9A和9B示用重組的人組織蛋白酶O2、L和牛胰蛋白酶消化的I型膠原(可溶性小牛皮膠原)的SDS-PAGE。圖9A膠原酶活性用人的組織蛋白酶O2，S和L(各50nM)在28℃，pH4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0下消化可溶性小牛皮膠原12小時(shí)。加入10μM的E-64終止反應(yīng)。未經(jīng)處理的可溶性膠原作為標(biāo)準(zhǔn)(S)。圖9B明膠酶活性用人組織蛋白酶O2(0.1nM)、組織蛋白酶L(0.2nM)和人組織蛋白酶S(1nM)在28℃，pH4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0下消化變性(70℃下加熱10分鐘)的可溶性小牛皮膠原。分子量標(biāo)準(zhǔn)如左側(cè)泳道所示。圖10示人組織蛋白酶O2原初部分純化的SDS-PAGE。圖11A、11B、11C、11D、11E、11F、11G、11H、11I、11J、11K和11L示人體組織中人組織蛋白酶O2的免疫組織化學(xué)染色。(A)破骨細(xì)胞瘤，(B)肺巨噬細(xì)胞，(C)細(xì)支氣管，(D)子宮內(nèi)膜，(E)胃，(F)結(jié)腸，(G)腎，(H)胎盤，(I)肝，(J)卵巢，(K)腎上腺，(L)睪丸。本發(fā)明提供了新的人組織蛋白酶O2蛋白和核酸。本發(fā)明的人組織蛋白酶O2蛋白可通過(guò)幾種方法鑒定。組織蛋白酶O2核酸或組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)最初是以核酸和/或氨基酸序列與圖1所示序列的大致同源性來(lái)確定的，這一同源性可依照總的核酸序列或氨基酸序列。本發(fā)明的組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)與其他組織蛋白酶相比同源性有限。例如，成熟的人組織蛋白酶O2與成熟的人組織蛋白酶L之間同源性約為59％，與成熟的人組織蛋白酶S的同源性為58％，與成熟的人組織蛋白酶B的同源性為26％，與成熟的人組織蛋白酶H的同源性為47％。此外，人組織蛋白酶O2的原初部分與人組織蛋白酶L原始部分的同源性為38％，與人組織蛋白酶S原始部分的同源性為51％，與人組織蛋白酶B原初部分的同源性為13％，與人組織蛋白酶H原初部分的同源性為23％。另外，人組織蛋白酶O2蛋白與兔破骨細(xì)胞蛋白質(zhì)的同源性大約為90％。在此，如果一種蛋白質(zhì)的序列與圖1所示的氨基酸序列相比總的同源性優(yōu)選大于90％，更優(yōu)選地大于95％，和最優(yōu)選地大于98％時(shí)，這種蛋白質(zhì)即為“組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)”。這一同源性將用本領(lǐng)域所知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行測(cè)定，如按Devereux等在“核酸研究”(Nucl.AcidRes.)12387-395(1984)中所述的“最適”(BestFit)測(cè)序方案。序列的比較包括在所要比較的序列中引入空缺。此外，對(duì)于含有比圖1所示蛋白質(zhì)多或少的氨基酸的序列，同源性百分比被理解為同源性氨基酸數(shù)目相對(duì)于氨基酸總數(shù)的百分比。因此，例如對(duì)于以下討論的短于圖1所示序列的同源性，將根據(jù)較短一段序列的數(shù)目確定。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)為人的組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)。本發(fā)明的組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)可短于圖1所示的氨基酸序列。如實(shí)施例2所示，人組織蛋白酶O2蛋白可經(jīng)過(guò)與組織蛋白酶B和S及木瓜蛋白酶相似的翻譯后加工(Bromme等“生物化學(xué)雜志”(J.Biol.Chem.)2684832-4838(1993)；Vernat等“生物化學(xué)雜志”(J.Biol.Chem)26621451-21457(1991)；和Rowan等“生物化學(xué)雜志”(J.Biol.Chem.)26715993-15999(1992))。組織蛋白酶O2蛋白以早期原蛋白形式生成，含有一段常有的前序列，一段原序列或“原初部分”和成熟序列。這些包括前、原和成熟的編碼序列的人組織蛋白酶O2示于圖1。前序列包括圖1中所示的序列中頭15個(gè)氨基酸，原始部分為第16氨基酸至第114氨基酸(98個(gè)氨基酸)，而成熟蛋白則從115位至329位(215個(gè)氨基酸)。原序列或原初部分被假定作為該酶的抑制劑，直至該酶被激活，很可能是由于pH值變化的結(jié)果。對(duì)木瓜蛋白酶(Vernet等，同上)、組織蛋白酶S和組織蛋白酶L來(lái)說(shuō)原初部分的蛋白酶解過(guò)程是自我蛋白酶解。組織蛋白酶O2的定義包括前原組織蛋白酶O2、原組織蛋白酶O2、成熟組織蛋白酶O2和獨(dú)立于成熟組織蛋白酶O2的原初部分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，圖1所示序列的部分或片段也包括在組織蛋白酶O2蛋白的定義范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施例中片段的長(zhǎng)度范圍為40-200個(gè)氨基酸，優(yōu)選的片段是與Tezuka等在同上文獻(xiàn)中所述的兔破骨細(xì)胞蛋白質(zhì)不一致，而與人組織蛋白酶O2蛋白至少有95-98％同源性。在優(yōu)選的實(shí)施例中，當(dāng)組織蛋白酶O2蛋白用于產(chǎn)生抗體，如用于診斷目的抗體時(shí)，組織蛋白酶O2蛋白必須與圖1所示的原初部分或成熟蛋白至少有一個(gè)共同表位或決定簇。“表位”或“決定簇”在此指一個(gè)蛋白質(zhì)的一個(gè)部分，它能產(chǎn)生和結(jié)合一個(gè)抗體。因此，在多數(shù)情況下，對(duì)應(yīng)于一個(gè)較小的組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗體能夠結(jié)合到全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)上。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，抗體是對(duì)應(yīng)于一個(gè)獨(dú)特的表位而產(chǎn)生，即該抗體對(duì)其他的蛋白質(zhì)，如其他的組織蛋白酶蛋白質(zhì)或其他生物的組織蛋白酶不表現(xiàn)交叉反應(yīng)或交叉反應(yīng)很弱。對(duì)于核酸，核酸序列總的同源性與氨基酸同源性相當(dāng)，但要考慮遺傳密碼的簡(jiǎn)并和不同生物的密碼子偏倚。因此核酸序列的同源性可能會(huì)低于或高于蛋白質(zhì)序列的同源性。因此與圖1核酸序列相比，核酸序列的同源性優(yōu)選為大于65％，更優(yōu)選為大于75％，最優(yōu)選為大于85％。在一些實(shí)施例中同源性能高達(dá)約95％至98％或99％。在一個(gè)實(shí)施例中，核酸的同源性是通過(guò)雜交試驗(yàn)而測(cè)定的。例如，與圖1核酸序列在高度嚴(yán)緊條件下雜交的核酸被認(rèn)為是組織蛋白酶O2基因。高度嚴(yán)緊的條件通常是0.1×SSC，37～65℃。在另一個(gè)實(shí)施例中應(yīng)用了不甚嚴(yán)緊的雜交條件，例如減弱的嚴(yán)緊條件通常為2×SSC和0.1％SDS。本發(fā)明組織蛋白酶O2蛋白和核酸優(yōu)選為重組體。在此使用的“核酸”可指DNA或RNA，或者同時(shí)含有脫氧-和核糖核苷酸的分子。核酸包括基因組DNA、cDNA和寡核苷酸，包含有義和反義核酸。特別是反義核酸包括在核酸的定義內(nèi)。反義核酸會(huì)同圖1所示核酸序列的相應(yīng)的非編碼鏈雜交，但可能會(huì)含有核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸。通常反義核酸有防止mRNA表達(dá)的功能，這樣使組織蛋白酶O2蛋白不能產(chǎn)生。核酸可以是雙鏈、單鏈，或含有部分雙鏈或單鏈的序列。“重組核酸”在此指用內(nèi)切核酸酶。通過(guò)核酸操作在體外最初形成的核酸，這在自然界中是一種不常見的形式。因此，一個(gè)分離的線性的組織蛋白酶O2蛋白基因，或者通過(guò)連接正常情況下不結(jié)合在一起的DNA分子而在體外形成的表達(dá)載體，這兩者都被認(rèn)為是用于本發(fā)明目的重組體。人們了解，一旦構(gòu)建了重組的核酸并且再被導(dǎo)入宿主細(xì)胞或生物體，它將非重組地復(fù)制，即利用縮主細(xì)胞體內(nèi)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)而非體外操作。但是這些核酸盡管隨后是非重組復(fù)制，但曾經(jīng)是以重組產(chǎn)生而來(lái)，因而仍然認(rèn)為是用于本發(fā)明目的的重組體。同樣地，“重組蛋白”是用重組技術(shù)產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，即按上面所示方法通過(guò)重組核酸的表達(dá)而產(chǎn)生。重組蛋白質(zhì)至少在一個(gè)或多個(gè)特征上區(qū)別于天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。例如，蛋白質(zhì)可從與該蛋白正常相關(guān)聯(lián)的其野生型宿主中的蛋白質(zhì)和化合物中的一部分或全部中分離出來(lái)。因此，例如那些大致或部分純化的或者沒(méi)有細(xì)胞時(shí)存在的組織蛋白酶O2蛋白被認(rèn)為是重組體。這一定義包括從一種不同生物或宿主細(xì)胞中所含的一種生物中產(chǎn)生組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)?；蛘咄ㄟ^(guò)采用可誘導(dǎo)啟動(dòng)子或高表達(dá)啟動(dòng)子可以產(chǎn)生顯著高于通常所見到濃度的蛋白質(zhì)，這樣生成的蛋白質(zhì)濃度增加?；蛘叩鞍踪|(zhì)會(huì)成為自然界中不常見的一種形式，因?yàn)樵黾恿吮砦粯?biāo)記或者是氨基酸替代、插入和缺失。組織蛋白酶O2蛋白的范圍還包括其他生物的組織蛋白酶O2蛋白，其克隆和表達(dá)概括如下。關(guān)于反義核酸，其定義為與圖1所示的相應(yīng)的非編碼序列全部或部分雜交的核酸。通常用于測(cè)定反義雜交的雜交條件是高度嚴(yán)緊的條件，如在0.1×SSC，65℃下。一旦確定了組織蛋白酶O2蛋白的核酸，就可對(duì)其克隆，并且必要時(shí)可將其組成部分進(jìn)行重組而形成整個(gè)組織蛋白酶O2蛋白的核酸。一旦從天然來(lái)源分離到，如包含在一個(gè)質(zhì)粒中或其他載體中，或者以線性核酸片段的形式從載體中切下來(lái)，那么這一重組的組織蛋白酶O2蛋白的核酸可進(jìn)一步作為探針，鑒定和分離其他組織蛋白酶O2蛋白的核酸。也可將其作為“前體”核酸，以產(chǎn)生經(jīng)修飾的或異體的組織蛋白酶O2蛋白的核酸和蛋白質(zhì)。用編碼組織蛋白酶O2蛋白的本發(fā)明的核酸，構(gòu)建了各種不同的表達(dá)載體。這些表達(dá)載體既可以是自我復(fù)制的染色體外的載體，也可以是整合到宿主基因組的載體。通常這些表達(dá)載體包括轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)核酸，這些核酸可操作地連接編碼組織蛋白酶O2蛋白的核酸?！翱刹僮鞯剡B接”在上下文中指轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)DNA，相對(duì)于組織蛋白酶O2蛋白所處的位置使轉(zhuǎn)錄處于起始。通常，這意味著啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始或起始序列位于組織蛋白酶O2蛋白編碼區(qū)的5′端。轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)核酸通常對(duì)用于表達(dá)組織蛋白酶O2蛋白的宿主細(xì)胞是合適的，例如，芽孢桿菌屬(Bacillus)的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)核酸序列可用于在芽孢桿菌中表達(dá)組織蛋白酶O2蛋白。很多類型合適的表達(dá)載體和適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列為本領(lǐng)域所知，可用于各種宿主細(xì)胞。一般地，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列可包括，但不限于啟動(dòng)子序列、前導(dǎo)或信號(hào)序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強(qiáng)子或激活序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，調(diào)節(jié)的序列包括一個(gè)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始和終止序列。啟動(dòng)子序列編碼組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子既可以是自然出現(xiàn)的啟動(dòng)子，也可以是雜合啟動(dòng)子。結(jié)合多于一種啟動(dòng)子因子的雜合啟動(dòng)子，也為本領(lǐng)域所知，也可用于本發(fā)明。此外，表達(dá)載體可含有其他因子。例如，表達(dá)載體可有兩個(gè)復(fù)制系統(tǒng)，因而可使其維持在兩個(gè)生物體中。例如在哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，而在原核宿主中克隆和擴(kuò)增。而且，對(duì)于整合性表達(dá)載體，這種表達(dá)載體至少含有一個(gè)與宿主細(xì)胞基因組同源的序列，優(yōu)選為兩個(gè)同源序列位于表達(dá)結(jié)構(gòu)的旁側(cè)。這種整合載體可以通過(guò)為載體中內(nèi)含物選擇適當(dāng)?shù)耐葱蛄卸拐陷d體引導(dǎo)到宿主細(xì)胞中特定位點(diǎn)。用于整合載體的結(jié)構(gòu)為本領(lǐng)域所熟知。此外，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，表達(dá)載體含一個(gè)可選擇的標(biāo)記基因，以便于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的篩選。選擇基因?yàn)楸绢I(lǐng)域所熟知，并隨所用的宿主細(xì)胞的不同而變化。本發(fā)明的組織蛋白酶O2蛋白的產(chǎn)生，是通過(guò)培養(yǎng)用含有編碼組織蛋白酶O2蛋白的核酸的一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)的，培養(yǎng)是在能誘導(dǎo)或?qū)е陆M織蛋白酶O2蛋白的表達(dá)的適當(dāng)條件下進(jìn)行。適合于組織蛋白酶O2蛋白表達(dá)的條件將隨表達(dá)載體和宿主細(xì)胞選擇的不同而不同，很容易為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)而確定。例如，在表達(dá)載體中用組成型啟動(dòng)子需要使宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖最優(yōu)化，而采用一種誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子則需要適合于誘導(dǎo)的生長(zhǎng)條件。此外，在一些實(shí)施例中，收獲的時(shí)間是重要的。例如，在昆蟲細(xì)胞表達(dá)中所用的桿狀病毒系統(tǒng)是裂解性病毒，因而收獲時(shí)間的選擇對(duì)產(chǎn)物的得率是關(guān)鍵性的。合適的宿主細(xì)胞包括酵母、細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌、昆蟲和動(dòng)物細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞。使人特別感興趣的是黑腹果蠅(Drosophilamelangaster)細(xì)胞、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和其他酵母、大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、SF9細(xì)胞、C129細(xì)胞、293細(xì)胞、鏈孢霉屬(Neurospora)、BHK、CHO、COS、HeLa細(xì)胞和永生化的哺乳動(dòng)物骨髓和淋巴細(xì)胞系。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)，細(xì)菌的表達(dá)系統(tǒng)為本領(lǐng)域所熟知。合適的細(xì)菌啟動(dòng)子是能夠結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶，并能將組織蛋白酶O2蛋白的編碼序列在下游(3’)起始轉(zhuǎn)錄成mRNA的任意核酸序列。細(xì)菌啟動(dòng)子通常在位于接近編碼序列5′端有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。這一轉(zhuǎn)錄起始區(qū)典型的包括一個(gè)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。編碼代謝途徑酶的序列提供特別有用的啟動(dòng)子序列。例子包括來(lái)源于糖代謝酶的啟動(dòng)子序列，如半乳糖、乳糖和麥芽糖，以及來(lái)自生物合成酶的序列，如色氨酸。來(lái)源于噬菌體的啟動(dòng)子也可以應(yīng)用，并且為本領(lǐng)域所知。此外，合成的啟動(dòng)子和雜合啟動(dòng)子也是有用的，例如tac啟動(dòng)子是trp和lac啟動(dòng)子序列的雜合體。而且，一種細(xì)菌啟動(dòng)子能包括自然產(chǎn)生的非細(xì)菌來(lái)源的啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子能結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶并起始轉(zhuǎn)錄。除了具功能的啟動(dòng)子序列，還需要一個(gè)有效的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。在大腸桿菌(E.coli)中，核糖體的結(jié)合位點(diǎn)稱為Shine-Delgarno(SD)序列，它包括一個(gè)起始密碼子和一段位于起始密碼子上游3-11個(gè)核苷酸處的長(zhǎng)度為3-9個(gè)核苷酸的序列。表達(dá)載體也可以包括一段信號(hào)肽序列，該序列能使組織蛋白酶O2蛋白在細(xì)菌中分泌。這一信號(hào)序列典型地編碼一段由疏水氨基酸組成的信號(hào)肽，該信號(hào)肽引導(dǎo)蛋白質(zhì)從細(xì)胞中分泌，這一點(diǎn)為本
技術(shù)領(lǐng)域：
所熟知。蛋白質(zhì)或者分泌到生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中(革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)，或者分泌到位于細(xì)胞內(nèi)膜和外膜之間的壁膜間隙中(革蘭氏陰性細(xì)菌)。細(xì)菌的表達(dá)載體也可以包括一個(gè)選擇標(biāo)記基因，以便于選擇經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌菌株。合適的選擇基因包括使細(xì)菌對(duì)藥物，如氨芐青霉素、氯霉素、紅霉素、卡那霉素、新霉素、四環(huán)素產(chǎn)生抗性的基因。選擇標(biāo)記也包括生物合成基因，如組氨酸、色氨酸、和亮氨酸生物合成途徑中的基因。這些組成部分被裝配到表達(dá)載體中。用于細(xì)菌的表達(dá)載體為本領(lǐng)域所熟知，包括用于枯草桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(E.coli)、奶油色鏈球菌(Streptococcuscremoris)、變鉛青鏈球菌(Streptococcuslividans)和其他的一些載體。細(xì)菌的表達(dá)載體被轉(zhuǎn)化入細(xì)菌宿主細(xì)胞是采用本
技術(shù)領(lǐng)域：
所熟知的技術(shù)，如氯化鈣處理、電穿孔法及其他方法。在一個(gè)實(shí)施例中，組織蛋白酶O2蛋白生成于昆蟲細(xì)胞中。用于昆蟲細(xì)胞轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體，特別是基于桿狀病毒的表達(dá)載體是本領(lǐng)域所熟知的。簡(jiǎn)要地說(shuō)，桿狀病毒是一種能大量產(chǎn)生其外殼蛋白的很大的DNA病毒。由于桿狀病毒基因組大小的原因，外源基因必須通過(guò)重組置于病毒基因組中。因此，這一表達(dá)系統(tǒng)的組成包括一個(gè)轉(zhuǎn)移載體，它通常是細(xì)菌質(zhì)粒，同時(shí)含有桿狀病毒基因組的一個(gè)片段和一個(gè)用于插入組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)的方便的限制性酶切位點(diǎn)；一種野生型的桿狀病毒，它帶有一段與轉(zhuǎn)移載體中桿狀病毒特異性片段同源的序列(這使得異源基因能同源重組到桿狀病毒基因組中)；以及合適的昆蟲宿主細(xì)胞和生長(zhǎng)培養(yǎng)基。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)也為本領(lǐng)域所知，并且應(yīng)用于一個(gè)實(shí)施例中。哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子是能夠結(jié)合哺乳動(dòng)物RNA聚合酶，并能將組織蛋白酶O2蛋白的編碼序列在下游(3′)起始轉(zhuǎn)錄成mRNA的任意DNA序列啟動(dòng)子將含有一個(gè)通常位于靠近編碼序列5′端的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，和位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游25-30bp處的一個(gè)TATA框。TATA框被認(rèn)為是引導(dǎo)RNA聚合酶II在正確的位點(diǎn)開始RNA合成。一個(gè)哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子也含有一個(gè)上游啟動(dòng)子因子，通常位于TATA框上游100-200bp之內(nèi)的部分。上游啟動(dòng)子因子決定轉(zhuǎn)錄起始的速率，它能以任意方向起作用。作為哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子特別有用的是來(lái)源于哺乳動(dòng)物病毒基因的啟動(dòng)子，因?yàn)椴《净虺３楦弑磉_(dá)的，并且宿主范圍廣。實(shí)施例中包括了SV40早期啟動(dòng)子、小鼠乳房腫瘤病毒LTR啟動(dòng)子、腺病毒主要后期啟動(dòng)子和單純皰疹病毒啟動(dòng)子。通常，被哺乳動(dòng)物細(xì)胞識(shí)別的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列是位于翻譯終止密碼子3′端的調(diào)節(jié)區(qū)，因而這些序列連同啟動(dòng)子因子一起位于編碼序列的旁側(cè)。成熟mRNA的3′末端是通過(guò)位點(diǎn)特異性翻譯后切割和聚腺苷酸化而形成的。轉(zhuǎn)錄終止子和聚腺苷酸化信號(hào)的例子包括那些源于SV40的終止子和信號(hào)。將外源核酸引入哺乳動(dòng)物宿主和其他宿主的方法，為本領(lǐng)域所熟知，并且會(huì)隨所用宿主細(xì)胞不同而不同。這些技術(shù)包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、polybrene(1，5二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔法、脂質(zhì)體中多核苷酸膠囊化和將DNA直接顯微注射入核。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，組織蛋白酶O2蛋白生成于酵母細(xì)胞內(nèi)。酵母的表達(dá)系統(tǒng)在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，包括用于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、白色念球菌(Candidaalbicans)和麥芽糖假絲酵母(C.maltosa)、多形漢遜氏酵母(Hansenulapolymorpha)、脆壁克魯維氏酵母(Kluyveromycesfragilis)和乳克魯維氏酵母(K.1actis)、季也蒙氏畢赤氏酵母(Pichiaguillerimondii)和巴斯德畢赤氏酵母(P.pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和Yarrowialipoltica的表達(dá)載體。用于在酵母中表達(dá)的優(yōu)選啟動(dòng)子序列包括誘導(dǎo)型的GAL1，10啟動(dòng)子、來(lái)自醇脫氫酶、烯醇化酶、葡糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶和酸性磷酸酶基因的啟動(dòng)子。酵母選擇標(biāo)記包括ADE2、HIS4、LEU2、TRP1和能產(chǎn)生衣霉素抗性的ALG7；能產(chǎn)生抗G418的G418抗性基因；能使酵母生長(zhǎng)在有銅離子環(huán)境中的CUP1基因。一種重組的組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或分泌。組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)也可以用本領(lǐng)域所熟知的技術(shù)制成融合蛋白。因此，假如所需的表位很小時(shí)，可將組織蛋白酶O2蛋白質(zhì)與一個(gè)載體蛋白融合而形成一個(gè)免疫原?；蛘邔⒔M織蛋白酶O2蛋白制成融合蛋白以增加表達(dá)或者為其他的原因。包括在本發(fā)明的組織蛋白酶O2蛋白限定范圍內(nèi)的還有氨基酸序列的變體。這些變體屬于三類中的一種或多種取代、插入或缺失的變體。這些變體通常是在編碼組織蛋白酶O2蛋白的DNA中，通過(guò)位點(diǎn)特異性核苷酸誘變而制得的，是采用本領(lǐng)域熟知的盒式誘變或其他技術(shù)產(chǎn)生編碼變體的DNA，隨后如上面所概述的在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)DNA。但含有多至約100-150個(gè)殘基的變異的組織蛋白酶O2蛋白片段，可采用已建立的技術(shù)在體外合成而制得。氨基酸序列變體的特點(diǎn)是變體的預(yù)定性質(zhì)，這一特點(diǎn)使它們與組織蛋白酶O2蛋白氨基酸序列自然產(chǎn)生的等位變異或種間變異區(qū)分開來(lái)。變體通常表現(xiàn)出與自然產(chǎn)生類似物有相同性質(zhì)的生物學(xué)活性，盡管變體也是可以選擇的，它們具有修飾過(guò)的特性。這一點(diǎn)以下將作更全面的概述。雖然引入氨基酸序列變異的一個(gè)位點(diǎn)或區(qū)域是預(yù)定的，但突變本身則無(wú)需預(yù)定。例如，為了優(yōu)化在某一特定位點(diǎn)突變的性能，在一個(gè)靶密碼子或靶區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)誘變，并篩選表達(dá)的組織蛋白酶O2蛋白變體，作為所需活性的最優(yōu)化結(jié)合。在已知序列的DNA中預(yù)定位點(diǎn)產(chǎn)生取代突變的技術(shù)是熟知的，例如M13引物誘變。篩選突變體是采用組織蛋白酶O2蛋白活性的測(cè)定來(lái)進(jìn)行的；例如可將純化的或部分純化的組織蛋白酶O2用于如實(shí)施例中所述的動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，以測(cè)定氨基酸取代、插入或缺失的影響?；蛘呷绱宋乃沂镜?，將突變的組織蛋白酶O2基因置于組織蛋白酶O2缺失株中，并測(cè)定組織蛋白酶O2活性。對(duì)于某一基因序列的缺失株的產(chǎn)生，是本
技術(shù)領(lǐng)域：
所知的。氨基酸的取代典型的為單個(gè)殘基；插入通常在大約1～20個(gè)氨基酸，盡管也可以是相當(dāng)大的插入。缺失的范圍約為1～30個(gè)殘基，雖然在有些情況下也允許更大的缺失，例如當(dāng)組織蛋白酶O2蛋白的原序列或成熟部分缺失時(shí)。此外，如上所述，用組織蛋白酶O2蛋白很小的片段產(chǎn)生抗體是可能的。取代、缺失、插入或它們?nèi)我獾慕Y(jié)合可用于獲得一個(gè)最終的衍生物。通常這種變化出現(xiàn)在幾個(gè)氨基酸上，以盡量減少分子的改變。但在某些情況下較大的變化是可以允許的。當(dāng)需要對(duì)組織蛋白酶O2蛋白的特性作小的改變時(shí)，通常按下列圖表進(jìn)行取代圖表1原始?xì)埢纠匀〈鵄laSerArgLysAsnGln，HisAspGluCysSerGlnAsnGluAspGlyProHisAsn，GlnIleLeu，ValLeuIle，ValLysArg，Gln，GluMetLeu，IlePheMet，Leu，TyrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp，PheValIle，Leu功能上或免疫學(xué)特性的重大變化是通過(guò)選擇比圖I所示的取代基保守性較小的取代基而實(shí)現(xiàn)的。例如，可以進(jìn)行取代使其更顯著地影響改變區(qū)域的多肽骨架結(jié)構(gòu)，如α-螺旋或β-折疊結(jié)構(gòu)；靶位點(diǎn)分子的電荷或疏水性；或者側(cè)鏈的體積。通常對(duì)多肽性質(zhì)會(huì)產(chǎn)生最大變化的是這樣一些取代(a)親水性殘基，如由絲氨?；蛱K氨酰取代了疏水性殘基，如亮氨酰、異亮氨酰、苯丙氨酰、纈氨?；虮滨?或被其取代)；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代了任何其他的殘基(或被其取代)；(c)帶正電荷側(cè)鏈的殘基，如賴氨酰、精氨酰或組氨酰取代了帶負(fù)電荷的殘基，如谷氨?；蛱於滨?或被其取代)；或者(d)含有一個(gè)大的側(cè)鏈的殘基，如苯丙氨酸，取代了不帶側(cè)鏈的殘基，如甘氨酸(或被其取代)。雖然變體也是被選擇來(lái)按所需修飾多肽的特性，但變體通常表現(xiàn)出同樣性質(zhì)的生物學(xué)活性，并且同天然形成的類似物一樣會(huì)引起相同的免疫反應(yīng)?；蛘?，可以設(shè)計(jì)變體使其組織蛋白酶O2蛋白的生物學(xué)活性發(fā)生改變。例如，組織蛋白酶O2蛋白的蛋白酶解活性可以通過(guò)取代催化三聯(lián)體的氨基酸而改變。由第25位的半胱氨酸、第162位的組氨酸和第182位的天冬酰胺組成的催化三聯(lián)體可以單個(gè)地或同時(shí)改變，以降低或失去蛋白酶解的活性。這一方法可以降低組織蛋白酶O2服用的毒性。同樣地，位于原序列和成熟序列之間的切割位點(diǎn)也可以進(jìn)行改變，例如，以消除蛋白酶解加工。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，組織蛋白酶O2蛋白在表達(dá)后純化或分離。組織蛋白酶O2蛋白可以按各種不同的、為本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員所知的方法進(jìn)行分離或純化，這些方法取決于樣品中存在的其他組分。標(biāo)準(zhǔn)的純化方法包括電泳、分子、免疫學(xué)和層析技術(shù)，層析技術(shù)包括離子交換、疏水、親和和反相HPLC層析，以及層析聚焦。例如，組織蛋白酶O2蛋白可用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的抗-組織蛋白酶O2抗體柱進(jìn)行純化。也可用超濾和滲濾技術(shù)，結(jié)合蛋白質(zhì)濃縮。對(duì)于恰當(dāng)?shù)募兓夹g(shù)的一般性指導(dǎo)，見Scopes，R.的“蛋白質(zhì)純化”(ProteinPurification)，Springer-Verlag，NY(1982)出版。必需的純化程度因組織蛋白酶O2蛋白的應(yīng)用而不同。在某些情況下沒(méi)有必要進(jìn)行純化。在一些實(shí)施例中，組織蛋白酶O2酶被表達(dá)為酶原。如實(shí)施例中所示，酶原可以按本
技術(shù)領(lǐng)域：
所知的方法，用外源的蛋白酶處理而將該酶轉(zhuǎn)變成成熟的具活性形式。合適的外源蛋白酶包括，但不局限于胃蛋白酶和組織蛋白酶D。一旦需要表達(dá)和純化了組織蛋白酶O2蛋白，它們就可應(yīng)用于許多方面。例如，按實(shí)施例5所示，本發(fā)明的組織蛋白酶O2蛋白具有膠原酶活性。因而組織蛋白酶O2蛋白可用作膠原酶，既可以在體外，也可以在體內(nèi)使用。例如，組織蛋白酶O2可用于處理那些含有能引起干擾的或產(chǎn)生問(wèn)題的量的膠原分析樣品。同樣地，組織蛋白酶O2蛋白也可用于降解體內(nèi)過(guò)量的膠原。有很多疾病與過(guò)量膠原相關(guān)。例如，脊椎盤疾病如嚴(yán)重的椎盤發(fā)炎和突出的一種治療涉及到注射膠原酶和糜木瓜蛋白酶以降解盤膠原(Leonardo等，Ann.ChirmGyneacol.82141-148(1993)；Gogan等“脊椎”(Spine)17388-94(1992)；Stula，Nerochirturgia33169-172(1990)；和Boccanera等，ChirOrgani.Mov.7525-32(1990))?；蛘撸谥委熣尺B，如骨盆粘連、手術(shù)后粘連、肺粘連、腹部粘連等等也可以用組織蛋白酶O2進(jìn)行處理或溶解。同樣地，瘢痕和瘢痕瘤也可以用組織蛋白酶O2治療，以除去或減少出現(xiàn)的過(guò)量膠原。此外，子宮內(nèi)膜異位是另一種臨床上重要的疾病，它涉及過(guò)量的膠原和其他物質(zhì)在子宮和周圍組織中的沉積；某些形成的子宮內(nèi)膜異位也可以用本發(fā)明的組織蛋白酶O2治療。在另一個(gè)實(shí)施例中，組織蛋白酶O2可以用于溶解腫瘤周圍的基質(zhì)。一般情況下腫瘤pH值低于生理pH，而且如實(shí)施例所述，組織蛋白酶O2在酸性pH下具活性，因而，組織蛋白酶O2適用于溶解通常包圍腫瘤的基于膠原的基質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的組織蛋白酶O2蛋白也可以治療固縮骨發(fā)育障礙——一種類似于骨硬化病的骨病。這一疾病看來(lái)是由破骨細(xì)胞半胱氨酸蛋白酶活性不足引起的。在一些實(shí)施例中，可通過(guò)基因治療給予組織蛋白酶O2。此外，由于組織蛋白酶O2在酸性pH下起作用，組織蛋白酶O2可與骨的脫礦化化合物，如酸結(jié)合施用，以降解骨組織。因而可治療骨的異常生長(zhǎng)或過(guò)量生長(zhǎng)。本發(fā)明的組織蛋白酶O2也可用于篩選組織蛋白酶O2蛋白酶抑制劑和半胱氨酸蛋白酶抑制劑。半胱氨酸蛋白酶抑制劑有各種不同用途，將為本
技術(shù)領(lǐng)域：
所意識(shí)到，這其中包括通過(guò)與親和層析柱結(jié)合以純化半胱氨酸蛋白酶，以及同已知的半胱氨酸蛋白酶抑制劑相似的抑制半胱氨酸蛋白酶的作用。另外，半胱氨酸蛋白酶抑制劑可能有治療作用，因?yàn)橛性S多不同的生理疾病與半胱氨酸蛋白酶量的增加有關(guān)，其中包括關(guān)節(jié)炎、炎癥、骨質(zhì)疏松、肌肉萎縮、腫瘤侵入、多發(fā)性骨髓瘤和腎小球性腎炎，這些為本領(lǐng)域所知。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，組織蛋白酶O2的原初部分可用作組織蛋白酶O2的特異性抑制劑。這樣，例如可以將原初部分分開來(lái)表達(dá)，即不帶成熟序列，并將原初部分作為組織蛋白酶O2的一個(gè)高度特異的緊密結(jié)合抑制物，這一點(diǎn)如實(shí)施例3所示。因此，原初部分可以以治療方式加入含有過(guò)量組織蛋白酶O2的樣品或組織中；例如按以下所述用于治療骨的疾病或腫瘤。在一個(gè)實(shí)施例中，標(biāo)記組織蛋白酶O2，并將其用于診斷、定量或確定樣品或組織中組織蛋白酶O2的存在。此外，組織蛋白酶O2蛋白可用于產(chǎn)生針對(duì)組織蛋白酶O2蛋白的多克隆和單克隆抗體，它們的作用見以下描述。同樣地，組織蛋白酶O2蛋白可以用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)結(jié)合到親和層析柱上。這些柱然后可用于純化組織蛋白酶O2的抗體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，采用本
技術(shù)領(lǐng)域：
熟知的技術(shù)可產(chǎn)生針對(duì)組織蛋白酶O2蛋白的單克隆抗體。如上所述，這種抗體可針對(duì)組織蛋白酶O2蛋白的全長(zhǎng)產(chǎn)生，或者是針對(duì)組織蛋白酶O2蛋白的部分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，抗體的產(chǎn)生是針對(duì)人組織蛋白酶O2蛋白獨(dú)特的表位；就是說(shuō)，這些抗體與針對(duì)其他生物的組織蛋白酶O2蛋白所產(chǎn)生的抗體沒(méi)有交叉反應(yīng)或反應(yīng)很弱，這些生物的組織蛋白酶例如來(lái)源于兔或大鼠的組織蛋白酶。這些抗體有很多用途。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，這些抗體被用于診斷在樣品或患者存在的組織蛋白酶O2。例如，過(guò)量的組織蛋白酶O2蛋白，會(huì)存在于破骨細(xì)胞相關(guān)的疾病和骨病以及腫瘤中，可用這些抗體進(jìn)行診斷。同樣地，組織蛋白酶O2的高含量與某些卵巢或?qū)m頸瘤有關(guān)，其證據(jù)為HeLa細(xì)胞中組織蛋白酶O2含量高。因而這些類型的腫瘤可以用本發(fā)明的抗體進(jìn)行檢測(cè)或診斷。檢測(cè)組織蛋白酶O2可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)；例如，血液或組織樣品可從患者獲得，用標(biāo)記的組織蛋白酶O2抗體測(cè)定反應(yīng)性，例如采用象RIA和ELISA那樣的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體可以直接或間接標(biāo)記?！皹?biāo)記的”此處指一個(gè)化合物至少含有一個(gè)元素、同位素或相連的一個(gè)化合物，使得能對(duì)該化合物進(jìn)行檢測(cè)。通常標(biāo)記有三類a)同位素標(biāo)記，可以是放射性的或重同位素；b)免疫標(biāo)記，可以是抗體標(biāo)記或抗原標(biāo)記；和c)著色染料或熒光染料。標(biāo)記可摻入化合物的任何位置。這樣，例如可以標(biāo)記組織蛋白酶O2蛋白的抗體用于檢測(cè)，或者可以制備和標(biāo)記針對(duì)組織蛋白酶O2蛋白抗體的第二抗體。在一個(gè)實(shí)施例中，針對(duì)本發(fā)明組織蛋白酶O2蛋白的抗體用于從一個(gè)樣品中純化或分離組織蛋白酶O2蛋白。例如，可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將針對(duì)組織蛋白酶O2蛋白所產(chǎn)生的抗體與親和層析柱相結(jié)合。這些層析柱可用于從組織樣品中提取組織蛋白酶O2蛋白。最近的工作顯示半胱氨酸蛋白酶可用作DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(Xu等，同上)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的組織蛋白酶O2蛋白可用作轉(zhuǎn)錄因子。寄生蟲衛(wèi)并殖吸蟲(Paragonimuswestermani)最近顯示出能表達(dá)與半胱氨酸蛋白酶同源的免疫抑制劑(Hamajima等，同上)。事實(shí)上，它與本發(fā)明的組織蛋白酶O2蛋白的同源性大約為40％，因而在一個(gè)實(shí)施例中，組織蛋白酶O2蛋白可用作免疫抑制劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，當(dāng)組織蛋白酶O2蛋白用于人體時(shí)，這種組織蛋白酶O2蛋白為人的組織蛋白酶O2蛋白。這是治療上的需要，以保證對(duì)于使用組織蛋白酶O2的不良免疫反應(yīng)減小至最低程度。使用本發(fā)明組織蛋白酶O2蛋白可以通過(guò)多種方式，包括但不限于口服、皮下、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、穿皮、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、肺內(nèi)、陰道、直腸或眼內(nèi)方式。本發(fā)明的藥物組合物包含一種組織蛋白酶O2蛋白，它以一種適合于給患者使用的形式存在。這一藥物組合物可含有以下物質(zhì)中一種或多種載體蛋白，如血清白蛋白；緩沖液；填料，如微晶纖維素、乳糖、玉米和其它淀粉；結(jié)合劑；甜味劑和其他調(diào)味劑；著色劑；和聚乙二醇。添加劑是本領(lǐng)域所熟知的，可以按各種不同配方使用。本發(fā)明的藥物組合物通常以治療上有效的劑量來(lái)使用，這一劑量可按常規(guī)由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。人們認(rèn)為本發(fā)明的人組織蛋白酶O2蛋白有一些特性，它在用于治療時(shí)使人的蛋白比來(lái)自其他種的組織蛋白酶O2蛋白更能被接受。特別是來(lái)源于其他種的組織蛋白酶O2蛋白的抗原性，在人體中使這些蛋白作為治療組合物不易被接受；即，來(lái)自其他種的組織蛋白酶會(huì)在人體中引發(fā)不良的免疫反應(yīng)。下列實(shí)施例用于更全面地描述應(yīng)用上述發(fā)明的方式，以及闡述了實(shí)施本發(fā)明各方面所預(yù)計(jì)的最佳模式。人們懂得這些實(shí)施例并不用于限定本發(fā)明的真正范圍，而是作為示例的目的而提出。本文所引用的參考文獻(xiàn)被收作本發(fā)明的參考。實(shí)施例實(shí)施例1人組織蛋白酶O2的克隆除非有其他說(shuō)明，所有一般性的重組DNA技術(shù)按Sambrook等的方法進(jìn)行(“分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(MolecularCloning，ALaboratoryManual)，冷泉港出版社，1989)。根據(jù)已發(fā)表的兔破骨素基因序列(Tezuko等，1994)設(shè)計(jì)2個(gè)PCR簡(jiǎn)并引物5′-GGA-TAC-GTT-ACN-CCN-GT-3′(序列8)5′-GC-CAT-GAG-G/ATA-NCC-3′(序列9)這些引物用于篩選人脾“快速克隆”的cDNA制備物(Clontech)。分離和純化一段擴(kuò)增的450bp片段，并用作cDNA探針用于篩選人脾cDNA文庫(kù)(Clontech中的gt10)。采用在濾膜上直接重新形成噬斑的技術(shù)(Woo，“酶學(xué)方法”(MethodsEnzymol.)68389-395(1979))在20張濾膜上對(duì)600,000克隆進(jìn)行篩選。這一技術(shù)使得只允許較短處理時(shí)間的陽(yáng)性噬斑的信號(hào)放大，因而減弱了背景和假陽(yáng)性的顯現(xiàn)。洗膜采用中等嚴(yán)緊條件室溫下2×SSC，0.1％SDS中洗10分鐘，一次，再在68℃下2×SSC，0.1％SDS中洗20分鐘，一次。從兩個(gè)陽(yáng)性噬斑中分離噬菌體，并克隆到pBluescriptSK+載體(Stratagene)的EcoRI位點(diǎn)。在ABI373A型測(cè)序儀上對(duì)一個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行完全測(cè)序；其序列(序列1)示于圖1。人組織蛋白酶O2(序列2)、人組織蛋白酶S(序列4)和人組織蛋白酶L(序列5)的序列比較如圖2所示。實(shí)施例2人組織蛋白酶O2的表達(dá)用標(biāo)準(zhǔn)方法將人組織蛋白酶O2的cDNA克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的多角體蛋白基因中。將編碼早期酶原的完全開放讀框的cDNA插入pVL1392轉(zhuǎn)移載體(PharMingen)的BglII和BamH1位點(diǎn)。重組桿狀病毒的產(chǎn)生是將桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體和線性化的AcNPV基因組DNA(PharMingen)共轉(zhuǎn)染到Sf9細(xì)胞中，然后通過(guò)同源重組產(chǎn)生重組桿狀病毒。在熒光測(cè)定底物分析中，按終點(diǎn)稀釋測(cè)定組織蛋白酶O2的表達(dá)，概述如下。通過(guò)噬斑純化獲得病毒(AcNPVCO2)。在Sf900II培養(yǎng)基(GibcoBRL，GrandIsland，NY)上培養(yǎng)Sf9細(xì)胞至濃度2×106細(xì)胞/ml，并在最大氧吸入為1時(shí)感染。每隔24小時(shí)測(cè)定總細(xì)胞數(shù)和組織蛋白酶O2的細(xì)胞活性及分泌活性。3.5天后收獲細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)多數(shù)分子量約43KDa的免疫反應(yīng)性物質(zhì)在感染細(xì)胞內(nèi)。與培養(yǎng)基中43KDa的單一產(chǎn)物相對(duì)照，在細(xì)胞提取物中檢測(cè)到一條額外的44KDa的淺帶。推斷較大分子量的這條帶代表未經(jīng)加工的早期原組織蛋白酶O2，而43KDa的蛋白質(zhì)推斷是酶原。在剛剛進(jìn)行細(xì)胞裂解后，和自體活化條件下，用Z-RF-MCA合成底物在pH7.5下觀察不到活性。自體活化的條件為40℃、pH4.0～4.5之間、二硫蘇糖醇的存在條件下?？杀籈-64抑制的活性在自體活化條件下的增加和pH5.5下進(jìn)行測(cè)定，是由于內(nèi)源Sf9半胱氨酸蛋白酶的原因(未發(fā)表結(jié)果)。將人組織蛋白酶B在37℃下，pH4.0和5.5下溫育2小時(shí)觀察不到組織蛋白酶O2前體的加工(資料未顯示)。重組人組織蛋白酶O2的活化、純化和N-末端測(cè)序細(xì)胞內(nèi)組織蛋白酶O2以無(wú)活性的前體形式產(chǎn)生于Sf9細(xì)胞內(nèi)。這種酶在細(xì)胞裂解液中如下的還原和酸性條件下被活化。Sf9細(xì)胞通過(guò)在2000×g下離心從生產(chǎn)培養(yǎng)基中收獲，并且在Dounce勻漿器中裂解。將含有無(wú)活性的人組織蛋白酶O2前體的細(xì)胞裂解液用100mM乙酸鈉緩沖液、pH3.75配制成100ml液體，該緩沖液中含有0.5％tritonX-100、5mM二硫蘇糖醇和2.5mM的Na2EDTA，并將pH調(diào)至4.0。通過(guò)用胃蛋白酶處理使前體轉(zhuǎn)變成有活性的酶。加入豬胃蛋白酶(Sigma，St.Louis，MO)至終濃度為0.4mg/ml后，將活化混合物在200rpm振蕩器中40℃下保溫90分鐘?；罨饔玫臏y(cè)定采用Z-FR-MCA(10μM)作為產(chǎn)熒光底物，在pH7.5、100mMTris/Hcl緩沖液中測(cè)定。組織蛋白酶O2前體通過(guò)用胃蛋白酶在pH4.0下處理能有效地轉(zhuǎn)化成成熟具活性的酶。細(xì)胞粗提物或濃縮的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基上清液的消化，出現(xiàn)了前體隨時(shí)間的消失和經(jīng)過(guò)36KD中間產(chǎn)物的成熟酶(29KD)的生成(圖3)。相應(yīng)于這一加工過(guò)程，觀察到在pH7.5下測(cè)定的能被E-64抑制的活性增加。在pH4.5下加入純化的具活性的組織蛋白酶O2而沒(méi)有觀察到前體的活化作用(數(shù)據(jù)未顯示)，表明了在溶酶體內(nèi)不可能有組織蛋白酶O2順式或反式的自體活化作用。這與相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，如木瓜蛋白酶和組織蛋白酶S形成了對(duì)比。這些酶有一條潛在的自體催化活化途徑(Vernet等“生物化學(xué)雜志”(J.Biol.Chem.)2651661-1666(1990)，Bromme等，“生物化學(xué)雜志”(J.Biol.Chem.)2684832-4838(1993))。破骨細(xì)胞內(nèi)組織蛋白酶O2的自然的活化酶可以是天冬氨酰蛋白酶的組織蛋白酶D，它出現(xiàn)于破骨細(xì)胞溶酶體中，但少量分泌到吸收腔隙中(Goto等，1993)?；罨牧呀庖河?M的Tris堿調(diào)至pH7.0，通過(guò)在10000×g下離心澄清，上清液用2.5M硫酸氨調(diào)至pH5.5。經(jīng)過(guò)16,000×g下離心，澄清的上清液通過(guò)超濾(YM10Amicon)濃縮至50ml，再經(jīng)10000×g離心，澄清的上清液裝在丁基Sepharose4FastFlow(Pharmacia，Sweden)柱上，并用硫酸氨梯度(25mM乙酸緩沖液中2.5M至0M，pH5.5)洗柱。在0M硫酸氨下洗脫活性。然后將收集并且濃縮的部分上FPLC.MonoS柱(Pharmacia，Sweden)，并且在pH5.5、20mM乙酸鈉中以線性Nacl梯度(0-2M)洗脫。電泳中同源的組織蛋白酶O2在1.4MNacl中洗脫。1LSf9細(xì)胞培養(yǎng)物(約2×109細(xì)胞)的平均產(chǎn)量是大約1mg純化的酶(表1)表1重組人組織蛋白酶O2a的純化a獲自1LSf9培養(yǎng)物b經(jīng)胃蛋白酶活化純化的酶為一個(gè)單鏈酶，并且在4-20％Tris/甘氨酸SDS凝膠中還原條件下的表現(xiàn)分子量為29KDa。用內(nèi)切糖苷酶H和F以及N-糖苷酶F處理不產(chǎn)生分子量的改變，這表明這一蛋白酶是非糖基化的(數(shù)據(jù)未顯示)。人組織蛋白酶O2在其成熟序列中有兩個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。但是，兩個(gè)位點(diǎn)都有一個(gè)脯氨酸殘基緊鄰著天冬酰胺或蘇氨酸，因而它們的利用是不可能的。組織蛋白酶O2還在原初部分含有一個(gè)推斷的糖基化位點(diǎn)，該位點(diǎn)靠近位于成熟酶和原初部分之間的那個(gè)加工位點(diǎn)。同樣，經(jīng)過(guò)用內(nèi)切糖苷酶H和F以及N-糖苷酶F處理，沒(méi)有觀察到酶原的分子量變化。采用自動(dòng)化Edman降解法進(jìn)行NH2-末端測(cè)序。成熟蛋白酶的N末端測(cè)序揭示了在木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶的天然加工位點(diǎn)有一個(gè)脯氨酸靠著N末端的丙氨酸(NH2-APDSVDYRKKGYVTPVKN)(序列10)。相比之下，自體催化激活的半胱氨酸蛋白酶常常在加工位點(diǎn)有一段來(lái)源于原初部分的3-6個(gè)氨基酸的延伸片段(Bromme等，1993)。所計(jì)算的成熟的組織蛋白酶O2的分子量為23,495，這似乎是該酶實(shí)際的分子量。在相似條件下測(cè)定時(shí)，胰蛋白酶(24KDa)也表現(xiàn)出同樣的表觀分子量29KDa。重組人組織蛋白酶S用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，并按別處所述方法純化(Bromme和McGraph，未發(fā)表結(jié)果)。重組人組織蛋白酶L由Dr.Mort惠贈(zèng)(Shriner殘廢兒童醫(yī)院(Shriner′sHospitalforCrippledChildren)，Montreal，Quebec)。所有應(yīng)用的組織蛋白酶為電泳上同源性的，它們的體積克分子濃度按Barrett和Kirschke(1981)的方法用E-64通過(guò)活性位點(diǎn)滴定進(jìn)行測(cè)定。熒光測(cè)定酶試驗(yàn)人組織蛋白酶O2的測(cè)定用產(chǎn)熒光的底物Z-FR-MCA(MCA，甲基香豆酰胺)在100mM乙酸鈉緩沖液中進(jìn)行，其中含有2.5mM的二硫蘇糖醇和2.5mMEDTA。MCA底物的初始水解速率在1cm的小比色杯中25℃下，以380nm的激發(fā)波長(zhǎng)和450nm的發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。Z-FR-MCA的濃度是低于標(biāo)準(zhǔn)條件的5μM。動(dòng)力學(xué)常數(shù)Vmax和Km用Enzfitter程序(Leatherbarrow，Enzfitter，ElsevierBiosoft，Cambridge，UK(1987))通過(guò)非線性回歸分析而獲得。組織蛋白酶O2的抑制試驗(yàn)是在恒定的底物濃度(5μMZ-FR-MCA)和酶濃度(1nM)下，底物試驗(yàn)緩沖液中不同濃度抑制劑存在下進(jìn)行的。組織蛋白酶O2用抑制劑預(yù)保溫10分鐘，并開始用底物進(jìn)行反應(yīng)。測(cè)定殘基活性并由未抑制速率計(jì)算抑制百分比。實(shí)施例3組織蛋白酶O2的原初部分的克隆和表達(dá)人組織蛋白O2的原初部分用下列引物按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增5′-CTGGATCCCTGTACCCTGAGGAGATACTG-3′(序列11)5′-CTAAGCTTCTATCTACCTTCCCATTCTGGGATA-3′(序列2)前區(qū)域在pTrcHis載體(InvitrogenCorp.，SanDiego，CA)中表達(dá)，它包含一串6個(gè)組氨酸殘基，它們?cè)诜g后蛋白中作為一個(gè)金屬結(jié)合域。這一金屬結(jié)合域用于在包含于Xpress系統(tǒng)蛋白表達(dá)盒中Invitrogen′sProBond樹脂上進(jìn)行組織蛋白酶O2的原初部分的純化。一塊純化的原初部分的凝膠如圖10所示。純化的原初部分抑制親化酶，其Ki值為0.1nM。實(shí)施例4人組織蛋白酶O2的抗體和免疫組織化學(xué)。在新西蘭白兔中制備針對(duì)人組織蛋白酶O2的酶原。用PfuDNA聚合酶(Promega)由早期酶原序列的制備物通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼酶原的cDNA。所用的引物是根據(jù)帶有NheI位點(diǎn)的酶原的5′端和帶有BamHI位點(diǎn)的3′端而合成。人組織蛋白酶O2在大腸桿菌(BL21(DE3))中含有來(lái)自Novagen的pET11C載體中克隆和表達(dá)。用0.4mMIPTG在OD600＝0.6下誘導(dǎo)表達(dá)，在誘導(dǎo)后2小時(shí)收獲細(xì)胞。收獲后，表達(dá)的蛋白質(zhì)在Novex12％Tris-甘氨酸SDS凝膠上電泳，然后進(jìn)行考馬斯染色并脫色。將經(jīng)N-末端測(cè)序證實(shí)的組織蛋白酶O2的酶原帶切割下來(lái)。將蛋白質(zhì)從凝膠條上電洗脫下來(lái)，并在用1×的洗脫緩沖液預(yù)處理過(guò)的Centricon10上濃縮。將抗原用1×PBS加至1ml，用于免疫接種(ELLabs，Soguel，CA)?？贵w用丙酮制粉從全血清中純化出來(lái)，制成經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物BL21(DE3)，并通過(guò)親和結(jié)合將抗原洗脫至硝酸纖維素上。純化的抗體對(duì)于人組織蛋白酶O2酶原、原初部分和成熟酶具特異性，而在1∶2000稀釋后Western印跡分析中與人組織蛋白酶S、L和B不存在交叉反應(yīng)。用現(xiàn)有方法(Cattoretti等，1992)制備福爾馬林固定和石蠟包埋的人組織切片(Biogenex，SanRamon，CA)，并按照StrAviGen檢測(cè)系統(tǒng)(Biogenex)用對(duì)照兔IgG或親和純化的抗組織蛋白酶O2抗體染色。切片用Mayer氏蘇木精復(fù)染。破骨細(xì)胞的免疫染色顯示了多核破骨細(xì)胞強(qiáng)的特異性染色，而基質(zhì)細(xì)胞不顯反應(yīng)(圖11)。也觀察到出生前人骨中破骨細(xì)胞濃的免疫組織化學(xué)染色(資料未顯示)。在肺部，有兩個(gè)部位能檢測(cè)到組織蛋白酶O2；第一個(gè)是肺泡的巨噬細(xì)胞(11)第二個(gè)是在支氣管上皮細(xì)胞。組織蛋白酶O2還發(fā)現(xiàn)于胃腺的上皮細(xì)胞、結(jié)腸中的腸腺、腎的鄰近小管和遠(yuǎn)側(cè)小管以及子宮內(nèi)膜中子宮腺體的上皮。而且，肝臟中的枯否細(xì)胞以及睪丸中的生精細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)組織蛋白酶O2深的染色。在腎上腺皮質(zhì)、卵巢和胎盤中觀察到較為一致的染色(圖11)。同樣地，抗電泳上同源的人組織蛋白酶O2的原初部分的多克隆抗體也在新西蘭白兔中制備。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備針對(duì)原初部分、組織蛋白酶O2酶原和成熟組織蛋白酶O2的單克隆抗體。實(shí)施例5人組織蛋白酶O2的特性下列實(shí)驗(yàn)用部分純化的實(shí)施例2的人組織蛋白酶O2進(jìn)行。重組人組織蛋白酶O2的pH活性曲線和pH穩(wěn)定性。組織蛋白酶O2的pH穩(wěn)定性測(cè)定是通過(guò)將具活性的蛋白酶溫育于25℃、不同pH值下，在5mM二硫蘇糖醇和5mMEDTA存在下進(jìn)行。殘基的活性測(cè)定采用上述熒光測(cè)定底物試驗(yàn)法在不同時(shí)間間隔進(jìn)行。底物水解的起始速率如上述方法進(jìn)行測(cè)定。人組織蛋白酶O2的pH活性曲線是在1μM底物(Z-FR-MCA)濃度([S]＜＜Km，其中起始速率V0直接與Kcat/Km值成正比)下得到的。下列緩沖液用于pH活性曲線測(cè)定100mM檸檬酸鈉(pH2.8-5.6)和100mM磷酸鈉(pH5.8-8.0)。所有緩沖液含有1mMEDTA和0.4MNacl，以減小離子強(qiáng)度的變化。三質(zhì)子化模型(Khouri等“生物化學(xué)”(Biochem.)308929-8936(1991))用于pH活性數(shù)據(jù)的最小二次回歸分析。數(shù)據(jù)附合下列等式。(Kcat/Km)obs＝(Kcat/Km)/([H+]/K1+1+K2/[H+])組織蛋白酶O2、S、L的pH穩(wěn)定性在三個(gè)不同的pH值下進(jìn)行研究。重組的人組織蛋白酶O2、S和L溫育于37℃下pH5.5的100mM乙酸鈉緩沖液、pH6.5的100mM磷酸鉀緩沖液、pH7.5的100mMTris/Hcl，含5mM二硫蘇糖醇和2.5mMEDTA。溫育0.5、1、2和4小時(shí)后，用5μM的Z-FR-MCA測(cè)定組織蛋白酶O2(100mM磷酸鉀緩沖液，pH6.5)和組織蛋白酶L(100mM乙酸鈉緩沖液，pH5.5)剩余的活性，用5μM的Z-VVR-MCA測(cè)定組織蛋白酶S(100mM磷酸鉀緩沖液，pH6.5)的剩余活性。pH活性曲線是酶功能和結(jié)構(gòu)統(tǒng)一性的敏感量度。比較不同的但相關(guān)的蛋白酶的pH曲線顯示在這些蛋白酶的內(nèi)在活性和穩(wěn)定性方面有差異。人組織蛋白酶O2顯示出鈴狀的pH曲線，兩側(cè)的pK值為4.0和8.13(表2；圖5)。</tables>a從(PK1+PK2)/2計(jì)算而來(lái)b來(lái)自Bromme等，1993，同上c來(lái)自Khouri等，1991，同上人組織蛋白酶O2的最適pH值在6.0-6.5之間，與所觀察到的組織蛋白酶S的值相近(Bromme等，同上，1993)。反映離子對(duì)穩(wěn)定性的pH曲線的寬度(Menard等，“生物化學(xué)”(Biochem.)305531-5538(1991))在組織蛋白酶O2是4.15，而在組織蛋白酶S為3.35(Bromme等，1993，同上)。人組織蛋白酶O2的這一參數(shù)更接近于所觀察到的非常穩(wěn)定的木瓜蛋白酶的值，后者曲線寬度為3.91(Khouri等，同上，1991)。人組織蛋白酶O2在微酸性至中性pH值下比組織蛋白酶L穩(wěn)定，但不如組織蛋白酶S穩(wěn)定(表3)。表337℃下重組人組織蛋白酶O2與重組人組織蛋白酶S和L的pH穩(wěn)定性比較<tablesid="table3"num="003"><tablewidth="663">蛋白酶保溫時(shí)間(hr)殘余活性(％)pH5.5pH6.5pH7.5組織蛋白酶O20.5124918870528549221511000組織蛋白酶S0.5124100959283100100947191726160組織蛋白酶L0.512487787151123000000</table></tables>組織蛋白酶O2在37℃pH6.5下經(jīng)過(guò)1小時(shí)剩余活性約為50％，而在相同條件下基本上觀察不到組織蛋白酶L活性。但是必須考慮到測(cè)定pH穩(wěn)定性時(shí)沒(méi)有底物保護(hù)，底物保護(hù)通常會(huì)增加pH穩(wěn)定性。在用組織蛋白酶O2進(jìn)行3H彈性蛋白降解試驗(yàn)中，在pH7.0下經(jīng)過(guò)2小時(shí)仍能觀察到溶液化的3H片段的增加。重組人組織蛋白酶O2的抑制物曲線在熒光測(cè)定酶試驗(yàn)(見前面描述)中向純化的酶中加入抑制劑，以測(cè)定蛋白酶類特異性抑制劑對(duì)組織蛋白酶O2的抑制效果。人組織蛋白酶O2表現(xiàn)出半胱氨酸蛋白酶典型的抑制物曲線。它受半胱氨酸蛋白酶抑制劑抑制，并受半胱氨酸和絲氨酸蛋白酶兩者的抑制劑所抑制(表4)。在0.1μM以上濃度，肽醛、重氮甲烷、E-64和雞半胱氨酸肽酶抑制物完全抑制酶活性。另一方面，特異性的絲氨酸和天冬氨酸蛋白酶抑制劑不影響酶活性。沒(méi)有觀察到4mM濃度的EDTA對(duì)組織蛋白酶O2活性的影向。濃度較高(＞5mM)時(shí)觀察到部分非特異性抑制。表4重組人組織蛋白酶O2的抑制劑特性組織蛋白酶O2活性只被半胱氨酸蛋白酶的特異性抑制劑抑制。重組人組織蛋白酶O2的底物特異性用前面所述的底物試驗(yàn)測(cè)定針對(duì)合成底物的底物特異性。用Z-X-R-MCA類型的合成底物確定人組織蛋白酶O2的S2P2特異性，其中的X等同于F、L、V或R。半胱氨酸蛋白酶的S2亞位點(diǎn)小域在結(jié)構(gòu)上明確，并且決定了這一類蛋白酶的主要特異性。例如，組織蛋白酶B在S2亞位點(diǎn)小域的底部有一個(gè)谷氨酸(E245)殘基，它有利于結(jié)合象精氨酸那樣的堿性殘基。這一谷氨酸殘基在所有其他已知的人組織蛋白酶中被中性殘基所替代，導(dǎo)致Z-R-R-MCA底物非常低的水解率。組織蛋白酶O2的第205位含有一個(gè)亮氨酸殘基，使Z-R-R-MCA成為一個(gè)很不好的底物(圖6)。組織蛋白酶O2對(duì)P2殘基的特異性與組織蛋白酶S的相似。這兩種酶在這一位置相對(duì)于苯丙氨酸優(yōu)選為亮氨酸，而組織蛋白酶的特征為反向特異性(表5，圖6)。P2位置的纈氨酸能被組織蛋白酶O2相對(duì)較好地接受，而在P2中出現(xiàn)的帶β-支鏈的這種殘基使之成為不適于組織蛋白酶L、S和B的底物。表5重組人組織蛋白酶O2催化的Z-X-R-MCA水解的動(dòng)力學(xué)參數(shù)</tables>為計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)Kcat和Km，通常在9-11個(gè)不同的底物濃度下獲得起始速率，使結(jié)果符合公式(I)。通過(guò)用E-64滴定活性位點(diǎn)以測(cè)定酶濃度(Kinder等，“生物化學(xué)雜志”(Biochem.J.)201367-372(1982))。組織蛋白酶O2對(duì)二肽底物的催化效率(Kcat/Km)與組織蛋白酶S和B的值相近，但比組織蛋白酶L的值小大約1個(gè)數(shù)量級(jí)。有趣的是組織蛋白酶O2的Km值與所測(cè)的組織蛋白酶L的值相近。Km值在一定程度上反映出底物與蛋白酶的親和性。這一趨勢(shì)對(duì)三肽底物Z-LLR-MCA甚至更為明顯，其Km值低至4×10-7M(表5)。但是與組織蛋白酶S和L形成對(duì)照的是組織蛋白酶O2的Kcat值幾乎要小兩個(gè)數(shù)量級(jí)，這可能反映了它的無(wú)效結(jié)合。重組的人組織蛋白酶O2對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的活性如所述方法(Banda等“酶學(xué)方法”(MethodsEnzymol.)144，288-305(1987))制備[3H]彈性蛋白，其比活性為113,000cpm/mg蛋白。將彈性蛋白(2mg)溫育于含有2.5mM二硫蘇糖醇、2.5mMEDTA和0.05％TritonX-100的1ml緩沖液中，以進(jìn)行組織蛋白酶O2、S和L的測(cè)定。經(jīng)10、20、30、50、90、120和180分鐘取小份樣品，在14,000×g下離心1分鐘，并用液體閃爍計(jì)數(shù)儀(1450MicrobetaPlus，Wallac/Pharmacia)在含有閃爍液的24孔板中計(jì)數(shù)。在彈性蛋白降解試驗(yàn)中人組織蛋白酶O2、S和L和牛彈性蛋白酶的濃度分別為65nM、28nM、80nM和80nM。為了測(cè)定pH對(duì)蛋白酶活性的影響，在pH4.5和5.5(乙酸鈉100mM、二硫蘇糖醇和EDTA各2.5mM。TritonX-1000.05％)，以及pH7.0(Tris/HCl100mM，二硫蘇糖醇和EDTA各2.5mM、TritonX-1000.05％)下進(jìn)行消化。除了在溫育混合物中不加二硫蘇糖醇和EDTA而其他條件相同情況下，測(cè)定牛胰彈性蛋白酶(Boehringer，Mannheim，IN)。在pH5.5下觀察到最大活性。組織蛋白酶O2在pH4.5-7.0之間有一個(gè)高于組織蛋白酶S1.7-3.5倍的彈性蛋白酶解活性。這一彈性蛋白酶解活性在組織蛋白酶L的最適pH(pH5.5)和中性pH下，與組織蛋白酶L和胰彈性蛋白酶相比活性大約分別高9倍和2.4倍(圖7)。測(cè)定的組織蛋白酶L和S的值與已發(fā)表資料(Kirschke等，“蛋白酶解和蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)”(ProteolysisandProteinTurnover(Bond，J.S.和Barrett，A.J.編)pp.33-37，Portland出版社，London和ChapelHill(1993)，Kirschke和Wiederanders，“酶學(xué)方法”(MethodsEnzymol.)244,500-511(1994))十分吻合。將可溶性小牛皮I型膠原以0.4mg/ml稀釋于含2mM二硫蘇糖醇/2mMEDTA的100mM乙酸鈉，pH4.5、5.0、5.5，100mM磷酸鉀緩沖液，pH6.0、6.5，和100mMTris/HCl，pH7.0中。人組織蛋白酶O2、S、L和牛胰蛋白酶(Sigma)保溫于28℃100nM的酶濃度下10小時(shí)。為測(cè)定組織蛋白酶O2和S的膠原活性，在用蛋白酶溫育之前將I型膠原在70℃下加熱10分鐘。反應(yīng)混合物在含有1nM蛋白酶下28℃溫育30分鐘。樣品用4-20％的Tris-甘氨酸凝膠(Novex，SanDiego，CA)進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺電泳。組織蛋白酶O2在28℃、pH5.0和6.0之間能充分降解I型膠原，而在pH4.5和pH7.0其降解作用顯著減弱(圖9a)。主要的酶切似乎發(fā)生于端肽區(qū)域，因?yàn)閺摩潞挺媒M分中釋放的α單體要稍小一些。在α單體內(nèi)也可能發(fā)生其他的酶切。還不清楚酶切是在完整的螺旋區(qū)還是在松散的α單體中。經(jīng)組織蛋白酶O2作用后觀察到的I型膠原的主要片段大小為70-80KDa。組織蛋白酶L也酶切端肽區(qū)，但實(shí)際上未檢測(cè)到小分子量的片段。組織蛋白酶L的膠原酶解活性的有效pH范圍，與組織蛋白酶O2(pH4.0和5.5之間)相比更偏酸性。組織蛋白酶S似乎只顯示非常弱的膠原酶解活性。與之對(duì)照，組織膠原酶將α單體酶切成3/4和1/4片段(Gross和Nagai，“美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)”(Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.)54,1197-1204(1965))。胰蛋白酶與組織蛋白酶O2相比在相等酶濃度下沒(méi)有觀察到I型膠原的降解，這表明膠原的三重螺旋的完整性沒(méi)有受到破壞(資料未顯示)。除了組織蛋白酶O2的膠原酶活性，它還顯示出很強(qiáng)的明膠酶活性。在0.1nM的酶濃度下，變性的膠原在pH5.0至7.0范圍內(nèi)30分鐘內(nèi)完全降解。相反，組織蛋白酶L只在pH范圍4.5-5.5之間表現(xiàn)出明膠酶活性(圖6b)。組織蛋白酶S在pH4.0-7.0之間有活性，但比組織蛋白酶O2和L的活性明顯要弱。組織蛋白酶的相對(duì)彈性蛋白酶解活性與牛胰彈性蛋白酶的比較<>人組織蛋白酶O2信息含量的組織分布通過(guò)Northern印跡，用適當(dāng)?shù)娜梭w酶的cDNA探針測(cè)定人組織蛋白酶O2、L和S信息含量的組織分布。探針長(zhǎng)約450bp，包括了編碼活性位點(diǎn)半胱氨酸-25殘基(按木瓜蛋白酶編號(hào))和天冬氨酸-175之間殘基的一段區(qū)域。圖8示人組織蛋白酶O2的Northern印跡。如圖8所示，人破骨細(xì)胞瘤制備物中信息含量表明與組織蛋白酶L相比，組織蛋白酶O2的表達(dá)要高很多倍。人組織蛋白酶O2mRNA的組織分布表明它與組織蛋白酶L有一些相似，但前者的組織濃度在多數(shù)器官(心臟、胎盤、肺、胰腺和腎)中似乎明顯要低。另一方面，人組織蛋白酶O2在人體組織和細(xì)胞系中分布與人組織蛋白酶L和S相比，表現(xiàn)出顯著差異。組織蛋白酶O2在卵巢、小腸和結(jié)腸中有很高的轉(zhuǎn)錄含量，但在肝中沒(méi)有信息，而肝中富含組織蛋白酶L。組織蛋白酶O2也見于HeLa細(xì)胞中。組織和細(xì)胞系分布(Northern印跡)</tables>序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人Khepri制藥公司(KhepriPharmaceuticals，Inc.)(ii)發(fā)明名稱組織蛋白酶O2蛋白酶(iii)序列數(shù)目12(iv)通訊地址(A)收件人Flehr，Hohbach，Test，Albritton&amp;Herbert(B)街道FourEnbarcaderoCenterSuite3400(C)城市舊金山(D)州加利福尼亞(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編94111-4187(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，版本#1.30(vi)當(dāng)前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朠CT/US95(B)申請(qǐng)日26-10-1995(C)分類(vii)優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S未知(B)申請(qǐng)日02-10-1995(vii)優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S08/330,121(B)申請(qǐng)日27-10-1994(viii)律師/代理人資料(A)姓名Silva，RobinM.(B)注冊(cè)號(hào)38,304(C)文獻(xiàn)/檔案號(hào)FP-60261-1-PC/DJB/RMS(ix)通訊資料(A)電話(415)781-1989(B)傳真(415)398-3249(C)電傳910-277299(2)序列1資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1482堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特點(diǎn)(A)名稱/要點(diǎn)CDS(B)位置142..1128(xi)序列描述序列1GCGCACTCACAGTCGCAACCTTTCCCCTTCCTGACTTCCCGCTGACTTCCGCAATCCCGA60TGGAATAAATCTAGCACCCCTGATGGTGTGCCCACACTTTGCTGCCGAAACGAAGCCAGA120CAACAGATTTCCATCAGCAGCATGTGGGGGCTCAAGGTTCTGCTGCTACCT171MetTrpGlyLeuLysValLeuLeuLeuPro1510GTGGTGAGCTTTGCTCTGTACCCTGAGGAGATACTGGACACCCACTGG219ValValSerPheAlaLeuTyrProGluGluIleLeuAspThrHisTrp152025GAGCTATGGAAGAAGACCCACAGGAAGCAATATAACAACAAGGTGGAT267GluLeuTrpLysLysThrHisArgLysGlnTyrAsnAsnLysValAsp303540GAAATCTCTCGGCGTTTAATTTGGGAAAAAAACCTGAAGTATATTTCC315GluIleSerArgArgLeuIleTrpGluLysAsnLeuLysTyrIleSer455055ATCCATAACCTTGAGGCTTCTCTTGGTGTCCATACATATGAACTGGCT363IleHisAsnLeuGluAlaSerLeuGlyValHisThrTyrGluLeuAla606570ATGAACCACCTGGGGGACATGACCAGTGAAGAGGTGGTTCAGAAGATG411MetAsnHisLeuGlyAspMetThrSerGluGluValValGlnLysMet75808590ACTGGACTCAAAGTACCCCTGTCTCATTCCCGCAGTAATGACACCCTT459ThrGlyLeuLysValProLeuSerHisSerArgSerAsnAspThrLeu95100105TATATCCCAGAATGGGAAGGTAGAGCCCCAGACTCTGTCGACTATCGA507TyrIleProGluTrpGluGlyArgAlaProAspSerValAspTyrArg110115120AAGAAAGGATATGTTACTCCTGTCAAAAATCAGGGTCAGTGTGGTTCC555LysLysGlyTyrValThrProValLysAsnGlnGlyGlnCysGlySer125130135TGTTGGGCTTTTAGCTCTGTGGGTGCCCTGGAGGGCCAACTCAAGAAG603CysTrpAlaPheSerSerValGlyAlaLeuGluGlyGlnLeuLysLys140145150AAAACTGGCAAACTCTTAAATCTGAGTCCCCAGAACCTAGTGGATTGT651LysThrGlyLysLeuLeuAsnLeuSerProGlnAsnLeuValAspCys155160165170GTGTCTGAGAATGATGGCTGTGGAGGGGGCTACATGACCAATGCCTTC699ValSerGluAsnAspGlyCysGlyGlyGlyTyrMetThrAsnAlaPhe175180185CAATATGTGCAGAAGAACCGGGGTATTGACTCTGAAGATGCCTACCCA747GlnTyrValGlnLysAsnArgGlyIleAspSerGluAspAlaTyrPro190195200TATGTGGGACAGGAAGAGAGTTGTATGTACAACCCAACAGGCAAGGCA795TyrValGlyGlnGluGluSerCysMetTyrAsnProThrGlyLysAla205210215GCTAAATGCAGAGGGTACAGAGAGATCCCCGAGGGGAATGAGAAAGCC843AlaLysCysArgGlyTyrArgGluIleProGluGlyAsnGluLysAla220225230CTGAAGAGGGCAGTGGCCCGAGTGGGACCTGTCTCTGTGGCCATTGAT891LeuLysArgAlaValAlaArgValGlyProValSerValAlaIleAsp235240245250GCAAGCCTGACCTCCTTCCAGTTTTACAGCAAAGGTGTGTATTATGAT939AlaSerLeuThrSerPheGlnPheTyrSerLysGlyValTyrTyrAsp255260265GAAAGCTGCAATAGCGATAATCTGAACCATGCGGTTTTGGCAGTGGGA987GluSerCysAsnSerAspAsnLeuAsnHisAlaValLeuAlaValGly270275280TATGGAATCCAGAAGGGAAACAAGCACTGGATAATTAAAAACAGCTGG1035TyrGlyIleGlnLysGlyAsnLysHisTrpIleIleLysAsnSerTrp285290295GGAGAAAACTGGGGAAACAAAGGATATATCCTCATGGCTCGAAATAAG1083GlyGluAsnTrpGlyAsnLysGlyTyrIleLeuMetAlaArgAsnLys300305310AACAACGCCTGTGGCATTGCCAACCTGGCCAGCTTCCCCAAGATG1128AsnAsnAlaCysGlyIleAlaAsnLeuAlaSerPheProLysMet315320325TGACTCCAGCCAGCCAAATCCATCCTGCTCTTCCATTTCTTCCACGATGGTGCAGTGTAA1188CGATGCACTTTGGAAGGGAGTTGGTGTGCTATTTTTGAAGCAGATGTGGTGATACTGAGA1248TTGTCTGTTCAGTTTCCCCATTTGTTTGTGCTTCAAATGATCCTTCCTACTTTGCTTCTC1308TCCACCCATGACCTTTTTCACTGTGGCCATCAGGACTTTCCCTGACAGCTGTGTACTCTT1368AGGCTAAGAGATGTGACTACAGCCTGCCCCTGACTGTGTTGTCCCAGGGCTGATGCTGTA1428CAGGTACAGGCTGGAGATTTTCACATAGGTTAGATTCTCATTCACGGGACCCGG1482(2)序列2資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度329氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述序列2MetTrpGlyLeuLysValLeuLeuLeuProValValSerPheAlaLeu151015TyrProGluGluIleLeuAspThrHisTrpGluLeuTrpLysLysThr202530HisArgLysGlnTyrAsnAsnLysValAspGluIleSerArgArgLeu354045IleTrpGluLysAsnLeuLysTyrIleSerIleHisAsnLeuGluAla505560SerLeuGlyValHisThrTyrGluLeuAlaMetAsnHisLeuGlyAsp65707580MetThrSerGluGluValValGlnLysMetThrGlyLeuLysValPro859095LeuSerHisSerArgSerAsnAspThrLeuTyrIleProGluTrpGlu100105110GlyArgAlaProAspSerValAspTyrArgLysLysGlyTyrValThr115120125ProValLysAsnGlnGlyGlnCysGlySerCysTrpAlaPheSerSer130135140ValGlyAlaLeuGluGlyGlnLeuLysLysLysThrGlyLysLeuLeu145150155160AsnLeuSerProGlnAsnLeuValAspCysValSerGluAsnAspGly165170175CysGlyGlyGlyTyrMetThrAsnAlaPheGlnTyrValGlnLysAsn180185190ArgGlyIleAspSerGluAspAlaTyrProTyrValGlyGlnGluGlu195200205SerCysMetTyrAsnProThrGlyLysAlaAlaLysCysArgGlyTyr210215220ArgGluIleProGluGlyAsnGluLysAlaLeuLysArgAlaValAla225230235240ArgValGlyProValSerValAlaIleAspAlaSerLeuThrSerPhe245250255GlnPheTyrSerLysGlyValTyrTyrAspGluSerCysAsnSerAsp260265270AsnLeuAsnHisAlaValLeuAlaValGlyTyrGlyIleGlnLysGly275280285AsnLysHisTrpIleIleLysAsnSerTrpGlyGluAsnTrpGlyAsn290295300LysGlyTyrIleLeuMetAlaArgAsnLysAsnAsnAlaCysGlyIle305310315320AlaAsnLeuAlaSerPheProLysMet325(2)序列3資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度329氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述序列3MetTrpGlyLeuLysValLeuLeuLeuProValValSerPheAlaLeu151015HisProGluGluIleLeuAspThrGlnTrpGluLeuTrpLysLysThr202530TyrSerLysGlnTyrAsnSerLysValAspGluIleSerArgArgLeu354045IleTrpGluLysAsnLeuLysHisIleSerIleHisAsnLeuGluAla505560SerLeuGlyValHisThrTyrGluLeuAlaMetAsnHisLeuGlyAsp65707580MetThrSerGluGluValValGlnLysMetThrGlyLeuLysValPro859095ProSerArgSerHisSerAsnAspThrLeuTyrIleProAspTrpGlu100105110GlyArgThrProAspSerIleAspTyrArgLysLysGlyTyrValThr115120125ProValLysAsnGlnGlyGlnCysGlySerCysTrpAlaPheSerSer130135140ValGlyAlaLeuGluGlyGlnLeuLysLysLysThrGlyLysLeuLeu145150155160AsnLeuSerProGlnAsnLeuValAspCysValSerGluAsnTyrGly165170175CysGlyGlyGlyTyrMetThrAsnAlaPheGlnTyrValGlnArgAsn180185190ArgGlyIleAspSerGluAspAlaTyrProTyrValGlyGlnAspGlu195200205SerCysMetTyrAsnProThrGlyLysAlaAlaLysCysArgGlyTyr210215220ArgGluIleProGluGlyAsnGluLysAlaLeuLysArgAlaValAla225230235240ArgValGlyProValSerValAlaIleAspAlaSerLeuThrSerPhe245250255GlnPheTyrSerLysGlyValTyrTyrAspGluAsnCysSerSerAsp260265270AsnValAsnHisAlaValLeuAlaValGlyTyrGlyIleGlnLysGly275280285AsnLysHisTrpIleIleLysAsnSerTrpGlyGluSerTrpGlyAsn290295300LysGlyTyrIleLeuMetAlaArgAsnLysAsnAsnAlaCysGlyIle305310315320AlaAsnLeuAlaSerPheProLysMet325(2)序列4資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度331氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述序列4MetLysArgLeuValCysValLeuLeuValCysSerSerAlaValAla151015GlnLeuHisLysAspProThrLeuAspHisHisTrpHisLeuTrpLys202530LysThrTyrGlyLysGlnTyrLysGluLysAsnGluGluAlaValArg354045ArgLeuIleTrpGluLysAsnLeuLysPheValMetLeuHisAsnLeu505560GluHisSerMetGlyMetHisSerTyrAspLeuGlyMetAsnHisLeu65707580GlyAspMetThrSerGluGluValMetSerLeuMetSerSerLeuArg859095ValProSerGlnTrpGlnArgAsnIleThrTyrLysSerAsnProAsn100105110ArgIleLeuProAspSerValAspTrpArgGluLysGlyCysValThr115120125GluValLysTyrGlnGlySerCysGlyAlaCysTrpAlaPheSerAla130135140ValGlyAlaLeuGluAlaGlnLeuLysLeuLysThrGlyLysLeuVal145150155160SerLeuSerAlaGlnAsnLeuValAspCysSerThrGluLysTyrGly165170175AsnLysGlyCysAsnGlyGlyPheMetThrThrAlaPheGlnTyrIle180185190IleAspAsnLysGlyIleAspSerAspAlaSerTyrProTyrLysAla195200205MetAspGlnLysCysGlnTyrAspSerLysTyrArgAlaAlaThrCys210215220SerLysTyrThrGluLeuProTyrGlyArgGluValAspLeuLysGlu225230235240AlaValAlaAsnLysGlyProValSerValGlyValAspAlaArgHis245250255ProSerPhePheLeuTyrArgSerGlyValTyrTyrGluProSerCys260265270ThrGlnAsnValAsnHisGlyValLeuValValGlyTyrGlyAspLeu275280285AsnGlyLysGluTyrTrpLeuValLysAsnSerTrpGlyHisAsnPhe290295300GlyGluGluGlyTyrIleArgMetAlaArgAsnLysGlyAsnHisCys305310315320GlyIleAlaSerPheProSerTyrProGluIle325330(2)序列5資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度333氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述序列5MetAsnProThrLeuIleLeuAlaAlaPheCysLeuGlyIleAlaSer151015AlaThrLeuThrPheAspHisSerLeuGluAlaGlnTrpThrLysTrp202530LysAlaMetHisAsnArgLeuTyrGlyMetAsnGluGluGlyTrpArg354045ArgAlaValTrpGluLysAsnMetLysMetIleGluLeuHisAsnGln505560GluTyrArgGluGlyLysHisSerPheThrMetAlaMetAsnAlaPhe65707580GlyAspMetThrSerGluGluPheArgGlnValMetAsnGlyPheGln859095AsnArgLysProArgLysGlyLysValPheGlnGluProLeuPheTyr100105110GluAlaProArgSerValAspTrpArgGluLysGlyTyrValThrPro115120125ValLysAsnGlnGlyGlnCysGlySerCysTrpAlaPheSerAlaThr130135140GlyAlaLeuGluGlyGlnMetPheArgLysThrGlyArgLeuIleSer145150155160LeuSerGluGlnAsnLeuValAspCysSerGlyProGlnGlyAsnGlu165170175GlyCysAsnGlyGlyLeuMetAspTyrAlaPheGlnTyrValGlnAsp180185190AsnGlyGlyLeuAspSerGluGluSerTyrProTyrGluAlaThrGlu195200205GluSerCysLysTyrAsnProLysTyrSerValAlaAsnAspThrGly210215220PheValAspIleProLysGlnGluLysAlaLeuMetLysAlaValAla225230235240ThrValGlyProIleSerValAlaIleAspAlaGlyHisGluSerPhe245250255LeuPheTyrLysGluGlyIleTyrPheGluProAspCysSerSerGlu260265270AspMetAspHisGlyValLeuValValGlyTyrGlyPheGluSerThr275280285GluSerAspAsnAsnLysTyrTrpLeuValLysAsnSerTrpGlyGlu290295300GluTrpGlyMetGlyGlyTyrValLysMetAlaLysAspArgArgAsn305310315320HisCysGlyIleAlaSerAlaAlaSerTyrProThrVal325330(2)序列6資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度335氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述序列6MetTrpAlaThrLeuProLeuLeuCysAlaGlyAlaTrpLeuLeuCys151015ValProValCysGlyAlaAlaGluLeuCysValAsnSerLeuGluLys202530PheHisPheLysSerTrpMetSerLysHisArgLysThrTyrSerThr354045GluGluTyrHisHisArgLeuGlnThrPheAlaSerAsnTrpArgLys505560IleAsnAlaHisAsnAsnGlyAsnHisThrPheLysMetAlaLeuAsn65707580GlnPheSerAspMetSerPheAlaGluIleLysHisLysTyrLeuTrp859095SerGluProGlnAsnCysSerAlaThrLysSerAsnTyrLeuArgGly100105110ThrGlyProTyrProProSerValAspTrpArgLysLysGlyAsnPhe115120125ValSerProValLysAsnGlnGlyAlaCysGlySerCysTrpThrPhe130135140SerThrThrGlyAlaLeuGluSerAlaIleAlaIleAlaThrGlyLys145150155160MetLeuSerLeuAlaGluGlnGlnLeuValAspCysAlaGlnAspPhe165170175AsnAsnTyrGlyCysGlnGlyGlyLeuProSerGlnAlaPheGluTyr180185190IleLeuTyrAsnLysGlyIleMetGlyGluAspThrTyrProTyrGln195200205GlyLysAspGlyTyrCysLysPheGlnProGlyLysAlaIleGlyPhe210215220ValLysAspValAlaAsnIleThrIleTyrAspGluGluAlaMetVal225230235240GluAlaValAlaLeuTyrAsnProValSerPheAlaPheGluValThr245250255GlnAspPheMetMetTyrArgThrGlyIleTyrSerSerThrSerCys260265270HisLysThrProAspLysValAsnHisAlaValLeuAlaValGlyTyr275280285GlyGluLysAsnGlyIleProTyrTrpIleValLysAsnSerTrpGly290295300ProGlnTrpGlyMetAsnGlyTyrPheLeuIleGluArgGlyLysAsn305310315320MetCysGlyLeuAlaAlaCysAlaSerTyrProIleProLeuVal325330335(2)序列7資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度339氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述序列7MetTrpGlnLeuTrpAlaSerLeuCysCysLeuLeuValLeuAlaAsn151015AlaArgSerArgProSetPheHisProValSerAspGluLeuValAsn202530TyrValAsnLysArgAsnThrThrTrpGlnAlaGlyHisAsnPheTyr354045AsnValAspMetSerTyrLeuLysArgLeuCysGlyThrPheLeuGly505560GlyProLysProProGlnArgValMetPheThrGluAspLeuLysLeu65707580ProAlaSerPheAspAlaArgGluGlnTrpProGlnCysProThrIle859095LysGluIleArgAspGlnGlySerCysGlySerCysTrpAlaPheGly100105110AlaValGluAlaIleSerAspArgIleCysIleHisThrAsnAlaHis115120125ValSerValGluValSerAlaGluAspLeuLeuThrCysCysGlySer130135140MetCysGlyAspGlyCysAsnGlyGlyTyrProAlaGluAlaTrpAsn145150155160PheTrpThrArgLysGlyLeuValSerGlyGlyLeuTyrGluSerHis165170175ValGlyCysArgProTyrSerIleProProCysGluHisHisValAsn180185190GlySerArgProProCysThrGlyGluGlyAspThrProLysCysSer195200205LysIleCysGluProGlyTyrSerProThrTyrLysGlnAspLysHis210215220TyrGlyTyrAsnSerTyrSerValSerAsnSerGluLysAspIleMet225230235240AlaGluIleTyrLysAsnGlyProValGluGlyAlaPheSerValTyr245250255SerAspPheLeuLeuTyrLysSerGlyValTyrGlnHisValThrGly260265270GluMetMetGlyGlyHisAlaIleArgIleLeuGlyTrpGlyValGlu275280285AsnGlyThrProTyrTrpLeuValAlaAsnSerTrpAsnThrAspTrp290295300GlyAspAsnGlyPhePheLysIleLeuGlyGlyGlnAspHisCysGly305310315320IleGluSerGluValValAlaGlyIleProArgThrAspGlnTyrTrp325330335GluLysIle(2)序列8資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列8GGATACGTTACNCCNGT17(2)序列9資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列9GCCATGAGRTANCC14(2)序列10資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述序列10AlaProAspSerValAspTyrArgLysLysGlyTyrValThrProVal151015LysAsn(2)序列11資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列11CTGGATCCCTGTACCCTGAGGAGATACTG29(2)序列12資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列12CTAAGCTTCTATCTACCTTCCCATTCTGGGATA3權(quán)利要求1.一種重組人組織蛋白酶O2蛋白，其氨基酸序列與圖1所示的氨基酸序列(序列2)至少有約95％同源。2.如權(quán)利要求1的一種重組人組織蛋白酶O2蛋白，其氨基酸序列(序列2)如圖1所示。3.如權(quán)利要求1的一種重組組織蛋白酶O2蛋白，它包括早期原組織蛋白酶O2蛋白。4.如權(quán)利要求1的一種重組組織蛋白酶O2蛋白，它包括原組織蛋白酶O2蛋白。5.如權(quán)利要求1的一種重組組織蛋白酶O2蛋白，它包括組織蛋白酶O2蛋白的原初部分。6.編碼一種人組織蛋白酶O2蛋白的一種重組核酸。7.如權(quán)利要求6的一種重組核酸，它能與圖1所示的核酸序列(序列1)雜交。8.如權(quán)利要求6的一種重組核酸，其中所述組織蛋白酶O2蛋白包含早期原組織蛋白酶O2蛋白。9.如權(quán)利要求6的一種重組核酸，其中所述的組織蛋白酶O2蛋白含有原組織蛋白酶O2蛋白。10.如權(quán)利要求6的一種重組核酸，它含有組織蛋白酶O2蛋白的原初部分。11.如權(quán)利要求7的核酸，它含有一種DNA，其序列與圖1所示序列(序列1)至少有約95％同源。12.如權(quán)利要求8的一種重組核酸，其序列如圖1所示(序列1)。13.一種表達(dá)載體，含有可操作地與編碼人組織蛋白酶O2蛋白連接的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)DNA。14.一種用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中含有編碼一種人組織蛋白酶O2蛋白的一種核酸。15.制備一種人組織蛋白酶O2蛋白的一種方法，包括a)培養(yǎng)用一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，該載體包括一種編碼一種組織蛋白酶O2蛋白的核酸；和b)表達(dá)所述核酸以制備一種組織蛋白酶O2蛋白。16.結(jié)合組織蛋白酶O2蛋白的一種抗體。17.權(quán)利要求16的抗體，其中所述組織蛋白酶O2蛋白是成熟的組織蛋白酶O2蛋白。18.權(quán)利要求16的抗體，其中所述組織蛋白酶O2蛋白是原組織蛋白酶O2蛋白。19.權(quán)利要求16的抗體，其中所述組織蛋白酶O2蛋白是組織蛋白酶O2蛋白的原初部分。20.權(quán)利要求16的抗體，其為單克隆抗體。全文摘要本發(fā)明涉及組織蛋白酶O2蛋白、核酸和抗體。文檔編號(hào)C12N1/21GK1170415SQ95196841公開日1998年1月14日申請(qǐng)日期1995年10月26日優(yōu)先權(quán)日1994年10月27日發(fā)明者迪特爾·布羅米,凱瑟琳·奧凱莫特申請(qǐng)人:阿里斯制藥公司