專利名稱：游動放線菌阿卡布糖生物合成基因及其分離方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來自放線菌，主要是游動放線菌屬SE 50/110及其突變株的阿卡布糖(acarbose)生物合成基因；涉及放線菌屬阿卡布糖生物合成基因的分離方法，即利用來源于已知的dTDP-葡萄糖脫水酶高度保守的蛋白區(qū)域的基因探針，尋找基因acbA(編碼dTDP-葡萄糖合酶)、acbB(編碼dTDP-葡萄糖脫水酶)和acbC(編碼一種環(huán)化酶，此環(huán)化酶與AroB即細菌3-脫氫奎尼酸合酶部分相同)，或者一個或多個來自游動放線菌屬的阿卡布糖生物合成基因。本發(fā)明還涉及阿卡布糖生物合成基因的應(yīng)用。
早期的專利申請(例如DE 2 064 092、DE 2 209 8334)涉及到以下發(fā)現(xiàn)，即許多放線菌，特別是游動放線菌科，產(chǎn)生糖苷水解酶(優(yōu)選消化道的碳水化合物水解酶)的寡糖樣抑制劑。所描述的此組抑制劑中，效力最強的抑制劑是化合物阿卡布糖，即O-4，6-二脫氧-4-[[1S-(1S，4R，5S，6S)-4，5，6-三羥基-3-(羥甲基)-2-環(huán)己烯-1-基]-氨基]-α-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-D-吡喃葡萄糖(DE2347782)。
在人類醫(yī)學(xué)上，阿卡布糖用于糖尿病的控制。游動放線菌屬SE50(CBS No.961.70)及該菌株的天然變異株SE 50/110(CBS614.71)[DE22 09 834]，以及它們的選擇株和突變株，產(chǎn)生次級代謝物阿卡布糖。原始分離物來自肯尼亞的Ruiru附近。在上述專利申請，例如上述德國專利申請的實施例1-4中，描述了此類型蔗糖酶抑制劑的分離。從阿卡布糖的結(jié)構(gòu)上預(yù)計，阿卡布糖分子的脫氧葡萄糖部分的生成與各種抗生素的6-脫氧糖殘基的生物合成相一致。所述抗生素的例子有氨基糖苷類，如鏈霉素、春日霉素；大環(huán)內(nèi)酯類，如紅霉素、泰樂霉素；多烯類，如兩性霉素A和B、制霉菌素；蒽環(huán)型藥，如道諾霉素；糖肽類，如萬古霉素。
有可能利用基因工程，如利用與所需DNA序列特異結(jié)合的基因探針，直接從基因組中分離某些基因。這樣，有可能從大量未知序列中“釣”出要分離的基因。
在放線菌，特別是鏈霉菌中，進而得知在迄今所研究的次級代謝物生產(chǎn)菌中，生物合成基因并排地、成簇地排列在染色體上，而較少在質(zhì)粒上[Martin，J.F.，J.Ind.Microbiol.9，73-90(1992)；Chater，K.F.，Ciba Found.Symp.，171(Secondary MetabolitesTheir Function andEvolution)144-62(1992)]。因此有可能通過用基因探針來“釣”，分離相鄰的、至今未知的生物合成基因，從而能夠闡明這些未知的生物合成基因在所需的生物合成過程中的重要性。
分子生物學(xué)技術(shù)相應(yīng)的應(yīng)用迄今還未能在游動放線菌科獲得成功，也未期望能在這種遺傳學(xué)上未鑒定的微生物中獲得成功。
今人驚訝的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一來源于已知dTDP-葡萄糖脫水酶的高度保守蛋白質(zhì)區(qū)域的基因探針，適用于在游動放線菌屬中尋找acbA基因(編碼dTDP-葡萄糖合酶)和acbB基因(編碼dTDP-葡萄糖脫水酶)。更今人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)了以acbC形式存在的另一基因，此基因與acbB基因相鄰，編碼一種環(huán)化酶(與AroB即細菌3-脫氫奎尼酸合酶部分相同)，因此與不飽和環(huán)多醇(Valienamines)的生物合成有關(guān)。
本發(fā)明涉及acbB的完整DNA序列和acbA及acbC的部分DNA序列。
acbB的完整氨基酸序列和acbA及acbC的部分氨基酸序列。
從放線菌，特別是從游動放線菌屬中分離次級代謝產(chǎn)物生物合成基因的方法，其特征是將來源于已知dTDP-葡萄糖脫水酶的高度保守蛋白質(zhì)區(qū)域的基因探針用于尋找acbA基因(編碼dTDP-葡萄糖合酶)、acbB基因(編碼dTDP-葡萄糖脫水酶)和acbC基因(編碼一種環(huán)化酶，此環(huán)化酶與AroB即細菌3-脫氫奎尼酸合酶部分相同)，或者來源于游動放線菌屬的一個或更多個阿卡布糖生物合成基因。
放線菌中與阿卡布糖相關(guān)的天然物質(zhì)(如有效霉素、Oligostatins(trestatins)、脂解素)的生物合成基因的分離方法。
通過以下途徑提高游動放線菌屬的阿卡布糖合成產(chǎn)量，即增加基因劑量或使用更有效的啟動子，或者通過基因操作(如調(diào)節(jié)基因蛋白表達或調(diào)節(jié)基因識別位點的基因操作)來改變調(diào)節(jié)控制。
在一些限制阿卡布糖合成的生物合成步驟(瓶頸酶)中進行蛋白質(zhì)工程，或通過蛋白質(zhì)工程防止額外組份的生成，從而增加阿卡布糖合成產(chǎn)量。通過消除不需要的額外組份的生物合成途徑或不需要的酶降解反應(yīng)，將游動放線菌屬的產(chǎn)物范圍限制在所需的主要產(chǎn)物。
為了在游動放線菌屬中提高阿卡布糖生產(chǎn)能力，改變調(diào)控，因此改變營養(yǎng)需要。
在異源宿主菌株(如變鉛青鏈霉菌和其它鏈霉菌、快速生長細菌如大腸桿菌、枯草桿菌或谷氨酸棒桿菌、或酵母)中表達，以便通過改進空間-時間產(chǎn)率來增加產(chǎn)量；建立簡化的純化方法；達到產(chǎn)物范圍的特殊限制。
利用阿卡布糖生物合成基因，由合成的或微生物生產(chǎn)的前體開始，進行阿卡布糖或此類物質(zhì)的體外合成。
下面詳細描述本發(fā)明。
所有的基因工程方法，除非另有說明，一律按照J.Sambrook et al.圖2是用作為用于分離阿卡布糖生物合成基因的基因探針(acb探針)的、含有已知的dTDP-葡萄糖脫水酶序列的質(zhì)粒pAS1的示意圖。
圖3是含有與acb探針雜交的游動放線菌屬DNA的2.2kb BamHI片段的質(zhì)粒pAS2的示意圖。
圖4是為2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所構(gòu)建的、含有來自pAS2的1.3kb Pst I/Bam HI片段的質(zhì)粒pAS 2/1的示意圖。
圖5是為2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所構(gòu)建的、含有來自pAS2的1.6kb Sph I/Bam HI片段的質(zhì)粒pAS 2/2的示意圖。
圖6是為2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所構(gòu)建的、含有來自pAS2的0.9kb Pst I片段的質(zhì)粒pAS 2/3的示意圖。
圖7是為2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所構(gòu)建的、含有來自pAS2的0.6kb SphI片段的質(zhì)粒pAS 2/4的示意圖。
圖8是為2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所構(gòu)建的、含有來自pAS2的0.8kb Hinc II/Hind III片段的質(zhì)粒pAS 2/5的示意圖。
圖9是為2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所構(gòu)建的、含有來自pAS2的0.65kb Xho I/Sal I片段的質(zhì)粒pAS 2/6的示意圖。


圖10是為2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所構(gòu)建的、含有來自pAS2的0.5kb Xho I/Sal I片段的質(zhì)粒pAS 2/7的示意圖。
圖11是為2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所構(gòu)建的、含有來自pAS2/3的0.28kb Hinc II片段的質(zhì)粒pAS 2/8的示意圖。
圖12是為2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所構(gòu)建的、含有來自pAS2/1的0.7kb Xho I/Bcl I片段的質(zhì)粒pAS 2/9的示意圖。
圖13是為2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所構(gòu)建的、含有來自pAS2的0.3kb Sst I/Bcl I片段的質(zhì)粒pAS 2/10的示意圖。
圖14是2.2kb Bam HI片段的DNA序列以及基因acbA、B、C的氨基酸序列的示意圖。
下面詳細描述本發(fā)明。
所有的基因工程方法，除非另有說明，一律按照J.Sambrook et al.(Molecular CloningA Laboratory manual；2nd edition，1989；Cold SpringHarbor Laboratory Press，N.Y.，U.S A.)進行操作。
使用寡核苷酸引物(見表1)，用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)從游動放線菌屬SE 50/110中獲得篩選用的基因探針，寡核苷酸引物來源于已知dTDP-葡萄糖脫水酶的高度保守蛋白質(zhì)區(qū)域。將擴增后的游動放線菌屬SE 50/110 DNA片段克隆于pUC18中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)中。產(chǎn)生的質(zhì)粒(pAS1，見圖2)用煮沸法或堿溶解法從大腸桿菌中分離(Sambrook et al.，1989)。
來自大腸桿菌DH5α的質(zhì)粒pAS1用限制酶EcoR I和HindIII水解。分離0.3lkb的EcoR I/Hind III片段，并通過所謂的缺口翻譯法用32P標(biāo)記的脫氧核苷酸標(biāo)記。這個放謝性標(biāo)記的片段作為基因探針用于分離阿卡布糖生物合成基因，該片段在下文中稱為acb探針。
阿卡布糖生物合成基因按以下步驟分離。來自游動放線菌屬的染色體DNA用不同的限制酶(SstI、Bgl II和BamH I)切割，經(jīng)過凝膠層析，用acb探針通過Southern雜交研究同源基因。與基因探針雜交的DNA限制片段的大小如下10kb(Sst I)、9-10kb(Bgl II)和2.2kb(BamH I)。將與acb探針雜交的不同的DNA片段從凝膠上洗脫下來，連接到載體pUC18上，克隆于大腸桿菌DH5α中。
優(yōu)選對2.2kb BamH I DNA片段進行克隆及序列分析。通過并集物雜交(pool hybridization)識別含有與acb探針雜交的游動放線菌屬DNA的大腸桿菌DH5α克隆(見實施例7)。從陽性克隆中分離質(zhì)粒DNA，用Southem雜交證實并集物雜交的結(jié)果。所得的質(zhì)粒(見圖3)用不同的限制性核酸內(nèi)切酶進行切割。產(chǎn)生的DNA片段亞克隆到大腸桿菌DH5α的pUC18中，進行再連接和序列分析。
為了確定游動放線菌屬的2.2kb BamH I片段的DNA序列，構(gòu)建下列質(zhì)粒(實施例7)，分析插入DNA的序列(見圖1、14)pAS 2/1＝來自pAS2的1.3kb Pst I/BamH I片段(圖4)pAS 2/2＝來自pAS2的1.6kb Sph I/BamH I片段(圖5)pAS 2/3＝來自pAS2的0.9kb Pst I/片段(圖6)pAS 2/4＝來自pAS2的0.6kb Sph I/片段(圖7)pAS2/5＝來自pAS2/1的0.8kb Hinc II/Hind III片段(圖8)pAS 2/6＝來自pAS2的0.65kb Xho I/Sal I片段(圖9)pAS 2/7＝來自pAS2的0.5kb Xho I/Sal I片段(圖1 0)pAS 2/8＝來自pAS2/3的0.28kb Hinc II片段(圖11)pAS 2/9＝來自pAS2/1的0.7kbXho I/Bcl I片段(圖12)pAS 2/10＝來自pAS2的0.3kbSst I/Bcl I片段(圖13)用F.Sanger等人(1977)的方法或由其衍生出的方法進行DNA序列分析。將自讀序列分析試劑盒(Pharmacia，F(xiàn)reiburg，Germany)連同自動激光熒光(ALF)DNA序列分析儀(Pharmacia，F(xiàn)reiburg，Germany)一起使用。購買合適的熒光素標(biāo)記的pUC反向序列分析引物及序列分析引物(Pharmacia，F(xiàn)reiburg，Germany，見表1)。PCR引物引物名稱 序列AS2 5’GCCGCCGAATCCCATGTGGAC3’AS5 5’CCCGTAGTTGTTGGAGCAGCGGGT3’序列分析反應(yīng)引物引物名稱序列通用引物5’GTAAAACGACGGCCAGT3’反向引物5’GAAACAGCTATGACCATG3’
實施例實施例1大腸桿菌菌株的培養(yǎng)，質(zhì)粒DNA的制備和分離將大腸桿菌DH5α在LB培養(yǎng)基中在37℃下培養(yǎng)。在選擇壓(氨芐青霉素，100μg/ml)下保持?jǐn)y有質(zhì)粒的細菌。培養(yǎng)在回旋式搖床上以270轉(zhuǎn)/分進行。至少培養(yǎng)16小時的混合物稱為過夜培養(yǎng)物(OC)。
1.5ml在選擇壓下培養(yǎng)的過夜培養(yǎng)物細胞用于制備質(zhì)粒DNA。用堿性SDS溶解法分離質(zhì)粒(Birnboim & Doly，1979)。
按照制造商的說明(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)，用專一性限制性核酸內(nèi)切酶對載體DNA進行特異性水解。用5U特定的限制性核酸內(nèi)切酶來限制10μg質(zhì)粒DNA，37℃下保溫2小時。為了確保完全水解，再次加入等量的限制性核酸內(nèi)切酶，再保溫至少1小時。
切割后的DNA，根據(jù)DNA片段的大小，在0.5-1.2％水平瓊脂糖凝膠上電泳。為進行洗脫，用無菌解剖刀切下含有DNA片段的凝膠塊并稱重。用JETsorb試劑盒按說明(Genomed，BadOeynhausen，Germany)從瓊脂糖上洗脫出DNA片段。
實施例2游動放線菌屬的培養(yǎng)，染色體DNA的制備、切割和凝膠電泳將游動放線菌屬SE 50/110在TSB培養(yǎng)基中，在回旋式搖床上，于30℃下培養(yǎng)3天。預(yù)培養(yǎng)(5ml)在培養(yǎng)管內(nèi)于240轉(zhuǎn)/分下進行。在500ml帶隔板培養(yǎng)瓶中以100轉(zhuǎn)/分進行主培養(yǎng)(50ml)。培養(yǎng)后，離心沉降細胞，用TE緩沖液洗滌兩次。
用1.5-2mg細胞(鮮重)以苯酚/氯仿抽提法制備完整的DNA(D.A.Hopwood et al.，1985)。
20μg染色體DNA用10U適當(dāng)?shù)南拗泼?Gibco BRL，Eggenstein，Germany)在相應(yīng)的緩沖液中于37℃水解2小時。為了確保完全水解，再加入等量的限制性核酸內(nèi)切酶，重新保溫至少1小時。
切割后的DNA在0.7％水平瓊脂糖凝膠上電泳。
再次用JETsorb試劑盒洗脫出DNA片段(見實施例1)。
實施例3acb基因探針的制備按實施例1由pAS1制備的片段按制造商的說明，用GibcoBRL，Eggenstein，Germanv生產(chǎn)的缺口翻譯系統(tǒng)進行放射性標(biāo)記。用0.5-1.0μg的DNA片段和[α-32P]dCTP(3000 Ci/mmol；Amersham，Braunschweig，Germany)。然后將混合物煮沸10分鐘(變性)，立即加入雜交溶液中(見實施例4)。
實施例4將DNA轉(zhuǎn)移至膜上，DNA雜交(Southem雜交)及放射自顯影用Southern轉(zhuǎn)移法將DNA片段從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到濾膜上(Southern，E.M.，1975)。按實施例2獲得的瓊脂糖凝膠在0.25M HCl中搖動20分鐘。將凝膠置于3層Whatman 3MM吸水紙(Whatman，maidstone，England)上，將一張HybondTM-N+膜(Amersham，Braunshweig，Germany)放在凝膠上，去掉氣泡。將幾層吸水紙置于其上。將一個重約1kg的重物置于這疊濾紙上。通過將DNA吸入0.4M NaOH中轉(zhuǎn)移DNA。轉(zhuǎn)移至少12小時后，尼龍濾膜用2xSSC沖洗5分鐘并風(fēng)干。
將尼龍濾膜置于50-100ml預(yù)雜交溶液中，于68℃下在水浴中搖動至少2小時。在此期間，至少換兩次溶液。雜交在雜交盒中進行至少12小時。使用15ml含acb探針(見實施例3)的雜交溶液。
然后，尼龍濾膜用6×后洗液和1×后洗液各洗15分鐘。當(dāng)尼龍濾膜還潮濕時，用膠紙蓋住尼龍濾膜。在帶有增感屏的暗盒中，用Hyperfilm MP(Amersham，Braunshweig，Germany)于-80℃下進行放射自顯影至少16小時。
實施例5從游動放線菌屬完整的DNA中分離和克隆BamH I片段來自游動放線菌屬SE50/110的染色體DNA用BamH I完全水解，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，從瓊脂糖上洗脫出長度為1.5-3kb的DNA片段。載體質(zhì)粒pUC18由大腸桿菌DH5α制備，載體質(zhì)粒用BamH I水解，并按制造商說明用堿性磷酸酶(Boehringer，Mannheim，Germany)處理。取0.01-0.1μg DNA，按片段與載體之比為3∶1，混合物體積為20μl進行連接。使用1U T4 DNA連接酶及合適的緩沖液(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)。用完全連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞(如Hanahan 1983所述)。將氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化株轉(zhuǎn)移到LB-Amp選擇平板上(100μg/ml)。
實施例6鑒別含有dTDP-D-葡萄糖合酶基因的克隆研究青霉素抗性轉(zhuǎn)化株中是否含有dTDP-D-葡萄糖合酶基因。每種情況下都是從這些克隆中取10個克隆在選擇平板上劃線，將它們培養(yǎng)過夜，用3ml LB培養(yǎng)基從平板上洗下。從20個這樣的10克隆并集物中分離質(zhì)粒DNA(如Bimboim & Doly，1979所述)。用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I和Hind III水解這20個不同的質(zhì)粒制備物，以從多聚接頭上去掉克隆的BamH I片段。然后將限制混合物在0.8％瓊脂糖凝膠上進行電泳。用Southem轉(zhuǎn)移法將DNA從瓊脂糖凝膠上轉(zhuǎn)移至尼龍濾膜上(見實施例4)。再次與acb探針雜交(見實施例4)。這些并集物中的一個與acb探針有陽性反應(yīng)，將這個并集物分成10個單獨的克隆。同樣分離出這些克隆的質(zhì)粒，并進行上述操作。雜交質(zhì)粒被稱為pAS2，它含有一個2.2kb的BamHI片段。
實施例7質(zhì)粒pAS2的亞克隆由質(zhì)粒pAS2開始，產(chǎn)生幾個亞克隆，以便闡明雙鏈DNA的序列(圖1；圖4-13)。pAS2/1和pAS2/3質(zhì)粒pAS2用Pst 1水解，在1％瓊脂糖凝膠上分離限制混合物。從瓊脂糖凝膠上洗脫出水解產(chǎn)生的0.9kb Pst I片段和帶有余下的1.3kb Pst I/BamH I片段的質(zhì)粒條帶(JETsorb試劑盒；Genomed，Bad Oeynhausen，Germany)。
重新連接帶有1.3kb Pst I/BamH I片段的質(zhì)粒，得到亞克隆pAS 2/1。將0.9kb Pst I片段克隆到載體pUC18(用Pst I水解)中，產(chǎn)生亞克隆pAS 2/3。pAS 2/2和pAS 2/4質(zhì)粒pAS2用Sph I水解。重新連接帶有1.6kb Sph I/BamH I片段的質(zhì)粒，得到亞克隆pAS 2/2。將0.6kb Sph I片段克隆到pUC18(用Sph I水解)中，產(chǎn)生亞克隆pAS 2/4。pAS 2/5
質(zhì)粒pAS 2/1用Hinc II/Hind III水解。將產(chǎn)生的0.8kb片段克隆到pUC18(用Hind III/Hinc II水解)中，產(chǎn)生亞克隆pAS 2/5。pAS 2/6質(zhì)粒pAS2用Xho I/Sal I水解。將產(chǎn)生的0.65kb片段克隆到pUC18(用Sal I水解)中，產(chǎn)生亞克隆pAS 2/6。pAS 2/7質(zhì)粒pAS2用Xho I/Sal I水解。將產(chǎn)生的0.5kb片段克隆到pUC18(用Sal I水解)中，產(chǎn)生亞克隆pAS 2/7。pAS 2/8質(zhì)粒pAS 2/3用Hinc II水解。將產(chǎn)生的0.3kb片段克隆到pUC18(用Hinc II水解)中，產(chǎn)生亞克隆pAS 2/8。pAS 2/9質(zhì)粒pAS 2/1用Xho I/Bcl I水解。將產(chǎn)生的0.7kb片段克隆到pUC18(用Sal I/BamH I水解)中，產(chǎn)生亞克隆pAS 2/9。PAS 2/10質(zhì)粒pAS2用Sst I/Bcl I水解。將產(chǎn)生的0.3kb片段克隆到pUC18(用Sst I/BamH I水解)中，產(chǎn)生亞克隆pAS 2/10。
實施例8游動放線菌屬2.2kb BamH I片段的DNA序列分析對實施例7描述的質(zhì)粒進行序列分析。來自一個制備物(見實施例1)的6-8μg質(zhì)粒DNA用于序列分析反應(yīng)。用自讀序列分析試劑盒(Pharmacia，F(xiàn)reiburg，Germany)進行序列分析反應(yīng)。在這里使用對雙鏈DNA進行序列分析的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。為能使用A.L.F.(自動激光熒光(DNA)序列分析儀)來分析核苷酸序列，將熒光素標(biāo)記的通用序列引物和反向序列引物用作序列分析反應(yīng)的起始分子(見表1)。為制備凝膠，將8ml Hydro Link Long Ranger(Serva，Heidelberg，Germany)，33.6g尿素、8ml10×TBE緩沖液，加水至80ml混合，過濾滅菌，抽氣1分鐘。加入350μl 10％(W/V)過硫酸銨和40μl N，N，N’，N’-四甲基乙二胺引發(fā)聚合反應(yīng)。將溶液倒入凝膠模(50×50×0.05cm)中。在38w，45℃恒溫下電泳。用1×TBE緩沖液作電泳緩沖液。在一臺聯(lián)機計算機(Compaq 386/20e)上將所測得的熒光信號轉(zhuǎn)化成DNA序列。這臺聯(lián)機計算機也用來控制電泳儀(Program A.L.F.Manger 2.5；Pharmacia)。緩沖液與溶液培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10gNaCl10g酵母抽提物 5g水 加至1000ml用4M NaOH調(diào)pH至7.5TSB培養(yǎng)基胰蛋白胨大豆肉湯(Oxoid) 30g水 加至1000mlTE緩沖液(pH8.0)Tris-HCl10mMNa2EDTA1mM質(zhì)粒DNA的標(biāo)準(zhǔn)制備(Birnboim & Doly 1979方法的修改方法)混合物I50mM葡萄糖50mM Tris-HCl(pH8.0)
10mM EDTA(pH 8.0)5mg/ml溶菌酶混合物II200mM NaOH1％(w/v)SDS(十二烷基硫酸鈉)混合物III3M醋酸鉀1.8M甲酸鹽DNA-DNA雜交20XSSC3M NaCl0.3M檸檬酸鈉pH7.2預(yù)雜交溶液6XSSC0.01M磷酸鈉緩沖液pH6.81mM EDTA0.5％SDS0.1％脫脂奶粉雜交溶液在標(biāo)記反應(yīng)后，將acb探針加入到15ml預(yù)雜交溶液中。6X后洗液6XSSC0.5％SDSDNA序列分析TBE緩沖液(pH8.0)
1M Tris堿0.83M硼酸10mM EDTA參考文獻1.Bimboim H.C.&Doly J.(1979)A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinantplasmid DNANucleic Acids Res.，7，1513-15232.Hanahan D.(1983)Studies on transformation of Escherichia coli with plasmidsJ.Mol.Biol.166，557-5803.HopWood DA.et al.，(1985)Genetic manipulation of Streptomyces；A laboratory manual；The John Innes Foundation，Norwich，England4.Sanger F.；Nicklen S.；Coulson A.R.(1977)DNA sequencing with chain-terminating inhibitorsProc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463-54675.Southem E.M.，(1975)Detection of specific sequences among DNA Fragmentsseparated by gel electrophoresisJ.Mol.Biol.，98，503-521
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱BayerAG(B)街道B ayerwerk(C)城市Leverkusen(E)國家德國(F)郵政編碼51368(G)電話0214-3061455(H)傳真021 4-303482(ii)發(fā)明名稱阿卡布糖基因(iii)序列數(shù)；1(iv)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30B(EPA)(2)1號序列信息(i)序列特征(A)長度2219個堿基對(B)類型核苷酸(C)股數(shù)雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(vi)原始來源(A)生物體游動放線菌屬SE 50/110(xi)序列描述1號序列GGATCCGGGA GTACTTCACC CATCACGGCA TCGATCATTC GATCCTGGTG ATGCGGGTGG 60GCGAGACGGT CAAGGACTTC GACACGGCGG GCCGCATCGT CGCCGCGATG GACGCCTTCG 120GACTGGCCCG CCGCCGGGAG CCGATGATCG TCGTCGGTGG TGGGGTGCTG ATGGACGTGG 180CCGGTCTGGT GGCCAGCCTC TACCGGGCGC GGCACGCCGT TCTGCGGGTG CCGACGACAC 240TGGTCGGACT GATCGACGCG GTGTCGCGCG AAGACCGGGT CAACTTCAAC GGCCACAAGG 300AACCGGCTGG GTACGTACGC CCGGCTGATC TGACCCTGCT GGACCGCCGC TTCCTGGCCA 360CCCTGGACCG GCGCCACCTC AGCAACGGGC TCGCCGAGAT GCTCAAGATC GCGCTGATCA 420AGGATGCCGA GCTGTTCCAG CTGCTGGAGC GGCACGGGCG GGTCCTGATC GAGGAACGGT 480TCCAGGGCGT ACCGGAACCG GTGACCGGGC CGCCGTCCGG GCCCTGCGCG CGCCACCCAT 540GGCATGCTGG AGGAACTCGG CCCAATCTGT GGGAGAGCCG GCTGGAACGC AGTGTCGACT 600ACGGGCACAC GTTCAGCCCG ACCATCGAGA TGCGCGCGCT GCCGGCTCTG CTGCACGGCG 660AGGCCGTGTG TGTGGACATG GCGCTGACCA CGGTGCTGGC GTACCGGCGG GGTCTGCTCG 720ACGTCGCGCA GCGGGACCGG ATCTTCGCGG TGATGACCGC CCTGGGCCTG CCGACCGGCA 780TCCGCCTGCT CACGCCGGAG GTGCTGGAGG CGGCGTTGCA GGACACCGTC CGGCACCGGG 840ACGGGTGGCA GCGGCTGCCA CTGCCGGTGG GGATCGGGGG TGTCACGTTC GTCAACGACG 900TGACGGCCGC CGAGCTGCAG CCGCCGCGCT GATGCAGCAC CGGCTCGCCG AGGACGCCCT 960GCTGCTGCGC GCCCTAGCTC GGGCCGCGGA CGCCGATCGC CGGAAGCGAC CGGCGTCCGT 1020CCGCCCACCG GTTGCCGTCA GTCCACCAGG AACGGTTGGC GCGATACCAC GCGACCGTTT 1080CCGCGATGCC GTCGGTGAAA TCGACCCGCG GCCGGTAACC GAGTTCCCCG GCGATTTTCG 1140AATAGTCGAG AGAATAGCGC CGGTCGTGAC CTTTGCGATC GGTCACGAAA GATATGCGCG 1200AACGCCGGGC GCCGCACGCC TCGAGGAGGA TCTCGGTCAA TTCGAGATTC GTCGCCTCCC 1260ACCCACCGCC GATGTGATAG ACCTCGCCTG CCCGGCCGGC ACCCAGGGCC AGGGCGAGAC 1320CGCGGCAATG GTCGCTGACG TGGAGCCAGT CGCGGATGTT GCGGCCGTCG CCGTAGACCG 1380GTACGTCGAG CCCGTCGAGC AGCCTGGTGA CGAACAGCGG AATCATTTTC TCCGGGAATT 1440GCCGGGGCCC GTAGTTGTTG GAGCAGCGGG TCACCACGAC GTCCATCCCG TGCGTCTGGT 1500GGTAGGCCAG AGCGAGGAGG TCGGACCCGG CTTTGCTCGC GGCGTACGGC GAGTTGGGCG 1560CCAGCGGATG GCCCTCGGCC CACGAGCCGG TGTCGATCGA CCCGTACACC TCGTCGGTGG 1620AAACATGCAG GAAGCGGCCG ATATGGTGGC GTAGCGCGGC GTCCAGTAGC ACCTGAGTGC 1680CGACCAGGTT GCTGGCCACG AAGGGGCCGG AGGCGACCAC CGAGCGGTCG ACGTGGGTCT 1740CGGCGGCGAA GTGCGCCACG GTGTCGTGCC GCGCCATCAG CCCCTCGATT AGACCTTCGT 1800CACAGATGTC GCCCCGAACG AAGCTGAAAC GAGGGTCCGC CGACGCTTCG GCGAGATTTC 1860TGAGATTGCC TCCGTAACCC AGTTTGTCGA CGACCGTAAC CTGCGTCACG GGTTGTGGTG 1920TGGCAATGTC GCCACTGATC AGGGAAGTTA CAAAATGGGA CCCGATAAAG CCGGCTCCGC 1980CGGTGACCAA GATTTTCATC GCCGGGATTG TAGCAATGCC GCCAATGGGT GCCCGATGTT 2040CGGCCGAGCC ATTTACGGGG CTTGCTGATA TGGTCGGTCA CGTGCGCGGA ATATTGCTGG 2100CCGGGGGAAC CGGCTCACGG CTTCGACCGG TGACCTGGGC GGTTTCCAAA CAACTGATGC 2160CGGTCTATGA CAAACCGATG ATCTACTATC CGCTGGCCAC GCTCGTCAGC TGCGGATCC 2219
權(quán)利要求
1.具有1號序列的DNA序列。
2.權(quán)利要求1的DNA，其特征在于它含有編碼dTDP-葡萄糖合酶的完整acbA DNA序列和acbB(編碼dTDP-葡萄糖脫水酶)和acbC(編碼一種環(huán)化酶)的部分DNA序列。
3.權(quán)利要求2的DNA的功能變異體。
4.含有權(quán)利要求1-3的DNA的載體。
5.用權(quán)利要求4的載體轉(zhuǎn)化的微生物。
6.具有1號序列的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求6的氨基酸序列的功能變異體和突變體。
8.含有權(quán)利要求6和7的氨基酸序列或其部分的蛋白質(zhì)。
9.分離一個或多個來自放線菌的阿卡布糖生物合成基因的方法，其特征在于用來源于已知dTDP-葡萄糖脫水酶的高度保守蛋白質(zhì)區(qū)域的寡核苷酸引物作為基因探針，與阿卡布糖生物合成基因雜交。
10.制備阿卡布糖的方法，其特征在于培養(yǎng)權(quán)利要求5的微生物，從液體培養(yǎng)基中分離阿卡布糖。
11.按照權(quán)利要求2獲得的基因在鑒定其他阿卡布糖結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因中的應(yīng)用。
12.按照權(quán)利要求2和11獲得的基因在通過增加基因劑量，或使用更有效的啟動子或通過基因操作(如對調(diào)節(jié)基因蛋白表達或調(diào)節(jié)基因識別位點的基因操作)改變調(diào)控作用來提高阿卡布糖合成產(chǎn)量的應(yīng)用。
13.按權(quán)利要求2和11獲得的基因在分離與阿卡布糖相關(guān)的天然物質(zhì)的生物合成基因中的應(yīng)用。
14.按權(quán)利要求2和11獲得的基因在通過蛋白質(zhì)工程修飾生物合成酶中的應(yīng)用。
15.按權(quán)利要求2和11獲得的基因在消除不需要的阿卡布糖額外組份生物合成途徑中的應(yīng)用。
16.按權(quán)利要求2和11獲得的基因在消除不需要的阿卡布糖酶降解反應(yīng)中的應(yīng)用。
17.按權(quán)利要求2和11獲得的基因在獲得生物合成酶中的應(yīng)用及在由合成的或由微生物制備的前體合成阿卡布糖或此類化合物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及放線菌，主要是游動放線菌屬SE50/110及其突變株的阿卡布糖生物合成基因；涉及放線菌阿卡布糖生物合成基因的分離方法，即利用來源于已知dTDP-葡萄糖脫水酶的高度保守蛋白質(zhì)區(qū)域的基因探針，尋找acbA基因(編碼dTDP-葡萄糖合酶)、acbB基因(編碼dTDP-葡萄糖脫水酶)和acbC基因(編碼一種環(huán)化酶，此環(huán)化酶與AroB即細菌-3脫氫奎尼酸合酶部分相同)或者一個或多個游動放線菌屬阿卡布糖生物合成基因；還涉及阿卡布糖生物合成基因的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/60GK1144271SQ96102718
公開日1997年3月5日 申請日期1996年3月1日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月2日
發(fā)明者A·克呂格, W·皮帕斯堡, J·迪斯勒, A·施特拉曼 申請人:拜爾公司