專利名稱：參與酯酶分泌機(jī)制的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一編碼一參與沙雷氏菌屬的微生物的酯酶分泌機(jī)制的多肽的基因DNA，一包含該基因的重組質(zhì)粒，一用此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的新型微生物，一同時(shí)含有上述重組質(zhì)粒和帶有編碼一酯酶的基因的重組質(zhì)粒的新型微生物，以及一通過培養(yǎng)這些新型微生物進(jìn)行酯酶生產(chǎn)的過程。
近來，人們經(jīng)常嘗試將一些酶如酯酶用于水解反應(yīng)。為此目的人們發(fā)現(xiàn)了各種各樣的酯酶，如來源于動物(如豬的肝臟、豬的胰臟等)的酯酶以及由微生物如球形節(jié)細(xì)菌(Arthrobacterglobiformis)、白地霉(Geotrichum candidum)、CandidaCylindracea、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)等所產(chǎn)生的酯酶。另外，眾所周知由靈桿菌產(chǎn)生的酯酶是經(jīng)重組DNA技術(shù)制備的。
然而，已知的酯酶和已知的生產(chǎn)酯酶的方法都有各種各樣的問題。例如來源于動物的酯酶都很貴，來源于微生物的酯酶則在酶的活性、穩(wěn)定性或特異性等方面有缺點(diǎn)或者是生產(chǎn)酯酶的微生物沒有高的生產(chǎn)率。另外，即使利用基因重組的微生物，僅僅通過擴(kuò)增酯酶基因?qū)Ⅴッ府a(chǎn)率提高到適用于工業(yè)生產(chǎn)的水平也不一定容易。此外，即使提高了酯酶的產(chǎn)率，酯酶的胞外分泌有時(shí)也會不足，因此就要求復(fù)雜的程序回收此酶。
各種考察的結(jié)果表明本發(fā)明者已成功地獲得了編碼一參與沙雷氏菌屬的微生物的酯酶分泌機(jī)制的多肽的基因(DNA)，并已進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)經(jīng)用含該DNA的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化該微生物可顯著提高此酯酶產(chǎn)生微生物分泌酯酶的能力，基于這些新的發(fā)現(xiàn)本發(fā)明已經(jīng)成功地完成了。
本發(fā)明的目的之一是提供編碼一參與沙雷氏菌屬的微生物的酯酶分泌機(jī)制的多肽的基因。本發(fā)明的另一目的是提供一通過將該基因插入一載體質(zhì)粒而形成的重組質(zhì)粒并進(jìn)一步提供一含該重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明的又一目的是提供一通過培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化子并收集轉(zhuǎn)化子細(xì)胞內(nèi)外積累的酯酶以生產(chǎn)酯酶的方法附圖簡要說明

圖1列示了從實(shí)施例2的重組細(xì)胞中分離出的質(zhì)粒pPKHE200，pPKHE75，pPKHE35，pPKHE90和pPKHE65的限制性內(nèi)切酶圖譜。
此編碼一參與酯酶分泌機(jī)制的多肽的基因(此后稱為“酯酶分泌基因”)為一長4,466個(gè)堿基對的雙鏈DNA，序列中有三個(gè)開放的閱讀框架(ORF)，尤其含有示于后面的序列身份號1中的核苷酸序列。
此酯酶分泌基因的供體微生物包括屬于有酯酶生產(chǎn)能力的沙雷氏菌屬的任何微生物如靈桿菌Sr41(FERM BP-487)，液化沙雷氏菌ATCC 27592，靈桿菌ATCC 13880，靈桿菌ATCC 14764，靈桿菌ATCC 19180，靈桿菌ATCC 21074，靈桿菌ATCC 27117，靈桿菌ATCC 21212等。
插入酯酶分泌基因的載體質(zhì)粒包括在被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中可復(fù)制的任何質(zhì)粒。其中，該質(zhì)粒最好是那些拷貝數(shù)在1至幾千、帶有一對抗生素如氨卡青霉素、卡那霉素、氯霉素的抗性標(biāo)記并帶有適當(dāng)?shù)膯幼尤鏻ac，tac或trp的質(zhì)粒。此外，載體質(zhì)?？蛇M(jìn)一步攜帶一質(zhì)粒穩(wěn)定基因如par和parB。
這些載體質(zhì)粒包括如pLG339[Gene，Vol.18，332(1982)]，pBR322[Gene，Vol.2，95(1977)]，pUC18[Gene，Vol.33，103(1985)]，pUC19[Gene，Vol.33，103(1985)]，pHSG298[Gene，Vol.61，63(1987)]，pHSG299[Gene，Vol.61，63(1987)]及類似的其他質(zhì)粒。
上述這些質(zhì)?？少彽?，也可通過一常規(guī)方法如“廓清裂解物片”(參見Yasuyuki Takagi，“Procedure for Experimentin Genetic Engineering”，125頁，Kodansha出版，1980)或“堿裂解片”(參見Maniatis等，Molecular Cloning″，368頁，美國科爾德斯普林港實(shí)驗(yàn)室(1982)]從含這些質(zhì)粒的微生物中獲得。
宿主微生物(既用于質(zhì)粒的重組也用于所期望的酯酶的表達(dá))包括任何可用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化且可復(fù)制此質(zhì)粒、并可表達(dá)此質(zhì)粒上的基因且產(chǎn)生一有功能的蛋白質(zhì)的微生物。這些宿主微生物包括如屬于沙雷氏菌屬或大腸桿菌屬的微生物，尤其是靈桿菌Sr41及由其衍生的各種突變株如靈桿菌M-1(FERM BP-4068)，靈桿菌TT392(參見Journal of Bacteriology，Vol.161，1(1985)]或大腸桿菌K12 DH5[參見Maniatis等，“Molecular Cloning”，第二版，A10，美國科爾德斯普林港實(shí)驗(yàn)室(1989)]。
另外，攜帶一插入了沙雷氏菌屬的酯酶基因的重組質(zhì)粒的任何其它微生物也可用為宿主微生物，如靈桿菌TA5025(FERMBP-4067)。
含酯酶分泌基因的染色體DNA可用常規(guī)方法很容易地從含該基因的微生物獲得，如將微生物細(xì)胞用溶菌酶處理再用表面活性劑(如十二烷基磺酸鈉、月桂酰肌氨酸鈉等)處理，然后用有機(jī)溶劑(如苯酚、氯仿、二乙酯等)抽提以除去蛋白，再用乙醇沉淀DNA[參見Journal of Molecular Biology，Vol.3，208(1961)及Biochemica et Biophysica Acta，Vol.72，619(1963)]。
由含酯酶分泌基因的染色體DNA和載體質(zhì)粒DNA組成的重組質(zhì)?？捎贸Ｒ?guī)方法很容易地制備。如用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶(如EcoRI，BamHI，HindIII，SalI，SacI等)切染色體DNA和質(zhì)粒DNA，然后用DNA連接酶(如T4 DNA連接酶，E.coli DNA連接酶等)處理產(chǎn)物，若有必要，先用末端轉(zhuǎn)移酶或DNA多聚酶處理，再用DNA連接酶進(jìn)行處理(參見Methods in Enzymology，Vol.68，41(1979)，及Yasuyuki Takagi，Procedure forExperiment in Genetic Engineering″，135頁， Kodansha出版，1980]。
可按如下所述從經(jīng)上述程序獲得的重組質(zhì)粒的混合物中篩選含酯酶分泌基因的目的重組質(zhì)粒。
用含酯酶分泌基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化限制內(nèi)切酶缺陷且有酯酶生產(chǎn)力的微生物細(xì)胞，如攜帶含酯酶基因的重組質(zhì)粒(如示于Japanese Patent First Publication(Kokai)No.344891/1993的pLIPE111等)的大腸桿菌K12 DH5菌株，然后將此轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布到細(xì)胞可生長的含乳化的甘油三酯的瓊脂培養(yǎng)基上，如含經(jīng)聚氧化乙烯十六烷醇醚(Brij58)乳化的三丁酸甘油酯的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中同時(shí)也加有規(guī)定濃度的抗生素。30～37℃保溫1～2天后，分離在其周圍形成大的清亮環(huán)帶的轉(zhuǎn)化子克隆。
上面重組質(zhì)粒對宿主微生物的導(dǎo)入可用一常規(guī)方法實(shí)現(xiàn)，如在低溫下用CaCl2水溶液處理宿主細(xì)胞以提高其通透性然后再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入(參見Journal of Molecular Biology，Vol.53，159(1970)]，或用電穿孔的方法。
將參與酯酶分泌機(jī)制的DNA和酯酶基因一起插入同一個(gè)載體質(zhì)粒所得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化微生物細(xì)胞(如大腸桿菌K12 DH5等)，然后用與上述相同的方式處理所得到的轉(zhuǎn)化細(xì)胞也可篩選所期待的轉(zhuǎn)化子。
然后用“堿裂解片”從轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒以獲得重組質(zhì)粒，即通過將靈桿菌的酯酶基因插入載體質(zhì)粒所得到的質(zhì)粒。
為了提高轉(zhuǎn)化效率，在限制性內(nèi)切酶缺陷的且與用于表達(dá)酯酶的宿主微生物同種的微生物中修飾由此獲得的重組質(zhì)粒。也就是說當(dāng)所用的宿主微生物是靈桿菌Sr41時(shí)，上述質(zhì)粒被導(dǎo)入靈桿菌TT392中，此為一限制酶缺陷菌株。提取經(jīng)如此修飾的重組質(zhì)粒。然后將被修飾的質(zhì)粒導(dǎo)入宿主微生物中以獲得適于目的酯酶生產(chǎn)的目的轉(zhuǎn)化子。
按Takagi和Kizumi的方法[參見Journal of Bacteriology，Vol.161，1(1985)]可容易地將重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主微生物中，質(zhì)粒的提取可按堿裂解法等完成。此外，通過分離表達(dá)抗生素抗性的菌落也可獲得目的轉(zhuǎn)化子。用于該轉(zhuǎn)化的宿主微生物包括上面提及的微生物但最好是有高的酯酶產(chǎn)率的菌株。
用上述方法得到的被轉(zhuǎn)化的微生物如靈桿菌TA5030和靈桿菌TBS90。靈桿菌TA5030是通過用將一含酯酶基因的約2.6kb的SalI-BstPI DNA片段和一含酯酶分泌基因的約6.5kb的EcoRV-EcoRV DNA片段插入載體pMW119所得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化靈桿菌Sr41而得的；靈桿菌TBS90是通過用將一含酯酶基因的約2.6kb的SalI-BstPI DNA片段和一含酯酶分泌基因的約9.0kb的BamHI-SacI DNA片段插入載體pMW119所得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化靈桿菌Sr41而得的。這些轉(zhuǎn)化株都有與宿主微生物靈桿菌Sr41相同的形態(tài)特征。
通過將微生物在培養(yǎng)基中培養(yǎng)并收集微生物細(xì)胞內(nèi)外的酯酶可實(shí)現(xiàn)用上述被轉(zhuǎn)化的微生物生產(chǎn)酯酶。
用于酯酶生產(chǎn)的培養(yǎng)基包括微生物可在其中生長的任何常規(guī)培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基含有碳源如糖類(如葡萄糖、蔗糖、糖蜜等)、有機(jī)酸(如延胡索酸、檸檬酸等)或氨基酸(如丙氨酸、谷氨酸、天冬酰胺等)及氮源如無機(jī)銨鹽(如硫酸銨、氯化銨等)、脲、蛋白胨、玉米漿、酵母抽提物、酪蛋白水解物等。依培養(yǎng)基之不同，碳源通常占1～15％(W/V)，氮源則為0.1～2.0％(W/V)。培養(yǎng)也可可有可無地進(jìn)一步含有適量的無機(jī)鹽(如磷酸鹽、鎂鹽、鉀鹽、鈣鹽等)和/或金屬離子(如鐵、錳、銅、鋅等)。在合成培養(yǎng)基的情況下，還可進(jìn)一步含維生素或氨基酸，以及酯酶生產(chǎn)的誘導(dǎo)劑(如植物油、表面活性劑等)、消泡劑、適于在微生物中穩(wěn)定質(zhì)粒的抗生素。培養(yǎng)基的pH值最好調(diào)至5～8。
此被轉(zhuǎn)化的微生物的培養(yǎng)可用常規(guī)方法實(shí)現(xiàn)。例如，將微生物接種于培養(yǎng)基中，并經(jīng)振蕩培養(yǎng)、通氣培養(yǎng)、持續(xù)培養(yǎng)、不間斷培養(yǎng)等進(jìn)行培養(yǎng)。雖然依培養(yǎng)基種類和培養(yǎng)方法的不同培養(yǎng)條件可有所改變，但可以是適于微生物生長的任意條件，通常初始pH值為5～8，于20～40℃培養(yǎng)1～2天。
用常規(guī)方法收集在培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生的酯酶，例如，含于培養(yǎng)基中的酯酶可用無機(jī)鹽鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、用離子交換樹脂和各種柱色譜進(jìn)行吸附或解吸附、凝膠過濾、使用蛋白質(zhì)沉淀劑或這些方法的組合等方法來收集。在細(xì)胞內(nèi)積累的酯酶可先用物理方法和摩擦破碎法(Dyno Mill)或化學(xué)方法如溶菌酶處理來破碎細(xì)胞，然后再用上述方法收集細(xì)胞抽提物中的酯酶來得到。
本發(fā)明的酯酶分泌基因并不局限于此處詳細(xì)說明中所明確揭示的那些DNA序列，且包括有通過如插入、缺失或置換在序列中進(jìn)行修飾所獲得的DNA序列的任意基因。也就是說，酯酶分泌基因可通過利用以此處明確揭示的編碼酯酶基因的DNA序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的突變的DNA合成引物或利用化學(xué)誘變劑如甲酸、亞硫酸肼直接在試管中進(jìn)行人工修飾。另外，也可用NTG或紫外線處理酯酶生產(chǎn)菌株獲得突變基因。
實(shí)施例此以下面的例子來舉例說明本發(fā)明，但不應(yīng)認(rèn)為本發(fā)明局限于此。
在實(shí)施例中酯酶活性用常規(guī)方法進(jìn)行測量(利用日本Daini-ppon Pharmaceutical有限公司生產(chǎn)的脂酶試劑盒S，其中底物為三丁酸二巰基丙醇酯)，也可用另一方法測量，它包括將產(chǎn)物置于含橄欖油(作為底物)的酶促反應(yīng)液中，pH8.0，37℃反應(yīng)20分鐘，然后測量形成的脂肪酸的量，其中酯酶活性單位以每分鐘形成的脂肪酸的微摩爾數(shù)來表示。
此外，例子中所用的培養(yǎng)基描述如下，其中除非特別說明，“％”是重量/體積百分比(W/V％)。
LB培養(yǎng)基1.0％的細(xì)菌胰蛋白胨(Difco公司生產(chǎn))，0.5％的酵母抽提物(Difco公司生產(chǎn))及0.5％的氯化鈉。
LBG平板培養(yǎng)基1.0％的細(xì)菌胰蛋白胨(Difco公司生產(chǎn))，0.5％的酵母抽提物(Difco公司生產(chǎn))，及0.5％的氯化鈉及1.0％的Gellan樹膠(日本W(wǎng)ako Pure Chemical Industries公司生產(chǎn))。
含三丁酸甘油酯的LBG平板培養(yǎng)基含0.5％(v/v)三丁酸甘油酯，0.5％聚氧化乙烯十六烷醇醚及0.005％氨芐青霉素的LBG平板培養(yǎng)基。
酯酶生產(chǎn)培養(yǎng)基1.0％的葡聚糖，2.0％的酵母，0.2％的硫酸銨，0.1％的磷酸二氫鉀，0.05％的七水硫酸鎂，0.01％的二水氯化鈣，0.001％的七水硫酸亞鐵，0.5％的Tween 80及0.1％的亮色刺桐。
實(shí)施例1(1)含酯酶分泌基因的染色體DNA的制備在LB培養(yǎng)基(200ml)中通氣振蕩培養(yǎng)靈桿菌Sr41(FERM BP-487)，30℃過夜，然后離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸于0.9％的氯化鈉水溶液(200ml)中，離心以洗滌細(xì)胞，洗后的細(xì)胞懸于含200mg溶菌酶的50mM Tris-鹽酸-50mM乙二胺匹乙酸二鈉的水溶液(pH7.5，200ml)中，混合物在室溫下靜置1小時(shí)。
以0.5％的終濃度向混合物中加入十二烷基磺酸鈉，再加入蛋白酶K，混合物于50℃溫和地?fù)u動3小時(shí)以裂解細(xì)胞，用等體積的被10mM Tris-鹽酸-1mM乙二胺匹乙酸二鈉水溶液(pH8.0)(此后稱之為“TE”)飽和的苯酚抽提混合物二次，再用TE飽和的苯酚和氯仿的等體積混合物抽提二次，所得水相用乙醇沉淀。沉淀溶于TE中以制備含2.5mg帶酯酶分泌基因的染色體DNA的TE溶液。
(2)重組質(zhì)粒DNA的制備用限制性內(nèi)切酶SacI徹底消化上述(1)中制備的染色體DNA(20μg)，用TE飽和的苯酚和氯仿的等體積混合物抽提二次，向混合物中加0.5倍體積的7.5M乙酸銨，用2倍體積的乙醇沉淀以回收DNA。
將帶有來自靈桿菌Sr41的酯酶基因的約2.6kb的基因組DNA片段(SalI-BstPI片段)插入載體質(zhì)粒pMWE119中以制備質(zhì)粒載體pMWE121。將被上述相同的限制性內(nèi)切酶徹底消化的質(zhì)粒載體pMWE121用堿性磷酸酶(日本Takara Shuzo有限公司生產(chǎn)，0.4單位)在56℃處理1小時(shí)以去磷酸化，產(chǎn)物用被TE飽和的苯酚和氯仿的等體積混合物抽提二次，再向其中加入0.5倍體積7.5M的乙酸銨，然后用2倍體積的乙醇沉淀以回收載體質(zhì)粒DNA。將此去磷酸化的質(zhì)粒載體與上述染色體DNA(3μg)混合，用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo公司生產(chǎn))在4℃連接16小時(shí)以得重組質(zhì)粒DNA。
(3)用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及用大腸桿菌宿主構(gòu)建克隆庫用Hanahan的方法[參見Journal of Molecular Biology，Vol.166，557(1983)]處理大腸桿菌DH5細(xì)胞，并向其中加入含上述(2)中制備的質(zhì)粒DNA的反應(yīng)混合物，使混合物轉(zhuǎn)變實(shí)現(xiàn)。將如此處理的細(xì)胞涂布于含氨芐青霉素(50μg/ml)的LBG平板培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)以產(chǎn)生含插入了靈桿菌Sr41的染色體DNA片段的重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子(約50,000株)。
(4)含酯酶分泌基因的轉(zhuǎn)化子菌株的分離及確認(rèn)當(dāng)酯酶產(chǎn)生菌接種于含三丁酸甘油酯的LBG平板培養(yǎng)基上時(shí)，產(chǎn)生到培養(yǎng)基中的酯酶會降解三丁酸甘油酯以產(chǎn)生脂肪酸，籍此菌落周圍的甘油三酯乳劑便被轉(zhuǎn)變，在菌落周圍會形成一清亮的環(huán)圈，用此現(xiàn)象可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子的篩選。
將上述(3)得到的轉(zhuǎn)化子(約50,000株)接種于含三丁酸甘油酯的LBG平板培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，由此可從SacI的DNA庫中分離出形成清亮環(huán)帶的菌株。
此清亮環(huán)帶的形成將被歸因于通過導(dǎo)入含酯酶分泌基因的重組質(zhì)粒提高了酯酶的胞外分泌能力，因?yàn)楫?dāng)靈桿菌Sr41接種到含三丁酸甘油酯的LBG平板培養(yǎng)基上并于37℃過夜培養(yǎng)時(shí)可觀察到清亮的環(huán)帶的形成；而當(dāng)未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5和攜帶載體質(zhì)粒pMWE121的大腸桿菌DH5被接種到含三丁酸甘油酯的LBG平板上并于37℃過夜培養(yǎng)時(shí)，觀察不到清亮環(huán)帶的形成。
此外，將可形成清亮環(huán)帶的轉(zhuǎn)化子在含氨芐青霉素(200μg/ml)的LB培養(yǎng)基(60ml)中通氣振蕩培養(yǎng)，37℃過夜，然后用常規(guī)方法測量培養(yǎng)混合物上清的酯酶活性，結(jié)果可觀察到34,800單位的酯酶活性。
另外，將上述培養(yǎng)混合物的上清走SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，用兔的抗靈桿菌產(chǎn)生的酯酶的抗酯酶抗體通過Western雜交分析結(jié)果。結(jié)果產(chǎn)物顯示出一條新帶，此帶在僅含載體質(zhì)粒的大腸桿菌DH5的產(chǎn)物顯示不出，且此帶與從靈桿菌Sr41的培養(yǎng)物上清中得到的純化的標(biāo)準(zhǔn)酯酶位于相同位置。
實(shí)施例2質(zhì)粒的分析用常規(guī)方法[參見Maniatis等，“Molecular Cloning”，368頁，美國科爾德斯普林港實(shí)驗(yàn)室(1982)]從例1-(4)的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞中制備質(zhì)粒DNA，并用各種限制性內(nèi)切酶作酶切然后走瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果證實(shí)除了含有來自靈桿菌的酯酶基因的約2.6kb的SacI-BstPI DNA片段外，此質(zhì)粒(此后稱為“pKHE200”)還含有一約20.0kb的SacI DNA片段。
該pKHE200中的約20.0kb的SacI DNA片段的限制性內(nèi)切酶圖譜示于所附的圖1中。
用各種限制性內(nèi)切酶切質(zhì)粒pKHE200的約20.0kb的SacI片段，并將每個(gè)片段亞克隆到質(zhì)粒載體pMWE121上，然后用此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，以上述同樣方式在含三丁酸甘油酯的LBG平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，并確定是否有清亮的環(huán)帶形成。
每個(gè)DNA片段的限制性內(nèi)切酶圖譜示于所附的圖1中。對于用含約9.0kb的BamHI-SacI DNA片段的質(zhì)粒(pKHE90)和含約6.5kb的EcoRV-EcoRV DNA片段的質(zhì)粒(pKHE65)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5，可觀察到清亮的環(huán)帶的形成及酯酶的活性(用常規(guī)方法測量)。然后對于用含約7.5kb的SacI-BamHI DNA片段的質(zhì)粒(pKHE75)和含約3.5kb的BamHI-BamHI DNA片段的質(zhì)粒(pKHE35)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5，既觀察不到清亮環(huán)帶的形成也觀測不到酯酶的活性(用常規(guī)方法測量)。
從上面的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)來自靈桿菌Sr41的酯酶分泌基因位于約6.5kb的EcoRV-EcoRV DNA片段上。
用質(zhì)粒pKHE65轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5菌株已于1996年2月9日交付工業(yè)科學(xué)和技術(shù)代理處國家生命科學(xué)和人類技術(shù)協(xié)會保管，登記號為FERM BP-5385(稱為“大腸桿菌TA5029”)。
實(shí)施例3克隆DNA的分析[核苷酸序列的確定]用Kilobase Deletion試劑盒(Takara Shuzo公司生產(chǎn))處理重組質(zhì)粒pKHE65以制備各種缺失質(zhì)粒。將這些質(zhì)粒與一引物退火，按照Sanger等的雙脫氧鏈終止法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.74，5463(1977)]用DNA多聚酶的Klenow片段合成互補(bǔ)鏈[用α-32P)dCTP(14.8×105Bq/pmol，74×104Bq)標(biāo)記]，根據(jù)在8％的脲修飾的聚丙烯酰胺凝膠上電泳和放射自顯影的數(shù)據(jù)確定其核苷酸序列。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)來自靈桿菌Sr41的酯酶分泌基因的DNA序列從起始密碼子GTG到密碼子BAG由4,466個(gè)堿基對組成，示于序列身份號1中，它包含參與酯酶分泌機(jī)制的三種多肽的DNA區(qū)域(ORE)。(推測這三個(gè)ORF構(gòu)成了一對兒操縱子)。
此外，由每個(gè)ORF編碼的多肽的氨基酸序列分別示于序列身份號2，3和4中。
實(shí)施例4酯酶高產(chǎn)菌株的制備將質(zhì)粒pKHE65導(dǎo)入限制內(nèi)切酶缺陷的菌株靈桿菌TT392中以得到轉(zhuǎn)化菌株。用“堿裂解法”從被轉(zhuǎn)化的菌株中提取被靈桿菌修飾了的pKHE65質(zhì)粒DNA。然后通過電穿孔法用上述獲得的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化靈桿菌Sr41細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子靈桿菌TA5030。將此轉(zhuǎn)化子(一接種環(huán))接種到含氨芐青霉素(500μg/ml)的酯酶生產(chǎn)培養(yǎng)基中，30℃往復(fù)振蕩培養(yǎng)20小時(shí)(搖幅7厘米，120轉(zhuǎn)/分)。離心培養(yǎng)液以獲得酯酶活性約3.5×105單位/ml的上清液(按常規(guī)方法測量)。此菌株的酯酶產(chǎn)率比宿主菌靈桿菌Sr41高約10倍，比含重組質(zhì)粒(用作載體質(zhì)粒)的靈桿菌Sr41高約2倍。
用帶有本發(fā)明的酯酶分泌基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的微生物有顯著優(yōu)越的酯酶胞外分泌能力。因此，當(dāng)一帶有含酯酶基因的重組質(zhì)粒的酯酶生產(chǎn)微生物被進(jìn)一步用含本發(fā)明的酯酶分泌基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化時(shí)，可獲得一在酯酶產(chǎn)量和酯酶胞外分泌方面都有優(yōu)越性狀的微生物，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化子可在工業(yè)水平上生產(chǎn)所期望的酯酶。
序列表序列身份號1長度4,466堿基對類型核苷酸鏈型雙鏈局部解剖線形分子類型基因DNA株靈桿菌Sr41序列GTG AAT CAA TTT ATC CCG CGC AAC GAA ATT GCG GAT GTT ATA CGT ACA 48CGC AGC AAA GTC TTC TGG ACC GTT GGT ATA TTT ACT GCG TTT ATT AAC 96CTG TTA ATG CTG GTT CCT TCC ATT TAT ATG CTC CAG GTT TAC GAC CGG 144GTG CTG CCT TCG CGC AAT GAA ATC ACG CTG TTA ATG CTG ACG CTG ATC 192ATG CTG GGC ATG TTC GGC ATG ATG TCG CTG TTG GAA TAC GTG CGC AGC 240ATG GTG GTG ATC CGC ATC GGC AGC CAG CTG GAT ATG CGT CTC AAC ACG 288CGA GTC TAT ACC GCG GCC TAC GAA GCG AAT CTG AAA AAC GGT TCG TCT 336GAC GCC GGT CAG ATG CTG AGC GAT TTG ACC AAT CTG CGC CAA TTC CTC 384ACC GGT AGC GCG CTG TTC GCC TTC TTT GAT GCG CCG TGG TTT CCG ATC 432TAT CTG TTG GTG ATA TTC CTC TTT AAC CCT TGG TTG GGC CTT TTC GCC 480CTG GTC GGT GCG CTG TTG CTG ATC GCA TTG GCG GTA ATC AAT GAA GTG 528GTT TCG AAA AAG CCG CTG GGA GAA GCC AGC AAG CTG TCG ATC ATG TCA 576GGT AAT TTG GCC AGC ACC AAT CTG CGA AAT GCC GAA GTG ATC GAG GCT 624TTG GGG ATG TTG CCT AAC CTG AAA CGC CGG TGG TTC GGT CTG CAC CAG 672CGG TTC TTG AAC AGC CAA CGC ATC GCC AGC GAA CGC GCA TCG CGG GTC 720ACG TCA ATC ACC AAG TTC GTG CGT ATG TCG CTG CAG TCC TTA GTG TTG 768GGC CTG GGG GGA TGG TTG GCG ATT GAT GGG CAC ATC ACG CCC GGC ATG 816ATG ATC GCC GGT TCT ATA TTG ATG GGG CGA ACG TTG GCG CCG ATC GAG 864CAG GTC ATT AAC GTT TGG AAA AGC TAT AGC GCG GCC AAA CTT TCT TAT 912GGC CGC TTG GTC AAG CTG CTG GAA ACG CAT CCG CAG CGT GGT ACC GGC 960ATG TCG CTG CCG CGT CCG GAA GGT GTG CTC TCC GTA GAA GGC GTG ACC 1008GCC ACG CCT CCG GGA TCG AAA GGG GAT GCG GTG CTG CAT AAC GTA AGT 1056TTT GCC ATT CAA CCC GGC GAT GTG CTG GGG ATT ATC GGT CCG AGT GCG 1104TCG GGC AAA TCA ACA TTG GCG CGC TTA CTG GTC GGT ATT TGG CCT GTG 1152AGC GAA GGG ATA GTG CGG TTG GAT AAT GCC GAC ATC TAC CAG TGG AAC 1200AAA GAC GAA CTG GGG CCC TAT ATC GGC TAT CTG CCG CAG GAC ATC GAG 1248TTG TTC GCC GGC ACT ATC GCC GAG AAC ATC GCT CGC TTT AAC GAC ATC 1296GAT TCA GAG AAA GTG ATT GAG GCT GCC AAG CTG GCT GGT GTG CAT GAA 1344CTG ATC CTG CGT TTC CCT AAC GGT TAC GAT TCG GTG ATC GGC AAC GGT 1392GGT GCA GGG TTG TCC GGC GGG CAG AAG CAA CGT ATC GGC CTG GCG CGG 1440GCA TTG TAT GGC GAT CCC GCG TTG GTG GTG TTG GAT GAG CCT AAC TCC 1488AAC CTG GAT GAT GCC GGC GAG AAA GCG TTG AAC CAG GCC ATC ATG TTC 1536CTT AAA CAG CGT AAT AAG ACG GTG GTC CTG ATC ACT CAC CGC ACC AAT 1584CTG CTG TCG ATG ACC AGC AAG CTG TTG CTG TTG GTT AAC GGG AAC GTC 1632AAT GCA TTC GGC CCA ACG CAG CAG GTG CTG CAG GCG TTG GCG AAT GCG 1680CAA AAA GCG CAG GTG CCT CCG CAG GCG GTG CGT GCG GTG AAC TCC GAG 1728CCG GAT GAA GGC GAA ATC CCT AAA ACT CAA ATT AAT TAA GCCGTGAACT 1777TGCCCGGCGG CGCTTTTGCG TCGCCGACAG TCAAAGGAGT TGGT ATG TCT ACG CAT1833ATT GGC GAG CCG CAA GAC TCG TAT ACT GAA GAG ATC CCA CAA GAT GAA 1881CGG CGG TTT ACC CGT ATG GGG TGG CTG GTG GTC GGG ATC GGT CTG TTC 1929GGG TTT TTA GCC TGG GCG GCC TTT GCG CCG TTG GAT AAA GGG GTG GCG 1977TCG CCG GGA TCG GTA ACC GTT TCC GGC AAC CGC AAA ACG GTG CAG GCC 2025CCG GCC AGC GGC ATC ATT AAG AAT ATT GCG GTC AGA GAT GGC GAC AAA 2073GTG AAA GCC GGT GAG GTG CTG GTG CAG CTC AGC CAG GTG CAG GCT CAA 2121GCT CAG GTT GAT TCG CTG CGG GAT CAG TAC TAC ACC ACG CTG GCG ACA 2169GAA GGG CGC TTG CTG GCA GAA CGC GAT GGG TTG AGC ATA GTG ACT TTC 2217TCA CCC ATT TTG GAC GCG GTG AAA GAT AAA CCT CGC GTG GCA GAA ATC 2265ATT GCA TTG CAA ACG CAG CTG TTC GCC TCC CGC CGC CAA GCG CTG CAA 2313AGT GAA ATC GAC GGC TAT AAG CAG TCA ATG GAC GGA ATC CGT TTC CAA 2361TTA AAA GGA CTG CAG GAT TCG CGC GGT AAC AAA CAG ATC CAG CTT TCC 2409AGC CTG CGT GAG CAG ATG AAC AGC ATG AAG CAG TTG GCG GCG GAC GGT 2457TAC CTA CCG CGT AAC CGT TAC CTG GAA GTG CAG CGC CAG TTT GCC GAG 2505GTA AAT AGC AGC ATT GAT GAA ACG GTG GGG CGG ATT GGC CAA TTG CAA 2553AAG CAG TTG CTG GAA TCA CAG CAA CGC ATC GAT CAG CGT TTC GCC GAC 2601TAC CAG CGC GAA GTC AGA ACG CAG CTG GCG CAA ACT CAA ATG GAC GCC 2649AGC GAA TTC CGC AAC AAG CTG CAA ATG GCC GAT TTC GAT CTG GGC AAC 2697ACC GCC ATC ACC TCA CCG GTG GAC GGC ACC GTG GTT GGA TTG AAT ATC 2745TTC ACT CAG GGG GGC GTC GTG GGA GCG GGT GAC CAC CTG ATG GAC GTT 2793GTG CCC AGC CAG GCG ACT TTG GTG GTG GAT TCT CGC CTC AAA GTC GAC 2841CTG TTC GAT AAG GTG TAC AAC GGG TTG CCG GTG GAT CTG ATG TTT ACC 2889GCC TTC AAC CAA AAC AAA ACC CCG AAA ATT CCG GGA ACC GTC ACC TTG 2937GTT TCC GCC GAC CGC CTG GTC GAC AAA GCC AAT GGC GAA CCT TAC TAC 2985CAG ATG CAG GTC ACG GTC TCG CCG GAG GGC ATG AAA ATG CTC AGT GGC 3033GAG GAC ATC AAG CCG GGG ATG CCG GTG GAG GTG TTC GTG AAA ACG GGG 3081TCG CGC TCG CTG TTG AGC TAT CTG TTT AAA CCT ATT TTG GAT CGC GCT 3129CAT ACT TCA TTA ACC GAG GAA TAA TT TTG ATT CAT TCA AAA CGA CAG 3176GCT GCC GGT CTG GTT ATC GGC ACC CTT TTG TTT GCG ATG TCT GCG CCG 3224GTT TAT TCG ATA GGG ATT TTA GAC GCA TAT TCG CTG GCA TTA GAA AAG 3272GAC CCG ACC TTT CGG GCG GCT ATA AAA GAG AAA GAA GCG GGA GAT GAA 3320AAC GAA AAT ATC GGC AGG GCA GGG CTG CTG CCG AAG GTA TCG CTG AAC 3368TAC CAG AAT TCG CCG CGC AAC TGG CAA ACT CAG AAG TAC CCG CAA AGC 3416GAC TTT TTC GGC AAT GTT TCG GAG GTT ACC CGG CGG CAG CAA TAT CGC 3464AGC TAT TCC AGT TCG ATC ACC TTG ACG CAG CCG CTG TTC GAT TAT GAA 3512GCT TAC GCC AGG TAC AAA GCC GGC GTG GCG CAG ACC ATG ATG TCG GAC 3660GAG ACG TAT CGC GGT AAG TTG CTG GAT TTG GCG GTG AGG GTG ATT AAC 3608GCC TAT GTC GAA GTG GCT TAT TCC AAG GAT CAA ATC GCG TTG GCC GAA 3656GCT CAA AAG GCG GCT TAC AAG GAA CAG CTG ACT TTG AAC GAT CGC CTG 3704ATG AGC GCC GGT GAA GGT ACC ATT ACC GAC GTA TCC GAA ACT CAG GCG 3752CGC TAT AGC CTG GCT GAA GCA CAG GTG ATA GAA GCG CGC GAT GCA CTG 3800GAT GCC GCA CAG CGT GAA TTG GAA GTA ATT ATC GGC ATG CCG CTG AAC 3848CAA CTG GAT GAA TTG CAG GTC TTG CGG CCG GGT AAA TTC AAA GTG GCG 3896CCG TTA ATC CCG TCC AAG TTC GAA GAG TGG CAA AAG ATC GCG TTG GAG 3944AAC AAC CCT GTA TTG GCC GCC TCG CGT CAT GGC GTG GAT GCT GCT AAG 3992TAT GAT GTC GAA AGG AAA CGG GCT GGC TTT ATG CCA CAG GTT CAG CTG 4040TAT GCT TCG CAT TCG GAA AAC GAC GCC AGC AGC GAC AAC ACG GTT AAC 4088CAG AAA TAC CGT ACT GAC AGC ATT GGC GTG CAG GTC AGC ATG CCT ATT 4136TAT TCC GGT GGC GGT GTT TCG GCA TCG ACC CGC CAG GCA GCG GCG CGT 4184TAC GGG CAA GCG ATG TAT GAA ATG GAT GCG CAA ACG GGC ACC ACG CTC 4232AAC GAT CTG CGC AAA CAG TAC AAT TTG TGT ATT AGC AGC AGC GCT AAA 4280GTG GCG GCC TAT GAA CTG GCG GTT CAA TCG GCG ACG ACC CAG GTG ACG 4328GCG ACC CGG CAA AGC GTG CTG GCT GGG CAA CGT GTC AAC GTC GAT GTG 4376CTC AAT GCC GAA CAG CAG CTC TAT AGC GCA CAG GCG ATT TTG GCC TCT 4424GCT AAA TAC ACT TAT ATC AAA TCC TGG GAT CAC CCT ATT GAG 4466序列身份號2長度588氨基酸類型氨基酸局部解剖線形分子類型肽序列Val Asn Gln Phe Ile Pro Arg Asn Glu Ile Ala Asp Val Ile Arg Thr1 5 10 15Arg Ser Lys Val Phe Trp Thr Val Gly Ile Phe Thr Ala Phe Ile Asn20 25 30Leu Leu Met Leu Val Pro Ser Ile Tyr Met Leu Gln Val Tyr Asp Arg35 40 45Val Leu Pro Ser Arg Asn Glu Ile Thr Leu Leu Met Leu Thr Leu Ile50 55 60Met Leu Gly Met Phe Gly Met Met Ser Leu Leu Glu Tyr Val Arg Ser65 70 75 80Met Val Val Ile Arg Ile Gly Ser Gln Leu Asp Met Arg Leu Asn Thr85 90 95Arg Val Tyr Thr Ala Ala Tyr Glu Ala Asn Leu Lys Asn Gly Ser Ser100 105 110Asp Ala Gly Gln Met Leu Ser Asp Leu Thr Asn Leu Arg Gln Phe Leu115 120 125Thr Gly Ser Ala Leu Phe Ala Phe Phe Asp Ala Pro Tyr Phe Pro Ile130 135 140Tyr Leu Leu Val Ile Phe Leu Phe Asn Pro Trp Leu Gly Leu Phe Ala145 150 155 160Leu Val Gly Ala Leu Leu Leu Ile Ala Leu Ala Val Ile Asn Glu Val165 170 175Val Ser Lys Lys Pro Leu Gly Glu Ala Ser Lys Leu Ser Ile Met Ser180 185 190Gly Asn Leu Ala Ser Thr Asn Leu Arg Asn Ala Glu Val Ile Glu Ala195 200 205Leu Gly Met Leu Pro Asn Leu Lys Arg Arg Trp Phe Gly Leu His Gln210 215 220Arg Phe Leu Asn Ser Gln Arg Ile Ala Ser Glu Arg Ala Ser Arg Val225 230 235 240Thr Ser Ile Thr Lys Phe Val Arg Met Ser Leu Gln Ser Leu Val Leu
245 250 255Gly Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ile Asp Gly His Ile Thr Pro Gly Met260 265 270Met Ile Ala Gly Ser Ile Leu Met Gly Arg Thr Leu Ala Pro Ile Glu275 280 285Gln Val Ile Asn Val Trp Lys Ser Tyr Ser Ala Ala Lys Leu Ser Tyr290 295 300Gly Arg Leu Val Lys Leu Leu Glu Thr His Pro Gln Arg Gly Thr Gly305 310 315 320Met Ser Leu Pro Arg Pro Glu Gly Val Leu Ser Val Glu Gly Val Thr325 330 335Ala Thr Pro Pro Gly Ser Lys Gly Asp Ala Val Leu His Asn Val Ser340 345 350Phe Ala Ile Gln Pro Gly Asp Val Leu Gly Ile Ile Gly Pro Ser Ala355 360 365Ser Gly Lys Ser Thr Leu Ala Arg Leu Leu Val Gly Ile Trp Pro Val370 375 380Ser Glu Gly Ile Val Arg Leu Asp Asn Ala Asp Ile Tyr Gln Trp Asn385 390 395 400Lys Asp Glu Leu Gly Pro Tyr Ile Gly Tyr Leu Pro Gln Asp Ile Glu405 410 415Leu Phe Ala Gly Thr Ile Ala Glu Asn Ile Ala Arg Phe Asn Asp Ile420 425 430Asp Ser Glu Lys Val Ile Glu Ala Ala Lys Leu Ala Gly Val His Glu435 440 445Leu Ile Leu Arg Phe Pro Asn Gly Tyr Asp Ser Val Ile Gly Asn Gly450 455 460Gly Ala Gly Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Ile Gly Leu Ala Arg465470 475 480Ala Leu Tyr Gly Asp Pro Ala Leu Val Val Leu Asp Glu Pro Asn Ser485 490 495Asn Leu Asp Asp Ala Gly Glu Lys Ala Leu Asn Gln Ala Ile Met Phe500 505 510Leu Lys Gln Arg Asn Lys Thr Val Val Leu Ile Thr His Arg Thr Asn515 520 525Leu Leu Ser Met Thr Ser Lys Leu Leu Leu Leu Val Asn Gly Asn Val530 535 540Asn Ala Phe Gly Pro Thr Gln Gln Val Leu Gln Ala Leu Ala Asn Ala545 550 555 560Gln Lys Ala Gln Val Pro Pro Gln Ala Val Arg Ala Val Asn Ser Glu565 570 575Pro Asp Glu Gly Glu Ile Pro Lys Thr Gln Ile Asn580 585序列身份號3長度443氨基酸類型氨基酸局部解剖線形分子類型肽序列Met Ser Thr His Ile Gly Glu Pro Gln Asp Ser Tyr Thr Glu Glu Ile1 5 10 15Pro Gln Asp Glu Arg Arg Phe Thr Arg Met Gly Trp Leu Val Val Gly20 25 30Ile Gly Leu Phe Gly Phe Leu Ala Trp Ala Ala Phe Ala Pro Leu Asp35 40 45Lys Gly Val Ala Ser Pro Gly Ser Val Thr Val Ser Gly Asn Arg Lys50 55 60Thr Val Gln Ala Pro Ala Ser Gly Ile Ile Lys Asn Ile Ala Val Arg65 70 75 80Asp Gly Asp Lys Val Lys Ala Gly Glu Val Leu Vla Gln Leu Ser Gln85 90 95Val Gln Ala Gln Ala Gln Val Asp Ser Leu Arg Asp Gln Tyr Tyr Thr100 105 110Thr Leu Ala Thr Glu Gly Arg Leu Leu Ala Glu Arg Asp Gly Leu Ser115 120 125Ile Val Thr Pro Ser Phe Ile Leu Asp Ala Val Lys Asp Lys Pro Arg130 135 140Val Ala Glu Ile Ile Ala Leu Gln Thr Gln Leu Phe Ala Ser Arg Arg145150 155 160Gln Ala Leu Gln Ser Glu Ile Asp Gly Tyr Lys Gln Ser Met Asp Gly165 170 175Ile Arg Phe Gln Leu Lys Gly Leu Gln Asp Ser Arg Gly Asn Lys Gln180 185 190Ile Gln Leu Ser Ser Leu Arg Glu Gln Met Asn Ser Met Lys Gln Leu195 200 205Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Arg Asn Arg Tyr Leu Glu Val Gln Arg210 215 220Gln Phe Ala Glu Val Asn Ser Ser Ile Asp Glu Thr Val Gly Arg Ile225 230 235 240Gly Gln Leu Gln Lys Gln Leu Leu Glu Ser Gln Gln Arg Ile Asp Gln245 250 255Arg Phe Ala Asp Tyr Gln Arg Glu Val Arg Thr Gln Leu Ala Gln Thr260 265 270Gln Met Asp Ala Ser Glu Phe Arg Asn Lys Leu Gln Met Ala Asp Phe275 280 285Asp Leu Gly Asn Thr Ala Ile Thr Ser Pro Val Asp Gly Thr Val Val290 295 300Gly Leu Asn Ile Phe Thr Gln Gly Gly Val Val Gly Ala Gly Asp His305 310 315 320Leu Met Asp Val Val Pro Ser Gln Ala Thr Leu Val Val Asp Ser Arg325 330 335Leu Lys Val Asp Leu Phe Asp Lys Val Tyr Asn Gly Leu Pro Val Asp340 345 350Leu Met Phe Thr Ala Phe Asn Gln Asn Lys Thr Pro Lys Ile Pro Gly355 360 365Thr Val Thr Leu Val Ser Ala Asp Arg Leu Val Asp Lys Ala Asn Gly370 375 380Glu Pro Tyr Tyr Gln Met Gln Val Thr Val Ser Pro Glu Gly Met Lys385 390 395 400Met Leu Ser Gly Glu Asp Ile Lys Pro Gly Met Pro Val Glu Val Phe405 410 415Val Lys Thr Gly Ser Arg Ser Leu Leu Ser Tyr Leu Phe Lys Pro Ile420 425 430Leu Asp Arg Ala His Thr Ser Leu Thr Glu Glu435 440序列身份號4長度437氨基酸類型氨基酸局部解剖線形分子類型肽序列Leu Ile His Ser Lys Arg Gln Ala Ala Gly Leu Val Ile Gly Thr Leu1 5 10 15Leu Phe Ala Met Ser Ala Pro Val Tyr Ser Ile Gly Ile Leu Asp Ala20 25 30Tyr Ser Leu Ala Leu Glu Lys Asp Pro Thr Phe Arg Ala Ala Ile Lys35 40 45Glu Lys Glu Ala Gly Asp Glu Asn Glu Asn Ile Gly Arg Ala Gly Leu50 55 60Leu Pro Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gln Asn Ser Pro Arg Asn Trp Gln65 70 75 80Thr Gln Lys Tyr Pro Gln Ser Asp Phe Phe Gly Asn Val Ser Glu Val85 90 95Thr Arg Arg Gln Gln Tyr Arg Ser Tyr Ser Ser Ser Ile Thr Leu Thr100 105 110Gln Pro Leu Phe Asp Tyr Glu Ala Tyr Ala Arg Tyr Lys Ala Gly Val115 120 125Ala Gln Thr Met Met Ser Asp Glu Thr Tyr Arg Gly Lys Leu Leu Asp130 135 140Leu Ala Val Arg Val Ile Asn Ala Tyr Val Glu Val Ala Tyr Ser Lys145 150 155 160Asp Gln Ile Ala Leu Ala Glu Ala Gln Lys Ala Ala Tyr Lys Glu Gln165 170 175Leu Thr Leu Asn Asp Arg Leu Met Ser Ala Gly Glu Gly Thr Ile Thr180 185 190Asp Val Ser Glu Thr Gln Ala Arg Tyr Ser Leu Ala Glu Ala Gln Val195 200 205Ile Glu Ala Arg Asp Ala Leu Asp Ala Ala Gln Arg Gln Leu Glu Val210 215 220Ile Ile Gly Met Pro Leu Asn Gln Leu Asp Glu Leu Gln Val Leu Arg225 230 235 240Pro Gly Lys Phe Lys Val Ala Pro Leu Ile Pro Ser Lys Phe Glu Glu245 250 255Trp Gln Lys Ile Ala Leu Glu Asn Asn Pro Val Leu Ala Ala Ser Arg260 265 270His Gly Val Asp Ala Ala Lys Tyr Asp Val Glu Arg Lys Arg Ala Gly275 280 285Phe Met Pro Gln Val Gln Leu Tyr Ala Ser His Ser Glu Asn Asp Ala290 295 300Ser Ser Asp Asn Thr Val Asn Gln Lys Tyr Arg Thr Asp Ser Ile Gly305 310 315 320Val Gln Val Ser Met Pro Ile Tyr Ser Gly Gly Gly Val Ser Ala Ser325 330 335Thr Arg Gln Ala Ala Ala Arg Tyr Gly Gln Ala Met Tyr Glu Met Asp340 345 350Ala Gln Thr Gly Thr Thr Leu Asn Asp Leu Arg Lys Gln Tyr Asn Leu355 360 365Cys Ile Ser Ser Ser Ala Lys Val Ala Ala Tyr Glu Leu Ala Val Gln370 375 380Ser Ala Thr Thr Gln Val Thr Ala Thr Arg Gln Ser Val leu Ala Gly385 390 395 400Gln Arg Val Asn Val Asp Val Leu Asn Ala Glu Gln Gln Leu Tyr Ser405 410 415Ala Gln Ala Ile Leu Ala Ser Ala Lys Tyr Thr Tyr Ile Lys Ser Trp420 425 430Asp His Pro Ile Glu43權(quán)利要求
1.一編碼參與來自沙雷氏菌屬的微生物的酯酶的分泌機(jī)制的多肽的基因。
2.如權(quán)利要求1所述的具有示于序列號1中的DNA序列的基因。
3.如權(quán)利要求1所述的包括一編碼示于序列號2，3或4的多肽的DNA的基因。
4.包括通過將權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的基因插入載體質(zhì)粒所得的質(zhì)粒的重組質(zhì)粒。
5.用權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的微生物。
6.通過用一包括通過同時(shí)將編碼來自沙雷氏菌屬微生物的酯酶的基因和編碼參與來自沙雷氏菌屬微生物的酯酶的分泌機(jī)制的多肽的基因插入一載體質(zhì)粒所得質(zhì)粒的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化一宿主微生物所得的轉(zhuǎn)化微生物。
7.通過用一包括通過將編碼來自沙雷氏菌屬微生物的酯酶的基因插入一載體質(zhì)粒所得的質(zhì)粒的重組質(zhì)粒和一包括通過將一編碼參與來自沙雷氏菌屬微生物的酯酶的分泌機(jī)制的多肽的基因插入一載體質(zhì)粒所得的質(zhì)粒的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化一宿主微生物所得的轉(zhuǎn)化微生物。
8.如權(quán)利要求6或權(quán)利要求7所述的微生物，其中之宿主微生物為一沙雷氏菌屬或大腸桿菌屬的微生物。
9.生產(chǎn)酯酶的方法，包括在一培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求6或權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)化子以及收集在細(xì)胞內(nèi)或在培養(yǎng)液中積累的酯酶。
全文摘要
編碼參與來自沙雷氏菌屬微生物的酯酶的分泌機(jī)制的多肽的基因，包括通過將該基因插入一載體質(zhì)粒所制得的質(zhì)粒的重組質(zhì)粒，用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的微生物，以及一包括在一培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化微生物及收集在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生的酯酶的用于酯酶產(chǎn)生的方法。該轉(zhuǎn)化微生物有顯著優(yōu)越的向胞外分泌酯酶的能力。
文檔編號C12N15/09GK1141342SQ9610272
公開日1997年1月29日 申請日期1996年3月25日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月23日
發(fā)明者柴谷武爾, 赤浩之, 河合衣里 申請人:田邊制藥株式會社