專利名稱：人胸腺素α原及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人胸腺素α原，其cDHA和所述cDNA在細(xì)菌，特別是大腸桿菌中的表達(dá)。
在T淋巴細(xì)胞分化成熟的過程中，胸腺上皮細(xì)胞分泌的多種肽類激素可能起著重要作用。Goldstein最先從胸腺素組分中分離到胸腺素α1(thymosinα)，它是一個含有28個氨基酸殘基的多肽，其等電點為4.2，分子量為約3KDa。它具有胸腺素組分V的部分功能。人工合成及大腸桿菌表達(dá)的胸腺素α1具有相同的生物學(xué)活性。
在從胸腺素組分V分離α1時，發(fā)現(xiàn)了另一組分，它含有35個氨基酸殘基，其N-末端的28個氨基酸序列與胸腺素α1完全一致，具有與α1相同的生物學(xué)活性，稱之為胸腺素α11。由于胸腺素α1和α11的N-末端完全一致，α11僅在C-末端多7個氨基酸且其C-末端最后一個氨基酸皆為谷氨酸，因此推測可能是體內(nèi)某一分子較大的蛋白質(zhì)在蛋白酶作用下分解成α1和α11兩種活性成分。
Haritos等在液氮中直接勻漿新鮮大鼠胸腺后，迅速放入煮沸的磷酸鹽緩沖液，以滅活內(nèi)源蛋白酶，蛋白分離時，未出現(xiàn)胸腺素α1和α11，而得到了分子量約為12Kda，等電點為3.55的新組分。序列分析表明，它含有111個氨基酸殘基，其N-末端的前28個氨基酸殘基為α1序列，前35個則為α11，故稱該組分為胸腺素α原(prothymosinα，ProTα)。
人的ProTα基因位于第2號染色體上，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成。與大鼠胸腺素α原不同，人的胸腺素α原為109個氨基酸殘基的多肽。分析胸腺素α原cDNA發(fā)現(xiàn)，在起始密碼子ATG后面緊接著的是胸腺素α原的成熟肽，即α1的序列，cDNA上游及下游也無疏水氨基酸密集的區(qū)域，顯示胸腺素α原無信號肽。胸腺素α原也無N-糖基化位點。在胸腺素α原氨基酸殘基中，酸性的谷氨酸聚集成簇，約占整個氨基酸殘基的32％，因它的等電點低?？拷叵偎卅猎腃-末端有很多核蛋白共有的Lys-Lys-Gln-Lys片段，所述片段可能為核定位信號，提示胸腺素α原可能作為核蛋白，從而在核內(nèi)發(fā)揮生理作用。Manrow等的工作為此提供了依據(jù)，他們將人胸腺素α原基因與β-半乳糖苷酶基因融合，不論β-半乳糖在N端還是C末端，轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后，該融合蛋白皆出現(xiàn)于細(xì)胞核內(nèi)，而單獨的β-半乳糖苷酶則僅分布于胞漿內(nèi)，與胸腺素α原融合后方顯示該特性。
本發(fā)明采用基因工程方法在制備人胸腺素α原方面取得了成功。
因此，本發(fā)明的目的之一是提供人胸腺素α原及其制備方法；即通過用植物血球凝集素(PHA)和重組人白細(xì)胞介素1(IL-2)聯(lián)合刺激胎兒胸腺細(xì)胞，從中提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR獲得了人胸腺素α原cDNA；將其克隆到pUC19中，經(jīng)序列分析表明，與已報道的序列一致。然后將所得的cDNA亞克隆到原核表達(dá)載體例如pBV220，pET3α中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，例如，DH5α，從而得到大腸桿菌中以可溶形式表達(dá)的胸腺素α原。經(jīng)活性測定表明，它可明顯刺激人外周血淋巴細(xì)胞E-玫瑰花結(jié)的形成率。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在不改變編碼胸腺素α原氨基酸序列的前提下，增加胸腺素α原上游引物中的A，T含量，可以明顯提高胸腺素α原的表達(dá)量，同時，不同培養(yǎng)基對它的表達(dá)也有影響。
因此本發(fā)明的另一目的是利用基因工程技術(shù)從培養(yǎng)的人胎兒胸腺細(xì)胞中獲得人胸腺素α原的基因及其在大腸桿菌中的表達(dá)。
本發(fā)明的目的是提供一種制備人胸腺素α原的方法，包括(a)合成富含A，T的引物(b)用(a)中合成的引物為模板合成胸腺素α原cDNA；(c)將(b)得到的cDNA克隆到表達(dá)載體中；(d)用所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞；(e)培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞，將所述細(xì)胞破碎后，從上清液中回收所表達(dá)的胸腺素α原。
其中所述的胸腺素α原cDNA序列含有圖3所示的序列。
其中所述的表達(dá)載體選自pBV220，pET32α。
其中所述的原核細(xì)胞為大腸桿菌。
其中所述的大腸桿菌選自大腸桿菌DH5α，JM101。
權(quán)利要求1方法制備的胸腺素α原。
權(quán)利要求6的胸腺素α原在增強動物免疫力方面的應(yīng)用。


圖1表示檢測胸腺總RNA的RT-PCR產(chǎn)物。
圖2表示重組質(zhì)粒pUC19的限制酶裂解分析。
圖3表示重組胸腺素α原的cDNA序列。
圖4表示不同上游引物對胸腺素α原表達(dá)的影響，以pBV220DH5α為對照。
圖5表示不同培養(yǎng)基對胸腺素α原表達(dá)的影響，以pBV220DH5α，LB培養(yǎng)基為對照。
材料和方法1.1細(xì)菌和質(zhì)粒細(xì)菌JM101，DH5α質(zhì)粒pUC19，購自北京華美生物技術(shù)公司；pBV220，表達(dá)質(zhì)粒，中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所惠贈。
1.2培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基和高濃度培養(yǎng)基配方見參考文獻(xiàn)8。玉米漿培養(yǎng)基為104％玉米漿和0.5％的水解酪蛋白，調(diào)pH至7.0。
1.3酶制劑及其其他試劑限制性內(nèi)切酶EcorI，BamhI及T4DNA連接酶均購自Promega公司，總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄等試劑也購自Promega公司，ITPG為中科院生態(tài)環(huán)境研究中心產(chǎn)品，植物血球凝集素2L-2等皆為標(biāo)準(zhǔn)試劑。
1.4引物合成本發(fā)明人設(shè)計出胸腺素α原的適合的引物，從而使以所述引物合成的cDNA在原核生物細(xì)菌，特別是大腸桿菌中表達(dá)，能夠使胸腺素α原的表達(dá)產(chǎn)率大大提高。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，增加上游引物中的A，T含量，就可以明顯地提高胸腺素α原的表達(dá)。在生產(chǎn)本發(fā)明的胸腺素α原過程中使用了如下四個引物引物I 5′CGG AAT TCA TGT CAG ACG CAG CCG TAG3′(含EcoRI位點)引物II 5′CGG AAT TCA TGT CTG ACG CAG CTG TAG ACA CC3′引物III5′CGG AAT TCA TGT CTG ATG CAG CTG TAG ATACCA G3′
引物IV5′CGG GAT CCT TAG GTC ATC CTC GTC GGT C3′其中引物I、II、III為上游引物，引物IV為下游引物，所述引物用美國ABI公司的391EPDNA合成儀合成。
1.5人胎兒胸腺細(xì)胞的培養(yǎng)取四月齡胎兒胸腺，制備成單個細(xì)胞，懸浮于RPMI1640培養(yǎng)液中，細(xì)胞密度為1×107/ml，在20ug/mlPHA和500U/mlIL-2的聯(lián)合刺激下，于37℃，5％CO2下培養(yǎng)24小時。
1.6胸腺細(xì)胞總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄PCR取刺激培養(yǎng)的胸腺細(xì)胞，按Promega公司的總RNA試劑盒的方法，提取細(xì)胞的總RNA，最后，溶于滅菌的去離子水中，取一定量的RNA，加下游引物和dNTP，在42℃下，反轉(zhuǎn)錄酶作用30分鐘，將胸腺素α原mRNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，進(jìn)一步加入上游引物及TaqDNA聚合酶后，進(jìn)行如下步驟先在94℃變性2分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，再在94℃1分鐘，50℃1分鐘，和72℃1分鐘進(jìn)行30個循環(huán)，最后于72℃延伸7分鐘。
1.7按Sambrook等人(分子克隆實驗室指南，第二版，1992，科學(xué)出版社，金冬雁等)的方法進(jìn)行DNA重組及其鑒定。按Sanger雙脫氧末端終止法進(jìn)行序列分析。玫瑰花結(jié)實驗用淋巴細(xì)胞分離液分離健康人外周血單核細(xì)胞，用Hanks液配成2×106/ml，實驗管加一定量的胸腺素α原表達(dá)上清液，對照則加相同對照菌上清液于30℃水浴90分鐘，加0.5％綿羊紅細(xì)胞后，涂片，染色，于高倍鏡下計數(shù)200個淋巴細(xì)胞中形成玫瑰花結(jié)的細(xì)胞數(shù)(結(jié)合4個及以上綿羊紅細(xì)胞)，計算玫瑰花形成細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，可用公式求得表達(dá)上清液的激活率。 結(jié)果與討論胸腺素α原cDNA的篩選體外培養(yǎng)人胚胎胸腺細(xì)胞，經(jīng)PHA和IL-2聯(lián)合刺激，提取的總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行30個循環(huán)的PCR，瓊脂糖凝膠電泳可觀察到有一條明顯的DNA帶，其分子量與胸腺素α原cDNA的大小相符結(jié)果示于圖1。
胸腺素α原cDNA的克隆，篩選及序列測定常規(guī)低熔點瓊脂糖回收法，經(jīng)RT-PCR得到的特異帶，用EcoRI和BAmHI雙酶切處理，在T4DNA連接酶的作用下，克隆入經(jīng)相同酶消化的pUC19中，轉(zhuǎn)化常規(guī)CaCl2處理的JM101感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在含X-gal的瓊脂平板上挑選白色菌落，用EcoRI和BamHI雙酶切鑒定，可見一特異帶被所述酶切出來，其分子量與胸腺素α原RT-PCR產(chǎn)物的一致，結(jié)果示于圖2。
挑出陽性轉(zhuǎn)化子，用Promega公司的質(zhì)粒純化系統(tǒng)提取質(zhì)粒，用GibcoBLRL公司的雙鏈測序系統(tǒng)測序，測得的胸腺素α原cDNA序列與文獻(xiàn)報道的一致。胸腺素α原的cDNA序列示于圖3。胸腺素α原cDNA在大腸桿菌中的表達(dá)上游胸腺素α原cDHA引物中的A，T含量對胸腺素α原表達(dá)的影響根據(jù)胸腺素α原cDNA序列，參考大腸桿菌偏愛密碼子，在不改變氨基酸序列的前提下，設(shè)計出3條引物，分別命名為引物I、II和III，這3條引物A，T含量不同。在相同的條件下，將3條引物獲得的胸腺素α原cDNA克隆入表達(dá)載體pBV220，然后轉(zhuǎn)化DH5α。于30℃培養(yǎng)4小時后，42℃熱誘導(dǎo)4小時，全菌的SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，引物I泳道未見特異表達(dá)帶，引物II泳道可見一條較弱的帶出現(xiàn)，經(jīng)激光掃描，這條帶約占細(xì)菌總蛋白的2.8％左右。引物III中，A，T堿基含量較高，泳道中可見這條特異帶比較明顯，經(jīng)掃描定量，約占細(xì)菌總蛋白的8.0％左右，見圖4的結(jié)果。
從這一結(jié)果可以看出，上游引物中A，T含量對胸腺素α原的表達(dá)確實有明顯的影響。引物III中A，T含量高，盡管編碼的氨基酸相同，但是胸腺素α原的表達(dá)量高。在這種情況下，可能氫鍵較弱，從而易于轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
不同培養(yǎng)基對胸腺素α原表達(dá)的影響胸腺素α原的氨基酸組成中，谷氨酸和天冬氨酸的含量豐富，其中谷氨酸約占總氨基酸的32％，天冬氨酸約占16％，在表達(dá)胸腺素α原時，二者有可能稱為限制因素。鑒于此，本發(fā)明人選用了三種培養(yǎng)基即LB培養(yǎng)基，高濃度肉湯和玉米漿培養(yǎng)基，以了解它們對胸腺素α原表達(dá)的影響。結(jié)果表明，同一菌株，在相同的條件下培養(yǎng)，用LB培養(yǎng)基時，胸腺素α原表達(dá)量約占整個細(xì)菌總蛋白的8.0％左右，而高濃度肉湯，則為15.0％，左右，用玉米漿培養(yǎng)的細(xì)菌繁殖旺盛，但不利于靶蛋白的表達(dá)，結(jié)果示于圖5。
表達(dá)產(chǎn)物初步活性的測定將克隆有胸腺素α原cDHA菌大量培養(yǎng)，超聲破碎，將上清液和沉淀物分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果胸腺素α原蛋白帶出現(xiàn)于上清液中，即它以可溶形式表達(dá)，不形成包涵體。將表達(dá)上清液加入人外周血單個核細(xì)胞懸液中，與綿羊紅細(xì)胞一起溫育。與對照相比，可明顯提高淋巴細(xì)胞玫瑰花結(jié)形成率，結(jié)果示于下列表1。
表I 對T細(xì)胞E一致瑰花結(jié)形成率的影響E一致瑰花結(jié)形成率活化率對照 45 0PBHV220H5α 55.1 22.4PrOTα-EXPrestione 70.3 56.2這表明，大腸桿菌表達(dá)的胸腺素α原具有生物活性。由于它以可溶形式表達(dá)，因而不需要復(fù)性，只需從細(xì)菌蛋白中進(jìn)一步純化出胸腺素α原，即可用于免疫學(xué)活性的測定及臨床應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種制備人胸腺素α原的方法，包括(a)合成富含A，T的引物；(b)用(a)中合成的引物為模板合成胸腺素α原cDNA；(c)將(b)得到的cDNA克隆到表達(dá)載體中；(d)用所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞；(e)培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞，將所述細(xì)胞破碎后，從上清液中回收所表達(dá)的胸腺素α原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的胸腺素α原cDNA序列含有圖3所示的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的表達(dá)載體選自pBV220，pET3α。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的原核細(xì)胞為大腸桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的大腸桿菌選自大腸桿菌DH5α，JM101。
6.權(quán)利要求1方法制備的胸腺素α原。
7.權(quán)利要求6的胸腺素α原在增強動物免疫力方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及人胸腺素α原及其制備方法，包括(a)合成富含A，T的引物(b)用(a)中合成的引物為模板合成胸腺素α原cDNA；(c)將(b)得到的cDNA克隆到表達(dá)載體中；(d)用所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞；(e)培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞，將所述細(xì)胞破碎后，從上清液中回收所表達(dá)的胸腺素α原，以及所述人胸腺素在增強動物免疫力方面的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/63GK1150602SQ9610529
公開日1997年5月28日 申請日期1996年5月31日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月31日
發(fā)明者張符光, 劉佃辛 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境研究所