專利名稱：在精氨酸存在下從原核微生物中提取周質(zhì)蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由原核微生物尤其是大腸桿菌生產(chǎn)的重組蛋白的提取方法。
將遺傳工程技術(shù)用于生產(chǎn)所需蛋白質(zhì)例如，胰島素，白細胞介素，生長激素等等的現(xiàn)象與日俱增正越來越受到重視。
總的來說，用含有編碼所需蛋白質(zhì)的基因以及該基因表達所必需的工具例如調(diào)節(jié)信號的一種表達載體轉(zhuǎn)化微生物。然后將該微生物培養(yǎng)于合適的培養(yǎng)基中并且根據(jù)合適的培養(yǎng)參數(shù)，以及當微生物細胞達到足夠量時，加入一種誘導(dǎo)劑引發(fā)所謂的表達期，在該階段，產(chǎn)生并積累高水平的所需蛋白質(zhì)。在培養(yǎng)結(jié)束后，采用例如離心或微過濾方法將懸浮的細胞與培養(yǎng)基分離開，并且然后利用一種提取方法進行提取，所述提取方法的起始步驟常常是破碎該微生物的細胞壁。
根據(jù)所述基因使用的表達工具(啟動子，終止子，核糖體結(jié)合位點，信號肽等等)的性質(zhì)，編碼所需蛋白質(zhì)的基因在原核微生物中的表達可以是在胞質(zhì)中，周質(zhì)中或者是分泌性的。
胞質(zhì)中表達可以獲得大量的蛋白質(zhì)。但是，在提取所需蛋白質(zhì)之前，對于含有一個或多個二硫橋鍵的蛋白質(zhì)，實施一個變性/復(fù)性步驟是必要的，但在以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)時該步驟特別麻煩和復(fù)雜。根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的傳統(tǒng)方法，在還原劑存在的條件下利用變性劑，接著利用包括尤其是監(jiān)控溶液的氧化還原狀態(tài)的復(fù)性條件，完成變性/復(fù)性步驟。在所使用的變性劑中，特別值得一提的是鹽酸胍，在獲得人白細胞介素-2的方法中已經(jīng)建議使用這種物質(zhì)。為此，可參見例如文獻EP-A2-0,145,390。
對于革蘭氏陰性細菌，因為這類細菌的生產(chǎn)能力低，所以極少或不使用分泌性表達系統(tǒng)，在所述分泌性表達系統(tǒng)中所需蛋白質(zhì)以活性形式存在于培養(yǎng)基中。在這里應(yīng)該注意到由于存在例如界面變性作用的危險，生物反應(yīng)器中高密度細菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)基對于敏感性重組蛋白質(zhì)并不是理想的停留場所。
在周質(zhì)中進行表達可在保護其免于環(huán)境損害的空間中直接獲得原理上進行了正確折疊的重組蛋白質(zhì)，因此，這種表達方式是獲得蛋白質(zhì)的明智的選擇種類。因此，對于這種情況，將蛋白質(zhì)進行變性/復(fù)性不是必要的。
在該領(lǐng)域內(nèi)通常使用的細胞破碎方法是例如采用超聲波或機械壓力(French Pressue Cell，球丸研磨機)使細胞溶解，化學(xué)溶解或酶促溶解，利用離液序列高的試劑或去污劑進行滲透壓休克和處理。這些方法可使大多數(shù)細胞膜包括質(zhì)膜以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜破碎形成均質(zhì)的細胞碎片懸液。通常在離心之后收集到的細胞碎片沉淀(核，細胞骨架，線粒體，溶酶體，核糖體，大分子等等)的性質(zhì)特別依賴于離心的時間和速度(在1000g10分鐘至150,000g3小時)而定。
在提取操作中遇到的困難是根據(jù)表達類型和所使用的提取方法而變化的，特別包括—重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)率受損—重組蛋白質(zhì)的生物活性喪失—重組蛋白質(zhì)的蛋白水解降解—提取用試劑的毒性以及強性監(jiān)測試劑的去除—工業(yè)上實施的困難—周質(zhì)蛋白質(zhì)和胞質(zhì)蛋白質(zhì)相混合。
此外，當產(chǎn)生的所需蛋白質(zhì)是疏水或帶電荷時，它們可能與本身也是疏水或帶電荷的細胞成分相結(jié)合，從而使提取特別困難。
采用遺傳工程技術(shù)進行工業(yè)化生產(chǎn)所需重組蛋白質(zhì)具有越來越大的優(yōu)勢，但這使研制能避免上述弊端或使之降至最低程度的提取方法成為必需的。
實際上，不僅生產(chǎn)大量所需蛋白質(zhì)是重要的，而且這些蛋白質(zhì)必須不被提取試劑污染，并且必須保留其全部生物活性。
為了達到該目的，尤其是對于白細胞介素-2的提取/分離已建議了各種各樣方法。
文獻EP-A2-0,145,390描述了獲得未糖基化的人白細胞介素-2(IL-2)的方法，該IL-2的比活性大于104U/mg，該方法使用了柱層析分離步驟用于提取IL-2。該方法還包括利用鹽酸胍進行的變性步驟。
文獻EP-A2-0,147,819提出了一種獲得均質(zhì)的以及純的重組白細胞介素-2的方法。該方法包括培養(yǎng)由含有編碼白細胞介素-2的基因的表達載體轉(zhuǎn)化的微生物，促使細胞溶解，回收細胞碎片，通過用合適的洗液洗滌細胞碎片，然后采用層析方法從洗液中純化而提取IL-2。所使用的洗液含有一種鹽例如氯化鈉或鹽酸胍，或者一種去污劑例如已知商品名為“Triton X-100”的產(chǎn)品。
根據(jù)一種優(yōu)選的方法，介紹了連續(xù)使用三種洗滌溶液，即含有氯化鈉的洗液，含有一種去污劑的洗液以及含有鹽酸胍的洗液。
文獻EP-A1-0,337,243描述了一種純化人白細胞介素-2的方法，該方法使用了兩種反相液體層析柱的系統(tǒng)。在層析純化步驟之前，用含有鹽酸胍的溶液對細菌細胞溶解產(chǎn)物的不溶部分進行提取，得到一種細菌提取物，然后用不含鹽酸胍的緩沖液稀釋該提取物，此后，進行層析，用乙腈梯度進行洗脫。
令人驚奇的是目前已發(fā)現(xiàn)，通過將源于所說微生物培養(yǎng)物的細胞或細胞碎片沉淀懸浮于一種緩沖溶液中，可以提取由原核微生物產(chǎn)生的所需蛋白質(zhì)，所述原核微生物是用含有編碼所需蛋白質(zhì)的基因以及該基因表達所需的工具例如在周質(zhì)中表達所需的調(diào)節(jié)信號的表達載體轉(zhuǎn)化的，所述緩沖溶液最好含有精氨酸，這種精氨酸可以是L和/或D型。
根據(jù)第一方面，本發(fā)明的主題是精氨酸作為周質(zhì)蛋白質(zhì)提取試劑的應(yīng)用。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明的主題是提取所需周質(zhì)蛋白質(zhì)的方法，該方法包括1)將源于用表達載體轉(zhuǎn)化的微生物培養(yǎng)物的細胞沉淀懸浮于一種含有精氨酸的緩沖溶液中(所述表達載體含有編碼所述蛋白質(zhì)的基因以及其在周質(zhì)中表達必需的所有調(diào)節(jié)信號)，并且在合適pH，溫度，細菌濃度等等條件下接觸一個時期之后。
2)在由此獲得的細菌懸液的上清液中回收所需蛋白質(zhì)。
所述用于提取所需周質(zhì)蛋白質(zhì)的方法的一種變體形式包括將從源于培養(yǎng)物的細胞溶解之后獲得的細胞碎片的沉淀懸浮于含有精氨酸的緩沖溶液中。
當提取緩沖液由含有精氨酸的水溶液組成并且當其pH是微堿性，優(yōu)選等于8時，周質(zhì)蛋白質(zhì)的提取特別有效，其中溶液中精氨酸濃度至少為0.4M，于室溫下在水中精氨酸的溶解度極限值范圍內(nèi)(在純水中極限值在0.8M左右，并且上面溶液有鹽存在)。
精氨酸是一種天然α-氨基酸，已有人建議將該氨基酸用作為Abbokinase(尿的纖維蛋白溶酶原激活因子)的雙鏈的變性/復(fù)性/取代的輔助劑，在這一操作過程中天然肽鏈的一部分由合成肽鏈取代。為此，可參照論文GA.Homandberg and T.wai inBiochimica etBiophysica Acta，1990，1038，209-215。
在本發(fā)明方法或變體方法中，沒有實施蛋白質(zhì)的變性/復(fù)性步驟并且精氨酸僅參與到從微生物的細胞或細胞碎片沉淀中提取蛋白質(zhì)的步驟。
就蛋白質(zhì)的產(chǎn)率和生物活性而言，精氨酸給蛋白質(zhì)的提取帶來顯著效果。事實上發(fā)現(xiàn)例如用本發(fā)明方法回收到產(chǎn)率大于95％的成熟形式的IL-13，而且保留了該分子的生物活性。應(yīng)該注意到在同樣表達系統(tǒng)中采用滲透壓休克進行提取的試驗并沒有產(chǎn)生可與之相比的產(chǎn)率。
比較實驗顯示在同樣條件下使用鹽酸胍也能使回收到的IL-13蛋白質(zhì)的產(chǎn)率大于95％以上。結(jié)果，與之相反，用此回收到的蛋白質(zhì)的生物活性比采用精氨酸方法要大大地降低。
由于不希望局限于某些特定理論的解釋，因而相對于為了實現(xiàn)提取需要在等于或大于5M的高濃度發(fā)揮變性作用的強有力的離液序列高的試劑例如鹽酸胍而言，認為精氨酸起著溫和的和生物學(xué)的離液序列高的試劑的作用。
可以在任何微生物培養(yǎng)方法之后實施本發(fā)明方法或其變體形式，所述微生物已用含有編碼所需蛋白質(zhì)的基因以及所述蛋白質(zhì)在周質(zhì)中表達需要的工具例如所有的必要調(diào)節(jié)信號的表達載體進行轉(zhuǎn)化。
該方法可以應(yīng)用到與大腸桿菌密切相關(guān)的細菌即所謂的組成腸桿菌科的兼性厭氧革蘭氏陰性細菌，這對本領(lǐng)域內(nèi)專業(yè)人員而言是顯而易見的。在該腸桿菌科中，發(fā)現(xiàn)下列屬內(nèi)菌種特別適用埃希氏桿菌，沙門氏菌，歐文氏菌，還有志賀氏菌，克雷氏菌，沙雷氏菌，變形菌和腸桿菌。
了解了精氨酸的離液序列高的特性，根據(jù)本發(fā)明，可優(yōu)先用精氨酸替代其他離液序列高的試劑也是明顯的。由于所談?wù)摰幕钕到y(tǒng)之間存在差異因而不可能在所有細菌科中舉證，但本領(lǐng)域技術(shù)人員知道怎樣將精氨酸提取方法應(yīng)用或適用于其特定的情況。
所述培養(yǎng)方法也是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的。涉及革蘭氏陰性細菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法已有描述，例如在EP-360,641和EP-356,335專利中報道了已知名為SEBR1250和TP2339的大腸桿菌菌株的獲得和使用。
當達到所需的細胞量時，將培養(yǎng)物進行離心(一般情況)或微過濾，并且根據(jù)本發(fā)明的方法將獲得的生物量沉淀與含有精氨酸的緩沖液相接觸。
作為一般規(guī)則，該操作步驟是在室溫約為25℃至2℃，優(yōu)選為4℃的溫度條件下進行的。
細胞沉淀與含有精氨酸的緩沖液的接觸時間必須保證足以使所需蛋白質(zhì)傳遞到緩沖液中。
總的來說，在4℃完成該步驟時，優(yōu)選的接觸時間約為1小時。
在生物量與含有精氨酸的提取緩沖液接觸期間提取過程，也就是周質(zhì)蛋白質(zhì)傳遞到培養(yǎng)基中的過程連續(xù)進行。完全提取或者含量不再進一步變化的提取所用的接觸時間為30分鐘至16小時。試驗證明在溫度為4℃，幾小時之內(nèi)就可獲得滿意的提取產(chǎn)率。還要注意應(yīng)將提取緩沖液中的生物量緩慢地攪拌以避免微生物團粒沉積從而獲得優(yōu)良結(jié)果，也就是說較高水平的提取是時間的函數(shù)。
本發(fā)明所述的提取方法既適用于提取疏水蛋白質(zhì)例如白細胞介素，尤其是在文獻EP-A1-0,506,574中描述的IL-13，也適用于提取親水蛋白質(zhì)例如生長激素(hGH)。本發(fā)明方法簡化了獲得hGH的步驟，而常規(guī)的hGH方法需要使用滲透壓休克進行提取。
為了實現(xiàn)直接從懸浮的細胞沉淀中提取所需的蛋白質(zhì)，優(yōu)選使用含有濃度為0.4M至0.8M的精氨酸的緩沖液。
當希望采用本發(fā)明方法的變體從細胞碎片沉淀中提取所需的周質(zhì)蛋白質(zhì)時，可采用類似于在本發(fā)明中使用的方法直到在離心或微過濾之后獲得細胞沉淀的步驟，然后根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法完成細胞的破碎。細胞破碎方法描述于例如C.T.Choma和H.Yamazaki，Can.J.Microbiol.，1981，27，547-550；L.O.Ingram，Journal of Bacteriology，1981，146，1，331-336；N.G.Nossal和L.A.Heppel.Journal of Biological Chemistry，1966，241，13，3065-3072；R.Bennett，D.R.Taylo和A.Huret，Biochem.Biophys.Acta，118，512-521(1966)以及描述于論文集Fermentation and enzymetechnology，Chap，12，239-309，J.Wiley and Sons publishers(1979)。
作為一般規(guī)則，將通過離心收集到的細胞碎片沉淀懸浮后與含有精氨酸的緩沖液接觸。細胞碎片懸液與含有精氨酸的緩沖液的接觸時間必須保證足以使所需蛋白質(zhì)傳遞到緩沖溶液中。一般來說，在4℃溫度時，幾乎完全提取所需的接觸時間是48小時。同樣，注意到緩慢地攪拌提取緩沖液中的生物量，從而避免細胞碎片沉積，可以得到與時間呈函數(shù)關(guān)系的高水平的提取量。
本發(fā)明的提取方法的一種變體方法尤其適用于提取所需的周質(zhì)蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)與細胞膜緊密結(jié)合，例如白細胞介素。
本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員熟知本發(fā)明所述含有精氨酸的提取緩沖液還可以含有一種輔助去污劑，該去污劑具有提高產(chǎn)率和/或提取所需蛋白質(zhì)的提取速率的作用。在所使用的輔助去污劑中，本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員能夠選擇那些能維持使用精氨酸作為提取試劑的優(yōu)點，尤其是所需蛋白質(zhì)的生物活性的保留的去污劑。在這些溫和的輔助去污劑中，可提及的有，例如烷基糖苷如烷基麥芽糖苷，壬基α-或者β-D-吡喃葡糖苷，辛基α-或者β-D-吡喃葡糖苷或烷基氨基甲酰基甲基α-或者β-D-吡喃葡糖苷例如，Hecameg。其毒性非常低，意味著其可在最終產(chǎn)品中以微量存在作為配方試劑。
為了實施從細胞碎片沉淀的懸液中提取所需蛋白質(zhì)，優(yōu)選使用含有濃度為0.4M至2.5M的精氨酸的緩沖溶液，特別是在鹽存在下獲得2.5M精氨酸濃度是可能的。
而且，發(fā)現(xiàn)如果將精氨酸以比從商品蛋白質(zhì)水解液制造的培養(yǎng)基中含有的精氨酸濃度高得多并且能滿足所使用菌株對精氨酸的需求的非常規(guī)濃度加入時，對分泌的重組周質(zhì)蛋白質(zhì)的產(chǎn)率帶來非常有利的影響。
此外，發(fā)現(xiàn)如果加到培養(yǎng)基中的精氨酸濃度為2克/升到10克/升之間時，由精氨酸發(fā)揮的有利影響尤其可觀。
因此，根據(jù)另一方面，本發(fā)明的主題是培養(yǎng)一種原核微生物的方法，該微生物已用含有編碼所需蛋白質(zhì)的基因的表達載體進行轉(zhuǎn)化，該培養(yǎng)方法包括在濃度相等于或至少為2克/升，尤其是濃度為2克/升到10克/升之間的精氨酸存在時培養(yǎng)所述微生物。
本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員對于各個特定的情況將會找到最佳的精氨酸濃度。
該方法特別適用于生產(chǎn)具有細胞因子類型活性的蛋白質(zhì)特別是IL-13，如文獻EP-A1-0.506，574描述的。
下文中借助實施例對本發(fā)明進行更詳細的描述，所給出的實施例僅是為了描述本發(fā)明。
實施例1在精氨酸存在下從大腸桿菌細胞沉淀中提取周質(zhì)IL-13。
1/培養(yǎng)瓶培養(yǎng)在本實施例中，使用了根據(jù)本發(fā)明方法獲得的P922質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌RB791菌株(Roger Brent，PNAS78(1981)pp.4204-4208)，該p922質(zhì)粒類似于歐洲專利EP360,641和356,335中定義的質(zhì)粒，并且其DNA序列是SEQ ID No.1的序列。
下文中顯示了組成該p922質(zhì)粒的不同序列。
啟動子序列粗體字顯示了大腸桿菌中的啟動子所特有的六個核苷酸TTGCTT和TATAATXhoI1 TCGAGTGGGT TTGAGGCGAT CACACTTCTG TTAACGCAGA ACCTAAACGC51ATCTCGACTG CACGGTGCAC CAATGCTTCT GGCGTCAGGC AGCCATCGGA101 AGCTGTGGTA TGGCTGTGCA GGTCGTAAAT CACTGCATAA TTCGTGTCGC151 TCAAGGCGCA CTCCCGTTCT GGATAATGTT TTTTGCGCCG ACATCATAAC-35201 GGTTCTGGCA AATATTCTGA AATGAGCTGT TTCGAGCTGA CTGACTGTTG-10251 CTTATATTAC ATCGATAGCG TATAATGTGT GG信使的未轉(zhuǎn)譯5′-引物區(qū)的序列粗體字顯示了核糖體結(jié)合位點。在該序列的3-引物端定位的CAT序列是由NdeI限制性酶識別的六個核苷酸的一部分。
RBS283 AATTGTGAGC GGATAACAAT TTCACACAGT TTTCGCGAA GAAGGAGATA333 TACAT編碼IL-13前體的序列用斜體描述的序列對應(yīng)于成熟IL-13的序列。未用粗體字書寫的序列是，將編碼IL-13的序列的末端與由限制性酶BamHI識別的六個核苷酸相連接的接頭序列。338 ATGAAAAAGA TCCTGGCGTT AGCTGCGCTG ACTACCGTTG TATTCTCTGC388 GTCCGCCTTC GCTGGCCCTG TGCCTCCCAG TACTGCCCTC AGCGAGCTCA438 TTGAGGAGCT GGTCAACATC ACCCAGAACC AGAAGHCTCC GCTCTHCAAT488 GGCAGCATGG TATGGAGCAT CAACCTGACA GCTGGCATGT ACTGTGCAGC538 CCTGGAATCC CTGATCAACG TGTCAGGCTG CAGTGCCATC GAGAAGACCC588 AGAGGATGCT GAGCGGATTC TGCCCGCACA AGGTCTCAGC TGGGCAGTTT638 TCCAGCTTGC ATGTCCGAGA CACCAAAATC GAGGTGGCCC AGTTTGTAAA688 GGACCTGCTC TTACATTTAA AGAAACTTTT TCGCGAGGGA CGGTTCAACT738 GAAACTTCGA AAGCATCATT ATTTG終止序列763 GGATCCGGCT GCTAACAAAG CCCGAAAGGA AGCTGAGTTG GCTGCTGCCA噬菌體T7基因10終止子813 CCGCTGAGCA ATAACTAGCA TAACCCCTTG GGGCCTCTAA ACGGGTCTTGHindIII863 AGGGGTTTTT TGCTGAAAGG AGGAACTATA TCCGGATGTA CCAAGCTTGG913 CCGGATCAAA GTTTTGTCGT CTTTCCAGAC GTTAGTAAAT GAATTTTCTG963 TATGAGGTTT TGCTAAACAA CTTTCAACAG TTTCAGCGGA GTGAGAATAG噬菌體fd終止子1013 AAAGGAACAA CTAAAGGAAT TGCGAATAAT AATITYFYCA CGTTGAAAAT1063 CTCCAAAAAA AAAGGCTCCA AAAGGAGCCT TTAATTGTAT CGGTTTATCA1113 GCTTGCTITC GAGGTGAATT TCTTAAACAG CTTGATACCG ATAGTTGCGC1163 CGACAATGAC AACAACCATC GCCCACGCAT AACCGATATA TTCGGTCGCT1213 GAGGCTFGCA GGGAGTCAAA GGCCGCTTTT GCGGGATCGA T
編碼乳糖操縱子阻遏物的基因1254 CCGCGGAAGC ATAAAGTGTA AAGCCTGGGG TGCCTAATGA GTGAGCTAAC1304 TCACATTAAT TGCGTTGCGC TCACTGCCCG CTTTCCAGTC GGGAAACCTG1354 TCGTGCCAGC TGCATTAATG AATCGGCCAA CGCGCGGGGA GAGGCGGTTT1404 GCGTATTGGG CGCCAGGGTG GTTTTTCTTT TCACCAGTGA GACGGGCAAC1454 AGCTGATTGC CCTTCACCGC CTGGCCCTGA GAGAGTTGCA GCAAGCGGTC1504 CACGCTGGTT TGCCCCAGCA GGCGAAAATC CTGTTTGCTG GTGGTTAACG1554 GCGGGATATA ACATGAGCTG TCTTCGGTAT CGTCGTATCC CACTACCGAG1604 ATATCCGCAC CAACGCGCAG CCCGGACTCG GTAATGGCGC GCATTGCGCC1654 CAGCGCCATC TGATCGTTGG CAACCAGCAT CGCAGTGGGA ACGATGCCCT1704 CATTCAGCAT TTGCATGGTT TGTTGAAAAC CGGACATGGC ACTCCAGTCG1754 CCTTCCCGTT CCGCTATCGG CTGAATTTGA TTGCGAGTGA GATATTTATG1804 CCAGCCAGCC AGACGCAGAC GCGCCGAGAC AGAACTTAAT GGGCCCGCTA1854 ACAGCGCGAT TTGCTGGTGA CCCAATGCGA CCAGATGCTC CACGCCCAGT1904 CGCGTACCGT CTTCATGGGA GAAAATAATA CTGTTGATGG GTGTCTGGTC1954 AGAGACATCA AGAAATAACG CCGGAACATT AGTGCAGGCA GCTTCCACAG2004 CAATGGCATC CTGGTCATCC AGCGGATAGT TAATGATCAG CCCACTGACG2054 CGTTGCGCGA GAAGATTGTG CACCGCCGCT TTACAGGCTT CGACGCCGCT2104 TCGTTCTACC ATCGACACCA CCACGCTGGC ACCCAGTTGA TCGGCGCGAG2154 ATTTAATCGC CGCGACAATT TGCGACGGCG CGTGCAGGGC CAGACTGGAG2204 GTGGCAACGC CAATCAGCAA CGACTGTTTG CCCGCCAGTT GTTGTGCCAC2254 GCGGTTGGGA ATGTAATTCA GCTCCGCCAT CGCCGCTTCC ACTTTTTCCC2304 GCGTTTTCGC AGAAACGTGG CTGGCCTGGT TCACCACGCG GGAAACGGTC2354 TGATAAGAGA CACCGGCATA CTCTGCGACA TCGTATAACG TTACTGGTTT2404 CACATTCACC ACCCTGAATT GACTCTCTTC CGGGCGCTAT CATGCCATAC2454 CGCGAAAGGT TTTGCGCCAT TCGATCTACG CCGGACGCAT CGTGGCCGCA2504 AApBR 327的序列PflmI2506 CCAACCCTTG GCAGAACATA TCCATCGCGT CCGCCATCTC CAGCAGCCGC2556 ACGCGGCGCA TCTCGGGCCG CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AGGCTCCGCC2606 CCCCTGACGA GCATCACAAA AATCGACGCT CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC2656 CCGACAGGAC TATAAAGATA CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT2706 GCGCTCTCCT GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC2756 TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG CTTTCTCAAT GCTCACGCTG TAGGTATCTC2806 AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC2856 CGTTCAGCCC GACCGCTGCG CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA2906 ACCCGGTAAG ACACGACTTA TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG2956 ATTAGCAGAG CGAGGTATGT AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG3006 GCCTAACTAC GGCTACACTA GAAGGACAGT ATTTGGTATC TGCGCTCTGC3056 TGAAGCCAGT TACCTTCGGA AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA3106 CAAACCACCG CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT GTTTGCAAGC AGCAGATTAC3156 GCGCAGAAAA AAAGGATCTC AAGAAGATCC TTTGATCTTT TCTACGGGGT3206 CTGACGCTCA GTGGAACGAA AACTCACGTT AAGGGATTTT GGTCATGAGA3256 TTATCAAAAA GGATCTTCAC CTAGATCCTT TTAAATTAAA AATGAAGTTT3306 TAAATCAATC TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT3356 GCTTAATCAG TGAGGCACCT ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TCGTTCATCC3406 ATAGTTGCCT GACTCCCCGT CGTGTAGATA ACTACGATAC GGGAGGGCTT3456 ACCATCTGGC CCCAGTGCTG CAATGATACC GCGAGACCCA CGCTCACCGG3506 CTCCAGATTT ATCAGCAATA AACCAGCCAG CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA3556 AGTGGTCCTG CAACTTTATC CGCCTCCATC CAGTCTATTA ATTGTTGCCG3606 GGAAGCTAGA GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC AACGTTGTTG3656 CCATTGCTGC AGGCATCGTG GTGTCACGCT CGTCGTTTGG TATGGCTTCA3706 TTCAGCTCCG GTTCCCAACG ATCAAGGCGA GTTACATGAT CCCCCATGTT3756 GTGCAAAAAA GCGGTTAGCT CCTTCGGTCC TCCGATCGTT GTCAGAAGTA3806 AGTTGGCCGC AGTGTTATCA CTCATGGTTA TGGCAGCACT GCATAATTCT3856 CTTACTGTCA TGCCATCCGT AAGATGCTTT TCTGTGACTG GTGAGTACTC3906 AACCAAGTCA TTCTGAGAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTTGCC3956 CGGCGTCAAC ACGGGATAAT ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG4006 CTCATCATTG GAAAACGTTC TTCGGGGCGA AAACTCTCAA GGATCTTACC4056 GCTGTTGAGA TCCAGTTCGA TGTAACCCAC TCGTGCACCC AACTGATCTT4106 CAGCATCTTT TACTTTCACC AGCGTTTCTG GGTGAGCAAA AACAGGAAGG4156 CAAAATGCCG CAAAAAAGGG AATAAGGGCG ACACGGAAAT GTTGAATACT4206 CATACTCTTC CTTTTTCAAT ATTATTGAAG CATTTATCAG GGTTATTGTC4256 TCATGAGCGG ATACATATTT GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG4306 GTTCCGCGCA CATTTCCCCG AAAAGTGCCA CCTGACGTCT AAGAAACCAT4356 TATTATCATG ACATTAACCT ATAAAAATAG GCGTATCACG AGGCCCTTTC4406 GTCCC
質(zhì)粒pBR327描述于Gene，9,287～305(1980)。
在含有100mg/升氨芐青霉素的L培養(yǎng)基(Luria肉湯培養(yǎng)基，描述于Molecular Cloning，A Laboratory ManualSambrook，F(xiàn)ritsch，Maniatis；Cold Spring Harbor Laboratroy Press，2nd edition 1989)上，以200rpm的轉(zhuǎn)速在30℃將大腸桿菌RB791/p922菌株預(yù)培養(yǎng)過夜。將該預(yù)培養(yǎng)物進一步接種到含L培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，使起始OD值(OD＝在600nm處測得的光密度值，OD＝1時對應(yīng)于每升中含有400-450mg的生物量)為0.6。在接種一小時之后，用1mM IPTG(異丙基β-D-1-半乳糖呋喃糖硫苷)誘導(dǎo)該培養(yǎng)物并且連續(xù)培養(yǎng)3小時。將該細菌懸液的樣品離心并將由此回收到的細菌沉淀懸浮于下面的提取緩沖液中，以便使提取時最后的OD值達到10，這相當于每升中含有4.5克生物量。
本實施例中使用如下所述提取緩沖液A溶于Milli-Q水(Millipore)中的0.8M精氨酸，用HCl將pH校正到8.0。
B溶于Milli-Q水中的5M鹽酸胍，未進行pH校正，提取是在4℃，溫和磁攪拌條件下進行1小時。
為了檢測提取效率，取出1ml光密度OD為0.2的培養(yǎng)物懸液樣品，并且以5,000g將該樣品離心10分鐘獲得相應(yīng)的細菌沉淀，將該沉淀用SDS變性后加到16.5％聚丙烯酰胺凝膠上電泳。再將細菌懸液離心，通過超過濾(Millipore Ultrafree-MC過濾裝置，其截留臨界值為5,000Da)將上清液脫鹽，然后加到凝膠上。利用抗-CHO IL-13抗體進行Western印跡分析肉眼觀察凝膠本身，并且用Phosphor ImagerR(Molecular Dynamics)定量分析。本實施例中使用的抗-CHO(中國倉鼠卵巢)IL-13抗體是免疫接種兔獲得的。
在本實施例中發(fā)現(xiàn)，對于成熟形式在鹽酸胍存在下或者換種方式在精氨酸存在下的提取過程事實上是圓滿的，在兩種情況下其提取產(chǎn)率均高于99％。還注意到在精氨酸存在下從上清液提取時沒有看到IL-13的前體形式，這與在鹽酸胍存在下獲得的提取結(jié)果完全不同。
2/發(fā)酵罐培養(yǎng)在含有100mg/升氨芐青霉素的L培養(yǎng)基中接種大腸桿菌RB791/p922菌株，并在30℃攪拌培養(yǎng)到形成預(yù)培養(yǎng)物。取該預(yù)培養(yǎng)物100ml用作為總體積為2.5升的MBR牌發(fā)酵罐的接種物。培養(yǎng)是在1.2升體積培養(yǎng)基中進行的，培養(yǎng)基組成如下所述并且在下文中定義了培養(yǎng)條件。
大腸桿菌RB791/p922的發(fā)酵培養(yǎng)基下面給出的是終體積為1升的配方，其中應(yīng)扣除接種物的體積。
1.溶于700ml的Milli-Q水中
添加Milli-Q水至800ml，在120℃高壓蒸汽滅菌30分鐘。2.在100ml Milli-Q水中通過0.2μm濾膜過濾
在培養(yǎng)期間甘油濃度保持在10到15克/升之間。
3.在誘導(dǎo)時加入
在其他計算方法中并不包括這次加入的體積。*微量元素溶液按照1ml/升的比例使用該溶液。對于終體積為1升的Milli-Q水，下列物質(zhì)溶于800ml水中
加入100ml濃HCl。用Milli-Q水將體積調(diào)至1000ml。
當OD值達到58時，通過加入濃度為1克/升的IPTG激發(fā)IL-13的表達，并繼續(xù)培養(yǎng)5小時。
發(fā)酵罐培養(yǎng)參數(shù)如下pH＝7.4T＝30℃pO2＝40mmHg，通過攪拌調(diào)節(jié)，空氣流速在1到3升/分鐘之間。
所使用的提取方法和檢測生物活性的方法相同于上文第一節(jié)中描述的方法。
發(fā)現(xiàn)在鹽酸胍或另一種方式在精氨酸存在下，對從發(fā)酵罐而不是培養(yǎng)瓶獲得的細菌沉淀進行提取時，對IL-13成熟形式而言事實上是圓滿的，在兩種情況下提取產(chǎn)率均大于97％。
實施例2由此方法提取到的IL-13的生物活性按照上文描述的超過濾方法將實施例1中鹽酸胍或精氨酸存在下獲得的提取物進行脫鹽處理。在經(jīng)過系列稀釋之后，將提取物與依賴于IL-13的B9細胞系的亞克隆接觸。經(jīng)過稀釋的樣品的IL-13活性誘導(dǎo)了B9細胞的生長并測定半增殖的濃度。在接觸3天之后通過加入MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)終止細胞生長并且通過吸收在565nm處產(chǎn)生的藍顏色而用分光光度計檢測。以相對于IL-13標準物的ng/ml值表示IL-13生物活性，該IL-13標準物本身已用待選的國際標準物進行校正，該標準是從根據(jù)N.Vita，Archieves of Biochemistry and Biophysics，1983，225，2，436-445免疫接種兔而獲得的CHO IL-13培養(yǎng)物得到的。
下文表II中顯示了得到的結(jié)果。
表II
上述結(jié)果證明在進行其他后繼的純化操作之前精氨酸提取物的比生物活性大于鹽酸胍提取物中的比生物活性。
實施例3在精氨酸存在下從大腸桿菌細胞沉淀中提取周質(zhì)hGH在含有100mg/升氨芐青霉素的L培養(yǎng)基(Luria肉湯)中將SEBR1250菌株(EP-360，641和EP-356，335)以200rpm速率攪拌，于37℃預(yù)培養(yǎng)過夜。將該培養(yǎng)物再接種于含L培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，以便使起始OD值達0.2。在等待一小時之后，用1mM IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物，并繼續(xù)培養(yǎng)3小時。將細菌懸液的樣品進行離心，將由此獲得的細菌沉淀懸浮于提取緩沖液中，使在提取時的最終OD＝10，這相當于～4.5克生物量/升。
提取條件如下
為了檢測提取效率，取出OD值為0.2，相當于1ml培養(yǎng)懸液樣品，將樣品以5,000g離心10分鐘獲得相應(yīng)的細菌沉淀，在用SDS變性之后加樣品到16.5％聚丙烯酰胺凝膠上。將細菌懸液離心，將其上清加到凝膠上。利用抗-hGH抗體進行Western印跡法肉眼觀察凝膠本身，并用Phosphor Imager(Molecular Dynamics)進行定量分析，所使用的抗-hGH抗體是免疫接種兔獲得的。
對用Pohosphor Imager獲得的譜帶進行分析得出下列結(jié)論，在精氨酸存在下提取大腸桿菌中產(chǎn)生的人周質(zhì)hGH是有效的。在本實施例中，在0.8M精氨酸存在下，pH8.0，T22℃以及在20小時時期內(nèi)可以獲得至少60％產(chǎn)率，而在0.8M精氨酸存在下，pH8.0，T4℃以及在20小時時期內(nèi)可以獲得大于80％的提取產(chǎn)率。
由于hGH是一種疏水蛋白，可以總結(jié)出在精氨酸存在下可方便地提取到在大腸桿菌周質(zhì)中積累的其性質(zhì)有很大變化的重組蛋白質(zhì)。
實施例4在精氨酸存在下從大腸桿菌細胞碎片中提取周質(zhì)IL-131/發(fā)酵罐培養(yǎng)在本實施例中，使用了與實施例1中定義的菌株相類似的大腸桿菌TP2339(EP360，641和EP356，335)菌株，該菌株已用根據(jù)本發(fā)明方法獲得的p922質(zhì)拉轉(zhuǎn)化。
在含有100mg/升氨芐青霉素的L培養(yǎng)基中接種大腸桿菌TP229/p922菌株并在30℃攪拌條件下培養(yǎng)直到形成預(yù)培養(yǎng)物。取預(yù)培養(yǎng)物100ml用于接種到總體積為2.5升的MBR發(fā)酵罐中。培養(yǎng)是在1.2升體積培養(yǎng)基以及下文定義的條件下完成的。
大腸桿菌TP2339/p922的發(fā)酵培養(yǎng)基以終體積為1.2升計算，培養(yǎng)基由1升經(jīng)過高溫蒸汽消毒的相和0.1升其組成描述于下文中的過濾相，以及0.1升上文中定義的預(yù)培養(yǎng)物加入組成的。
1/經(jīng)過高溫蒸汽消毒的相(1000ml)溶解于900ml的Milli-Q水中
用KOH溶液將pH調(diào)至7.4，然后用Milli-Q水加至1000ml。在120℃高壓蒸汽滅菌30分鐘。
2/過濾相(100ml)在無菌條件下通過一個0.2μm膜過濾
在培養(yǎng)期間將葡萄糖濃度維持于5到15克/升之間。
當OD值達到40(每升干物質(zhì)量約16克)時，通過加入濃度為1克/升的IPTG而引發(fā)IL-13的表達，并繼續(xù)進行5小時。培養(yǎng)參數(shù)如下所述用3NHCl和KOH將pH調(diào)節(jié)到7.4T＝37℃pO2由攪拌調(diào)節(jié)為50mbar，空氣流速為1到3升/分鐘2/細菌胞體的回收和研磨以～6400g將1升培養(yǎng)物懸浮液離心20分鐘。將沉淀溶解于相同體積的10mM Tris緩沖液，1mM EDTA，1mg/升胃蛋白酶抑制劑，pH8中，并且用一個螺旋漿形攪拌器進行機械攪拌。
在Manton-Gaulin擠壓器中以700巴的壓力進行2個周期完成研磨。在本實施例中經(jīng)過研磨的制劑可在-80℃貯存。
3/提取在解凍之后，取出5ml OD值相當于75(每升干物質(zhì)為30克)的經(jīng)過研磨的制劑，然后以23,300g離心50分鐘。
將由此得到的沉淀溶于體積為上面起始時使用體積的1/3的0.1mM Tris緩沖液pH7.0中，并且然后用含有精氨酸的溶液將體積調(diào)節(jié)到相等于初始體積，以便使最后精氨酸濃度達到2.5M并且pH為8.0。
對于該實施例，將輔助去污劑(終濃度為20克/升的Hecameg)與精氨酸結(jié)合使用。
以這種方式制備的細胞碎片懸液置于轉(zhuǎn)速為300rpm，4℃的旋轉(zhuǎn)攪拌器中2天。
以23,300g將懸液離心，總共時間為50分鐘，上清液中含有預(yù)期的提取物。
4/生化分析以及生物活性分析a)采用Biorad＂Protein Assay＂方法對總蛋白質(zhì)進行分析。
b)使用實施例1中方法分析重組IL-13。
由此方法提取到的IL-13的產(chǎn)率所獲得的結(jié)果描述于下列表中
在該實施例中發(fā)現(xiàn)在2.5M精氨酸和一種輔助去污劑存在下對細胞碎片進行提取可使提取產(chǎn)率達到約70％。
實施例5在精氨酸存在下IL-13在培養(yǎng)基中的表達在不同濃度的精氨酸存在下在含有100mg/升氨芐青霉素的L培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌RB791/p922。接種1小時之后，加入1mMIPTG激發(fā)誘導(dǎo)作用，并且繼續(xù)培養(yǎng)3小時。
將相當于OD為0.2的1ml培養(yǎng)懸液的細菌沉淀樣品以及相應(yīng)的上清液樣品加到凝膠上電泳，肉眼觀察并按上文描述定量分析。結(jié)果顯示于下面表中
顯然，在實驗條件以及所用的表達系統(tǒng)中-精氨酸濃度為2克/升時周質(zhì)IL-13表達提高，濃度為4克/升時基本上也能提高表達，-在濃度為8克/升時細菌生長速率減慢，-在所述濃度時，精氨酸并不會使IL-13滲泄到上清中。
本發(fā)明所述精氨酸提取方法的價值在于可將蛋白質(zhì)提取物直接用于或經(jīng)過最低程度的處理后用于生物活性檢測試驗。
提取方法的這種簡化作用對重組周質(zhì)蛋白質(zhì)的工業(yè)生產(chǎn)以及對通過以實驗室規(guī)模分析與例如突變蛋白質(zhì)相關(guān)的生物活性而進行篩選都有益處。
與常常用作提取試劑的鹽酸胍截然不同，精氨酸不會侵蝕工業(yè)上使用材料尤其是鋼。再者，精氨酸是非污染性試劑，因而不需要代價昂貴的污水處理過程。
由體內(nèi)獲得的分泌重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)率提高的事實證明在濃度相當于至少2克/升，尤其是濃度為2克/升至10克/升的精氨酸存在下在培養(yǎng)基中表達周質(zhì)蛋白質(zhì)的價值。
序列表(1)綜合資料(i)申請人(A)姓名SANOFI(B)街道32-34 rue Marbeuf(C)城市巴黎(E)國家法國(F)郵編(EIP)75008(G)電話53.77.41.31(H)傳真53.77.42.16(ii)發(fā)明名稱在精氨酸存在下從原核微生物中提取周質(zhì)蛋白質(zhì)的方法(iii)序列數(shù)1(iv)計算機可讀形式(A)媒體類型Floppy軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID No1的資料(i)序列特征(A)長度4400個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞啟動子(B)位置1..282(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞.5′UTR(B)位置283..337(D)其他資料/注釋＝＂信使RNA的未轉(zhuǎn)譯5’區(qū)序列＂(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-RNA(B)位置338..762(D)其他資料/注釋＝＂IL-13前體的編碼序列＂(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞終止子(B)位置763..812(D)其他資料注釋＝＂終止序列＂(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞終止子(B)位置813..1012(D)其他資料/注釋＝＂噬菌體T7基因10終止子＂(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞終止子(B)位置1013..1253(D)其他資料＂/注釋＝＂噬菌體fd終止子＂(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-RNA(B)位置1254..2505(D)其他資料/注釋＝＂編碼乳糖操縱子阻遏物的基因＂(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-RNA(B)位置2506..4410(D)其他資料/注釋＝＂pBR327的序列＂(xi)序列描述SEQ ID No1TCGAGTGGGT TTGAGGCGAT CACACTTCTG TTAACGCAGA ACCTAAACGC ATCTCGACTG 60CACGGTGCAC CAATGCTTCT GGCGTCAGGC AGCCATCGGA AGCTGTGGTA TGGCTGTGCA120GGTCGTAAAT CACTGCATAA TTCGTGTCGC TCAAGGCGCA CTCCCGTTCT GGATAATGTT180TTTTGCGCCG ACATCATAAC GGTTCTGGCA AATATTCTGA AATGAGCTGT TTCGAGCTGA240CTGACTGTTG CTTATATTAC ATCGATAGCG TATAATGTGT GGAATTGTGA GCGGATAACA300ATTTCACACA GTTTTTCGCG AAGAAGGAGA TATACATATG AAAAAGATCC TGGCGTTAGC360TGCGCTGACT ACCGTTGTAT TCTCTGCGTC CGCCTTCGCT GGCCCTGTGC CTCCCAGTAC420TGCCCTCAGG GAGCTCATTG AGGAGCTGGT CAACATCACC CAGAACCAGA AGGCTCCGCT480CTGCAATGGC AGCATGGTAT GGAGCATCAA CCTGACAGCT GGCATGTACT GTGCAGCCCT540GGAATCCCTG ATCAACGTGT CAGGCTGCAG TGCCATCGAG AAGACCCAGA GGATGCTGAG600CGGATTCTGC CCGCACAAGG TCTCAGCTGG GCAGTTTTCC AGCTTGCATG TCCGAGACAC660CAAAATCGAG GTGGCCCAGT TTGTAAAGGA CCTGCTCTTA CATTTAAAGA AACTTTTTCG720CGAGGGACGG TTCAACTGAA ACTTCGAAAG CATCATTATT TGGGATCCGG CTGCTAACAA780AGCCCGAAAG GAAGCTGAGT TGGCTGCTGC CACCGCTGAG CAATAACTAG CATAACCCCT840TGGGGCCTCT AAACGGGTCT TGAGGGGTTT TTTGCTGAAA GGAGGAACTA TATCCGGATG900TACCAAGCTT GGCCGGATCA AAGTTTTGTC GTCTTTCCAG ACGTTAGTAA ATGAATTTTC960TGTATGAGGT TTTGCTAAAC AACTTTCAAC AGTTTCAGCG GAGTGAGAAT AGAAAGGAAC 1020AACTAAAGGA ATTGCGAATA ATAATTTTTT CACGTTGAAA ATCTCCAAAA AAAAAGGCTC 1080CAAAAGGAGC CTTTAATTGT ATCGGTTTAT CAGCTTGCTT TCGAGGTGAA TTTCTTAAAC 1140AGCTTGATAC CGATAGTTGC GCCGACAATG ACAACAACCA TCGCCCACGC ATAACCGATA 1200TATTCGGTCG CTGGAGCTTG CAGGGAGTCA AAGGCCGCTT TTGCGGGATC GATCCGCGGA 1260ACCATAAAGT GTAAAGCCTG GGGTGCCTAA TGAGTGAGCT AACTCACATT AATTGCGTTG 1320CGCTCACTGC CCGCTTTCCA GTCGGGAAAC CTGTCGTGCC AGCTGCATTA ATGAATCGGC 1380CAACGCGCGG GGAGAGGCGG TTTGCGTATT GGGCGCCAGG GTGGTTTTTC TTTTCACCAG 1440TGAGACGGGC AACAGCTGAT TGCCCTTCAC CGCCTGGCCC TGAGAGAGTT GCAGCAAGCG 1500GTCCACGCTG GTTTGCCCCA GCAGGCGAAA ATCCTGTTTG CTGGTGGTTA ACGGCGGGAT 1560ATAACATGAG CTGTCTTCGG TATCGTCGTA TCCCACTACC GAGATATCCG CACCAACGCG 1620CAGCCCGGAC TCGGTAATGG CGCGCATTGC GCCCAGCGCC ATCTGATCGT TGGCAACCAG 1680CATCGCAGTG GGAACGATGC CCTCATTCAG CATTTGCATG GTTTGTTGAA AACCGGACAT 1740GGCACTCCAG TCGCCTTCCC GTTCCGCTAT CGGCTGAATT TGATTGCGAG TGAGATATTT 1800ATGCCAGCCA GCCAGACGCA GACGCGCCGA 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CGTTTCCCCC TGGAAGCTCC 2700CTCGTGCGCT CTCCTGTTCC GACCCTGCCG CTTACCGGAT ACCTGTCCGC CTTTCTCCCT 2760TCGGGAAGCG TGGCGCTTTC TCAATGCTCA CGCTGTAGGT ATCTCAGTTC GGTGTAGGTC 2820GTTCGCTCCA AGCTGGGCTG TGTGCACGAA CCCCCCGTTC AGCCCGACCG CTGCGCCTTA 2880TCCGGTAACT ATCGTCTTGA GTCCAACCCG GTAAGACACG ACTTATCGCC ACTGGCAGCA 2940GCCACTGGTA ACAGGATTAG CAGAGCGAGG TATGTAGGCG GTGCTACAGA GTTCTTGAAG 3000TGGTGGCCTA ACTACGGCTA CACTAGAAGG ACAGTATTTG GTATCTGCGC TCTGCTGAAG 3060CCAGTTACCT TCGGAAAAAG AGTTGGTAGC TCTTGATCCG GCAAACAAAC CACCGCTGGT 3120AGCGGTGGTT TTTTTGTTTG CAAGCAGCAG ATTACGCGCA GAAAAAAAGG ATCTCAAGAA 3180GATCCTTTGA TCTTTTCTAC GGGGTCTGAC GCTCAGTGGA ACGAAAACTC ACGTTAAGGG 3240ATTTTGGTCA TGAGATTATC AAAAAGGATC TTCACCTAGA TCCTTTTAAA TTAAAAATGA 3300AGTTTTAAAT CAATCTAAAG TATATATGAG TAAACTTGGT CTGACAGTTA CCAATGCTTA 3360ATCAGTGAGG CACCTATCTC AGCGATCTGT CTATTTCGTT CATCCATAGT TGCCTGACTC 3420CCCGTCGTGT AGATAACTAC GATACGGGAG GGCTTACCAT CTGGCCCCAG TGCTGCAATG 3480ATACCGCGAG ACCCACGCTC ACCGGCTCCA GATTTATCAG CAATAAACCA 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4380AATAGGCGTA TCACGAGGCC CTTTCGTCCC 4410
權(quán)利要求
1.精氨酸的應(yīng)用，用作為提取重組周質(zhì)蛋白質(zhì)的試劑。
2.提取所需周質(zhì)蛋白質(zhì)的方法，該方法包括1/將來自于原核微生物培養(yǎng)物細胞沉淀懸浮于含有精氨酸的緩沖液中，所述微生物已由含有編碼所述蛋白質(zhì)的基因和該基因在所述微生物的周質(zhì)中表達所需工具的表達載體進行轉(zhuǎn)化；并且2/在由此獲得的細菌懸液的上清液中回收所需蛋白質(zhì)。
3.提取所需周質(zhì)蛋白質(zhì)的方法，該方法包括1/將原核微生物培養(yǎng)物的細胞碎片沉淀懸浮于含有精氨酸的緩沖液中，所述微生物已由含有編碼所述蛋白質(zhì)的基因以及該基因在所述微生物周質(zhì)中表達所需工具的表達載體進行轉(zhuǎn)化；并且2/在由此獲得的細菌懸液上清中回收所需蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述方法，其特征在于含有精氨酸的緩沖溶液是一種堿性水溶液，該溶液含有濃度至少為0.4M的精氨酸。
5.培養(yǎng)原核微生物的方法，所述微生物已由含有編碼所需蛋白質(zhì)的基因的表達載體進行轉(zhuǎn)化，其特征在于該方法包括在濃度至少為2克/升的精氨酸存在下完成培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于培養(yǎng)是在濃度為2克/升到10克/升之間的精氨酸存在下完成的。
全文摘要
本發(fā)明涉及將精氨酸用作為提取重組周質(zhì)蛋白質(zhì)的一種試劑。本發(fā)明進一步涉及提取所需周質(zhì)蛋白質(zhì)的方法，該方法包括(i)將原核微生物培養(yǎng)物的細胞或細胞碎片的沉淀懸浮于含有精氨酸的緩沖溶液中，所述微生物由含有編碼所述蛋白質(zhì)的基因以及在所述微生物周質(zhì)中表達該基因所需工具的表達載體進行轉(zhuǎn)化；以及(ii)在由此獲得的細菌懸液的上清液中回收所需蛋白質(zhì)。
文檔編號C12P21/00GK1142502SQ96105578
公開日1997年2月12日 申請日期1996年1月31日 優(yōu)先權(quán)日1995年1月31日
發(fā)明者R·利果克斯, P·邁頓多, M·西洛米 申請人:薩諾費公司