專利名稱：人肝增殖素的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及人肝增殖素cDNA的分離，核苷酸序列分析及生產(chǎn)其編碼蛋白的方法和表達產(chǎn)物促肝細胞增殖活性鑒定等方面該基因表達產(chǎn)物有潛在的臨床應用價值。
2/3肝部分切除PH大鼠血液經(jīng)交叉循環(huán)可促進正常大鼠肝細胞增殖，受此啟發(fā)，人們開始從PH后大鼠外周血發(fā)掘特異肝增殖刺激因子，并最終從中分離出一種能強列刺激肝細胞增殖的蛋白質，即肝細胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)，但進一步的研究表明該因子并非象人們所期望的那樣具有肝特異性，肝細胞亦非其主要靶細胞LaBrecque等最早描述了存在于PH后大鼠肝組織中的一種特異性肝細胞刺激因子即肝臟刺激物(Hepatic Stimulator Substance，HSS)，隨后，許多實驗證實該物質廣泛存在于哺乳動物新生肝，幼仔肝及再生肝組織中，但各家命名不一，因而顯得十分混亂，從人胎肝、新生小牛肝及乳豬肝等提取的此類因子已廣泛應用臨床治療重型病毒性肝炎，并取得較好療效，但受其來源、種屬差異及生化制劑本身的局限，這些產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)及質量的提高受到較大限制，因此，國內(nèi)、外多家致力于此類因子的分子克隆。
本發(fā)明的目的在于提供一種人肝增殖素。
八十年代末，我們率先在國內(nèi)、外開展了人胎肝中促肝細胞增殖活性物質的研究，在對其生物活性進行深入研究，證明人胎肝組織中確含有一種新的促肝細胞增殖活性因子的基礎上，利用超濾，DEAE-Cellulose，F(xiàn)PLC-monoQ，HPLC等對此活性因子進行純化，其相對活性提高近5萬倍，但由于該蛋白質氨基端的封閉，氨基酸序列測定未獲成功。總的來說，該因子基本特性是分子量約1.4～2.0KDa，對蛋白酶敏感，耐熱，可促進肝細胞增殖，其生物活性具有器官特異性，無種屬特異性。從人胎肝中提取poly(A)+mRHA，在非洲爪蟾卵母細胞可翻譯出此因子的活性，表明該因子是肝細胞基因表達產(chǎn)物。本發(fā)明利用功能表達篩選法，從人胎肝cDNA文庫中篩選到編碼促肝增殖蛋白質的cDNA，并對其表達產(chǎn)物的生物活性進行了研究。
從4月齡水囊引產(chǎn)人胎肝組織提取mRNA，以pcDNAI質粒為載體，構建表達型人胎肝cDNA文庫，將文庫進行矩陣排列后，通過功能表達篩選人肝增殖素全長cDNA，核苷酸序列測定表明該克隆含有375bp的讀碼框架(序列見

圖1)，推導的氨基酸序列見圖2，理論分子量為15KDa，與提純蛋白質在變性條件下SDS-PAGE結果相符。通過原該、真核系統(tǒng)表達的產(chǎn)物具有促進肝細胞增殖及抗肝損傷的活性，因而有可能應用臨床治療重型肝炎、慢性活動性肝炎等疾病。
本發(fā)明的實施方法如下圖1為本發(fā)明核苷酸序列圖。
圖2為本發(fā)明氨基酸序列圖。
圖3為本發(fā)明的實施方法圖。
圖4為pcDNAI質粒的結構圖。
圖5為文庫的矩陣排列示意圖。
1.mRNA的提取在以前的研究中，我們證實4月齡人胎肝組織中特異活性最高，因此選擇4月齡人胎肝組織為起始材料，利用總RNA提取，mRNA純化試劑盒(Promcga公司)提取mRNA。甲醛變性凝膠電泳表明所提mRHA完整性良好。
2.cDNA文庫的建取所提10ugmRNA，以5’-AATTCGCGGCCGC-(T)15為引物，Pharmacia公司cDNA合成試劑盒進行cDNA合成，(pcDNAI質粒購自Clontech公司，結構見圖4)，進而利用EcoRI人工接頭，將合成cDNA定向重組于pcDNAI質粒，轉化大腸桿菌JM109，獲107轉化子，隨機挑出轉化子，經(jīng)EcoRI、NotI酶切分析，4/7轉化子含有外源插入片段，平均大小約1.5Kb，表明所建文庫質量良好。
3.文庫的矩陣排列及表達篩選從所構建文庫取約108重組子的細菌懸液，稀釋于含氨芐青霉素、四環(huán)素的LB培養(yǎng)液，按每孔100μL約50個重組子克隆接種于96孔細胞培養(yǎng)板(各板留出第12列和第H行，供排列矩陣用)，培養(yǎng)板標記后于30℃培養(yǎng)過夜，次日按每行(列)從各孔分別取10u1細菌懸液接種于對應行或列空孔形成行池(pool)、列池(pool)(見圖4)，這樣文庫被排列成210個小矩陣，約含210×77×50重組子。
文庫排列完成后，以板為單位，從行池和列池取10ul細胞懸液，接種于20ml(含氨芐青霉素LB培養(yǎng)液，分別提取質粒，取約10ug質粒DNA，以標準DEAE-葡聚糖法轉染cos-7細胞，轉染前1天，按細胞密度4×105/60mm皿傳代培養(yǎng)cos-7細胞，以含5％小牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時，DEAE-葡聚糖法轉染cos-7細胞基本按Promega公司試劑盒進行，故為對照，同時將pcDNAI質粒轉染入cos-7細胞，轉染后4小時，以新鮮1640培養(yǎng)液輕輕洗滌細胞二次，并加入3ml不含血清的1640培養(yǎng)液，于37℃5％CO2條件下培養(yǎng)72小時后，收集培養(yǎng)上清和細胞，超聲破碎后，65℃加熱10分鐘，72000g離心20分鐘，收上清，以1/3肝部分切除模型進行活性檢測，有活性的板行、列陽性池交叉孔細菌在含氨芐青霉素平板上涂板，挑出單個克隆進行矩陣排列，重復上述篩選過程，直至得到單一克隆。
4、生物活性檢測，篩選結果及陽性克隆序列分析我們選擇了國際上公認的模型之一——1/3肝部分切除模型觀察表達產(chǎn)物的促肝細胞增殖活性。取200±10gWister大白鼠，按Higgens和Anderson介紹的方法行1/3肝部分切除，術后4小時腹腔注射表達產(chǎn)物1ml，同時設生理鹽水及荷空質粒對照組，每組5只動物，20小時按100uci/kg體重腹腔注射3H-TdR，2小時后處死大鼠并于固定部位取肝組織，按Morley等介紹的方法進行DNA提取及8H-TdR摻入計數(shù)，結果以cpm/ug DNA計算。活性單位以刺激指數(shù)表示，刺激指數(shù)＝實驗組cpm/對照組cpm值。經(jīng)功能篩選第28板的G行池和8列池表達產(chǎn)物具有促肝增殖活性，經(jīng)再一輪篩選得到單一陽性克隆，其表達產(chǎn)物具有促肝增殖活性(刺激指數(shù)＝3.2)并具有劑量一效應正相關。對此克隆以末端終止法進行核苷序列測定，表明含有375bp的讀碼框架(圖1)，能編碼125AA，分子量為15KDa的蛋白質(圖2)。
5.原核表達生產(chǎn)肝增殖素按圖1序列合成引物引物15′-CGGAATTCATGCGGACGCAGCAGAAGC-3′；引物25′-GCGGATCCCTAGTCACAGGAGCCATCC-3′；以陽性克隆cDNA為模板，在100ul含5mM引物1，引物2，50mMKCL，10mMTris-HCL(PH9.0)，0.1％TritonX-100，1.5mMMgCL2，200mMdNTP，2.0uTaq DNA聚合酶(Promega公司)體系進行PCR，其參數(shù)為95℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃1分鐘，共35次循環(huán)，最后一次循環(huán)后72℃延伸7分鐘；PCR產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠電泳上進行電泳，并回收約390bp特異擴增片段，經(jīng)純化后，以EcoRI，BamHI酶切4h，并與以相應酶切的原核表達載體pBV-220(由中國病毒基因工程國家重點實驗室候云德教授惠贈)連接，取約10ng連接產(chǎn)物，以標準實驗過程轉化氯化鈣法制備的感受態(tài)E.coliJM109，轉化產(chǎn)物在含氨芐青霉素LB平板上30℃培養(yǎng)過夜，挑出轉化子于10ml含氨芐青霉素LB培養(yǎng)液培養(yǎng)，提取質粒，以EcoRI，BamHI酶切，三株克隆含有390bp的外源插入片段，末端終止法核苷酸序列測定結果同表1，且插入方向正確；將單個陽性轉化子于10ml含氨芐青霉素LB培養(yǎng)液30℃培養(yǎng)過液，次日按2％于LB培養(yǎng)液30℃擴增培養(yǎng)至0D600≈0.4～0.5，迅速提高培養(yǎng)溫度至42℃，繼續(xù)培養(yǎng)5小時，離心收集細菌，SDS-PAGE檢測，表明有特異蛋白表達帶，分子量約15KDa，與理論值一致。表達產(chǎn)物同樣具有促1/3肝部分切除大鼠肝細胞增殖的活性6.抗肝損傷活性經(jīng)預試驗，以死亡率，病理變化及肝功能為指標綜合選定4ml/kgCCL4(1∶1 CCL4∶豆油)為最佳致死劑量。取雄性Wister大白鼠60只，體重200±15g，每只按4ml/kg一次性腹腔注射CCL4，4小時后，隨機分成3組，每組20只大鼠，分別一次性腹腔注射陽性克隆轉化cos-7細胞裂解液1ml，生理鹽水1ml及荷空質粒轉化cos-7細胞上清及裂解液1ml，逐日記錄死亡動物，存活超過120h計為存活動物，結果兩組對照組存活率均為15％，陽性克隆組存活率達40％，此外，我們還觀察到重組肝增殖素具有降低中毒大鼠外周血轉氨酶水平的作用，表明重組肝增殖素具有抗肝損傷的活性。
總之，本發(fā)明公開了一種人肝增殖素的核苷酸序列，并提供了表達產(chǎn)物的理化性質(如耐熱、分子量為15KDa)及生物活性檢測方法(如體內(nèi)生物活性)。此序列可重組于任何表達載體，以進行原核、真核(如細菌、酵母、昆蟲、高等值物，培養(yǎng)的哺乳細胞等)的表達。
本發(fā)明的cDNA及其編碼的多肽產(chǎn)物可通過與可檢測標記物(如32p-dATP、125I等)標記，而成為一種試劑，用于固定組織，液體樣品的檢測及DNA雜交以確定人肝增殖素基因定位和染色體圖譜中相關基因的定位。
由于重組人肝增殖素具有促進肝細胞增殖及抗肝損傷的活性，因此本發(fā)明的重組多肽產(chǎn)品或配有稀釋劑，輔劑等的制品可能應用臨床治療嚴重肝病(如重型病毒性肝炎)。
權利要求
1.一種編碼人肝增殖素多肽的核苷酸序列，它具有附圖1所列DNA序列。
2.根據(jù)權利要求1的所述核苷酸序列，它包括附圖1中所列DNA序列的互補鏈，以及能編碼人肝增殖素和其類似物的基因序列和人工合成DNA序列。
3.一種人肝增殖素，它能促進肝細胞增殖并且具有提高CCL4誘導肝功能衰竭大鼠存活率的作用，其分子量為15KDa，并且含有附圖2所示氨基酸序列。
4.一種重組生產(chǎn)人肝增殖素的方法，其特征在于將權利要求1-2所述DNA序列置于合適載體中，轉化原核或真核宿主細胞，在合適條件下培養(yǎng)轉化細胞，得到人肝增殖素多肽
5.根據(jù)權利要求4所述方法，其中合適載體為原核表達載體，其中原核宿主為大腸桿菌。
6.根據(jù)權利要求4所述方法，其中真核宿主細胞為哺乳細胞。
全文摘要
利用功能篩選法分離到人的能編碼一種新的促肝增殖物質—肝增殖素的全長cDNA，其中含有375bp，能編碼125氨基酸組成蛋白的開放讀碼框架，理論推算此蛋白分子量為15KDa，與變性條件下SDS-PAGE結果相符；由原核或真核產(chǎn)生的重組肝增殖素具有促進40％肝部分切除大鼠肝細胞增殖及提高CCL4誘導肝功能衰竭大鼠存活率的作用，揭示重組肝增殖素有可能應用臨床治療重型肝炎，慢性活動性肝炎等嚴重肝病。
文檔編號C12N15/85GK1158895SQ9610320
公開日1997年9月10日 申請日期1996年3月8日 優(yōu)先權日1996年3月8日
發(fā)明者楊曉明, 賀福初, 邱兆華, 謝玲, 吳祖澤, 宮鋒, 胡志遠, 魏漢東, 何浩 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所