專利名稱：含有過敏原基因的重組真核載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可用于預(yù)防和治療過敏性疾病的重組載體，本發(fā)明還涉及包含所述重組載體的藥物組合物。
過敏性疾病(AD)包括過敏性鼻炎、過敏性氣喘和異位性皮炎，影響約20％人口，且是疾病和死亡的主要因素之一。最近發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)AD和針對(duì)所吸入過敏原的立即性高度敏感性有關(guān)，且有家族傾向(此現(xiàn)象一般稱為異位性)。AD的病因?qū)W尚不清楚，然而，目前發(fā)現(xiàn)其有很多細(xì)胞性和體液性的缺陷，包括升高的IgE總量和多重陽(yáng)性過敏原的特異性IgE抗體。雖然目前已探討出許多種發(fā)病機(jī)理觀念，但AD的一般性治療仍無法令人滿意。類固醇和環(huán)孢菌素等免疫抑制劑施用于病人上的臨床效果已有改善，然而，由于其對(duì)肝和腎臟系統(tǒng)具有毒性而降低了其在兒童身上的用途。即使現(xiàn)在已有一些具有顯著副作用的有效療法，仍有一部分病人對(duì)所有形式的藥物均有抗性。
過敏性異質(zhì)的主要特征為發(fā)展出對(duì)環(huán)境抗原的持久免疫球蛋白E(IgE)反應(yīng)的傾向。IgE的生產(chǎn)是高度依賴于IL-4及受IFN-γ強(qiáng)力抑制。其他細(xì)胞激素如IL-5、IL-6、IL-8、IL-10和IL-13及細(xì)胞表面分子如CD40和CD23等亦有參與。近來用支氣管肺泡灌洗液所進(jìn)行的研究顯示，IgE的生產(chǎn)可被抑制性T細(xì)胞所調(diào)節(jié)。再者，免疫療法成功的因素之一與抑制性T細(xì)胞的產(chǎn)生有關(guān)，其可調(diào)降過敏反應(yīng)。亦有證據(jù)顯示異位性個(gè)體中有抑制性T細(xì)胞功能的缺陷，特別是在有過敏性氣喘的兒童身上。近來一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)亦顯示，某些亞型的CD8+T細(xì)胞可能在IgE生產(chǎn)中扮演重要的角色，且可抑制過敏誘發(fā)的呼吸道過度反應(yīng)(AHR)。因此，可能可藉由產(chǎn)生抗原特異性的抑制性T細(xì)胞以調(diào)節(jié)異位性病人中的IgE抗體反應(yīng)和AHR。
先前的亞單位預(yù)防接種已使用經(jīng)純化的蛋白質(zhì)或病毒載體。但有些實(shí)質(zhì)上的限制，若能使免疫用蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，則這種限制可被克服。這方面，基因疫苗代表了亞單位疫苗發(fā)展上的一種新取向。于肌肉內(nèi)注射DNA已顯示可造成由該DNA所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)，描述于如Wolff，J.A.et al.，Science 247，1465-1468(1990)，Tang，D.L.et al.，Nature 356，152-154(1992)及Ulmer，J.B.et al.，Science259，1745-1749(1994)。再者，結(jié)果顯示質(zhì)粒DNA獨(dú)立保留在染色體以外，不復(fù)制亦不插入宿主細(xì)胞的染色體組中，如Wolff J.A.etal.，Hum.Mol.Genet.1363-369(1994)中所描述。至目前為止，尚未在接種部位觀察到嚴(yán)重發(fā)炎反應(yīng)或其他并發(fā)癥。此外，現(xiàn)已充分了解，衍生自細(xì)胞內(nèi)抗原的勝肽通常是由主要組織相容復(fù)合體(MHC)第I類分子呈遞給CD8+T細(xì)胞，該MHC第I類分子在幾乎所有體細(xì)胞上均有表達(dá)，而衍生自細(xì)胞外抗原的勝肽是由MHC第II類分子呈遞給CD4+T細(xì)胞，該MHC第II類分子通常是由特殊的抗原表達(dá)細(xì)胞所表達(dá)。因此，將過敏原送入內(nèi)部抗原處理途徑可能是一種促使抗原特異性CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的方法，進(jìn)而調(diào)節(jié)過敏原特異性的IgE合成。
在本發(fā)明中，本發(fā)朋人發(fā)現(xiàn)直接接種編碼屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)第5群過敏原(Derp5)的質(zhì)粒(pCMVD)至小鼠的四頭肌中，可在再接受Derp5激發(fā)時(shí)產(chǎn)生抑制活體內(nèi)Derp5特異性IgE合成、AHR和呼吸道發(fā)炎的效果，使用不同劑量的pCMVD治療過敏化的小鼠，發(fā)現(xiàn)療效與劑量有相關(guān)性。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)直接注射編碼重組日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)蛋白26(rSj26)的質(zhì)粒DNA(pCMVG)可有效地以劑量依賴形式調(diào)降rSj26誘發(fā)的過敏性免疫反應(yīng)，包括rSj26特異性IgE合成和皮炎。因此，本發(fā)明推論直接基因植入是一種預(yù)防和治療由IgE所中介的過敏性疾病的方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種重組載體，其包括真核表達(dá)載體和過敏原基因，本發(fā)明還涉及包含前述重組載體的藥物組合物，其可用于預(yù)防和治療過敏性疾病及抑制過敏原特異性IgE產(chǎn)生，其適合以肌內(nèi)注射、鼻內(nèi)輸送、真皮內(nèi)或氣管內(nèi)輸送等方式投藥。pCMVD及pCMVG被保藏于中國(guó)臺(tái)灣新竹食品工業(yè)發(fā)展研究所(FIRDI)；其編號(hào)為FIRDI 940114及940115，保藏日為1996年4月2日，并保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，其編號(hào)為ATCC97499及97498，1996年4月1日保藏。


圖1為使用肌肉原位細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)Derp5的表達(dá)。在注射100微克pCMVD DNA后12天時(shí)所取出的肌肉的粗大冷凍切片，是以Derp5(A)或Derp1(B)的單克隆抗體(mAb)染色，光學(xué)放大100倍。切片以蘇本色素作復(fù)染色。在六組個(gè)別的注射位置都得到相似的結(jié)果。箭頭指出陽(yáng)性染色細(xì)胞。注射空白載體的對(duì)照組肌肉則末顯示有被染色的肌肉細(xì)胞。
圖2為(A)在肌肉內(nèi)注射pCMVD后的免疫反應(yīng)。已接受pCMVD注射的BALB/c小鼠的血清經(jīng)每周收取，且以實(shí)施例中所描述的方式測(cè)定抗Derp5 IgG1、IgG2a和IgE的效價(jià)。在此組中檢測(cè)不到Derp5特異性IgE。注射空白載體的小鼠無Derp5特異性免疫反應(yīng)。一單位抗體相當(dāng)于1微克IgG1/毫升和1微克IgG2a/毫升。(B)由pCMVD免疫過的小鼠取出的脾細(xì)胞亞群的活體外增殖反應(yīng)。亞群的去除如實(shí)施例中所描述。由FAScam分析，經(jīng)純化的細(xì)胞亞群顯示具有少于0.5％污染細(xì)胞。然后將得自天然BALB/c小鼠脾臟的CD4+或CD8+細(xì)胞加入該細(xì)胞族群以取代被去除的細(xì)胞。細(xì)胞以Derp5(15微克/毫升)培養(yǎng)72小時(shí)。增殖是以3H-胸苷的摻入來分析。所示的數(shù)據(jù)是三次培養(yǎng)物的平均值±SD。細(xì)胞并末對(duì)Derp1的刺激而反應(yīng)增殖。
圖3(A)pCMVD注射(肌肉內(nèi))對(duì)主要IgE反應(yīng)的抑制作用，其是Ag特異性的抑制作用。小鼠(每組n＝6)如所示般以pCMVD或空白載體(pCMV)進(jìn)行免疫。免疫后三周時(shí)，小鼠分別接受Derp5(10微克加上氫氧化鋁)或Derp1(10微克加上氫氧化鋁)。所示數(shù)據(jù)是在激發(fā)后21天時(shí)的平均值±SD(每組n＝6)。以如實(shí)施例所述的方式測(cè)定抗原特異性IgG2a和IgE的效價(jià)。*代表p＜0.01。(B)經(jīng)pCMVD免疫小鼠的脾細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移對(duì)Derp5特異性IgE反應(yīng)的抑制作用。如FAScam分析所示，所用的CD4-和CD8+族群含有＜0.5％污染細(xì)胞。用得自經(jīng)pCMVD免疫的小鼠的末分解脾細(xì)胞作為對(duì)照組。所示數(shù)據(jù)是第21天時(shí)的平均值±SD(每組n＝6)，抗Derp5IgG2a和IgE是以實(shí)施例所述的方式測(cè)定。*代表p＜0.01。1單位抗體相當(dāng)于1微克IgG2a/毫升和100毫微克IgE/毫升。
圖4為以過敏原基因轉(zhuǎn)植方式進(jìn)行呼吸道過度反應(yīng)的免疫預(yù)防。由肌肉內(nèi)注射100微克pCMV或pCMVD到鼠中，并在3周后以Derp5或食鹽水敏化。敏化三周后，小鼠接受Derp5或食鹽水的吸入激發(fā)。吸入后18小時(shí)，以實(shí)施例中所描述的方式測(cè)定肺部抗性。*代表p＜0.01。
圖5為以過敏原基因轉(zhuǎn)植方式抑制過敏原誘發(fā)的呼吸道過度反應(yīng)。并將小鼠通過腹膜內(nèi)注射Der5加以敏化，然后在敏化二周后，以不同劑量(3微克，30微克，100微克)的pCMVD質(zhì)粒DNA治療。以合成質(zhì)粒治療1周后，小鼠吸入過敏原，并測(cè)定肺部阻力的變化。*代表p＜0.01。
圖6為以過敏原基因轉(zhuǎn)植方式抑制過敏原誘發(fā)的呼吸道發(fā)炎。
圖7為以pCMVG(左)和pCMV(右)處理的小鼠的照片。
圖8為以過敏原基因轉(zhuǎn)植方式抑制過敏原誘發(fā)的IgE合成。小鼠是以10微克rSj26加上氫氧化鋁由腹膜內(nèi)注射來敏化，然后在敏化二周后，以不同劑量(3微克，30微克，100微克)的pCMVD質(zhì)粒DNA處理。所示數(shù)據(jù)為處理后第7天時(shí)的平均值±SD(每組n＝6)，并以實(shí)施例所描述的方式測(cè)定抗rSj26 IgG2a和IgE的效價(jià)。*代表p＜0.01。
調(diào)降非病原性抗原的免疫反應(yīng)是維持呼吸道和胃腸道粘膜表面免疫性內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵，且已有人認(rèn)為其控制機(jī)制的失效是過敏性疾病的關(guān)鍵致病因素。此過程的一個(gè)重要因素是對(duì)所吸入或食入抗原的Th2依賴性IgE反應(yīng)的選擇性抑制，而此抑制作用是由抗原特異性CD8+T細(xì)胞所介導(dǎo)。本發(fā)明人的研究結(jié)果顯示由肌肉內(nèi)注射、鼻內(nèi)輸送或氣管內(nèi)輸送等方式給予編碼過敏原蛋白質(zhì)的DNA表達(dá)載體會(huì)對(duì)接續(xù)而來的過敏原激發(fā)產(chǎn)生顯著的“分離型耐受性(split tolerance)”。
本發(fā)明人最近發(fā)現(xiàn)將編碼屋塵螨(Sermatophagoides pteronyssinus)第5群過敏原(Derp5)的質(zhì)粒(pCMVD)直接接種至小鼠的四頭肌中時(shí)，可造成Derp5特異性T細(xì)胞和IgG反應(yīng)。此種將質(zhì)粒DNA給予小鼠的作法造成在活體內(nèi)再以Derp5激發(fā)時(shí)，所發(fā)生的Derp5特異性IgE合成有多于90％被抑制，且AHR亦被抑制。這種效果可藉由經(jīng)pCMVD免疫的小鼠的CD8+脾細(xì)胞而轉(zhuǎn)移至其他小鼠中。經(jīng)pCMVD處理的小鼠的主要免疫反應(yīng)特征是產(chǎn)生Derp5特異性CD8+T細(xì)胞，這些細(xì)胞可抑制過敏原特異性IgE的合成及減少AHR。本發(fā)明人亦發(fā)現(xiàn)直接注射編碼rSj26的質(zhì)粒DNA(pCMVG)可有效地以劑量依賴形式調(diào)降小鼠中由rSj26所誘發(fā)的過敏性免疫反應(yīng)，包括皮炎和rSj26特異性IgE的合成。先前的報(bào)導(dǎo)顯示，向來被認(rèn)為只是細(xì)胞毒性細(xì)胞的CD8+T細(xì)胞實(shí)際上在免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)中扮演一個(gè)更具活性的角色。CD8+T細(xì)胞可調(diào)節(jié)IgE的產(chǎn)生，是經(jīng)由IFN-γ對(duì)B細(xì)胞的抑制效果來抑制IgE合成，和/或藉影響支持IgE生產(chǎn)的類Th2 CD4+T細(xì)胞的分化和功能來達(dá)成。另一種解釋是可能CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞或CD4+T細(xì)胞有物理性的交換作用，及可能經(jīng)由同源交互作用來提供抑制訊號(hào)。
基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明提供了可用于預(yù)防和治療過敏性疾病的重組載體，其包括真核表達(dá)載體和過敏原基因，如cDNA。過敏性疾病的預(yù)防是指免疫預(yù)防過敏原誘發(fā)的IgE合成和目標(biāo)器官中的發(fā)炎現(xiàn)象。過敏性疾病的治療是指治療經(jīng)過敏原敏化的個(gè)體以調(diào)降IgE的合成和目標(biāo)器官中的發(fā)炎現(xiàn)象。該真核表達(dá)載體是選自由含CMV啟動(dòng)子的載體、RSV啟動(dòng)予的載體或含SV40啟動(dòng)子的載體所組成的一組，其中優(yōu)選為pCMV。該過敏原包括任何可引起人類過敏反應(yīng)的環(huán)境抗原，如螨類過敏原、日本血吸蟲的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、房屋灰塵、動(dòng)物皮屑、花粉和花生等。
本發(fā)明還提供一種用于預(yù)防和治療過敏性疾病的藥物組合物及一種用于抑制過敏原特異性IgE產(chǎn)生的藥物組合物，其包括本發(fā)明的重組載體及醫(yī)藥上可接受的載體。該過敏性疾病包括如過敏性氣喘、過敏性鼻炎、異位性皮炎及過敏癥。此藥物組合物的給藥方式優(yōu)選為肌肉內(nèi)注射、鼻內(nèi)輸送及氣管內(nèi)輸送。該醫(yī)藥上可接受的載體可為本領(lǐng)域中已知的任何適用于肌肉內(nèi)注射、鼻內(nèi)輸送、氣管內(nèi)輸送或真皮內(nèi)輸送的公知載體，例如，生理上可接受的緩沖溶液、生理鹽水、金珠或脂質(zhì)體。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明來處理病人時(shí)，重組載體的使用劑量在約0.01至約1.0毫克/千克體重之間，視欲預(yù)防或治療的疾病的特質(zhì)和進(jìn)展以及其他因素，例如病人的年齡和身體狀態(tài)而有所變動(dòng)。
近來，在異位性這個(gè)領(lǐng)域中的研究幾乎都著重在已建立的過敏性疾病的治療。具體言之，治療是集中在控制免疫發(fā)炎階段末端過敏作用細(xì)胞所釋放的各種介質(zhì)，如細(xì)胞素?；蛎庖咦饔迷诋a(chǎn)生免疫反應(yīng)方面可節(jié)省時(shí)間和人力，且可提供一種獨(dú)特的預(yù)防接種方法。此研究的新發(fā)現(xiàn)為基因免疫作用可導(dǎo)致對(duì)過敏原的“免疫反應(yīng)偏離”，并保護(hù)動(dòng)物免疫過敏性氣喘的侵襲。質(zhì)粒DNA的移入在抑制過敏性免疫反應(yīng)上具有出人意外的高效率，表示本發(fā)明方法提供了一種簡(jiǎn)單、安全又持久有效的免疫預(yù)防和治療第1型過敏反應(yīng)的方式。
下列實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但非限制本發(fā)明的范圍，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的替代和改變，均仍涵蓋于本發(fā)明的范圍中，而不偏離本發(fā)明的精神和目的。實(shí)施例1A材料與方法1、動(dòng)物使用6至8周大的雌性BALB/c，其得自臺(tái)灣大學(xué)醫(yī)學(xué)院的動(dòng)物中心(最初是來自Jackson實(shí)驗(yàn)室，Bar Harbor，ME)。在每一組實(shí)驗(yàn)中，小鼠在年齡及性別上是相配合的。
2、pCMVD重組質(zhì)粒的分子克隆Derp5 cDNA是由Lin，K.L.et al.，J.Allergy Clin，Immunol.94989(1994)所描述的克隆WM經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增而獲得。5’和3’引物的序列分別為5’-AAAAAGATCTATCAT GAAATTCATC-3’(劃底線處為Bgl II位點(diǎn))及5’-ATTAAGCTTAACTTCAATCTTTTTA-3’(劃底線處為Hind III位點(diǎn))，涵蓋整個(gè)Derp5序列。PCR產(chǎn)物以BglII和Hind III消化再克隆入真核表達(dá)載體pCMV2中，pCMV2最初是衍生自pcDNA3(Invitrogen)，然后命名為pCMVD。質(zhì)粒繁殖先在SURE菌株中進(jìn)行，然后以WizardTMDNA純化系統(tǒng)(威州麥狄遜Promega公司)根據(jù)廠商指示進(jìn)行質(zhì)粒的純化。以260和280nm吸光及瓊脂糖凝膠電泳來分析DNA的質(zhì)和量。
3、Derp5過敏原的免疫組織化學(xué)染色免疫染色是根據(jù)Histomouse-SPTM試劑盒(加州南舊金山Zymed公司)的指示來進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，冷凍的肌肉切片(5μm)在室溫下干燥后，固定于純冷丙酮(10分鐘，4℃)，先以Peroxo-Block(Zymed公司)處理45秒以終止內(nèi)部過氧化物酶的活性。然后以10％非免疫血清封阻1小時(shí)。封阻后，以Derp5的mAb(得自臺(tái)灣大學(xué)的林博士)在1微克/毫升下與適當(dāng)切片共同培育1小時(shí)。用Derp1 mAb(4CI，得自美國(guó)的M.Chapman先生)作為對(duì)照組抗體。以同樣方式注射空白載體的小鼠作為陰性對(duì)照組。所有的培育是在25℃下在保濕箱中進(jìn)行。培育后再加入生物素綴合的第二抗體及鏈霉抗生物素-過氧化物酶共軛體。加入3-氨基-9-乙基卡唑以呈現(xiàn)訊號(hào)。最后，將玻片以蘇木色素溶液復(fù)染色。
4、Derp5特異性IgG1、IgG2a和IgE的測(cè)定Derp5特異性IgG1、IgG2a和IgE的量是以ELISA測(cè)定。蛋白質(zhì)高結(jié)合板以100微升稀釋于包被緩沖液(0.1M NaHCO3，pH8.2)濃度為5微克/毫升的經(jīng)純化的Derp5包被。在4℃下培育過夜后，清洗板3次，并在25℃下以3％(重量/體積)BSA-PBS緩沖液封阻2小時(shí)。測(cè)定IgG時(shí)，所用血清是1∶100稀釋，測(cè)定IgE時(shí)，所用血清是1.10稀釋，測(cè)定是進(jìn)行二次重復(fù)。在4℃下培育過夜后，加入稀釋于0.05％明膠緩沖液中的與生物素共軛的單克隆大鼠抗小鼠IgEmAb(加州圣地亞哥Phar Minigen公司)或大鼠抗小鼠IgG mAb(Phar Minigen公司)，再培育1小時(shí)。然后加入抗生物素-堿性磷酸酯酶(密蘇里州圣路易Sigma化學(xué)公司)，在25℃下培育1小時(shí)，接著清洗6次。加入磷酸酯酶底物磷酸對(duì)硝基苯酯二鈉鹽(Sigma化學(xué)公司)。將板于微測(cè)試盤自動(dòng)讀數(shù)儀(臺(tái)灣計(jì)數(shù)技術(shù)(Metertech)公司)在405nm讀取數(shù)據(jù)。讀數(shù)是以市售放射線同位素為參考值，該標(biāo)準(zhǔn)是小鼠抗-TNPmAb，IgG1(1073)，IgG2a(G155-178)及IgE(IgE-3)(PharMinigen)。
5、淋巴球的制備及細(xì)胞轉(zhuǎn)移步驟純化的CD4-和CD8-脾細(xì)胞得自磁性活化細(xì)胞分類“MASC’(德國(guó)Bergisch Gladbach，Miltenyi Biotec)。簡(jiǎn)言之，在免疫后3周取自pCMVD免疫和對(duì)照組小鼠的脾細(xì)胞與包被有抗CD4或抗CD8單克隆抗體的超表磁性微粒共同培育，在4℃下30分鐘，再與鏈抗生物素蛋白輟合的微粒(Miltenyi Biotec)共同培育30分鐘。用“MACS”鋼絨管柱置入0.6Tesla的磁場(chǎng)以將標(biāo)記的細(xì)胞與未標(biāo)記的細(xì)胞分離。將所欲濃度的脾細(xì)胞(106/受體)再懸浮于PBS中，最終體積為0.1毫升。將此細(xì)胞懸浮液注射入年齡和性別相配合的同基因受體的尾部靜脈中。受體隨后被由腹膜內(nèi)注射10微克Derp5及4毫克氫氧化鋁(澳洲龐伯Wyeth藥廠)加以敏化。每周在麻醉情況下自尾部靜脈取出靜脈血液。
6、T細(xì)胞增殖分析細(xì)胞經(jīng)純化后再懸浮于完全組織培養(yǎng)基(RPMI1640)中，其中補(bǔ)充有鏈霉素(100微克/毫升)、青霉素(100單位/毫升)、谷氨酸(5毫摩爾/升)和10％加熱滅活的胎牛血清。每孔有1×105細(xì)胞，在96孔的平底組織培養(yǎng)板中與Derp5(15微克/毫升)共同培育72小時(shí)。細(xì)胞再以1μCi[3H]TdR脈沖18小時(shí)，然后以細(xì)胞收取機(jī)收取細(xì)胞。在液閃計(jì)數(shù)儀(加州福樂敦Beckman公司)中測(cè)量胸苷摻入量。
7、得自pCMVD免疫小鼠的脾細(xì)胞的細(xì)胞激素生產(chǎn)IL-4及IFN-γ均是以ELISA方法根據(jù)廠商Phar Minigen提供的步驟來測(cè)量。IL-10(R & D)和TGF-β(Promega)是以ELISA試劑盒根據(jù)廠商提供的步驟來測(cè)定。
8、氣霧劑的吸入及肺部阻力的分析將小鼠由腹膜內(nèi)注射10微克Derp5來敏化，敏化21天后，用超聲波噴霧器以稀釋于PBS中的0.1％Derp5進(jìn)行激發(fā)。吸入激發(fā)是在連接于DeVilbiss肺部超聲波噴霧器(賓州蘇馬賽DeVilbiss公司，笫2512型)上的1升空間中進(jìn)行，其可產(chǎn)生氣霧。暴露于氣霧下8-18小時(shí)后，由腹膜內(nèi)注射Promaz以麻醉小鼠，并插入20-規(guī)格的氣管套管。以充滿食鹽水的導(dǎo)管(PE60)和差壓轉(zhuǎn)換器(加州挪斯基Validyne工程公司的DP45-14)來測(cè)量食道壓力的改變。將食道導(dǎo)管伸入小鼠食道直到可清楚區(qū)辨出心臟的影響。用連接至差壓轉(zhuǎn)換器(MP45-14，Validyne)的呼吸描記器(Fleisch00000，Zabona，瑞士巴塞爾)檢測(cè)氣管上的呼吸量。來自轉(zhuǎn)換器的訊號(hào)連接至一臺(tái)電腦上，并用數(shù)位電子肺部偵測(cè)系統(tǒng)(PMS，Mumed，英國(guó)倫敦)，其可計(jì)算實(shí)際時(shí)間點(diǎn)上的肺部阻力(RL)和動(dòng)態(tài)柔量(Ddyn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是以電訊貯存。而實(shí)驗(yàn)性追蹤或經(jīng)處理數(shù)據(jù)則視需要點(diǎn)印在協(xié)射印表機(jī)上。由靜脈內(nèi)給予乙酰膽堿(Ac)，起始劑量為1.25毫克/千克。每Ac劑量的平均體積為10微升。大約間隔5分鐘后，且只在緩肺壓力和體積降至前一劑量基準(zhǔn)線的10％以內(nèi)，及在下一劑量給予前，給予增加20倍濃度的Ac。在Ac第一劑量前，給予10微升靜脈內(nèi)食鹽水以建立基礎(chǔ)值。對(duì)個(gè)別動(dòng)物在各Ac劑量上，計(jì)算對(duì)基準(zhǔn)線的改變百分比的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，以獲得Derp5敏化或PBS假劑(Sham)敏化組的Ac劑量-反應(yīng)曲線。
9、支氣管肺泡灌洗和細(xì)胞計(jì)數(shù)在測(cè)量肺功能變數(shù)后，將小鼠以5×0.5毫升小份的0.9％無菌食鹽水經(jīng)由以氣管切開術(shù)入的聚乙烯管灌洗。將灌洗液離心(4℃，500g，10分鐘)，將細(xì)胞沉淀再懸浮于0.5毫升Hank’s平衡鹽溶液中。加入10微升細(xì)胞懸浮液至90微升Kimura染料中，再于Neubauer箱室中在光學(xué)顯微鏡下計(jì)算以獲得細(xì)胞總數(shù)。由cytospin制備物經(jīng)May-Grunwald染料染色來獲得分化細(xì)胞數(shù)目。以標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)技術(shù)將細(xì)胞鑒定和分辨為嗜伊紅性粒細(xì)胞，淋巴球，嗜中性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，在400放大倍數(shù)下計(jì)算500個(gè)細(xì)胞，并計(jì)算各細(xì)胞種類的百分比和絕對(duì)數(shù)目。B、結(jié)果1、質(zhì)粒pCMVD DNA免疫的免疫反應(yīng)為檢視是否肌肉細(xì)胞攝取pCMVD DNA會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，將100微克于PBS中的pCMVD注射入雌性BALB/c小鼠的四頭肌中。對(duì)照組動(dòng)物注射PBS或無Derp5基因插入的適當(dāng)空白載體。在免疫12天后，以抗-Derp5 mAb進(jìn)行原位細(xì)胞化學(xué)免疫染色，以確定轉(zhuǎn)移入肌肉細(xì)胞內(nèi)的基因的表達(dá)(圖1)。此外，抗原特異性的免疫反應(yīng)是以Derp5特異性IgG1和IgG2a抗體的產(chǎn)生作為指標(biāo)，抗體的產(chǎn)生在免疫后四周時(shí)達(dá)到高峰，然后逐漸下降。Derp5特異性IgE抗體在經(jīng)免疫的小鼠中檢測(cè)不到(圖2A)。
2、活體內(nèi)的過敏原特異性T細(xì)胞反應(yīng)為檢視pCMVD注射后的Derp5特異性T細(xì)胞反應(yīng)，在免疫后3周時(shí)，由經(jīng)免疫的小鼠中提取脾細(xì)胞，然后以Derp5培養(yǎng)。以[3H]-胸苷摻入量來分析其增殖。在免疫后3周時(shí)，顯示有Derp5特異性的T細(xì)胞反應(yīng)(圖2B)。再者，未分份的脾細(xì)胞對(duì)DepAg的增殖反應(yīng)可因CD4+細(xì)胞的去除而抑制，但因CD8+細(xì)胞的去除而增進(jìn)，顯示CD4+細(xì)胞增殖會(huì)被CD8+亞群抑制。
3、活體內(nèi)過敏原特異性IgE反應(yīng)的抑制測(cè)定pCMVD DNA注射對(duì)調(diào)節(jié)IgE反應(yīng)的活體內(nèi)功效。在免疫后3周時(shí)，載體和pCMVD處理的小鼠均以腹膜內(nèi)注射過敏原Derp5來激發(fā)。在過敏原激發(fā)后三周時(shí)，以ELISA分析血清中抗Derp5 IgE的存在。在以載體處理的組別中，Derp5-特異性IgE顯著增加；相對(duì)地，以pCMVD處理的小鼠則表達(dá)超過90％的Derp5特異性IgE合成的抑制(圖3A)。pCMVDDNA注射對(duì)IgE合成的抑制是對(duì)Derp5有特異性的，因?yàn)橐詐CMVD處理的小鼠若以另一種屋塵螨過敏原Derp1激發(fā)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生Derp1特異性IgE。因此，直接基因轉(zhuǎn)移可有效地以過敏原特異性的方式抑制活體內(nèi)過敏原特異性IgE的合成。
4、T細(xì)胞對(duì)過敏原特異性IgE反應(yīng)抑制作用的影響由于內(nèi)部所表達(dá)的抗原通常是由MHC第1類分子所呈遞且驅(qū)動(dòng)CD8+T細(xì)胞，所以研究是否Derp5特異性IgE在活體內(nèi)的抑制是由CD8+T細(xì)胞引起。未分群CD8+去除或CD4+去除的脾細(xì)胞以中斷轉(zhuǎn)移移入天然受體中。然后將受體以Derp5加氫氧化鋁佐劑激發(fā)，并測(cè)定Derp5-特異性的IgE反應(yīng)。CD4-細(xì)胞和末分群的組別都表現(xiàn)對(duì)Derp5-特異性IgE的顯著抑制。相對(duì)地，CD8-組則未顯示有抑制效果，表示CD8+T細(xì)胞可調(diào)整降正在進(jìn)行中的IgE生產(chǎn)(圖3B)。
5、過敏原特異性IgE反應(yīng)的抑制作用中所涉及的細(xì)胞激素生產(chǎn)由于先前的研究顯示CD8+T細(xì)胞抑制抗原-特異性抗體反應(yīng)是由殺死Ag反應(yīng)性B細(xì)胞或藉生產(chǎn)可溶性因子，如IFN-γ、IL-4、IL-10和TGF-β而實(shí)現(xiàn)，因此研究得自經(jīng)pCMVD處理的小鼠的脾臟T細(xì)胞的活體外化及細(xì)胞激素生產(chǎn)。以pCMVD免疫后3周時(shí)，取出小鼠的脾臟并以Derp5培養(yǎng)。在培養(yǎng)48小時(shí)后，收集上清液，并以ELISA測(cè)定IFN-γ、IL-4、IL-10和TGF-β的濃度。DNA免疫的小鼠的未分脾細(xì)胞針對(duì)特異性Ag分泌高量IFN-γ，此反應(yīng)因CD8+去除而顯著減少，但去除CD4+細(xì)胞則無此現(xiàn)象。同時(shí)，CD8+族群生產(chǎn)小量IL-4。相對(duì)地，IL-4和IL-10的產(chǎn)生在CD4+族群中較為顯著。在這二組中，TGF-β的產(chǎn)生并無差別，如表1所示。
表1示出經(jīng)pCMVD處理的小鼠的脾細(xì)胞的細(xì)胞激素生產(chǎn)。以質(zhì)粒pCMVD免疫四組BALB/c小鼠(每組n＝3)。免疫3周后，以所示方式用重組Derp5(15微克/毫升)培養(yǎng)脾細(xì)胞。對(duì)IFN-γ和IL-4而言，在48小時(shí)收集培養(yǎng)物上清液，而對(duì)TGF-β和IL-10而言，在72小時(shí)時(shí)收集培養(yǎng)物上清液，以ELISA測(cè)定細(xì)胞激素濃度。所示結(jié)果是綜合二次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，且以平均值±SD來表示。
細(xì)胞激素的分泌細(xì)胞 IFN-γ IL-4 IL-10 TGF-β(毫微克/毫升) (微微克/毫升) (單位/毫升) (微微克/毫升)未分群 16.5±2.3 870.4±130.53.96±0.4362.0±27.5CD4-11.41±1.6198.6±46.3 1.08±0.3219.3±21.4CD8-0.9±0.5 719.1±58.6 4.02±0.5365.2±30.2培養(yǎng)液 0.7±0.4 15.1±8.0 0.39±0.2365.1±20.4實(shí)施例2A.材料與方法1、動(dòng)物使用6至8周大的雌性BALB/c，其是得自臺(tái)灣大學(xué)醫(yī)學(xué)院的動(dòng)物中心(最初來自Jackson實(shí)驗(yàn)室，Bar Harbor，ME)。在每一組實(shí)驗(yàn)中，選用同性別和年齡的小鼠。
2、pCMVG重組質(zhì)粒的分子克隆rSj26 cDNA由pGEX2經(jīng)聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增所獲得。5’和3’引物序列分別為5’-TAACAGATCTATGTCCCCTATACTAGG-3’(劃底線處為Bgl II位點(diǎn))和5’-TAATAAGCTTTGGAGGATGGTC-3’(劃底線處為Hind III位點(diǎn))，涵蓋整個(gè)rSj26序列。此PCR產(chǎn)物以Bgl II和Hind III消化并克隆入真核表達(dá)載體pCMV2中，pCMV2最初衍生自pcDNA3(Invitrogen)，并命名為pCMVG。質(zhì)粒的增殖最初在SURE菌株中進(jìn)行，然后以WizardTMDNA純化系統(tǒng)(威州麥迪遜Promega公司)根據(jù)廠商指示進(jìn)行質(zhì)粒的純化。以260和280nm吸光及瓊脂糖凝膠電泳來分析DNA的質(zhì)和量。
3、研究步驟起初小鼠以10微克rSj26和4毫克氫氧化鋁(澳洲龍伯Wyeth藥廠)由腹膜內(nèi)注射進(jìn)行敏化。敏化后14天時(shí)，由腹內(nèi)注射0.1毫克PromAceR(紐約州紐約市Ayerst實(shí)驗(yàn)室)以麻醉小鼠。切開皮膚10公分以使下層肌肉可被直接看到。將針頭插入四頭肌內(nèi)0.2公分深，然后使用連接至1毫升針筒的27-規(guī)格的針，將于0.1毫升PBS中的100微克、30微克或3微克的pCMVG或pCMV分別注射入小鼠。基因轉(zhuǎn)植后7天時(shí)，小鼠再度接受10微克rSj26的激發(fā)。激發(fā)后7天時(shí)，殺死小鼠以進(jìn)行皮膚活組織檢查及血液采樣。
4、重組Sj26的純化重組Sj26由含導(dǎo)引rSj26合成的質(zhì)粒(pSj26)的大腸桿菌中純化出來。大腸桿菌在含100微克青霉素的Luria培養(yǎng)基中，在37℃下，同時(shí)有劇烈攪拌的情況下生長(zhǎng)過夜。加入IPTG至0.1mM并再培養(yǎng)3小時(shí)。在室溫下，在10000g離心30分鐘以清洗細(xì)胞沉淀，再懸浮于含5mM EDAT的10mM Tris-HCl，150mMNaCl(TBS，PH7.5)中。在3TIU抑蛋白酶酞(Sigma)、0.5mM PMSF(Sigma)和20微克/毫升DNase(Boehringer)的存在下，使用Braun均質(zhì)機(jī)(德國(guó)B，Braun公司)以0.1毫米玻璃珠打破細(xì)胞。將Triton X-100(1％)加入細(xì)菌裂解液中，再以離心(40000rpm，20分鐘)預(yù)澄清，將裂解液的上清液通過谷胱甘肽瓊脂管柱(Sigma)。在以TBS緩沖液充分清洗后，用5mM稀釋的還原態(tài)谷胱甘肽于50mM Tris-HCl(pH8.0)中的溶液溶離rSj26蛋白質(zhì)。
5、血清中rSj26特異性IgE和IgG效價(jià)的測(cè)定rSj26特異性IgE、IgG1和IgG2a的量以ELISA測(cè)定。Costar高結(jié)合板以100微升經(jīng)純化的rSj26或Derp5包被，其是稀釋于包被緩沖液(0.1M NaHCO3，pH8.2)中至濃度為5微克/毫升。在4℃下培養(yǎng)過夜后，在室溫下清洗板3次并以3％(重量/體積)BSA-PBS緩沖液封阻2小時(shí)。將血清樣本稀釋于明膠緩沖液中，當(dāng)測(cè)定IgG時(shí)，稀釋1∶100，當(dāng)測(cè)定IgE時(shí)，稀釋1∶10，以二次重復(fù)加入板中。當(dāng)測(cè)定血清中的特異性IgE時(shí)，使用市售標(biāo)準(zhǔn)(PharMinigen)，且讀數(shù)參考該標(biāo)準(zhǔn)。血清樣本和標(biāo)準(zhǔn)在4℃下培養(yǎng)過夜。加入稀釋于0.05％明膠緩沖液中的生物素輟合的單克隆大鼠抗小鼠IgG MoAb(Phar Minigen)，再培育1小時(shí)。然后加入抗生物素-堿性磷酸酯酶(Sigma)(1∶1000)及在室溫下培育1小時(shí)，再清洗6次。加入磷酸酯酶底物磷酸對(duì)硝基苯酯二鈉鹽(Sigma)以進(jìn)行呈色反應(yīng)。在微測(cè)試盤自動(dòng)讀數(shù)儀(Metertech)中，在405nm下讀取板的數(shù)據(jù)。讀數(shù)是以4只小鼠合并的標(biāo)準(zhǔn)血清為參考，該小鼠最初由腹膜內(nèi)注射10微克rSj26或Derp5加上氫氧化鋁，再以相同劑量注射21天。標(biāo)準(zhǔn)血清計(jì)算為100ELISA單位/毫升。
6、以過敏原基因轉(zhuǎn)植來免疫預(yù)防過敏原誘發(fā)的AHR由于pCMVD抑制Derp5特異性IgE合成的功效和特異性，于是本發(fā)明人測(cè)試是否接種pCMVD至小鼠中可抑制過敏原誘發(fā)的AHR。以超聲波噴霧器進(jìn)行Derp5氣霧激發(fā)后再測(cè)定肺部阻力(RL)。在pCMV免疫的小鼠中，Derp5敏化的小鼠在PC100中顯示有顯著減少的乙酰膽堿劑量(14.6±0.5)，相對(duì)于pCMVD免疫的小鼠(31.9±.2)和假劑(sham)敏化的小鼠(30.2±1.3)(圖4)。綜合這些結(jié)果可知，直接基因轉(zhuǎn)植不僅可抑制過敏原誘發(fā)的IgE合成，亦可抑制過敏原誘發(fā)的AHR。
7、以過敏原基因直接移入來抑制過敏原誘發(fā)的AHR因?yàn)榇蠖鄶?shù)個(gè)體在治療前均經(jīng)過敏原敏化，本發(fā)明人研究是否直接基因轉(zhuǎn)植可調(diào)降過敏原敏化過的小鼠中的AHR。小鼠最初是以10微克Derp5加上氫氧化鋁由腹膜內(nèi)進(jìn)行敏化，在敏化2周后，以不同劑量的pCMVD質(zhì)粒DMA治療。過敏原基因轉(zhuǎn)植后一周時(shí)，小鼠接受吸入激發(fā)及肺部功能測(cè)試。過敏原基因轉(zhuǎn)植顯示對(duì)AHR有顯著作用，相較于以假劑處理的小鼠。因此，直接過敏原基因轉(zhuǎn)植可調(diào)降過敏原誘發(fā)的AHR(圖5)。
8、以過敏原基因直接移入來抑制過敏原誘發(fā)的呼吸道發(fā)炎除了測(cè)定肺部功能外，本發(fā)明人進(jìn)行支氣管肺泡灌洗 以研究過敏原誘發(fā)的AHR的致病過程，及測(cè)定過敏原基因轉(zhuǎn)植對(duì)呼吸道細(xì)胞浸潤(rùn)的影響。在測(cè)定肺部功能后，小鼠接受支氣管肺泡灌洗。與以假劑處理的小鼠相較，在以pCMVD處理的小鼠中，嗜中性白細(xì)胞顯著減少(圖6)。
9、組織學(xué)評(píng)估各活組織檢查樣本是以4％甲醛固定再以石蠟包埋。切出5微米切片以供用蘇木色素-伊紅(eosin)染色法進(jìn)行染色。B.結(jié)果1、過敏原基因轉(zhuǎn)植造成的rSj26特異性IgE的減少為研究是否直接注射rSj26基因可調(diào)降活體內(nèi)進(jìn)行中的rSj26特異性IgE合成，注射由3微克至100微克間不同劑量的pCMVG質(zhì)粒至經(jīng)rSj26敏化的小鼠中。在pCMVG處理過的小鼠中，rSj26特異性IgE顯著減少。相對(duì)地，rSj26特異性IgG2a則無顯著差異。此外，pCMVGDNA注射可抑制rSj26特異性IgE的合成，且具有專一性。因?yàn)榻?jīng)pCMVG處理的大鼠以Derp5激發(fā)時(shí)，可產(chǎn)生Derp5特異性IgE。因此，直接基因轉(zhuǎn)植可以有效地抑制活體內(nèi)過敏原特異性IgE的合成(圖8)。
2、皮膚中發(fā)炎反應(yīng)的減低為研究過敏原基因轉(zhuǎn)植治療皮炎的功效，注射pCMVG質(zhì)粒DNA至rSj26敏化過的小鼠中。激發(fā)注射后7天時(shí)，對(duì)所有小鼠作皮膚組織檢查。組織學(xué)評(píng)估顯示，在pCMV(空白載體)處理過的小鼠中，有顯著的發(fā)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，而在pCMV處理過的小鼠中，則無明顯的細(xì)胞浸潤(rùn)。pCMVG處理過的小鼠亦顯示光滑的皮膚，而相對(duì)地，以pCMVG處理過的小鼠顯示紅斑及稀簿的皮膚(圖7)。因此，直接注射pCMVG質(zhì)?？梢哉{(diào)節(jié)皮膚的發(fā)炎現(xiàn)象。
權(quán)利要求
1.一種重組質(zhì)粒，其包括真核表達(dá)載體及過敏原基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其中該真垓表達(dá)載體是選自由含CMV啟動(dòng)子的載體、含RSV啟動(dòng)子的載體或含SV40啟動(dòng)子的載體所組成的一組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組載體，其中該過敏原包括任何可引起人類過敏反應(yīng)的環(huán)境抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其中該過敏原是選自由屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)過敏原、日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、房屋灰塵、動(dòng)物皮屑、花粉或花生所組成的一組。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒，其中該過敏原是屋塵螨過敏原或日本血吸蟲的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶。
6.根據(jù)權(quán)利要1所述的重組質(zhì)粒，其可用于預(yù)防和治療過敏性疾病。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其可用于抑制過敏原特異性IgE的產(chǎn)生。
8.一種可用于預(yù)防和治療過敏性疾病的藥物組合物，其包括權(quán)利要求1的重組質(zhì)粒及醫(yī)藥上可接受的載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其中該過敏性疾病包括過敏性氣喘、過敏性鼻炎、異位性皮炎、休克和其他過敏癥。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其是以肌肉內(nèi)注射、鼻內(nèi)輸送、氣管內(nèi)輸送或真皮內(nèi)輸送的方式投藥。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其中該醫(yī)藥上可接受的載體為生理鹽水、金珠或脂質(zhì)粒。
12.一種可用于抑制過敏原特異性IgE產(chǎn)生的藥物組合物，其包括權(quán)利要求1的重組載體及醫(yī)藥上可接受的載體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其中該過敏性疾病包括過敏性氣喘、過敏性鼻炎、異位性皮炎和過敏癥。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其是以肌內(nèi)內(nèi)注射、鼻內(nèi)輸送、氣管內(nèi)輸送或真皮內(nèi)輸送的方式投藥。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其中該醫(yī)藥上可接受的載體為生理鹽水、金珠或脂質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明提供一種可用于預(yù)防和治療過敏性疾病的重組載體，其包括真核表達(dá)載體及過敏原基因，當(dāng)這種重組載體以肌肉內(nèi)注射、鼻內(nèi)輸送、氣管內(nèi)輸送或真皮內(nèi)輸送的方式給予個(gè)體時(shí)，可抑制過敏原特異性IgE的產(chǎn)生。本發(fā)明亦提供包含重組載體的藥物組合物，其可用于預(yù)防和治療過敏性疾病及用于抑制過敏原特異性IgE產(chǎn)生。
文檔編號(hào)C12NGK1163936SQ96104938
公開日1997年11月5日 申請(qǐng)日期1996年4月29日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月29日
發(fā)明者許清祥, 蔡考圓, 陶秘華, 謝貴雄 申請(qǐng)人:許清祥, 蔡考圓, 陶秘華, 謝貴雄