專利名稱：一種新的細(xì)菌菌種保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種新的細(xì)菌菌種保存方法。
經(jīng)典的保存菌種方法常用冷凍真空干燥保存法。此法為1.制備菌液。將待保存的新鮮純培養(yǎng)物，以無(wú)菌手段研磨于脫脂牛奶中，制成濃厚菌懸液，分裝于菌種管內(nèi)，一般不超過(guò)菌種管球部的1/2，并做好標(biāo)記。2.冷凍。將裝好的菌種管放入冷凍干燥儀內(nèi)，立即降溫至-40℃以下，冷凍1h或過(guò)夜。3.干燥。然后將干燥儀轉(zhuǎn)至抽真空狀態(tài)連續(xù)3-6h，至球部菌液干燥成蜂窩狀為止。4.真空封口。將干燥好的菌種管抽真空，達(dá)到所需真空度后，邊抽真空邊封口。5.檢查，鑒定。干燥好的菌種管，用真空測(cè)定應(yīng)達(dá)到所需真空度(10-1以上)。菌種外觀呈蜂窩狀，加入溶劑后可立即溶解。同時(shí)，還應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，檢查存活情況，必要時(shí)再進(jìn)行詳細(xì)鑒定。6.保存。4℃保存，保存時(shí)間一年或數(shù)年。7.啟用。將要用的菌種管取出，折斷，用毛細(xì)管吸取少量鹽水或肉湯，加入菌種管內(nèi)待溶解后，即可轉(zhuǎn)種使用。已有技術(shù)出處1.菌種保藏手冊(cè)科學(xué)出版社1980，2.衛(wèi)生防疫微生物檢驗(yàn)操作規(guī)程北京出版社1991。3.微生物學(xué)通報(bào)1989(4)220-224，王美芝等著L-干燥法和冷凍真空干燥法保藏放線菌效果比較。但經(jīng)典的冷凍真空干燥法，在干燥過(guò)程中，需兩次抽真空，使固化水分直接升華，細(xì)菌易受到損傷。其次，需要特殊儀器設(shè)備，一般實(shí)驗(yàn)室難于開(kāi)展此工作。第三操作過(guò)程較為復(fù)雜。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下1.使用菌種為35種細(xì)菌，259菌株，具體品種見(jiàn)表1。
2.使用培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基，它們是SS瓊脂，泰康鎧瓊脂，普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂，血瓊脂，BCYE瓊脂，營(yíng)養(yǎng)肉湯。配方見(jiàn)表2。
3.將預(yù)定要保存的菌種，接種于相應(yīng)培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)良好。
4.用特殊棉拭子滾動(dòng)沾取菌苔，放入帶螺蓋的玻璃管中，擰緊管蓋，迅速放入-20℃至-30℃冰柜中保存。菌種保存期為2年。
5.啟用。從冰柜保存處取出，待溫度升至室溫后，直接接種于相應(yīng)培養(yǎng)基上。
6.特殊棉拭子的制備。
將少許脫脂棉，纏繞在棉簽上，然后浸泡于浸泡溶液中，浸透后取出棉拭子，50℃-60℃烘干，放入帶螺蓋的小玻璃管中，蓋緊，滅菌備用。
浸泡溶液配方按重量百分比，每一百份水溶液中，含結(jié)晶氯化鈣0.005-0.015，硫乙醇酸鈉0.05-0.015，丙酮酸鈉0.005-0.015。其中水為去離子水。最佳配方為結(jié)晶氯化鈣0.01，硫乙醇酸鈉0.1，丙酮酸鈉0.01，去離子水為99.88。
本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn)1.適用于大量菌種保存。2.保存的細(xì)菌，直接吸附于滅菌和特殊處理的棉拭子上，無(wú)需真空干燥，立即進(jìn)入干燥環(huán)境，保持細(xì)菌體內(nèi)固有水分，能更好地保持細(xì)菌原有特性。3.化學(xué)藥品能使保存的微小環(huán)境，呈缺氧狀態(tài)，使細(xì)菌免于氧化作用。4.不需特殊保護(hù)劑。5.適于科研機(jī)關(guān)使用，更便于基層單位使用，有推廣使用價(jià)值。6.減少污染。7.成本低，不需特殊設(shè)備。
本方法效果良好在正式試驗(yàn)中，使用菌種35個(gè)種，菌株259菌株，經(jīng)過(guò)3年觀察試驗(yàn)，本發(fā)明以直接分離，接種相應(yīng)平板上，全部試驗(yàn)用菌株生長(zhǎng)良好，存活率為100％，冷凍真空干燥保存法，用直接分離，轉(zhuǎn)種相應(yīng)平板上，有13株菌未見(jiàn)生長(zhǎng)，即使用復(fù)蘇修補(bǔ)培養(yǎng)法進(jìn)行增殖，仍未見(jiàn)生長(zhǎng)，存活率為94.98％。兩種方法保存菌種比較見(jiàn)表1。
本發(fā)明有附圖

圖1中1.棉拭子，2.玻璃管，3.螺紋管蓋。
實(shí)施例1.使用肺炎鏈球菌，培養(yǎng)內(nèi)湯按常規(guī)接種、培養(yǎng)。
2.將少許脫脂棉，纏繞在棉簽上，浸泡在浸泡液中，浸透后取出棉拭子。浸泡液配方為結(jié)晶氯化鈣0.01％，硫乙醇酸鈉0.1％，丙酮酸鈉0.01％，去離子水為99.88％(配至100ml)。將浸透棉拭子50℃烘干，放入帶螺蓋小瓶中，緊蓋，滅菌。
3.用棉拭子滾動(dòng)沾取菌苔，放入小管，擰緊蓋，迅速放入-20℃冰柜中保存，可保存2年。
表1 兩種方法保存菌種比較(正式試驗(yàn))
表2.
培養(yǎng)基處方1.SS瓊脂g牛肉浸膏5，蛋白胨5，乳糖10，3號(hào)膽鹽8.5，檸檬酸鈉8.5，硫代硫酸鈉8.5，檸檬酸鐵1，瓊脂13.5，煌綠0.00033，中性紅0.025，蒸餾水1000ml。
2.麥康鎧瓊脂g蛋白胨17，多價(jià)胨3，乳糖10，膽鹽1.5，氯化鈉5，中性紅0.03結(jié)晶紫0.001，蒸餾水1000ml。pH 7.1。
3.普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂gpH7.6牛肉膏湯1000ml，瓊脂2。
4.血瓊脂gpH7.6普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂1000ml，加脫纖維羊血5-10ml。
5.BCYE瓊脂gN-2-乙酰氨基-2-氨基乙烷磺酸(ACES)10，酵母浸膏10，活性炭2，瓊脂17，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.4，可溶性焦磷酸鐵0.25，蒸餾水1000ml。
6.營(yíng)養(yǎng)肉湯g牛肉浸液1000ml，蛋白胨10，氯化鈉5，磷酸氫二鉀2。
權(quán)利要求
1.一種新的細(xì)菌菌種保存方法，其特征在于本方法按如下步驟進(jìn)行(1)將預(yù)定要保存的菌種，接種于相應(yīng)培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)良好。(2)用特殊棉拭子滾動(dòng)沾取菌苔，放入帶螺蓋的玻璃管中，擰緊管蓋。(3)迅速放入-20℃至-30℃冰柜中保存。(4)啟用時(shí)，從冰柜取出，待溫度升至室溫后，直接接種于相應(yīng)培養(yǎng)基上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于特殊棉拭子的制法為將少許脫脂棉，纏繞在棉簽上，然后浸泡在浸泡溶液中，浸透后取出棉拭子，于50-60℃烘干，放入帶螺蓋的玻璃管中，擰緊蓋，滅菌備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的浸泡溶液，其特征在于浸泡溶液配方為按重量百分比，每一百份浸泡溶液中含結(jié)晶氯化鈣0.005-0.015份，硫乙醇酸鈉0.05-0.015份，丙酮酸鈉0.005-0.015份，水為去離子水。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的浸泡溶液，其特征在于，其最佳配方為按重量百分比，每一百份浸泡溶液中含結(jié)晶氯化鈣0.01份，含硫乙醇酸鈉0.1份，含丙酮酸鈉0.01份。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的細(xì)菌菌種保存方法。它使用一種特殊的棉拭子滾動(dòng)沾取已培養(yǎng)的菌種菌苔，迅速放入已處理好的小管中，并擰緊管蓋，立即放入-20℃至-30℃冰柜中保存，菌種可保存2年。
文檔編號(hào)C12M1/26GK1142535SQ9610522
公開(kāi)日1997年2月12日 申請(qǐng)日期1996年5月21日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月21日
發(fā)明者路文彬, 彭曉旻, 吳家麗, 嚴(yán)寒秋 申請(qǐng)人:北京市衛(wèi)生防疫站