專利名稱：新的賴氨酸脫羧酶基因以及生產(chǎn)l－賴氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大腸桿菌的一種新的賴氨酸脫羧酶基因，它與L-賴氨酸的降解有關(guān)，本發(fā)明還涉及一種屬于埃希氏桿菌屬的微生物，這種微生物對此基因和/或另外一種被稱為cadA的L-賴氨酸脫羧酶基因表現(xiàn)出限制性表達(dá)。此外還涉及到一種通過微生物合成L-賴氨酸的方法。最近，對L-賴氨酸作為一種食品添加劑的需求正在迅速增長。
背景技術(shù)：
賴氨酸脫羧酶催化L-賴氨酸脫羧生成1，5-戊二胺，這個酶被稱為大腸桿菌L-賴氨酸降解酶。其基因的核苷酸序列被稱為cadA，這個基因編碼的氨基酸序列已經(jīng)發(fā)表(Meng，S.和Bennett，G.N.，J.Bacteriol.，174.2659(1992))。有關(guān)除大腸桿菌cadA序列以外的編碼賴氨酸脫羧酶的基因已有2篇報(bào)導(dǎo)，其中描述說，在大腸桿菌突變株中測到過微弱的酶活性(Goldemberg，S.H.，J.Bacteriol.，141，1428(1980)；Wertheimer，S.J.和Leifer，Z.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，114，882(1983))。然而，Goldemberg，S.H.曾報(bào)導(dǎo)說此酶活性在60℃加熱4分鐘后降低約30％。但是，Wertheimer，S.J.等人的報(bào)導(dǎo)則沒有觀察到這個現(xiàn)象。由此，確定了在第二種賴氨酸脫羧酶的存在。
另一方面，用大腸桿菌生產(chǎn)L-賴氨酸的已知方法包括培養(yǎng)對賴氨酸類似物有抗性的突變株，或培養(yǎng)攜載了帶有L-賴氨酸生物合成遺傳信息的脫氧核酸的載體的重組菌株(日本專利公開No.56-18596)。然而沒有任何報(bào)導(dǎo)涉及用具有賴氨酸脫羧酶基因限制性表達(dá)的埃希氏桿菌屬微生物生產(chǎn)L-賴氨酸。
發(fā)明公開本發(fā)明的一個目的是獲得大腸桿菌的新的賴氨酸脫羧酶基因；生成一種屬于埃希氏桿菌屬的產(chǎn)L-賴氨酸微生物，它對此基因和/或cadA基因表現(xiàn)出限制性表達(dá)；提供一種通過培養(yǎng)埃希氏桿菌屬微生物生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。
本發(fā)明人在構(gòu)建一種已知的賴氨酸脫羧酶基因即cadA基因受到損壞的大腸桿菌菌株時，發(fā)現(xiàn)作為賴氨酸脫羧酶降解L-賴氨酸的產(chǎn)物的1，5-戊二胺依然在此菌株中產(chǎn)生。因此，本發(fā)明人推測在大腸桿菌中應(yīng)存在一種新的賴氨酸脫羧酶基因，而且通過使用埃希氏桿菌屬微生物可對L-賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)生很大影響。在進(jìn)行了此基因的克隆實(shí)驗(yàn)之后，本發(fā)明人成功地得到了不同于cadA基因的新的L-賴氨酸脫羧酶基因。另外還發(fā)現(xiàn)通過此基因和cadA基因在大腸桿菌L-賴氨酸生產(chǎn)菌株中的限制性表達(dá)，使L-賴氨酸降解活性顯著降低或消失，并使L-賴氨酸產(chǎn)量明顯增加。由此，完成了此項(xiàng)發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明提供一種編碼大腸桿菌L-賴氨酸脫羧酶的新的基因。把這個基因命名為“l(fā)dc”基因。
另一方面，本發(fā)明提供一種屬于產(chǎn)L-賴氨酸的埃希氏桿菌屬的微生物，這種微生物細(xì)胞內(nèi)的賴氨酸脫羧酶活性降低或消失。
此外，本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)賴氨酸的方法，這個方法包括在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述埃希氏桿菌屬微生物，使之生產(chǎn)L-賴氨酸并積累于培養(yǎng)液中，然后收集L-賴氨酸。
上述屬于埃希氏桿菌屬的微生物包括這樣一種微生物，其細(xì)胞內(nèi)的賴氨酸脫羧酶活性由于ldc基因和/或cadA基因的限制性表達(dá)而降低或消失。
本發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容敘述如下。<1>制備含有新的賴氨酸脫羧酶基因的DNA片段含有本發(fā)明的新的賴氨酸脫羧酶基因(ldc)的DNA片段可從已有的大腸桿菌菌株，例如K-12或其衍生菌株得到。
首先，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(下稱“PCR方法”)從由大腸桿菌中分離到的W3110株的染色體DNA中獲得已知的賴氨酸脫羧酶基因，cadA基因。cadA基因的核苷酸序列和由其編碼的氨基酸序列分別在SEQ ID NO5和6中給出。通過使用質(zhì)?；蚴删w載體確認(rèn)是否在DNA片段中含有新的賴氨酸脫羧酶基因的方法，從大腸桿菌W3110的染色體DNA文庫中克隆與cadA基因序列相似的DNA片段。用PCR方法制備探針進(jìn)行Southern雜交確認(rèn)克隆中確實(shí)含有目的基因。
確認(rèn)存在于如此得到的DNA片段中的目的基因核苷酸序列的方法如下。首先，將此DNA片段與在大腸桿菌細(xì)胞中可自主復(fù)制的質(zhì)粒載體相連接，以制備用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的重組DNA。所得到的轉(zhuǎn)化子在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并從增殖細(xì)胞中回收重組DNA。用雙脫氧法(Sanger，F(xiàn).等，Proc.Natl.Acad.sci.，74，5463(1977))檢測回收重組DNA中所含DNA片段的全部核苷酸序列。對DNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析以確定啟動子、操縱子、SD序列、起始密碼子、終止密碼子、開放閱讀框架等所在位置。
本發(fā)明的新的賴氨酸脫羧酶基因具有序列表中SEQ ID NO3所示DNA片段中全部核苷酸序列的第1005-1007核苷酸ATG到第3141-3143核苷酸GGA的序列。這個基因編碼的賴氨酸脫羧酶氨基酸序列在序列表SEQ ID NO4中給出。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，新的賴氨酸脫羧酶與cadA基因編碼的賴氨酸脫羧酶基因的同源性是69.4％。
本發(fā)明的基因可以是序列表中SEQ ID NO4所給出的賴氨酸脫羧酶氨基酸序列的編碼序列，也可以是不限于上述核苷酸序列的一段核酸序列。本發(fā)明的基因編碼的賴氨酸脫羧酶氨基酸序列可以有一個或多個氨基酸替換、缺失或插入而不會引起賴氨酸脫羧酶活性的實(shí)質(zhì)退化。具有這類缺失、插入或替換的賴氨酸脫羧酶基因可以從大腸桿菌的自發(fā)突變或人工誘變株中得到，也可以從大腸桿菌以外的埃希氏屬微生物中得到。對具有SEQ ID NO4氨基酸序列的賴氨酸酶基因?qū)嵭畜w外突變或定點(diǎn)誘變可獲得編碼這種具有缺失、插入或替換的賴氨酸脫羧酶突變基因。這些突變的處理可以按照本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟知的方法進(jìn)行，如下所述。
然而，本文涉及的編碼含有一個或多個氨基酸替換、缺失或插入的賴氨酸脫羧酶基因包括那些來源于“l(fā)dc”基因和可以被認(rèn)為實(shí)質(zhì)上與ldc-基因相同的基因。這并不是要將此含義延伸到那些不同來源的基因。也不可能對“多個”的確切范圍做具體描述。但對本領(lǐng)域的專業(yè)人員來說不難理解，例如與SEQ ID NO3有200個以上的氨基酸殘基不同的蛋白質(zhì)，編碼這個蛋白質(zhì)的cadA基因與本發(fā)明的基因是不同的。而對那些編碼有同樣賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)的基因，即使其編碼的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO3氨基酸序列有2至3個氨基酸殘基的差異，仍包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。<2>建立能夠限制性表達(dá)賴氨酸脫羧酶基因的埃希氏桿菌屬微生物本發(fā)明的微生物是一種細(xì)胞內(nèi)賴氨酸脫羧酶活性降低或消失的埃希氏桿菌屬微生物。這種埃希氏桿菌屬微生物包括大腸桿菌。其細(xì)胞內(nèi)賴氨酸脫羧酶活性的降低或消失是通過諸如新的賴氨酸脫羧酶基因(ldc)和上述已知的cadA基因中任意一個或兩個基因同時進(jìn)行的限制性表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。另外，細(xì)胞內(nèi)賴氨酸脫羧酶活性的降低和消失也可以通過修飾酶的結(jié)構(gòu)，使這些基因編碼的賴氨酸脫羧酶的專一性活性降低或消失來實(shí)現(xiàn)。
使ldc基因和已知的cadA基因進(jìn)行限制性表達(dá)的方法包括基因轉(zhuǎn)錄水平的限制性表達(dá)。這是通過這類基因的啟動子序列中一個或多個核苷酸替換、缺失、插入、添加或倒位而使啟動子活性降低的方式實(shí)現(xiàn)的(M.Rosenberg和D.Court，Ann.Rev.Genetics 13(1979)P.319，P.Youderian，S.Bouvier和M.Susskind，Cell 30(1982)P.843-853)。另一種方法是通過使SD序列和起始密碼之間的區(qū)域中一個或多個核苷酸發(fā)生替換、缺失、插入、添加或倒位從而在轉(zhuǎn)錄水平上限制這些基因的表達(dá)(J.T.Dunn，E.Buzash-Pollert和F.W.Studier，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，75(1978)P.2743)。此外，為使賴氨酸脫羧酶專一性降低或消失，可使用一種方法，即使編碼區(qū)的核苷酸序列中一個或多個核苷酸發(fā)生替換、缺失、插入、添加或倒位，從而使賴氨酸基因編碼區(qū)被修飾或破壞。
除上述ldc或cadA基因外，這類允許發(fā)生核苷酸替換、缺失、插入、添加或倒位的基因也可以是有一個或多個氨基酸替換、缺失或插入?yún)s不使其編碼的賴氨酸脫羧酶基本活性退化的那些ldc或cadA基因。
引起基因中核苷酸替換、缺失、插入、添加或倒位的方法還包括定點(diǎn)突變的方法(Kramer，W.和Frits，H.J.，Mothods in Engymology.，154，350(1987))，和一種用諸如亞硫酸鈉和羥胺等化合物處理的方法(Shortle.D.和Nathans，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75，270(1978))。
定點(diǎn)突變是一種用合成的寡核苷酸使選擇性替換、缺失、插入、添加或倒位引入到選定的有限核苷酸對的技術(shù)。要使用這種技術(shù)，首先得使質(zhì)粒變性成單鏈，該質(zhì)粒中克隆有帶特定DNA序列的目的基因。然后合成與希望的突變部位互補(bǔ)的寡核苷酸。但此方法中合成的寡核苷酸不要有完全互補(bǔ)的序列，而應(yīng)被設(shè)計(jì)成具有可任選的核苷酸替換缺失、插入、添加或倒位。此后，將上述單鏈DNA與有可任選的替換、缺失、插入、添加或倒位的合成寡核苷酸進(jìn)行退火。用T4連接酶和DNA聚合酶I的Klenow片段合成完整的雙鏈質(zhì)粒，并導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。由此獲得轉(zhuǎn)化子。質(zhì)粒中所具有的可任選的核苷酸替換、缺失、插入、添加或倒位被固定下來。重組PCR方法(PCR Technology，Stockton press(1989))與上述方法類似，也可以引入突變使基因被修飾或受到破壞。
化學(xué)試劑法直接用連二亞硫酸鈉、羥胺等處理含目的基因的DNA片段，使其發(fā)生隨機(jī)的堿基替換、缺失、插入、添加或倒位等基因突變。
通過用上述誘變中得到的被修飾或被破壞的基因取代埃希氏桿菌屬微生物染色體中的正常基因可抑制細(xì)胞中l(wèi)dc基因和/或cadA基因的表達(dá)。這種取代基因的方法包括使用同源重組(分子遺傳實(shí)驗(yàn)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1972)；Matsuyama，S.和Mizushima，S.，J.Bacteriol.，162，1196(1985))。同源重組基于埃希氏桿菌屬微生物普遍具有的能力。當(dāng)與染色體有同源序列的質(zhì)粒等被引入細(xì)胞時，在有同源序列的部位就會發(fā)生一定頻率的重組，并使整個質(zhì)粒結(jié)合到染色體上。此后若又有重組在此部位發(fā)生，這個質(zhì)粒就會從染色體上脫落。而有時在此過程中引入的突變更容易固定在染色體上。這取決于重組的位置和與質(zhì)粒一起脫落的原本是正常的基因。篩選這樣的菌株可以得到染色體上正?；蚣罕黄茐牧说幕蛐揎椓说幕蛩〈木?。而通過引入核苷酸替換，缺失，插入、添加或倒位所造成的突變，就可得到這種被破壞或被修飾的基因。
經(jīng)過基因取代的埃希氏桿菌屬微生物具有賴氨酸生產(chǎn)活性。這種有賴氨酸生產(chǎn)活性的埃希氏桿菌屬微生物，比如大腸桿菌微生物菌株可以通過對沒有賴氨酸生產(chǎn)活性的菌株施以誘變處理而得到。這種誘變處理可使此微生物具有對賴氨酸類似物如S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(下稱“AEC”)具有抗性。這類突變處理方法包括用化學(xué)試劑如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍和亞硝酸處理大腸桿菌細(xì)胞或用紫外照射、輻射或類似方法處理大腸桿菌細(xì)胞。尤其是，這種微生物菌株包括大腸桿菌AJ13069(FERMP14690)。它由大腸桿菌K-12的W3110菌株獲得AEC抗性后形成的。大腸桿菌AJ13069于1994年12月6日起保存在國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(郵編305，1-3，Higashi1-Chome，Tsukuba-Shi，Ibarakiken，Japan)保藏號FERM P-14690，并于1995年9月29日按布達(dá)佩斯協(xié)議轉(zhuǎn)送到國際保藏中心。保藏號是FERM BP-5262。
通過基因重組技術(shù)引入并增強(qiáng)攜帶與L-賴氨酸生物合成有關(guān)的遺傳信息的DNA也可以得到產(chǎn)L-賴氨酸活性的大腸桿菌菌株。所引入的基因是編碼L-賴氨酸生物合成途徑中各種酶的基因，比如天冬氨酸激酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶和琥珀酰二氨基庚二酸脫?；浮．?dāng)基因所編碼的酶被L-賴氨酸反饋抑制，比如天冬氨酸激酶或二氫吡啶二羧酸合成酶的情況下，最好使用突變型基因，這種基因編碼的酶由于抑制作用而脫敏。為了引入和增強(qiáng)這類基因，可以采用一種方法即將這類基因連接到在大腸桿菌細(xì)胞中可自主復(fù)制的載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌以得到重組DNA。或者也可以通過使用轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)座(Berg，D.E和Berg，C.M.Bio/Technol.，1，417(1983))，Mu噬菌體(日本專利公開No.2-109985)或同源重組(分子遺傳實(shí)驗(yàn)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1972))將此基因結(jié)合到宿主染色體上。
其它獲得攜帶功能損壞的基因的埃希氏桿菌屬微生物的方法包括用化學(xué)試劑如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍和亞硝酸處理，或用紫外照射，輻射等處理帶有目的基因的埃希氏桿菌屬微生物，使其發(fā)生遺傳突變。
在下面實(shí)施例中，帶有功能損壞的基因的埃希氏桿菌菌株是通過下述方法建立的。即，使其編碼區(qū)部分缺失，在缺失部位插入藥物抗性基因。這樣就會得到可以利用上述同源重組法的賴氨酸脫羧酶基因以代替大腸桿菌染色體上的賴氨酸脫羧酶基因。
在一個微生物菌株中的本發(fā)明的新的賴氨酸脫羧酶基因和cadA基因的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用或?qū)ζ渲腥我环N產(chǎn)生抑制作用都是可能的。在具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力的埃希氏桿菌屬微生物中，賴氨酸脫羧酶基因的表達(dá)會受到限制，或按上面介紹的方法，可以使賴氨酸脫羧酶基因呈現(xiàn)限制性表達(dá)的埃希氏桿菌屬微生物具備L-賴氨酸生產(chǎn)能力。<3>利用賴氨酸脫羧酶基因呈限制性表達(dá)的埃希氏桿菌屬微生物的L-賴氨酸生產(chǎn)通過培養(yǎng)用上述方法獲得的具有限制性表達(dá)賴氨酸脫羧酶基因的埃希氏桿菌屬微生物在培養(yǎng)液中生產(chǎn)和積累可觀量的L-賴氨酸。只有通過已知的cadA基因的限制性表達(dá)才能增加L-賴氨酸的積累量。但是，本發(fā)明的新的賴氨酸脫羧酶基因的表達(dá)限制對增加L-賴氨酸的收獲量更有效。通過使用cadA基因和本發(fā)明的新的基因的表達(dá)都受到限制的菌株可達(dá)到L-賴氨酸生產(chǎn)的最理想的效果。
L-賴氨酸生產(chǎn)用的培養(yǎng)基是普通培養(yǎng)基，含有碳源、氮源、無機(jī)離子和可任選的其它微量有機(jī)營養(yǎng)源。碳源可以用糖類如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物；醇類如甘油、山梨醇；有機(jī)酸如延胡索酸、檸檬酸、琥珀酸。氮源可用無機(jī)銨鹽如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨；有機(jī)氮源如大豆水解物；氨氣；氨水。無機(jī)離子有磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子及其它少量添加物。除此之外，最好還有維生素B1，適量酵母浸膏等作為微量有機(jī)營養(yǎng)源。
培養(yǎng)優(yōu)選地在有氧條件下持續(xù)16-72小時。培養(yǎng)溫度控制在30℃至45℃，pH值控制在5至7?？捎脽o機(jī)或有機(jī)的酸性或堿性的物質(zhì)，或氨氣等調(diào)節(jié)pH值。
充分培養(yǎng)后，收集發(fā)酵液中的L-賴氨酸。收集方法可根據(jù)具體情況將普通離子交換樹脂法，沉淀法或其它已知方法結(jié)合起來進(jìn)行。
附圖簡述

圖1顯示含有新的賴氨酸脫羧酶基因的質(zhì)粒pUC6F5HH5的結(jié)構(gòu)。圖2顯示含有新的賴氨酸脫羧酶基因的溫度敏感質(zhì)粒pTS6F5HH5的結(jié)構(gòu)以及pTS6F5HH5Cm質(zhì)粒的構(gòu)建。其中這個基因的一部分被含有氯霉素抗性基因的片段替換。圖3顯示帶有正常賴氨酸脫羧酶基因的菌株WC196和WC196C，WC196L以及帶有受損的賴氨酸脫羧酶基因的菌株WC196LC之間L-賴氨酸降解活性的比較。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方案下面參照實(shí)施例對本發(fā)明做更詳細(xì)的解釋。
實(shí)施例1(1)新的賴氨酸脫羧酶基因克隆按常規(guī)方法從來自National of Genetics(Yata 1111，Mishima-Shi，Shizuoka-ken，Japan)的大腸桿菌K-12 W3110菌株細(xì)胞中提取染色體DNA。同時，以Meng，S.和Bennett，G.N.，J.Bacteriol，174，2659(1992)中描述的cadA基因的核酸序列(見SEQ ID NO5)為基準(zhǔn)用常規(guī)方法合成序列表中給出的SEQ ID NOS1和2兩個合成的DNA引物。它們分別與cadA基因的5′端上游序列和3′端序列同源。在按照Erlich等人(PCR Technology，Stockton press(1989))的方法做PCR實(shí)驗(yàn)時使用此染色體DNA和這對DNA引物。這樣得到的2.1kb片段含有幾乎全部cadA基因。這個片段用隨機(jī)引物標(biāo)記盒(Takara Shuzo生產(chǎn))和[α-32P]dcTP(Amersham Japan生產(chǎn))進(jìn)行標(biāo)記以制備雜交探針。
下一步，用制備好的探針和大腸桿菌/Gene Mapping膜(TakaraShuzo生產(chǎn))按常規(guī)方法進(jìn)行雜交(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，第二版(1989))。Kohara等人的基因文庫(大腸桿菌染色體DNAλ噬菌體文庫見Kohara，.Y.等.，Cell 50，495-508(1987))已事先吸附在大腸桿菌/Gene Mapping膜上面。在雜交時，通過弱化探針洗脫條件(2×SSC，55℃30分鐘)富集有類似于cadA基因序列的λ噬菌體克隆。結(jié)果，除了在含有cadA基因區(qū)(21H11，5G7)克隆中找到強(qiáng)標(biāo)記外，還在三個噬菌體克隆E2B8、6F5H和10F9中成功地發(fā)現(xiàn)弱標(biāo)記信號。三個λ噬菌體克隆E2B8、6F5H、10F9的插入序列是相互交疊連續(xù)的大腸桿菌染色體片段。由此，用常規(guī)方法分離出Kohara等人的基因文庫中6F5Hλ噬菌體DNA并進(jìn)行各種限制酶解，以便用上述探針以及與上述類似的方法進(jìn)行印跡雜交。結(jié)果表明，用HindIII酶解得到的5kbp DNA片段與cadA基因序列相似。
用T4連接酶將HindIII酶解6F5Hλ噬菌體DNA所得到的5kbp片段與質(zhì)粒pUC19(Takara Shuzo生產(chǎn))HindIII酶解物相連。將此混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(Takara Shuzo生產(chǎn))得到在加入50mg/ml氨芐青霉素的完全平板培養(yǎng)基(10克蛋白胨，5克酵母浸膏，5克氯化鈉溶于1升水中)上能生長的氨芐青霉素抗性菌株。由此得到的微生物菌株含有一插入HindIII酶解6F5Hλ噬菌體DNA所得5kbp片段的質(zhì)粒。從這些細(xì)胞中抽提質(zhì)粒就得到質(zhì)粒pUC GF5HH5。圖1表示質(zhì)粒pUC6F5HH5的結(jié)構(gòu)。
含有此質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pUC6F5HH5被命名為AJ13068于1994年12月6日保藏在國立生命科學(xué)與人體技術(shù)研究所保藏號是FERMP-14689，并于1995年9月29日按布達(dá)佩斯協(xié)議轉(zhuǎn)移到國際保藏中心，其保藏號是FERM BP-5251。(2)確定新的賴氨酸脫羧酶基因的核苷酸序列pUC 6F5HH5中ClaI和HindIII限制酶切點(diǎn)之間的核酸序列按分子克隆(第二版)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989中描述的方法測定。結(jié)果顯示此核酸序列就是序列表中SEQ ID NO3所編碼的序列。此DNA序列含有一開放閱讀框架，其編碼的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO4所示。(3)制備具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力的大腸桿菌大腸桿菌W3110在完全培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)4小時(含10克蛋白胨，5克酵母浸膏，5克氯化鈉，溶于1升水)，得到的微生物細(xì)胞用濃度為200微克/毫升的N-甲基-N′硝基-N亞硝基胍37℃處理30分鐘，清洗，再轉(zhuǎn)到基本平板培養(yǎng)基(含7克磷酸氫二鈉，3克磷酸二氫鉀，1克氯化銨，0.5克氯化鈉，5克葡萄糖，0.25克7水硫酸鎂，15克瓊脂溶于1升水)。其中加入5克/升AEC。經(jīng)37℃48小時培養(yǎng)后分離出現(xiàn)的克隆即得到AEC抗性菌株。WC196株作為其中之一具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力。WC196菌株被命名為AJ69于1994年12月6日保藏在國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，保藏號是FERM P-14690，并于1995年9月29日按布達(dá)佩斯協(xié)議轉(zhuǎn)入國際保藏中心，保藏號是FERM BP-5252。(4)建立新的賴氨酸脫羧酶基因功能受損的WC196菌株用T4 DNA連接酶將上述HindIII酶解6F5Hλ噬菌體DNA得到的5kbp片段與HindIII酶解的溫度敏感質(zhì)粒pMAN031相連接(Yasueda，H等)，Appl.Microbiol，Biotechnol，36，211(1991))。此反應(yīng)混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，然后在加有50毫克/升氨芐青霉素的完全培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24小時以使氨芐青霉素抗性菌株生長。由此得到的微生物菌株帶有插入HindIII酶解的6F5Hλ噬菌體DNA 5Kbp片段。從此細(xì)胞中提取質(zhì)粒得到pTS6F5HH5質(zhì)粒。將質(zhì)粒pTS6F5HH5用EcoRV酶解以除去其中的1kbp DNA片段。然后用T4連接酶將從pHSG 399(TakaraShuzo)經(jīng)AccI酶解得到的約1kbp氯霉素抗性基因片段插入其中。由此構(gòu)建成質(zhì)粒pTS6F5HH5Cm。此操作結(jié)果使我們成功構(gòu)建了新的賴氨酸脫羧酶基因功能受損的DNA片段質(zhì)粒。圖2表示質(zhì)粒pTS6F5HH5結(jié)構(gòu)和質(zhì)粒pTS6F5HH5Cm的結(jié)構(gòu)。
下一步，采用一般同源重組技術(shù)(Matsuyama，S.和Mizushima，S.，J.Bacteriol.162，1196(1985))，利用質(zhì)粒pTS6F5HH5Cm的溫度敏感性建立菌株。在此菌株中，WC196染色體上的新的賴氨酸脫羧酶基因被功能受損的新的賴氨酸脫羧酶基因DNA片段所取代。就是說，用質(zhì)粒pTS6F5HH5Cm轉(zhuǎn)化WC196，先獲得在30℃下對青霉素和氯霉素有抗性的菌株。s然后再由此菌株獲得42℃下對氨芐青霉素和氯霉素有抗性的菌株。再進(jìn)一步由此菌株得到30℃下對氨芐青霉素敏感而對氯霉素有抗性的菌株。這樣建立的菌株，其WC196株的染色體上新的賴氨酸脫羧酶基因被功能受損的新的賴氨酸脫羧酶基因DNA片段所取代。此菌株被命名為WC196L。(5)建立cadA基因缺陷型WC196菌株和WC196L菌株已知的賴氨酸脫羧酶基因cadA受損的大腸桿菌己為人們所知，包括例如來源于大腸桿菌K-12的GNB10181菌株(見Auger，E.A.等人Mol，Microbiol，3，609(1989))；此菌株可以從大腸桿菌遺傳貯備中心(Connecticut，USA)得到。已經(jīng)證明此菌株的cadA基因區(qū)是缺陷的。因此，GNB10181株的cadA基因缺陷特點(diǎn)由通用的P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)方法轉(zhuǎn)導(dǎo)給WC196從而創(chuàng)建了WC196C菌株。WC196株的cadA基因缺陷由核酸印跡雜交確認(rèn)。此外，帶有cadA基因缺陷的WC196LC菌株也通過與上述類似的方法建立。
實(shí)施例2(1)WC196、WC16C、WC196L和WC196LC菌株的賴氨酸降解活性的確定如上述建立的4個菌株在產(chǎn)賴氨酸培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)17小時(培養(yǎng)基含40克葡萄糖，16克硫酸銨，1克硫酸二氫鉀，2克酵母浸膏，10毫克4水或5水硫酸錳，10毫克7水硫酸鐵，溶于1升水；pH值用氫氧化鉀調(diào)到7.0，然后加30克無菌的碳酸鉀)。收集的微生物細(xì)胞用生理鹽水洗2次，懸浮在用于檢測的賴氨酸降解培養(yǎng)基中(含17克磷酸氫二鉀，3克磷酸二氫鉀，0.5克氯化鈉，10克L-賴氨酸鹽酸鹽，溶于1升水)。37℃培養(yǎng)31小時。
圖3顯示隨時間延續(xù)，培養(yǎng)基中剩余L-賴氨酸量的變化。L-賴氨酸量由AS-210 Biotech Analyzer(Asahi Chemical Industry)測定?？捎^察到WC196菌株中L-賴氨酸明顯降解。然而在已知賴氨酸脫羧酶基因cadA基因缺陷的WC196菌株，L-賴氨酸降解度略有下降。在帶有功能受損的賴氨酸脫羧酶基因的菌株WC196L和WC196LC中沒有觀察到L-賴氨酸降解。培養(yǎng)時間達(dá)3小時時，任何一種菌株內(nèi)剩余L-賴氨酸的量都有下降。但這種下降是因?yàn)長-賴氨酸進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)而不是降解造成的。(2)由WC196、WC196C、WC196L和WC196LC菌株生產(chǎn)L-賴氨酸上述四種菌株在前述L-賴氨酸生產(chǎn)用培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)20小時。在培養(yǎng)液中可檢測到L-賴氨酸和1，5-戊二胺的產(chǎn)生量和累積量。L-賴氨酸的量可用前述Biotech Analyser AS-210定量測定。1，5-戊二胺則用高壓液相層析定量測定。
結(jié)果如表1所示。與WC196相比，帶有功能受損的cadA.基因的WC196C，其L-賴氨酸的累積量增加而作為L-賴氨酸降解產(chǎn)物的1，5-戊二胺的累積量減少。與WC196和WC196C相比，帶有功能受損的新的賴氨酸脫羧酶基因的WC196L菌株也表現(xiàn)同樣的結(jié)果。而在攜帶這兩種功能受損的賴氨酸脫羧酶基因的WC196LC菌株中只檢測到L-賴氨酸累積量的進(jìn)一步增加卻檢測不到其降解產(chǎn)物1，5-戊二胺。
表1微生物菌株L-賴氨酸累積量1，5-戊二胺累積量(克/升)(克/升)WC196 1.40.6WC196C 1.90.4WC196L 2.30.1WC196LC3.3未檢測實(shí)施例3用含有新的賴氨酸脫羧酶基因的pUC6F5HH5轉(zhuǎn)化具有L-賴氨酸降解活性消失特點(diǎn)的大腸桿菌WC196LC以使其獲得氨芐青霉素抗性。WC196LC菌株和WC196LC/pUC6F5HH5菌株在添加有5克/升賴氨酸的生產(chǎn)賴氨酸用培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16小時，然后檢測1，5-戊二胺。
結(jié)果如表2所示。WC196LC菌株不能將L-賴氨酸轉(zhuǎn)化成1，5-戊二胺而WC196LC/pUC6F5HH5菌株有能力將L-賴氨酸轉(zhuǎn)化成1，5-戊二胺。
表2微生物菌株 1，5-戊二胺產(chǎn)量(克/升)WC196LC 未檢測WC196LC/pUC6F5HH5 0.93工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的新的賴氨酸脫羧酶基因與大腸桿菌的L-賴氨酸降解有關(guān)。培養(yǎng)上述基因和/或cadA基因呈限制表達(dá)并具有產(chǎn)L-賴氨酸活性的埃希氏桿菌屬菌株還可低成本高效率地生產(chǎn)L-賴氨酸。
序列表(1)一般資料(i)申請人AJINOMOTO Co.，Inc.
(ii)發(fā)明名稱NOVEL LYSINE DECARBOXYLASE GENE AND METHOD OFPRODUCING L-LYS INE(iii)序列數(shù)6(iv)相關(guān)地址(A)收信人(B)街道(C)城市(D)州(E)國家(F)郵編(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件FastSEQ Version1.5(vi)當(dāng)前申請資料(A)申請?zhí)?B)提交日期(C)分類(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?B)提交日期(viii)律師/代理人資料(A)姓名(B)注冊號(ix)遠(yuǎn)程通訊資料(A)電話(B)電傳(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義無(ix)序列描述SEQ ID NO1TGGATAACCA CACCGCGTCT 20(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義有(ix)序列描述SEQ ID NO2GGAAGGATCA TATTGGCGTT 20(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度3269個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(vi)來源(A)生物體大腸桿菌(B)菌株W3110(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵字CDS(B)位置1005至3143(ix)序列描述SEQ ID NO3ATCGATTCTC TGACTGCGGT TAGCCGTCAG GATGAGAAAC TGGATATTAA CATCGATGAA 60GAAGTGCATC GTCTGCGTGA AAAAAGCGTA GAACTGACAC GTAAAATCTT CGCCGATCTC120GGTGCATGGC AGATTGCGCA ACTGGCACGC CATCCACAGC GTCCTTATAC CCTGGATTAC180GTTCGCCTGG CATTTGATGA ATTTGACGAA CTGGCTGGCG ACCGCGCGTA TGCAGACGAT240AAAGCTATCG TCGGTGGTAT CGCCCGTCTC GATGGTCGTC CGGTGATGAT CATTGGTCAT300CAAAAAGGTC GTGAAACCAA AGAAAAAATT CGCCGTAACT TTGGTATGCC AGCGCCAGAA360GGTTACCGCA AAGCACTGCG TCTGATGCAA ATGGCTGAAC GCTTTAAGAT GCCTATCATC420ACCTTTATCG ACACCCCGGG GGCTTATCCT GGCGTGGGCG CAGAAGAGCG TGGTCAGTCT480GAAGCCATTG CACGCAACCT GCGTGAAATG TCTCGCCTCG GCGTACCGGT AGTTTGTACG540GTTATCGGTG AAGGTGGTTC TGGCGGTGCG CTGGCGATTG GCGTGGGCGA TAAAGTGAAT600ATGCTGCAAT ACAGCACCTA TTCCGTTATC TCGCCGGAAG GTTGTGCGTC CATTCTGTGG660AAGAGCGCCG ACAAAGCGCC GCTGGCGGCT GAAGCGATGG GTATCATTGC TCCGCGTCTG720AAAGAACTGA AACTGATCGA CTCCATCATC CCGGAACCAC TGGGTGGTGC TCACCGTAAC780CCGGAAGCGA TGGCGGCATC GTTGAAAGCG CAACTGCTGG CGGATCTGGC CGATCTCGAC840GTGTTAAGCA CTGAAGATTT AAAAAATCGT CGTTATCAGC GCCTGATGAG CTACGGTTAC900GCGTAATTCG CAAAAGTTCT GAAAAAGGGT CACTTCGGTG GCCCTTTTTT ATCGCCACGG960TTTGAGCAGG CTATGATTAA GGAAGGATTT TCCAGGAGGA ACAC ATG AAC ATC ATT1016Met Asn Ile Ile1GCC ATT ATG GGA CCG CAT GGC GTC TTT TAT AAA GAT GAG CCC ATC AAA 1064Ala Ile Met Gly Pro His Gly Val Phe Tyr Lys Asp Glu Pro Ile Lys5 10 15 20GAA CTG GAG TCG GCG CTG GTG GCG CAA GGC TTT CAG ATT ATC TGG CCA 1112Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gln Gly Phe Gln Ile Ile Trp Pro25 30 35CAA AAC AGC GTT GAT TTG CTG AAA TTT ATC GAG CAT AAC CCT CGA ATT 1160Gln Asn Ser Val Asp Leu Leu Lys Phe Ile Glu His Asn Pro Arg Ile40 45 50TGC GGC GTG ATT TTT GAC TGG GAT GAG TAC AGT CTC GAT TTA TGT AGC 1208Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Glu Tyr Ser Leu Asp Leu Cys Ser55 60 65GAT ATC AAT CAG CTT AAT GAA TAT CTC CCG CTT TAT GCC TTC ATC AAC 1256Asp Ile Asn Gln Leu Asn Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr Ala Phe Ile Asn70 75 80ACC CAC TCG ACG ATG GAT GTC AGC GTG CAG GAT ATG CGG ATG GCG CTC 1304Thr His Ser Thr Met Asp Val Ser Val Gln Asp Met Arg Met Ala Leu85 90 95 100TGG TTT TTT GAA TAT GCG CTG GGG CAG GCG GAA GAT ATC GCC ATT CGT 1352Trp Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Gln Ala Glu Asp Ile Ala Ile Arg105 110 115ATG CGT CAG TAC ACC GAC GAA TAT CTT GAT AAC ATT ACA CCG CCG TTC 1400Met Arg Gln Tyr Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Asn Ile Thr Pro Pro Phe120 125 130ACG AAA GCC TTG TTT ACC TAC GTC AAA GAG CGG AAG TAC ACC TTT TGT 1448Thr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys Tyr Thr Phe Cys135 140 145ACG CCG GGG CAT ATG GGC GGC ACC GCA TAT CAA AAA AGC CCG GTT GGC 1496Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Tyr Gln Lys Ser Pro Val Gly150 155 160TGT CTG TTT TAT GAT TTT TTC GGC GGG AAT ACT CTT AAG GCT GAT GTC 1544Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu Lys Ala Asp Val165 170 175 180TCT ATT TCG GTC ACC GAG CTT GGT TCG TTG CTC GAC CAC ACC GGG CCA 1592Ser Ile Ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp His Thr Gly Pro185 190 195CAC CTG GAA GCG GAA GAG TAC ATC GCG CGG ACT TTT GGC GCG GAA CAG 1640His Leu Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Phe Gly Ala Glu Gln200 205 210AGT TAT ATC GTT ACC AAC GGA ACA TCG ACG TCG AAC AAA ATT GTG GGT 1688Ser Tyr Ile Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asn Lys Ile Val Gly215 220 225ATG TAC GCC GCG CCA TCC GGC AGT ACG CTG TTG ATC GAC CGC AAT TGT 1736Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu Ile Asp Arg Asn Cys230 235 240CAT AAA TCG CTG GCG CAT CTG TTG ATG ATG AAC GAT GTA GTG CCA GTC 1784His Lys Ser Leu Ala His Leu Leu Met Met Asn Asp Val Val Pro Val245 250 255 260TGG CTG AAA CCG ACG CGT AAT GCG TTG GGG ATT CTT GGT GGG ATC CCG 1832Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Ile Pro265 270 275CGC CGT GAA TTT ACT CGC GAC AGC ATC GAA GAG AAA GTC GCT GCT ACC 1880Arg Arg Glu Phe Thr Arg Asp Ser Ile Glu Glu Lys Val Ala 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Lys505 510 515TTC CTC GAC GAA CGT GGG ATC GTA GTA GAG AAA ACC GGC CCT TAT AAC2600Phe Leu Asp Glu Arg Gly Ile Val Val Glu Lys Thr Gly Pro Tyr Asn520 525 530CTG CTG TTT CTC TTT AGT ATT GGC ATC GAT AAA ACC AAA GCA ATG GGA2648Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr Lys Ala Met Gly535 540 545TTA TTG CGT GGG TTG ACG GAA TTC AAA CGC TCT TAC GAT CTC AAC CTG2696Leu Leu Arg Gly Leu Thr Glu Phe Lys Arg Ser Tyr Asp Leu Asn Leu550 555 560CGG ATC AAA AAT ATG CTA CCC GAT CTC TAT GCA GAA GAT CCC GAT TTC2744Arg Ile Lys Asn Met Leu Pro Asp Leu Tyr Ala Glu Asp Pro Asp Phe565 570 575 580TAC CGC AAT ATG CGT ATT CAG GAT CTG GCA CAA GGG ATC CAT AAG CTG2792Tyr Arg Asn Met Arg Ile Gln Asp Leu Ala Gln Gly Ile His Lys Leu585 590 595ATT CGT AAA CAC GAT CTT CCC GGT TTG ATG TTG CGG GCA TTC GAT ACT2840Ile Arg Lys His Asp Leu Pro Gly Leu Met Leu Arg Ala Phe Asp Thr600 605 610TTG CCG GAG ATG ATC ATG ACG CCA CAT CAG GCA TGG CAA CGA CAA ATT2888Leu Pro Glu Met Ile Met Thr Pro His Gln Ala Trp Gln Arg Gln Ile615 620 625AAA GGC GAA GTA GAA ACC ATT GCG CTG GAA CAA CTG GTC GGT AGA GTA2936Lys Gly Glu Val Glu Thr Ile Ala Leu Glu Gln Leu Val Gly Arg Val630 635 640TCG GCA AAT ATG ATC CTG CCT TAT CCA CCG GGC GTA CCG CTG TTG ATG2984Ser Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val Pro Leu Leu Met645 650 655 660CCT GGA GAA ATG CTG ACC AAA GAG AGC CGC ACA GTA CTC GAT TTT CTA3032Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys Glu Ser Arg Thr Val Leu Asp Phe Leu665 670 675CTG ATG CTT TGT TCC GTC GGG CAA CAT TAC CCC GGT TTT GAA ACG GAT3080Leu Met Leu Cys Ser Val Gly Gln His Tyr Pro Gly Phe Glu Thr Asp680 685 690ATT CAC GGC GCG AAA CAG GAC GAA GAC GGC GTT TAC CGC GTA CGA GTC3128Ile His Gly Ala Lys Gln Asp Glu Asp Gly Val Tyr Arg Val Arg Val695 700 705CTA AAA ATG GCG GGA TAACTTGCCA GAGCGGCTTC CGGGCGAGTA ACGTTCTGTT3183Leu Lys Met Ala Gly710AACAAATAAA GGAGACGTTA TGCTGGGTTT AAAACAGGTT CACCATATTG CGATTATTGC 3243GACGGATTAT GCGGTGAGCA AAGCTT 3269(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度713個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)序列描述SEQ ID NO4Met Asn Ile Ile Ala Ile Met Gly Pro His Gly Val Phe Tyr Lys Asp1 5 10 15Glu Pro Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gln Gly Phe Gln20 25 30Ile Ile Trp Pro Gln Asn Ser Val Asp Leu Leu Lys Phe Ile Glu His35 40 45Asn Pro Arg Ile Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Glu Tyr Ser Leu50 55 60Asp Leu Cys Ser Asp Ile Asn Gln Leu Asn Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr65 70 75 80Ala Phe Ile Asn Thr His Ser Thr Met Asp Val Ser Val Gln Asp Met85 90 95Arg Met Ala Leu Trp Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Gln Ala Glu Asp100 105 110Ile Ala Ile Arg Met Arg Gln Tyr Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Asn Ile115 120 125Thr Pro Pro Phe Thr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys130 135 140Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Tyr Gln Lys145 150 155 160Ser Pro Val Gly Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu165 170 175Lys Ala Asp Val Ser Ile Ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp180 185 190His Thr Gly Pro His Leu Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Phe195 200 205Gly Ala Glu Gln Ser Tyr Ile Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asn210 215 220Lys Ile Val Gly Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu Ile225 230 235 240Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Ala His Leu Leu Met Met Asn Asp245 250 255Val Val Pro Val Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Gly Ile Leu260 265 270Gly Gly Ile Pro Arg Arg Glu Phe Thr Arg Asp Ser Ile Glu Glu Lys275 280 285Val Ala Ala Thr Thr Gln Ala Gln Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr290 295 300Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Trp Ile Lys Gln305 310 315 320Thr Leu Asp Val Pro Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr325 330 335Thr His Phe His Pro Ile Tyr Gln Gly Lys Ser Gly Met Ser Gly Glu340 345 350Arg Val Ala Gly Lys Val Ile Phe Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Met355 360 365Leu Ala Ala Leu Ser Gln Ala Ser Leu Ile His Ile Lys Gly Glu Tyr370 375 380Asp Glu Glu Ala Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Thr Thr Ser385 390 395 400Pro Ser Tyr Pro Ile Val Ala Ser Val Glu Thr Ala Ala Ala Met Leu405 410 415Arg Gly Asn Pro Gly Lys Arg Leu Ile Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala420 425 430Leu His Phe Arg Lys Glu Val Gln Arg Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly435 440 445Trp Phe Phe Asp Ile Trp Gln Pro Pro Gln Val Asp Glu Ala Glu Cys450 455 460Trp Pro Val Ala Pro Gly Glu Gln Trp His Gly Phe Asn Asp Ala Asp465 470 475 480Ala Asp His Met Phe Leu Asp Pro Val Lys Val Thr Ile Leu Thr Pro485 490 495Gly Met Asp Glu Gln Gly Asn Met Ser Glu Glu Gly Ile Pro Ala Ala500 505 510Leu Val Ala Lys Phe Leu Asp Glu Arg Gly Ile Val Val Glu Lys Thr515 520 525Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr530 535 540Lys Ala Met Gly Leu Leu Arg Gly Leu Thr Glu Phe Lys Arg Ser Tyr545 550 555 560Asp Leu Asn Leu Arg Ile Lys Asn Met Leu Pro Asp Leu Tyr Ala Glu565 570 575Asp Pro Asp Phe Tyr Arg Asn Met Arg Ile Gln Asp Leu Ala Gln Gly580 585 590Ile His Lys Leu Ile Arg Lys His Asp Leu Pro Gly Leu Met Leu Arg595 600 605Ala Phe Asp Thr Leu Pro Glu Met Ile Met Thr Pro His Gln Ala Trp610 615 620Gln Arg Gln Ile Lys Gly Glu Val Glu Thr Ile Ala Leu Glu Gln Leu625 630 635 640Val Gly Arg Val Ser Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val645 650 655Pro Leu Leu Met Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys Glu Ser Arg Thr Val660 665 670Leu Asp Phe Leu Leu Met Leu Cys Ser Val Gly Gln His Tyr Pro Gly675 680 685Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Lys Gln Asp Glu Asp Gly Val Tyr690 695 700Arg Val Arg Val Leu Lys Met Ala Gly705 710(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度2145個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(vi)來源(A)生物體大腸桿菌(B)菌株CS520(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵字CDS(B)位置1至2145(xi)序列描述SEQ ID NO5ATG AAC GTT ATT GCA ATA TTG AAT CAC ATG GGG GTT TAT TTT AAA GAA48Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu1 5 10 15GAA CCC ATC CGT GAA CTT CAT CGC GCG CTT GAA CGT CTG AAC TTC CAG96Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln20 25 30ATT GTT TAC CCG AAC GAC CGT GAC GAC TTA TTA AAA CTG ATC GAA AAC 144Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn35 40 45AAT GCG CGT CTG TGC GGC GTT ATT TTT GAC TGG GAT AAA TAT AAT CTC 192Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu50 55 60GAG CTG TGC GAA GAA ATT AGC AAA ATG AAC GAG AAC CTG CCG TTG TAC 240Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr65 70 75 80GCG TTC GCT AAT ACG TAT TCC ACT CTC GAT GTA AGC CTG AAT GAC CTG 288Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu85 90 95CGT TTA CAG ATT AGC TTC TTT GAA TAT GCG CTG GGT GCT GCT GAA GAT336Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp100 105 110ATT GCT AAT AAG ATC AAG CAG ACC ACT GAC GAA TAT ATC AAC ACT ATT384Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile115 120 125CTG CCT CCG CTG ACT AAA GCA CTG TTT AAA TAT GTT CGT GAA GGT AAA432Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys130 135 140TAT ACT TTC TGT ACT CCT GGT CAC ATG GGC GGT ACT GCA TTC CAG AAA480Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys145 150 155 160AGC CCG GTA GGT 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ATG CAC ACC ACC ACT TCT1200Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser385 390 395 400CCG CAC TAC GGT ATC GTG GCG TCC ACT GAA ACC GCT GCG GCG ATG ATG1248Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met405 410 415AAA GGC AAT GCA GGT AAG CGT CTG ATC AAC GGT TCT ATT GAA CGT GCG1296Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala420 425 430ATC AAA TTC CGT AAA GAG ATC AAA CGT CTG AGA ACG GAA TCT GAT GGC1344Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly435 440 445TGG TTC TTT GAT GTA TGG CAG CCG GAT CAT ATC GAT ACG ACT GAA TGC1392Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys450 455 460TGG CCG CTG CGT TCT GAC AGC ACC TGG CAC GGC TTC AAA AAC ATC GAT1440Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp465 470 475 480AAC GAG CAC ATG TAT CTT GAC CCG ATC AAA GTC ACC CTG CTG ACT CCG1488Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro485 490 495GGG ATG GAA AAA GAC GGC ACC ATG AGC GAC TTT GGT ATT CCG GCC AGC1536Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser500 505 510ATC GTG GCG AAA TAC CTC GAC GAA CAT GGC ATC GTT GTT GAG AAA ACC1584Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr515 520 525GGT CCG TAT AAC CTG CTG TTC CTG TTC AGC ATC GGT ATC GAT AAG ACC1632Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr530 535 540AAA GCA CTG AGC CTG CTG CGT GCT CTG ACT GAC TTT AAA CGT GCG TTC1680Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe545 550 555 560GAC CTG AAC CTG CGT GTG AAA AAC ATG CTG CCG TCT CTG TAT CGT GAA1728Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu565 570 575GAT CCT GAA TTC TAT GAA AAC ATG CGT ATT CAG GAA CTG GCT CAG AAT1776Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn580 585 590ATC CAC AAA CTG ATT GTT CAC CAC AAT CTG CCG GAT CTG ATG TAT CGC1824Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg595 600 605GCA TTT GAA GTG CTG CCG ACG ATG GTA ATG ACT CCG TAT GCT GCA TTC1872Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe610 615 620CAG AAA GAG CTG CAC GGT ATG ACC GAA GAA GTT TAC CTC GAC GAA ATG1920Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met625 630 635 640GTA GGT CGT ATT AAC GCC AAT ATG ATC CTT CCG TAC CCG CCG GGA GTT 1968Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val645 650 655CCT CTG GTA ATG CCG GGT GAA ATG ATC ACC GAA GAA AGC CGT CCG GTT 2016Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val660 665 670CTG GAG TTC CTG CAG ATG CTG TGT GAA ATC GGC GCT CAC TAT CCG GGC 2064Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly675 680 685TTT GAA ACC GAT ATT CAC GGT GCA TAC CGT CAG GCT GAT GGC CGC TAT 2112Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr690 695 700ACC GTT AAG GTA TTG AAA GAA GAA AGC AAA AAA 2145Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys705 710 715(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度715個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)序列描述SEQ ID NO6Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu1 5 10 15Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln20 25 30Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn35 40 45Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu50 55 60Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr65 70 75 80Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu85 90 95Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp100 105 110Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile115 120 125Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys130 135 140Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys145 150 155 160Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met165 170 175Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp180 185 190His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe195 200 205Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn210 215 220Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile225 230 235 240Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp245 250 255Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu260 265 270Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg275 280 285Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr290 295 300Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys305 310 315 320Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr325 330 335Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly340 345 350Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu355 360 365Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val370 375 380Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser385 390 395 400Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met405 410 415Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala420 425 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Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val645 650 655Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val660 665 670Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly675 680 685Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr690 695 700Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys705 710 71權(quán)利要求
1.一種編碼賴氨酸脫羧酶的基因，它具有序列表中SEQ ID NO4給出的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的基因，其中該基因具有序列表中SEQ ID NO3的第1005至3143位密碼的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1的基因，其中所述氨基酸序列具有一個或多個氨基酸殘基替換、缺失或插入，但沒有任何賴氨酸脫羧酶活性的實(shí)質(zhì)性退化。
4.一種埃希氏桿菌屬的微生物，它具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力，并且其細(xì)胞內(nèi)賴氨酸脫羧酶活性降低或消失。
5.權(quán)利要求4的微生物，其中所述微生物是大腸桿菌。
6.權(quán)利要求4的微生物，其中細(xì)胞內(nèi)賴氨酸脫羧酶活性的降低或消失是通過限制權(quán)利要求1-3中任一權(quán)項(xiàng)限定的基因和/或cadA基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。
7.權(quán)利要求6的微生物，其中基因的表達(dá)是通過破壞權(quán)利要求1-3中任一權(quán)項(xiàng)的基因和/或cadA基因而被限制的。
8.權(quán)利要求6的微生物，其中權(quán)利要求1-3中任一權(quán)項(xiàng)限定的基因和/或cadA基因是通過其核苷酸序列中一個或多個核苷酸的替換、缺失、插入、添加或倒位而被破壞的。
9.一種產(chǎn)L-賴氨酸的方法，其包括在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種有L-賴氨酸生產(chǎn)能力的埃希氏桿菌屬微生物的步驟，該微生物的細(xì)胞內(nèi)賴氨酸脫羧酶活性降低或消失，以便生產(chǎn)L-賴氨酸并在培養(yǎng)液中累積并收集L-賴氨酸。
10.權(quán)利要求9的方法，其中通過限制權(quán)利要求1-3中任一權(quán)項(xiàng)限定的基因和/或cadA基因的表達(dá)而使細(xì)胞內(nèi)賴氨酸脫羧酶活性降低或消失。
全文摘要
通過在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)埃希氏桿菌微生物高效生產(chǎn)L－賴氨酸。在此微生物中與L－賴氨酸降解有關(guān)的賴氨酸脫羧酶活性降低或消失。例如,一種埃希氏桿菌屬微生物,其編碼賴氨酸脫羧酶的新型基因和/或cadA基團(tuán)的表達(dá)受到限制,使其產(chǎn)生L－賴氨酸并在培養(yǎng)液中積累和從中回收L－賴氨酸。
文檔編號C12N9/88GK1175280SQ9519757
公開日1998年3月4日 申請日期1995年12月5日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月9日
發(fā)明者菊池慶實(shí), 鈴木智子, 児島宏子 申請人:味之素株式會社