專利名稱：釀酒酵母金屬硫蛋白產(chǎn)生菌的選育發(fā)酵與提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過自然選育及誘變選育手段，從釀酒酵母中分離出對(duì)Cu2+、Cd2+等重金屬拮抗、又產(chǎn)生金屬硫蛋白的菌株；還涉及MT產(chǎn)生菌分級(jí)誘導(dǎo)、發(fā)酵調(diào)控及酵母菌MT分離、純化和生物活性檢測等技術(shù)。
國內(nèi)、外研究現(xiàn)狀分析金屬硫蛋白(Metallothionein，簡稱MT)是一類廣泛存在于生物中的低分子量，富含半胱氨酸、能被金屬誘導(dǎo)的金屬結(jié)合蛋白。生理功能廣泛，主要參與微量元素貯存、運(yùn)輸和代謝；拮抗電離輻射；清除羥基自由基及重金屬解毒等多種作用，涉及機(jī)體生長、發(fā)育、生殖、衰老、免疫、腫瘤發(fā)生、應(yīng)激反應(yīng)等各個(gè)方面。其研究與應(yīng)用在醫(yī)藥、保健食品和化妝品添加劑、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)、生物工程等各領(lǐng)域已取得一些令人興奮的成果。1978年7月，1985年8月，1992年12月就召開過三屆關(guān)于研究金屬硫蛋白的國際會(huì)議。目前，MT的研究，已成為生物化學(xué)及分子生物學(xué)領(lǐng)域的熱門課題之一。
自1957年Margoshes，M.和Vallee，B.L.等報(bào)道從蓄積鎘的馬腎臟中分離出MT以來，現(xiàn)已能從幾乎所有哺乳動(dòng)物組織(結(jié)締組織除外)、某些兩棲類、魚類、植物和某些真核、原核微生物中分離得到。1975年P(guān)rinz，R.和Weser，U.等報(bào)道在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中發(fā)現(xiàn)MT是真核微生物中有關(guān)MT的第一篇文章，迄今為止，在微生物MT近200篇文章中，1975-1985年10年時(shí)間里，只占13篇，自1985年來研究報(bào)道增多，多數(shù)文章為MT基因結(jié)構(gòu)、基因調(diào)控、MT基因啟動(dòng)于等理論文章，酵母菌MT應(yīng)用開發(fā)研究限于專利保護(hù)，報(bào)道極少，只有2篇。
從<CA>67年至92年7月檢索出有關(guān)酵母菌Metallothionein專利1.Ger.Offen DE 3,433,076(A1)(C1.C07k15/22)20 Mar.1986Appl.08 Sep.1984；16pp.題目Isolation and use of antirheumatic copper metallothioneinsCu-MT的分離和抗風(fēng)濕病中的應(yīng)用作者Weser，Ulrich；Hartmann，Hans Juergen；Gaertner，Alfred2.Ger.Offen DE 3,920，826(A1)(C1. C07k15/04)03，Jan.1991Appl.24 Jan.1989；3pp.題目Preparation of metallothionein as inflammation inhibitors炎癥抑制劑MT的制備作者Weser，Ulrich；Hartmann，Hans Juergen；Miesel，Ralf真核微生物中金屬誘導(dǎo)產(chǎn)生的MT主要特征低分子量(2,000-10,000道爾頓)；高金屬含量(含4-13個(gè)金屬原子/每分子MT)；氨基酸組成中半胱氨酸含量豐富(占6.8-43％)；沒有芳香族氨基酸或含量極微；具有金屬通過硫酯鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合的種種特殊吸收光譜行為；具有MT中典型的Cys-Xaa-Cys多肽序列(Cys表示半胱氨酸殘基，Xaa代表任一非特殊氨基酸殘基)。與哺乳動(dòng)物中MT相比，其主要差別是酵母菌MT中酸性氨基酸含量高(為哺乳動(dòng)物2-3倍)；Cys含量不同；有His(組氨酸)、Arg(精氨酸)等堿性氨基酸；另外酵母菌MT一般只被Cu2+、Ag2+誘導(dǎo)，不被其它金屬誘導(dǎo)。
根據(jù)國外文獻(xiàn)報(bào)道，56個(gè)屬酵母菌中，只發(fā)現(xiàn)酵母屬、裂殖酵母屬、假絲酵母屬等3個(gè)屬中7-8個(gè)種酵母菌有MT，國內(nèi)尚未見有關(guān)酵母菌MT的報(bào)道。
本發(fā)明的目的本發(fā)明所選育出的釀酒酵母BD101的金屬硫蛋白，與哺乳動(dòng)物金屬硫蛋白基本相似；經(jīng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)含MT釀酒酵母菌具有抗紫外線、60Co輻射、消除羥基自由基和重金屬解毒能力，與哺乳動(dòng)物金屬硫蛋白生理功能相同；可適用于藥物、機(jī)能性食品或化妝品添加劑的應(yīng)用開發(fā)；也可應(yīng)用于貴重金屬回收、有毒重金屬廢水污染處理。酵母菌生長迅速、繁殖快、原料價(jià)廉、培養(yǎng)簡便，其金屬硫蛋白提取易于掌握，酵母菌金屬硫蛋白研制，在醫(yī)藥、食品、化妝品添加劑、貴重金屬回收和重金屬污染治理等應(yīng)用方面，將展現(xiàn)誘人的前景，這是本發(fā)明的主要目的。
基因工程中異源哺乳動(dòng)物基因在酵母菌中表達(dá)率都不高，一般只占細(xì)胞總蛋白1％，酵母菌金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)是酵母菌中發(fā)現(xiàn)的最好表達(dá)系統(tǒng)之一，業(yè)已證實(shí)它能在不同屬的大多數(shù)細(xì)胞中行使其正常功能，幾乎使所有異源蛋白質(zhì)表達(dá)水平提高5-20倍，使基因表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量達(dá)到每升數(shù)毫克水平。為分離出酵母菌金屬硫蛋白啟動(dòng)子，能最大限度地提高異源目的基因產(chǎn)物產(chǎn)量，這也是本發(fā)明的目的之一。
發(fā)明的內(nèi)容及方法本發(fā)明的內(nèi)容包括(一)MT產(chǎn)生菌選育；(二)MT產(chǎn)生菌分級(jí)誘導(dǎo)及發(fā)酵調(diào)控；(三)酵母菌MT的分離純化。
(一)MT產(chǎn)生菌選育1.菌株特點(diǎn)(1)BD101菌株(液體Cu2+抗性5mmol/L)(2)BD101-69菌株(液體Cu2+抗性15mmol/L)(3)BD101-30菌株(液體Cu2+抗性25mmol/L)2.選育方法(1)自然選育通過常規(guī)的梯度平板法和菌懸液混合培養(yǎng)法，選出液體CuSO4終濃度5mmol/LCu2+抗性釀酒酵母菌株BD101，經(jīng)Cu2+誘導(dǎo)證實(shí)該菌產(chǎn)生Cu-MI。(2)亞硝基胍(NTG)誘變采用常規(guī)法對(duì)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生Cu-MT的菌株BD101抗性(5mmol/L)穩(wěn)定的純種，以亞硝基胍處理(NTG終濃度100-1,000微克/毫升，處理時(shí)間1-2小時(shí))，篩選高Cu2+抗性突變株，其中BD101-69突變株混合培養(yǎng)法進(jìn)一步證實(shí)，液體抗Cu2+終濃度達(dá)15mmol/L，經(jīng)Cu2+誘導(dǎo)證實(shí)該菌產(chǎn)生Cu-MT。(3)紫外線(UV)誘變以紫外線處理BD101-69突變株細(xì)胞(紫外線燈15W、燈距30cm、照射時(shí)間0.5-5分鐘)，篩選高Cu2+抗性突變株，其中BD101-30突變株經(jīng)菌懸液混合培養(yǎng)法進(jìn)一步證實(shí)液體抗Cu2+終濃度達(dá)25mmol/L，經(jīng)Cu2+誘導(dǎo)證實(shí)該菌產(chǎn)生Cu-MT。
(二)MT產(chǎn)生菌分級(jí)誘導(dǎo)及發(fā)酵調(diào)控1.分級(jí)誘導(dǎo)及發(fā)酵調(diào)控參數(shù)為(1)釀酒酵母BD101菌株金屬硫蛋白誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)金屬鹽CuSO4或CuCl2鹽濃度5mmol/L誘導(dǎo)方式分級(jí)誘導(dǎo)(2)產(chǎn)金屬硫蛋白發(fā)酵調(diào)控參數(shù)

2.方法(1)一級(jí)種子菌株(YPD斜面)活化——→克氏瓶(YPD平板)擴(kuò)大——→制成菌懸液直接接入種子罐或搖瓶進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。(2)二級(jí)種子種子罐空消——→裝入YPD培養(yǎng)基實(shí)消——→保壓降溫至30℃——→接入一級(jí)種子(1％)——→再通入無菌空氣培養(yǎng)——→二級(jí)種子菌懸液。(3)發(fā)酵發(fā)酵罐空消——→裝入YPD培養(yǎng)液(適當(dāng)濃度Cu2+鹽)實(shí)消——→保壓降溫至30℃——→接入二級(jí)種子(1％)——→30℃通入無菌空氣培養(yǎng)——→待MT積累高峰期放罐。(4).上述各罐滅菌采取高壓蒸汽滅菌，即121℃、0.3-0.5kg F/cm2。滅菌30分鐘，發(fā)酵調(diào)控參數(shù)見上款所述。
YPD培養(yǎng)基配方<

>(三)酵母菌MT分離純化1.主要技術(shù)特點(diǎn)無細(xì)胞提取液、凝膠過濾、親和層析純化MT2.釀酒酵母BD101 Cu-MT理化特性(1)只被金屬誘導(dǎo)的金屬結(jié)合蛋白；(2)低分子量約7,000道爾頓，表觀分子量14,000道爾頓；(3)氨基酸組成每個(gè)Cu-MT分子含59個(gè)氨基酸，其中Cys占10％；酸性氨基酸含量高，芳香族氨基酸含量≤1％；(4)高金屬含量每克分子Cu-MT含4克原子Cu；(5)具有金屬通過硫酯鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合的特殊吸收光譜Cu-MTA270nm處有吸收肩，脫輔基MTA270nm處吸收肩消失；(6)根據(jù)MT所帶電荷不同(取決于MT一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸序列)，可分為Cu-MT1和Cu-MT2兩個(gè)亞型。
3.方法(1)無細(xì)胞提取液制備離心收集酵母細(xì)胞——→洗滌三次——→超聲波或高壓勻漿器破壁——→離心棄沉淀——→80℃加熱5分鐘——→離心——→上清液濃縮即為MT粗提取液(用Ag飽和血紅蛋白法測定MT中Cu含量，按公式計(jì)算Cu-MT)。(2)凝膠過濾制備MT制劑取上述適當(dāng)濃縮后的提取液——→葡聚糖凝膠過濾層析分離——→用Tris·HCl緩沖液平衡、洗脫，用核酸、蛋白檢測儀和原子吸收光譜儀檢測，收集A270nm＞A280nm、富含Cu吸收峰蛋白組分，即為酵母菌MT制劑。(3)純化MT
將上述含Cu-MT制劑的組分——→親和層析——→再干燥獲Cu-MT純品。
釀酒酵母BD101菌株Cu-MT的優(yōu)點(diǎn)和效果(一)本發(fā)明工藝釀酒酵母菌MT產(chǎn)量與哺乳動(dòng)物MT產(chǎn)量相近。目前人們獲得哺乳動(dòng)物MT，一般從兔肝中提取，用Zn誘導(dǎo)兔肝得到MT1-2mg/g濕肝，釀酒酵母BD101菌Cu-MT產(chǎn)量達(dá)1mg左右/g濕重酵母細(xì)胞。酵母細(xì)胞生長快、繁殖速、培養(yǎng)簡便、原料價(jià)廉，已建立一套完整的發(fā)酵技術(shù)，為MT的開發(fā)應(yīng)用提供了新資源。
(二)據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，推測酵母菌Cu-MT具哺乳動(dòng)物MT相同的生物學(xué)功能。本發(fā)明所選育出的含Cu-MT釀酒酵母BD101菌株及其MT確具哺乳動(dòng)物MT相同的生物學(xué)活性。實(shí)驗(yàn)證明1.對(duì)紫外線輻射效應(yīng)三株MT產(chǎn)生菌隨Cu2+抗性增加(Cu-MT增加)，對(duì)紫外線輻射損傷致死率的下降率增加，表明在一定范圍內(nèi)有拮抗紫外線輻射效應(yīng)。2.對(duì)60Co輻射效應(yīng)三株MT產(chǎn)生菌隨Cu2+抗性增加(Cu-MT增加)對(duì)60Co輻射損傷致死率的下降率增加，表明在一定范圍內(nèi)有拮抗60Co輻射效應(yīng)。3.消除羥基自由基能力三株MT產(chǎn)生菌及其MT隨Cu2+抗性增加(Cu-MT增加)，消除羥基自由基能力增強(qiáng)，表明有較高的消除羥基自由基能力。4.重金屬解毒功能通過不同濃度Cu2+培養(yǎng)MT產(chǎn)生菌實(shí)驗(yàn)，表明MT產(chǎn)生菌在各自的生理及限范圍內(nèi)，對(duì)重金屬毒害具有解毒作用。
(三)自古以來人們就知道用酵母菌發(fā)酵制成的各種食品、飲料和藥物，本發(fā)明所選育的釀酒酵母菌種，為無毒菌株，生產(chǎn)過程沒有污染，不影響生態(tài)環(huán)境。
綜上所述，我們所選育出的釀酒酵母BD101所產(chǎn)生的Cu-MT，從Cys含量，氨基酸組成及金屬結(jié)合量看，與國外文獻(xiàn)報(bào)道有所差異，是否新發(fā)現(xiàn)的MT蛋白，尚待一級(jí)結(jié)構(gòu)測序后進(jìn)一步證實(shí)。本發(fā)明從誘變育種、分級(jí)誘導(dǎo)、親和層析、生物活性等四方面工作顯示出鮮明的創(chuàng)新特色。酵母菌MT拮抗60Co輻射效應(yīng)、消除羥基自由基能力，國外尚未見報(bào)道；酵母菌MT生物學(xué)活性研究，為MT在醫(yī)藥、食品和化妝品添加劑中開發(fā)應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。
本發(fā)明發(fā)酵、提取工藝最佳實(shí)施例按前述方法所述條件，斜面菌株——→克氏瓶擴(kuò)大培養(yǎng)——→種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)(YPD培養(yǎng)液)30℃，通氣培養(yǎng)12-16小時(shí)——→以1％接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵罐(YPD培養(yǎng)液，CuSO4為誘導(dǎo)劑，終濃度3-5mmol/L)，30℃，通氣培養(yǎng)18-24小時(shí)，通風(fēng)量V/V為1∶1.0-1.2，攪拌速度5-15轉(zhuǎn)/秒，離心收集酵母細(xì)胞，用蒸餾水洗滌3次，懸浮在蒸餾水中，然后放超聲波發(fā)生器(功率8-16W，時(shí)間10-15分鐘)或高壓勻漿器(500-1000磅水壓勻漿10-15分鐘)中，使細(xì)胞破壁、勻漿化，離心除去細(xì)胞殘?jiān)?，上清液?jīng)分子篩過濾(葡聚糖凝膠，分子量5000-30000道爾頓)，收集A270nm＞A280nm，含Cu-MT組分，經(jīng)過親和層析，收集A270nm＞A280nm含Cu-MT組分，再通過分子篩過濾(葡聚糖凝膠分子量5000-30000道爾頓)或透析去鹽，干燥，得Cu-MT純品，得率為4mg Cu-MT/g干酵母細(xì)胞，銅含量為≥30μg/mg蛋白。
權(quán)利要求
1.一種釀酒酵母金屬硫蛋白產(chǎn)生菌的選育、發(fā)酵與提取工藝，其特征在于所述方法包括誘變育種，分級(jí)誘導(dǎo)，分離純化和生物學(xué)效應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述誘變育種其特征在于通過梯度平板法和混合培養(yǎng)法從野生型菌株選育出液體CuSO4終濃度為5mmol/L Cu2+抗性菌株，然后從野生型菌株為出發(fā)菌株，進(jìn)行亞硝基胍(NTG)和紫外線(UV)誘變，NTG誘變條件為100-1000微克/毫升，處理1-2小時(shí)；UV誘變條件為15W/20-40cm燈距、照射0.5-5分鐘，在不同濃度的YPD平板上篩選出高Cu2+抗性突變株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述分級(jí)誘導(dǎo)其特征在于誘導(dǎo)及發(fā)酵調(diào)控條件，用CuSO4或CuCl2，(濃度5mmol/L)的溶液分級(jí)誘導(dǎo)；調(diào)控參數(shù)為培養(yǎng)液YPD(葡萄糖2-6％，酵母提取物0.5-2％，胰蛋白胨0.5-2％，CuSO4或CuCl2濃度5mmol/L)，pH值5.0-7.0，溫度30±2℃，接種量1-10％，通風(fēng)比1∶1.0(vvm)-1∶1.2(vvm)，攪拌速度5-15轉(zhuǎn)/秒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述分離純化其特征在于用超聲波發(fā)生器破碎細(xì)胞(功率為8-16W，時(shí)間10-15分鐘)或高壓勻漿器破碎細(xì)胞(500-1000磅水壓，時(shí)間10-15分鐘)，差速離心法除去細(xì)胞殘?jiān)?，親和層析或凝膠過濾層析，收集A270nm＞A280nm含Cu金屬硫蛋白組分，純化的金屬硫蛋白濃縮液經(jīng)干燥純品，冰箱保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述分級(jí)誘導(dǎo)其特征在于(1)MT產(chǎn)生菌釀酒酵母BD101對(duì)重金屬Cu2+的解毒作用(0-10mmol/L)；(2)MT產(chǎn)生菌釀酒酵母BD101拮抗紫外線輻射效應(yīng)(15W，30cm燈距，1-2分鐘內(nèi))；(3)MT產(chǎn)生菌釀酒酵母BD101拮抗60Co輻射效應(yīng)(2000-20000Rad/s)；(4)釀酒酵母BD101及其MT消除羥基自由基能力(ΔA550nm為0.2-1.2/mg蛋白)。
全文摘要
自釀酒酵母中選育出拮抗重金屬、并產(chǎn)生金屬硫蛋白的菌株BD101。該菌在添加Cu
文檔編號(hào)C12N15/01GK1138098SQ9610089
公開日1996年12月18日 申請(qǐng)日期1996年2月6日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月6日
發(fā)明者林稚蘭 申請(qǐng)人:北京大學(xué)