專利名稱：重組dna病毒和其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞的重組DNA病毒和其制備方法。本發(fā)明還涉及用于制備該重組DNA病毒的攜帶有編碼重組酶識別序列的DNA序列的重組DNA病毒載體。
逆轉(zhuǎn)錄病毒已常用作基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的病毒載體。然而，逆轉(zhuǎn)錄病毒僅被轉(zhuǎn)染到有絲分裂細(xì)胞中并整合到宿主細(xì)胞染色體中，因此，從安全的角度考慮，逆轉(zhuǎn)錄病毒作為病毒載體遇到了問題，特別是在基因治療中。這樣，人們認(rèn)為應(yīng)限制逆轉(zhuǎn)錄病毒作為病毒載體使用。
腺病毒載體是有利的，表現(xiàn)在它在各種動物的培養(yǎng)細(xì)胞中顯示出幾乎100％的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，與逆轉(zhuǎn)錄病毒不同它沒有整合到染色體中正機(jī)制，并且甚至能將基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到具靜止核的活細(xì)胞中?？紤]到這些有利因素，人們認(rèn)為腺病毒載體在轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因的計劃中可應(yīng)用于十分廣泛的領(lǐng)域。因此，在不遠(yuǎn)的將來會實現(xiàn)將腺病毒載體用作基因治療的一種主要方法。
腺病毒載體已廣泛用作基因治療或研究在高度分化細(xì)胞(例如神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞)中表達(dá)的一種方法。就基因治療技術(shù)而言，人們已廣泛研究了體內(nèi)基因治療，其中，通過將在活細(xì)胞中缺損的基因直接注射到細(xì)胞存在和發(fā)揮作用的組織中的方法將該基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞中。在美國，已允許五個研究小組進(jìn)行用體內(nèi)基因治療方法治療患有囊性纖維化的病人的臨床試驗。而且，基因治療研究也已經(jīng)擴(kuò)展到肌肉營養(yǎng)障礙、高脂蛋白血(II型)和腦腫瘤。另一方面，腺病毒載體甚至能將基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到有靜止核的活細(xì)胞中。因此，腺病毒載體已用于將基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到分化的細(xì)胞中，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中，然后進(jìn)行將基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到原代培養(yǎng)細(xì)胞或動物細(xì)胞中的實驗。
綜上所述，將腺病毒載體特別應(yīng)用于基因治療是人們期望的，這是因為該載體能夠經(jīng)直接注射或施用到動物體中使基因表達(dá)，并能使基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到各種分化的或未分化的細(xì)胞(包括神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞)中。
然而，與逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，腺病毒缺乏整合到染色體中的任何正機(jī)制，導(dǎo)致基因在載體中僅出現(xiàn)暫時的表達(dá)。這就是說，表達(dá)僅持續(xù)幾周，最多約2個月。這樣，當(dāng)治療效果需要保持時，腺病毒應(yīng)在長的期限內(nèi)在細(xì)胞中穩(wěn)定存在，以便腺病毒能夠連續(xù)產(chǎn)生插入到其中的外源基因的表達(dá)產(chǎn)物。
最近的研究已揭示出，腺病毒基因組的E2A基因區(qū)對腺病毒在細(xì)胞中的穩(wěn)定性起到不利的影響。
因此，本發(fā)明對解決上述問題已進(jìn)行了廣泛的研究，并已新發(fā)現(xiàn)在腺病毒的E2A基因區(qū)和L3基因區(qū)存在一個特定區(qū)，外源核苷酸可以插入到該區(qū)中。外源核苷酸可以用常規(guī)的方法直接插入到該特定區(qū)中；另外也可以首先向其中插入合適的接頭，以構(gòu)建必需的限制性酶位點，然后將外源核苷酸插入到E2A基因和L3基因之間的所述區(qū)內(nèi)。所述要插入的外源核苷酸可以是編碼多肽的外源基因(在轉(zhuǎn)染到細(xì)胞后，希望在動物細(xì)胞中表達(dá)該多肽)，或者可以是能作為細(xì)胞中天然存在的酶的底物的外源核苷酸。
本發(fā)明也已發(fā)現(xiàn)，通過使用在E2A和L3區(qū)之間具有重組酶識別序列的DNA病毒載體以及能夠在動物細(xì)胞中表達(dá)重組酶基因的重組DNA病毒載體，可以提供在動物細(xì)胞腺病毒基因組中缺失E2A基因區(qū)的腺病毒載體系統(tǒng)。
這里，＂重組酶＂一詞用來指特定的DNA重組酶它能夠識別包含幾十個核苷酸的特定DNA序列，以切割該特定序列，并且能夠交換由此形成的DNA片段以再連接那些片段。由此，制備了一種能夠表達(dá)重組酶的重組腺病毒載體，還制備了另一種在E2A基因區(qū)兩末端相同的方向上攜帶有兩個重組酶識別序列拷貝的重組腺病毒載體。當(dāng)上述兩種腺病毒載體共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中時，其它載體中表達(dá)的重組酶引起兩個重組酶識別序列之間的基因重構(gòu)，以便兩個重組酶識別序列之間的E2A基因區(qū)被切掉成環(huán)狀分子。缺失的E2A基因區(qū)的腺病毒裁體變得比含有E2A基因的原始腺病毒載體明顯地更穩(wěn)定且能有利于基因治療是很有希望的。
已知外源DNA序列可以插入到E2A基因區(qū)的右邊部分，即

圖1所示的E3基因區(qū)，但不知道存在于E2A基因區(qū)左邊部分的可以插入外源DNA序列的特定位點。按照本發(fā)明，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)在E2A基因和L3基因的終止密碼子之間存在一個可插入外源DNA序列的位點。由此，已第一次揭示了將兩種重組酶識別序列插入到腺病毒載體中，使E2A基因區(qū)位于兩者之間，以便不會破壞E2A基因區(qū)的功能，但腺病毒遺傳上具有的增殖功能被保持。
基于上述發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，由此完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的一個目的是構(gòu)建一種重組腺病毒載體系統(tǒng)，其中，被轉(zhuǎn)導(dǎo)到動物細(xì)胞中的腺病毒載體更穩(wěn)定地存在于所述細(xì)胞中，并且在特定位點插入到腺病毒載體中的外源基因因此能被連續(xù)表達(dá)以產(chǎn)生所需產(chǎn)物。本發(fā)明的另一個目的是提供用于基因治療的這樣一個系統(tǒng)。
這樣，本發(fā)明特有的特征如下(1)一種用于轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞的重組DNA病毒，該病毒攜帶有外源基因和調(diào)節(jié)所述外源基因表達(dá)的啟動子，其中E2A基因的功能被全部缺失。
(2)按照(1)的重組DNA病毒，其中所說的DNA病毒是腺病毒。
(3)按照(1)或(2)的重組DNA病毒，其中E2A基因區(qū)的部分或全部被缺失。
(4)按照(1)到(3)的任一重組DNA病毒，其中所說的外源基因和所說的調(diào)節(jié)所述外源基因表達(dá)的啟動子以朝左側(cè)的方向(與E1A和E1B基因自然轉(zhuǎn)錄的方向相反)被插入。
(5)按照(2)到(4)的任一重組DNA病毒，其中所述腺病毒基因組已被缺失包含E1A基因區(qū)在內(nèi)的1.3到9.3％的區(qū)段。
(6)按照(5)的重組DNA病毒，其中所說的外源基因和所說的調(diào)節(jié)該外源基因表達(dá)的啟動子在缺失所述區(qū)段的位點被插入。
(7)按照(6)的重組DNA病毒，其中所說的腺病毒基因組已被進(jìn)一步缺失包含E3基因區(qū)在內(nèi)的79.6到84.8％的區(qū)段。
(8)按照(1)到(7)的任一重組DNA病毒，其中所說的調(diào)節(jié)外源基因表達(dá)的啟動子是包含巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子、雞β-肌動蛋白啟動子、兔β-珠蛋白剪接受體和聚(A)序列的雜交啟動子(CAG啟動子)。
(9)一種用于轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞的重組DNA病毒，該病毒以相同的方向攜帶位于E2A基因區(qū)兩側(cè)的兩個重組酶識別序列。
(10)按照(9)的重組DNA病毒，其中所說的DNA病毒是一種腺病毒。
(11)按照(9)和(10)的重組DNA病毒，其中所說的兩個重組酶識別序列之一位于E2A基因的和L3基因的終止密碼子之間，而不缺失兩種基因聚(A)附加信號的功能。
(12)按照(11)的重組DNA病毒，其中兩個重組酶識別序列的另一個位于腺病毒基因組的從79.6到84.4％的讀框內(nèi)。
(13)按照(9)到(12)的任一重組DNA病毒，其中所說的重組酶是得自大腸桿菌P1噬菌體的重組酶Cre。
(14)按照(9)到(13)的任一重組DNA病毒，其中所說的重組酶序列的每一種是以下描述的DNA序列(SEQ ID NO1)，該DNA序列是作為重組酶Cre底物的Lox P DNA序列。
5＇-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3＇3＇-TATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATA-5′(15)按照(9)到(14)的任一重組DNA病毒，該病毒攜帶外源基因。
(16)按照(15)的重組DNA病毒，該病毒攜帶調(diào)節(jié)所述外源基因表達(dá)的啟動子。
(17)按照(16)的重組DNA病毒，其中所說的外源基因和所說的調(diào)節(jié)所述外源基因表達(dá)的啟動子以朝左側(cè)的方向(與E1A和E1B基因自然轉(zhuǎn)錄的方向相反)被插入。
(18)按照(10)到(17)的任一重組DNA病毒，其中所說的腺病毒基因組已被缺失了包含E1A基因區(qū)在內(nèi)的1.3到9.3％的區(qū)段。
(19)按照(18)的重組DNA病毒，其中所說的外源基因和所說的調(diào)節(jié)該外源基因表達(dá)的啟動子在已缺失所述區(qū)段的位點被插入。
(20)按照(19)的重組DNA病毒，其中所說的腺病毒基因組已被進(jìn)一步缺失了包含E3基因區(qū)在內(nèi)的79.6到84.8％的區(qū)段。
(21)按照(16)到(20)的任一重組DNA序列，其中所說的調(diào)節(jié)外源基因表達(dá)的啟動子是包含巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子、雞β-肌動蛋白啟動子、兔β-珠蛋白剪接受體和聚(A)序列的雜交啟動子(CAG啟動子)。
(22)一種構(gòu)建E2A基因功能完全缺失的重組DNA病毒的方法，該方法包括以下步驟將一種載體(a)和一種重組DNA病毒(b)轉(zhuǎn)導(dǎo)到動物細(xì)胞系中，所說的載體(a)具有插入其中的啟動子、重組酶基因和聚(A)序列，所說的重組DNA病毒(b)攜帶位于E2A基因區(qū)兩側(cè)的以相同方向定位的重組酶識別序列，和切掉位于兩個重組酶識別序列之間的E2A基因區(qū)。
(23)按照(22)的構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的重組DNA病毒(b)是一種腺病毒。
(24)按照(23)的構(gòu)建重組體DNA病毒的方法，其中所說的載體(a)是一種腺病毒。
(25)按照(22)到(24)的任一構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的兩個重組酶識別序列之一位于E2A基因的和L3基因的終止密碼子之間，而并不缺失兩種基因聚(A)附加信號的功能。
(26)按照(22)到(25)的任一構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的重組酶是得自大腸桿菌P1噬菌體的重組酶Cre。
(27)按照(22)到(26)的任一構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的重組酶序列的每一種是作為重組酶Cre底物的Lox P DNA序列(SEQ ID NO1)。
(28)按照(22)到(27)的任一構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的重組DNA病毒(b)攜帶一個外源基因。
(29)按照(28)的構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的重組DNA病毒(b)還攜帶調(diào)節(jié)所述外源基因表達(dá)的啟動子。
(30)按照(29)的構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的外源基因和所說的調(diào)節(jié)該外源基因表達(dá)的啟動子以朝左側(cè)方向(與E1A和E1B基因自然轉(zhuǎn)錄的方向相反)被插入。
(31)按照(24)到(30)的構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的載體(a)和重組DNA病毒(b)的腺病毒基因組已被缺失了包含E1A基因區(qū)在內(nèi)的1.3到9.3％的區(qū)段。
(32)按照(31)的構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的外源基因和所說的調(diào)節(jié)重組DNA病毒(b)的外源基因表達(dá)的啟動子在已缺失了所述區(qū)段的位點處被插入。
(33)按照(32)的構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的重組DNA病毒(b)的腺病毒基因組已被進(jìn)一步缺失包含E3基因區(qū)在內(nèi)的79.6到84.8％的區(qū)段。
(34)按照(29)到(33)的任一構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的調(diào)節(jié)外源基因表達(dá)的啟動子是包含巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子、雞β-肌動蛋白啟動子、兔β-珠蛋白剪接受體和聚(A)序列的雜交啟動子(CAG啟動子)。
(35)按照(22)的構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中E1A基因在載體(a)和重組DNA病毒(b)兩者中的功能已被缺失，其中動物細(xì)胞系是表達(dá)E1A基因的動物細(xì)胞系。
(36)一種用于轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞的重組DNA病毒，該病毒攜帶有插入到E2A基因的和L3基因的終止密碼子之間的外源基因。
圖1概念性地顯示了粘粒pAdex1cw的構(gòu)建。
圖2概念性地顯示了粘粒pAdex1CAwt的構(gòu)建。
圖3概念性地顯示了質(zhì)粒pA60X99的構(gòu)建。
圖4概念性地顯示了質(zhì)粒pA2L60X99的構(gòu)建。
圖5概念性地顯示了質(zhì)粒pA2L3L6099的構(gòu)建。
圖6顯示了從下述實驗獲得的結(jié)果用重組腺病毒Adex2L3LCANLacZ和Adex1CANCre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，回收共轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞，提取其DNA，并用所提取到的DNA作為模板完成聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。其中第1泳道顯示了使用引物(1)和(4)的電泳輪廓圖，第二泳道顯示了使用引物(2)和(3)的電泳輪廓圖。
以下更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
用于本發(fā)明的DNA病毒載體可以是得自DNA病毒(例如在轉(zhuǎn)染到細(xì)胞后僅能在染色體外存在的腺病毒)的任何載體。可以無任何限制地使用這類來源于DNA病毒的載體。這類載體的例子包括腺病毒載體、痘苗病毒載體和乳多空病毒。下文中，本發(fā)明將以腺病毒載體進(jìn)行描述，所述腺病毒載體是轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞的DNA病毒載體的優(yōu)選的例子，它攜帶有一個重組酶基因或一個重組酶識別序列。
用于本發(fā)明的腺病毒是利用動物為天然宿主的腺病毒。特別優(yōu)選的腺病毒是以人為宿主的人腺病毒。人腺病毒基因組是約36kbp的雙鏈線性DNA，并且具有以下所述的獨特的結(jié)構(gòu)DNA鏈在其兩個末端具有約100bp的反向重復(fù)序列，且DNA鏈還具有兩個55K蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)已被從E2B基因產(chǎn)物加工并共價連接到所述DNA鏈兩個末端的每一個的5＇末端上。
用于本發(fā)明的腺病毒的基因組最好是缺失E1基因區(qū)，尤其是E1A基因區(qū)。這是因為經(jīng)缺失與腺病毒致癌性轉(zhuǎn)化活性相關(guān)的E1A基因區(qū)，腺病毒被變成非毒性的，且僅插入到基因組中的外源基因被選擇性地表達(dá)。不需要缺失全部E1A基因區(qū)，但僅缺少部分E1A基因區(qū)，特別是僅在E1A基因區(qū)的1.3到9.3％的區(qū)段)就可達(dá)到以上所述的合乎需求的目的。
而且，本發(fā)明中使用的腺病毒的基因組也可以被缺失E3基因區(qū)。特別是，缺失E3基因區(qū)的76.6到84.8％的區(qū)段是優(yōu)選的。因為該區(qū)段不是復(fù)制腺病毒所必需的。
因此，用于本發(fā)明的腺病毒的特征在于，所述腺病毒在除人胎腎來源的細(xì)胞系(293細(xì)胞系)(其中EA和E1B基因被持續(xù)表達(dá))外的常規(guī)的宿主細(xì)胞中不能增殖。
然而，當(dāng)腺病毒事實上被轉(zhuǎn)染到人或動物中時，在人或動物中也表達(dá)少量的腺病毒蛋白質(zhì)，因為具有類似于E1A蛋白質(zhì)功能的蛋白質(zhì)存在于人或動物細(xì)胞中。已知如此表達(dá)的腺病毒蛋白質(zhì)引起細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，結(jié)果使攜帶病毒DNA的細(xì)胞受到功擊和消滅。這是為什么缺失E1A或E1B的病毒載體僅能暫時表達(dá)外源基因的原因。Yang et al.，Nature Genetics，Vol.7，362-369(1993)指出，缺少E2A基因?qū)ψ柚箷簳r表達(dá)和連續(xù)地保持基因表達(dá)是有效的。在Yang et al.，的方法中，使用了溫度敏感性E2A基因突變株，但當(dāng)施用到動物上時，盡管能在某種程序上抑制E2A基因的表達(dá)，卻不能完全阻止該表達(dá)。為了完全制止E2A基因的表達(dá)功能，可以考慮缺失E2A基因區(qū)。然而，E2A基因的表達(dá)產(chǎn)物是腺病毒基因組復(fù)制必需的，因此，缺失E2A基因的腺病毒即使在293細(xì)胞中也不能增殖。
按照本發(fā)明，將在E2A基因區(qū)兩端攜帶重組酶識別序列的重組腺病毒與表達(dá)重組酶的腺病毒共轉(zhuǎn)染到動物細(xì)胞中。然后，在細(xì)胞中表達(dá)的重組酶以在細(xì)胞中制備缺失E2A基因區(qū)的病毒粒子的方式發(fā)揮作用。至少可從表達(dá)重組酶的腺病毒供給足夠量的E2A基因產(chǎn)物。由此獲得的E2A基因缺失的病毒粒子完全不能表達(dá)E2A基因。明顯地，表達(dá)所需基因的期限因此會大大延長。
E2A基因區(qū)在其右邊具有一個可插入外源序列的位點是公知的。因而，可將重組酶識別序列插入到右邊。在E2A基團(tuán)區(qū)的左邊，選出E2A基因的和L3基因的終止密碼子之間的一特定位點不會阻止轉(zhuǎn)染過的重組腺病毒的增殖。E2A基因區(qū)、L3基因區(qū)和聚(A)-附加信號區(qū)的部分缺失不是優(yōu)選的，因為所形成的重組腺病毒的增殖被阻止。
就用于本發(fā)明的啟動子來說，有動物病毒基因啟動子和動物細(xì)胞基因啟動子。動物病毒基因啟動子的例子包括SV40基因啟動子和腺病毒主要晚期基因啟動子。動物細(xì)胞基因啟動子的例子是胸苷激酶基因啟動子，金屬硫蛋白基因啟動子和免疫球蛋白基因啟動子。本發(fā)明中特別有利的一種啟動子是CAG啟動子。該CAG啟動子是包含巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子、雞β-肌動蛋白啟動子、兔β-珠蛋白剪接受體和得自兔β-珠蛋白的聚(A)序列的一種雜合啟動子。日本專利KOKAI(公開)NO.3(1991)-168087報道該CAG啟動子是一個高效表達(dá)載體。該CAG啟動子可以用限制酶SalI和Hind III從質(zhì)粒pCAGGS(上述說明書第13頁第20行、第20頁第14行和第22頁第1行到第25頁第6行中描述)切下來構(gòu)建。由此構(gòu)建的CAG啟動子可以用于本發(fā)明。
用于本發(fā)明的重組酶是一種特異性DNA重組酶，該酶能夠識別特定的DNA序列，以切割該序列，并交換由此形成的DNA片段，以再連接那些片段。就這樣一種酶來說，有由大腸桿菌噬菌體P1編碼的重組酶Cre。這種酶的底物是噬菌體P1中的lox P DNA序列(在Abreniski et al.，J.Biol.Chem.，1984，259，1509-1514和Hoess et al.，P.N.A.S.，1984，81，1026-1029中描述)。即，lox P DNA序列是重組酶Cre的識別序列。所述重組酶的另一個例子是由得自酵母2μ質(zhì)粒的FLP基因(在James R.Broarch etal.，Cell，29，227-234中描述)編碼的重組酶。此外，也可以使用得自Zyqosaccharomyces rouxii的pSR1質(zhì)粒的重組酶。這種酶被R基因(在Matsuzaki et al.，Molecularand CellularBiology，8，955-962(1988)中描述)編碼。在這些酶中，來源細(xì)菌噬菌體P1的重組酶Cre對本發(fā)明來說是特別優(yōu)選的。
所述重組酶基因(例如，重組酶Cre基因)可以按公知的PCR方法經(jīng)擴(kuò)增細(xì)菌噬菌體P1 DNA中編碼重組酶的基因序列來制備。其它重組酶基因也可用類似的方法經(jīng)PCR方法制備。挑選用于PCR方法的引物，以便能擴(kuò)增編碼重組酶全長序列的基因序列。對常規(guī)方法構(gòu)建重組腺病毒載體來說，提供在其末端帶有合適的限制性位點的引物是優(yōu)選的。
所述重組酶的識別序列通常是幾十個bp的序列。例如，lox P序列由34個bp組成，核苷酸序列已全部被識別(Abremski etal.，J.Biol.Chem.，1984，259，1509-1514和Hoess et al.，P.N.A.S.，1984，81，1026-1029)。因此，可以用常規(guī)方法化學(xué)合成重組酶基因供本發(fā)明使用。
用于本發(fā)明的聚(A)序列不受特別的限制，但來源兔β-珠蛋白的序列是特別優(yōu)選的。
在本發(fā)明中，將核轉(zhuǎn)移信號序列與重組酶基因一道引入到腺病毒載體中是有利的。例如，可以使用SV40的核轉(zhuǎn)移信號。在腺病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后，在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生重組酶。這樣，為了使表達(dá)的重組酶對另一個腺病毒載體中的重組酶識別序列發(fā)揮作用，必須將重組酶轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。如Daniel Kalderon et al.，Cell，39，499-509(1984)中所描述的，核轉(zhuǎn)移信號序列加速重組酶轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。
用于本發(fā)明的外源基因不受特別的限制，只要該基因在以上所述的雜交啟動子(CAG啟動子)或其它啟動子的控制下能被表達(dá)。從實用的角度來看，優(yōu)選的例子包括病人中缺損的正?；颍?，腺苷脫氨酶、肌營養(yǎng)不良蛋白、低密度脂蛋白受體、α-1抗胰蛋白酶、血凝固因子VIII或血凝固因子IX，和半乳糖苷酶α或β；細(xì)胞因子，例如白介素1-12、干擾素-α、β或γ、腫瘤壞死因子-α或β、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、促紅細(xì)胞生成素、生長激素、胰島素、胰島素樣生長激素、神經(jīng)營養(yǎng)因子；非自身抗原基因，例如，異-HLA(HLA-B7)；編碼病毒抗原的核苷酸序列；抗癌基因，例如，P53、RB、WT-1、NM23和NF-1；致癌基因的反義鏈，例如Ras序列；和自殺基因，例如胸苷激酶和胞嘧啶脫氨酶。
可將啟動子、外源基因和聚(A)序列以從上游的順序或以其反向順序插入到重組腺病毒載體中。
下面描述構(gòu)建本發(fā)明的重組腺病毒的方法。
(1)首先描述的是構(gòu)建攜帶以相同的方向位于E2A基因區(qū)兩端的兩個重組酶識別序列、一個啟動子、一個外源基因和一個聚(A)序列的重組腺病毒載體的方法。為方便起見，就使用重組酶Cre為重組酶、lox P為識別序列和Lac Z基因為外源基因的具體實施方案描述該方法。然而，下述方法也可以以基本上類似的方式用于使用其它重組酶、識別序列、啟動子和聚(A)序列的其他實施方案中。(a)粘粒pAdex1CAwt的構(gòu)建①含有CAG啟動子的質(zhì)料pCMwCH31的構(gòu)建用EcoRI消化攜帶CAG啟動子的質(zhì)粒pCAGGS(Niwa et al.，Gene，108，193-200，1990)。然后，用Klenow酶填充消化產(chǎn)物。然后，使用連接酶用SwaI接頭連接DNA片段。用SalI消化所形成的質(zhì)粒。用Klenow酶填充該DNA片段，接著用連接酶與ClaI接頭連接。在用PstI消化如此獲得的質(zhì)粒后，用克列諾酶填充DNA片段成平端，并用連接酶與XhoI接頭連接以獲得含有CAG啟動子的質(zhì)粒pCMwCH31。
在用各自的限制酶消化后，用在瓊脂糖凝肢上進(jìn)行的電泳證實原始限制酶位點的消失和各自插入的接頭。②pAdex1c的構(gòu)建此后描述的實施例1(2)，(i)到(iV)的方法用于構(gòu)建pAdex1c，該方法簡要描述如下制備了以下三個質(zhì)粒含有缺失E1基因區(qū)的腺病毒基因組中左端17％區(qū)段的質(zhì)粒pUAF0-17D。
由向pUC19中插入一個2.8kb片段獲得質(zhì)粒pUAF0-8，所述片段相應(yīng)于腺病毒基因組左端8％區(qū)段，通過用BamHI接頭連接5型腺病毒DNA，然后用HindIII消化制備。
由在HindIII位點向puC19中插入一個3.4kb片段獲得質(zhì)粒pUAF8-17。所述片段相應(yīng)于腺病毒基因組左端的8-17％區(qū)段，由用HindIII消化腺病毒DNA獲得。
然后，將一個得自質(zhì)粒pUAF0-8的454bp BamHI-ClaI片段與一個得自質(zhì)粒pUAF8-17的2.9kb HindIII-ClaI片段連接。將所形成的連接產(chǎn)物在BamHI/HindIII位點插入到pUC19中以獲得質(zhì)粒pUAF0-17D。
此外，用Bst1107和EcoRI消化5型腺病毒DNA以獲得21.6kb片段。另外制備一個得自腺病毒基因組pX2W的6.5kb EcoRI-SalI片段。
另一方面，用Asp718和BamHI消化卡隆粒9-11(I.Saito & G.Stark，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，83，8664-8668，1986)，用克列諾酶填平該DNA片段然后進(jìn)行自身連接。此后，在EcoRI位點插入BamHI接頭，以制備卡隆粒chdRBR7-11。
將質(zhì)粒pUAF0-17的2.9kb BamHI-Bst1107片段、腺病毒基因組的21.6kb Bst1107-EcoRI片段和pX2W的6.5kb EcoRI-SwaI片段與一種DNA片段連接，所述DNA片段是經(jīng)用EcoRI和Ecl36I消化卡隆粒chdRBR7-11獲得的。所形成的連接產(chǎn)物進(jìn)行體外包裝以轉(zhuǎn)染進(jìn)DH5α。從由此獲得的轉(zhuǎn)化體中分離一種攜帶有目標(biāo)片段的轉(zhuǎn)化體，命名為pAdex1c。③盒式粘粒pAdex1cw的構(gòu)建在用ClaI消化后，進(jìn)行乙醇沉淀以重新獲得pAdex1c。將重新獲得的pAdex1c與合成接頭(1)(SEQ ID NO2)混合，所述接頭是5＇末端磷酸化的，并且含有SwaI、ClaI、SalI和NruI位點，如下面的描述合成接頭(1)5＇-CGATTTAAATCGATTGTCGACTCGCGA-3′3＇-TAAATTTAGCTAACAGCTGAGCGCTGC-5′將所述混合物在含有ATP和T4 DNA連接酶的溶液中反應(yīng)過夜使發(fā)生連接。在通過加熱使連接滅活后，用SwaI消化連接產(chǎn)物。經(jīng)過消化，SwaI片斷從具有多個插入其中的接頭的產(chǎn)物切下，獲得僅插入一個接頭的粘粒。接著，將反應(yīng)溶液加到離心柱(Spun column)(Pharmacia Inc.)上以除去從接頭衍生出的小片段。此后，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，經(jīng)自退火環(huán)化，然后經(jīng)體外包裝。經(jīng)用BamHI和NruI同時消化證實從每一集落制備的粘粒DNA的構(gòu)建。當(dāng)以預(yù)期的方向插入時，形成一個483bp片斷，當(dāng)以相反的方向插入時，形成一個464bp片段。這樣證實獲得了目標(biāo)盒式粘粒pAdex1cw，如圖1所示。④盒式粘粒pAdex1pCAw的構(gòu)建用HindIII和ClaI同時消化以上①構(gòu)建的質(zhì)粒pCMwCH31。用克列諾酶將DNA片段填補(bǔ)，并用在5＇末端磷酸化的PmeI接頭連接。在經(jīng)加熱滅活連接酶后，用Psp1406I消化連接產(chǎn)物。經(jīng)過消化，從具有多個插入其中的接頭的產(chǎn)物上切下Psp1406I片段，獲得在DNA片段兩端的每一端插入一個接頭的粘粒。接著，使反應(yīng)溶液進(jìn)行凝膠電泳以切下含有2.3kb DNA片段的凝膠。經(jīng)電泳從凝膠回收DNA片段。接下來用ClaI消化pAdex1cw，加到離心柱(PharmaciaInc.)除去所形成的小片段。使用T4 DNA連接酶將剩下的DNA片段與前述的2.3kb DNA片段連接。在加熱滅活連接酶后，將ClaI加入到系統(tǒng)中以消化由自退火形成的環(huán)狀粘粒。將DNA片段用于體外包裝。
采用BamHI和XhoI同時消化證實從每一集落制備的粘粒DNA的構(gòu)建。當(dāng)插入到預(yù)期的方向上時，形成483bp和4.8kb的兩個片段。當(dāng)以相反的方法插入時，形成2.7kb和2.5kb的兩個片段。這證實獲得了目標(biāo)盒式粘粒pAdex1pCAw。⑤盒式粘粒pAdex1CAwt的構(gòu)建[SAIBO KOGAKU(CellEngineering)，13(8)，759(1994)]在用SwaI消化后，進(jìn)行乙醇沉淀以回收pAdex1pCAw。將回收到的pAdex1pCAw與合成接頭(2)(SEQ ID NO3)混合，所述接頭是5＇末端磷酸化的，并且含有ClaI、XbaI、SpeI、PacI、SwaI和ClaI位點，如下面的描述合成接頭(2)5′-ATCGATTCTAGACTAGTTTAATTAATTTAAATCGAT-3＇3＇-TAGCTAAGATCTGATCAAATTAATTAAATTTAGCTA-5＇將所述混合物在含有ATP和T4 DNA連接酶的溶液中反應(yīng)一夜使發(fā)生連接。在加熱滅活連接酶后，向其中加入20單位PacI進(jìn)行消化。經(jīng)過消化，從具有多個插入其中的接頭的產(chǎn)物切下PacI片段，獲得僅插入一個接頭的粘粒。接著，將反應(yīng)溶液加到離心柱(PharmaciaInc.制造)上以除去從接頭衍生出的小片段。此后，在含有T4 DNA連接酶的溶液中連接過夜，接著經(jīng)自退火環(huán)化。加熱滅活連接酶后，將所形成的產(chǎn)物用于體外包裝。經(jīng)采用XbaI和XhoI同時消化證實從每一集落制備的粘粒DNA的構(gòu)建。當(dāng)以預(yù)期的方向插入時，形成一個522bp片段，當(dāng)以相反的方向插入時，形成一個568bp片段。這樣證實獲得了目標(biāo)盒式粘粒pAdex1CAwt，如圖2所示。(b)插入了loxP的粘粒的構(gòu)建I盒式粘粒pAdex2L3LCAwt的構(gòu)建①質(zhì)粒pA60X99X的制備在用BamHI消化盒式粘粒pAdex1CAwt后，加熱滅活限制酶。然后用T4 DNA連接酶連接所形成的DNA片段過夜。使用這一反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(GIBCO BRL)，并從所形成的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA，以獲得目標(biāo)質(zhì)粒pA60X99X。②質(zhì)粒pA60X99的制備(不同于腺病毒，除去了XbaI位點)。
在用XbaI消化質(zhì)粒pA60X99X后，將反應(yīng)混合物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。切下一段含有23.8kb DNA片段(它僅在兩個XbaI位點中的一個位點上被消化)的凝膠，從電泳凝膠回收該DNA片段。然后，將所述片段用克列諾酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)填補(bǔ)，接著用T4 DNA連接酶連接過夜。用這一反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。從如此獲得的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA。用BsrGI和XbaI同時消化這些質(zhì)粒DNA，獲得6.2bp DNA片段命名為質(zhì)粒pA60X99，如圖3所示。③質(zhì)粒pA2L60X9的制備(loxP插入到BsrGI位點)。
在用XhoI消化質(zhì)粒pULL2r(按下文中描述的方法制備)后，將消化產(chǎn)物的兩端用克列諾酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)填補(bǔ)。用苯酚-氯仿(1∶1)抽提后，接著用乙醇沉淀。經(jīng)離心收集沉淀，溶解在60μl TE緩沖液中。該反應(yīng)混合物在含有ATP和T4 DNA連接酶的連接酶溶液(總終體積為50μl)中與5＇-末端磷酸化的KpnI接頭(Takara Shuzo Co.，Ltd.)混合并反應(yīng)過夜，使其發(fā)生連接。然后用Asp718(Boehringer)消化連接產(chǎn)物。將反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。切下一段含有攜帶loxP的64bp DNA片段的凝膠，通過電泳從凝膠重新獲得所述DNA片段。
以上提到的質(zhì)粒pULL2r按以下方法制備。用限制酶Ecl136II消化質(zhì)粒pUC119(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，接著用堿性磷酸酶處理。然后將pUC119-Ecl136II片段和以下合成DNA片段(SEQID NO4)進(jìn)行連接5＇-CGAACGCGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTCGAGTCG-3＇3＇-GCTTGCGCATATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATAGAGCTCAGC-5＇其中下面劃線的序列表示loxP位點。該合成DNA片段攜帶loxP序列(在其末端具有MluI位點和XhoI位點)，當(dāng)Mlui和XhoI位點被連接時，消化所述序列形成NruI位點。這樣，獲得已插入兩個合成DNA片段的質(zhì)粒pULL2r。
另一方面，用包含在50μl溶液中的50單位的BsrGI消化10μg質(zhì)粒pA60X99。將反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以切下含23.8kb DNA片段的凝膠。通過電泳從凝膠回收DNA片段。使回收的DNA片段和前述的64bp DNA片段(攜帶loxP)在含有ATP和T4 DNA連接酶的溶液中反應(yīng)一夜使其發(fā)生連接。將無菌水和BsrGI活性緩沖劑加入到反應(yīng)混合物中。在經(jīng)70℃溫育10分鐘滅活連接酶后，用BsrGI消化由自退火形成的環(huán)狀pA60X99。用10μl這種反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。從如此獲得的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA。
為了驗證插入的loxP的取向，用ApaI和MluI同時消化質(zhì)粒DNA，并將反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。當(dāng)以預(yù)期的方向插入時，形成366bp和219bp的兩個片段，當(dāng)以相反的方向插入時，形成334bp和251bp的兩個片段。在用NruI消化的情況下，當(dāng)以預(yù)期的方向插入時，形成一個573bp片段，當(dāng)以相反的方向插入時，形成一個533bp片段。而且，在用DraI和KpnI同時消化的情況下，當(dāng)一個loxP以預(yù)期的方向插入時，形成一個320bp片段，當(dāng)兩個loxP序列以預(yù)期的方向插入時，形成一個384bp片段。這樣獲得了符合所有上述三種情況的目的質(zhì)粒，即目標(biāo)質(zhì)粒pA2L60X99(僅一個loxP已以預(yù)期的方向插入其中)，如圖4所示。④質(zhì)粒pA2L3L6099的制備(loxP插入到XbaI位點)在用XhoI于100μl溶液中消化質(zhì)粒pULL2r后，將消化產(chǎn)物的兩端用克列諾酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)填補(bǔ)。用苯酚-氯仿(1∶1)抽提，接著用乙醇沉淀。離心收集沉淀并溶解在TE緩沖劑中。該溶液在含有ATP和T4 DNA連接酶的連接酶溶液(總終體積50μl)中與5＇-末端磷酸化的SpeI接頭(Takara Shuzo Co.，Ltd.)混合和反應(yīng)一夜使其發(fā)生連接。進(jìn)一步加入SpeI進(jìn)行消化后，將反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。切下一段含有64bp DNA片段(攜帶loxP)的凝膠通過電泳從凝膠獲得所述DNA片段。
在用XbaI消化質(zhì)粒pA2L60X99后，將反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。切下一段含有23.8kb DNA的片段，經(jīng)電泳從所述凝膠重新獲得所述DNA片段。將這種DNA片段在含有ATP和T4 DNA連接酶的連接溶液中與前述的攜帶loxP的64bp DNA片段反應(yīng)一夜使其發(fā)生連接。在加熱滅活連接酶后，用XbaI處理連接產(chǎn)物以消化由自退火形成的環(huán)狀pA2L60X99。用這一反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。從如此獲得的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA。
為了驗證插入的loxP的取向，用BglII和MluI同時消化上述質(zhì)粒DNA。將反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。當(dāng)以預(yù)期的方向插入時，形成366bp和503bp的兩個片段，當(dāng)以相反的方向插入時，形成398bp和471bp的兩個片段。在用ApaI和MluI同時消化的情況下，當(dāng)以預(yù)期的方向插入時形成一個660bp的片段，當(dāng)以相反的方向插入時形成一個628bp的片段。另外，在用EcoNI和MluI同時消化的情況下，當(dāng)以預(yù)期的方向插入時形成一個311bp的片段，當(dāng)以相反的方向插入時形成一個343bp的片段。此外，在用HpaI和SacI同時消化的情況下，當(dāng)一個loxP以預(yù)期的方向插入時形成一個397bp的片段，當(dāng)兩個loxP序列以相反的方向插入時形成一個461bp的片段如此獲得了符合所有上述四種情況的目標(biāo)質(zhì)粒，即目標(biāo)質(zhì)粒LpA2L3L6099(僅一個loxP已以預(yù)期的方向插入其中)。如圖5所示。⑤盒式質(zhì)粒pAdex2L3LCAwt的構(gòu)建在用Csp45I(Toyobo Co.，Ltd.)，然后相繼用BamHI和用EcoRI在反應(yīng)溶液中消化盒式粘粒pAdex1CAwt后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以進(jìn)行檢驗。切下一段含有21kb DNA片段的凝膠，經(jīng)電泳從所述凝膠回收所述DNA片斷。當(dāng)回收的21kb BamHI-DNA片段時，用Csp45I和EcoRI進(jìn)行消化以防沾污其它片段。
在用BamHI消化質(zhì)粒pA2L3L6099后，用苯酚一氯仿(1∶1)抽提DNA片斷。使用葡聚糖凝膠G25(已事先用TE平衡)將水層進(jìn)行凝膠過濾。使所述回收到的DNA片段在含有ATP和T4 DNA連接酶的溶液中與前述的21kb DNA片段連接過夜。在加熱滅活連接酶后，盒式粘粒用于體外包裝。
這就是說，一份盒式粘粒用Gigapack XL試劑盒(StratageneCo.，Ltd.)進(jìn)行體外包裝。剩下的粘粒在-80℃下凍干。因為Gigapack XL試劑盒對42kb或更小的粘粒提供低的包裝效率，所以該試劑盒可以在某種程度上選擇由于包含插入序列，變得更大的粘粒。在本發(fā)明中，在挑出的10個集落中，它們中的大多數(shù)包含插入序列。因此，可以容易地獲得目標(biāo)克隆(即，病毒基因組已與其恰當(dāng)?shù)剡B接的克隆)。用Izumu Saito，et al.，JIKKEN IGAKU(Experimental Medicine)，7，183-187(1989)中所述的常規(guī)方法處理所述的粘粒。
將包裝完的粘粒轉(zhuǎn)染進(jìn)大腸肝茵DH5α(GIBCO BRL)。即，將粘粒以各種濃度接種到每-Ap+瓊脂板(補(bǔ)充了氨芐青霉素)和Ap+LB(池)，接著溫育過夜。從池中抽提并制備小量制備出的DNA，用來經(jīng)限制酶DraI消化后檢測具有插入序列的粘粒的比率。將集落連帶瓊脂板一起挑出，在Ap+LB中培養(yǎng)一夜以制備小量DNA。接著用DraI消化證實從每一集落制備的粘粒的結(jié)構(gòu)。當(dāng)以預(yù)期的取向插入時，形成一個891bp片段。當(dāng)以相反的取向插入時，形成一個1.4kb片斷。按照這一方法，獲得了目標(biāo)盒式粘粒pAdex2L3LCAwt。
即，用NruI和連接酶制備一種攜帶表達(dá)單位但缺失大多數(shù)腺病毒DNA的質(zhì)粒，然后從該質(zhì)粒制備一個DNA片段，用于cDNA克隆的最終證實。(C)插入loxP的粘粒的構(gòu)建II盒式粘粒pAdex2L3LCAwt的構(gòu)建①質(zhì)粒pUCA6065的制備在用BbmHI和PstI消化pA60X99后，將反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以切下一段含有1.7kb的攜帶BsrGI位點的DNA片段的凝膠。通過電泳從這一凝膠回收所述DNA片段。以類似的方法用BamHI和PstI消化pUC19以重新獲得一個2.7kb DNA片段。然后，將兩種片段加到緩沖劑中用于連接反應(yīng)，進(jìn)一步向其中加入ATP和T4 DNA連接酶。將反應(yīng)進(jìn)行過夜使其發(fā)生連接。用該反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，從所形成的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA，以獲得目標(biāo)質(zhì)粒pUCA6065。②質(zhì)粒p2LA6065的制備用BamHI和AflIII消化質(zhì)粒pUCA6065以制備一個780bp的DNA片段。另外，用BamHI和BsrGI消化相同的質(zhì)粒以制備一個3.6kb的DNA片段。將這兩種片段與如下所示的攜帶loxP的接頭DNA(SEQID NO11)混合。5’-CATGTAATTT AAATCTCGAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATACGCGT3’-ATTAAA TTTAGAGCTC TATTGAAGCA TATTACATAC GATATGCTTC AATATGCGCAATTTAAATGT AAAAATAATG TACTAGAGAC ACTTTCAATA AAGGCAAATG CTTTTATTT-3′TAAATTTACA TTTTTATTAC ATGATCTCTG TGAAAGTTAT TTCCGTTTAC GAAAATAAAC ATG-5′將混合物加入到緩沖劑中用于連接反應(yīng)，進(jìn)一步向其中加入ATP和T4連接酶。使反應(yīng)進(jìn)行過夜使其發(fā)生連接。用該反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，從所形成的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA。這樣獲得了一個接頭DNA已插入其中的目標(biāo)質(zhì)粒p2LA6065。③粘粒pA2LA3L6099的制備用BamHI和SfiI(或BglI)消化質(zhì)粒p2LA6065，以制備一個1.5kb的DNA片段。另外，用BamHI和SfiI消化質(zhì)粒pA2L3L6099，以制備約22kb的DNA片段。將這兩種片段加入到緩沖劑中用于連接反應(yīng)，進(jìn)一步向其中加入ATP和T4 DNA連接酶。使反應(yīng)進(jìn)行過夜使其發(fā)生連接，用該反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并從所形成的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA。這樣獲得了目標(biāo)粒pA2LA3L6099。④盒式粘粒pAdex2LA3LCAwt的構(gòu)建以類似于以上(b)⑤所述的構(gòu)建pAdex2L3LCAwt的方式從pA2LA3L6099和pAdex1CAwt構(gòu)建粘粒pAdex2LA3LACAwt。(d)插入loxP的粘粒的構(gòu)建III盒式粘粒pAdex2LD3LD3LCAwt的構(gòu)建①質(zhì)粒pHSGA6065的制備在用BamHI和PstI消化pA60X99后，將反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。切下一段含有1.7kb的攜帶BsrGI位點的DNA片段的凝膠。經(jīng)電泳從所述凝膠上回收所述DNA片段。用BamHI和PstI消化質(zhì)粒pHSG299(Takara Shuzo Co.，Ltd.)。以類似的方式重新獲得一個2.7kb的DNA片段。然后，將兩種片段加到緩沖劑中用于連接酶反應(yīng)，向其中再加入ATP和T4 DNA連接酶。將反應(yīng)進(jìn)行過夜使其發(fā)生連接。用該反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并從所形成的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA，以獲得目標(biāo)質(zhì)粒pHSGA6065。②質(zhì)粒p2LD6065的制備用BsrGI和DraI消化質(zhì)粒pHSGA6065，以制備一個4.4kb的DNA片段。將該片段與以下所示的攜帶loxP的接頭DNA(SEQ ID NO12)混合5’-GTACACTCTC GGGTGATTAT TTACCCCCAC CCTTGCCGTC TGCGCCGATT TAAATCTCGA3’-TGAGAG CCCACTAATA AATGGGGGTG GGAACGGCAG ACGCGGCTAA ATTTAGAGCTGATAACTTCG TATAATGTAT GCTATACGAA GTTATACGCG TATTTAAATC CGTTT-3’CTATTGAAGC ATATTACATA CGATATGCTT CAATATGCGC ATAAATTTAG GCAAA-5’將反應(yīng)混合物加到緩沖劑中用于連接酶反應(yīng)，向其中再加入ATP和T4 DNA連接酶。將反應(yīng)進(jìn)行過夜使其發(fā)生連接。用該反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并從得到的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA。由此獲得了其中已插入一個DNA接頭的目標(biāo)質(zhì)粒p2LD6065。③質(zhì)粒pA2LD3L6099的制備用BamHI和SfiI(或BglI)消化質(zhì)粒p2LD6065以制備一個1.5kb的DNA片段。另外，用BamHI和SfiI消化質(zhì)粒pA2L3L6099以制備約22kb的DNA片段。將兩種片段加入到緩沖劑中用于連接酶反應(yīng)，向其中再加入ATP和T4 DNA連接酶。將反應(yīng)進(jìn)行過夜使其發(fā)生連接。用該反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并從所形成的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA。如此獲得了目標(biāo)質(zhì)粒pA2LD3L6099。④盒式粘粒pAdex2LD3LCAwt的構(gòu)建以類似于以上(b)⑤所述的構(gòu)建pAdex2L3LCAwt的方式從pA2LD3L6099和pAdex1CAwt構(gòu)建粘粒質(zhì)粒pAdex2LD3LACAwt。(e)腺病毒DNA-末端蛋白復(fù)合物(Ad5 dlX DNA-TPC和Adex1CANLacZ DNA-TPC)的制備①使用Ad5dlX(I.Saito et al.，J.Virology，Vol.54，711-719(1985))或Adex1CANLacZ作為腺病毒DNA。將Ad5 dlXDNA-TPC和Adex1CANLacZ分別轉(zhuǎn)染進(jìn)Hela細(xì)胞(以10 Roux管的量)和293細(xì)胞，接著培養(yǎng)。
即，以0.2ml/Roux管的量轉(zhuǎn)染Ad5-dlX或Adex1CANLacZ的病毒溶液(～109Pfu/ml)。3天后將細(xì)胞去膜并離心收集。大多數(shù)腺病毒粒子不存在于培養(yǎng)基中而存在于細(xì)胞核中。因此，該病毒易于從感染細(xì)胞純化。
在無菌狀態(tài)下進(jìn)行下列過程。
②將如此獲得的細(xì)胞懸浮在Tris-HCl(PH8.0)中，用封閉型超聲波發(fā)生器進(jìn)行超聲波處理，以殺滅細(xì)胞從而釋放出病毒。
③在經(jīng)離心除去由此獲得的細(xì)胞碎片后，將上清液覆蓋于裝在超速離心機(jī)SW28管中的氯化銫溶液(比重為1.43)上。接著用墊層離心法進(jìn)行濃縮。
④將界面下緊靠界面的病毒層轉(zhuǎn)移到SW50.1管中。一般來說，界面下緊靠界面的病毒層是肉眼可見的。收集含有病毒層和其下面的層的5ml氯化銫溶液。同時，另一支管裝滿氯化銫溶液(比重為1.34)將這些管于35krpm、4℃下離心過夜。收集如此形成的表明病毒存在的白色帶，并轉(zhuǎn)移到事先形成梯度的管中。將該管進(jìn)一步在35krpm，4℃下超離心4小時。
⑤收集表明病毒存在的白色帶，并以相同的量與8M鹽酸胍混合。此外，將鹽酸胍飽和的氯化銫加入到混合物中。所形成的混合物裝入到VTi65管中。用4M鹽酸胍使顆粒蛋白變性以引起分解，從而釋放出DNA-TPC復(fù)合物。
⑥將以上所述的管以55krpm，15℃下超離心一夜，接著以0.2ml分級分離。從每一級餾份中取出1μl，與1μg/ml溴化乙錠水溶液混合，用熒光染色證實DNA存在或不存在。收集含有DNA的兩或三個級份。
⑦所述級份對500ml TE透析過夜兩次，然后在-80℃下貯存。以測定DNA的常規(guī)方法據(jù)OD260值測定如此獲得的Ad5dlX DNA-TPC復(fù)合物或Adex1CANLacZ DNA-TPC復(fù)合物的量。
⑧以足量的AgeI消化所形成的Ad5dlX DNA-TPC復(fù)合物或Adex1CANLacZ DNA-TPC復(fù)合物2小時。在經(jīng)葡聚糖凝膠G25柱的凝膠過濾后，將該復(fù)合物在-80℃下貯存，用于按以下步驟構(gòu)建攜帶loxP的重組腺病毒。(f)插入loxP的重組腺病毒的制備通過將SV40的核轉(zhuǎn)移信號序列加入到大腸桿菌LacZ基因的5＇-末端獲得NLacZ基因。
①向直徑為6cm和10cm的每個培養(yǎng)皿中裝入在加有10％FCS的DME中培養(yǎng)過的293細(xì)胞。②-1 Ad5d1X2L3L和Adex2L3LCANLacZ的構(gòu)建在將8μg粘粒pAdex2L3LCAwt DNA(具有l(wèi)oxP和一個導(dǎo)入其中的表達(dá)單位)與1μg事先用AgeI消化過的Ad5dlX DNA-TPC復(fù)合物或1μg事先用AgeI消化過的Ad5dlX DNA-TPC復(fù)合物或1μg事先用AgeI消化過的Adex1CANLacZ混合后，用Celfect試劑盒(Pharmacia)按磷酸鈣方法在6cm培養(yǎng)皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。即，將混合物滴加到6cm培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上，并繼續(xù)培養(yǎng)。
在培養(yǎng)過夜(約16小時)后，第二天早晨交換培養(yǎng)基。然后在當(dāng)天晚上，將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基與含5％FCS的DME一起以0.1ml/孔的量倒入到三個96-孔膠原涂覆板(未稀釋的貯存液、10倍稀釋液和100倍稀釋液)的孔中。為了避免各板之間細(xì)胞計數(shù)上的明顯差異，將從10cm培養(yǎng)皿收獲的293細(xì)胞的1/3加到兩塊稀釋液板的每塊上。②-2 Ad5dlX2LA3L和Adex2LA3LCANLacZ的構(gòu)建在將8μg粘粒pAdex2LA3LCAwt DNA(具有l(wèi)oxP和一個導(dǎo)入其中的表達(dá)單位)與1μg事先用AgeI消化過的Ad5dlX DNA-TPC復(fù)合物或1μg事先用AgeI消化過的Adex1CANLacZ DNA-TPC混合后，用Celfect試劑盒(Pharmacia)按磷酸鈣方法在6cm培養(yǎng)皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。即，將混合物滴加到6cm培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上，并繼續(xù)培養(yǎng)。
在培養(yǎng)一夜(約16小時)后，第二天早晨交換該培養(yǎng)基。然后在當(dāng)天晚上，將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基與含5％FCS的DME一起以0.1ml/孔的量倒入到三個96-孔膠原涂覆板(未稀釋的貯存液、10倍稀釋液和100倍稀釋液)的孔中。為了避免各板之間細(xì)胞計數(shù)上的明顯差異，將從10cm培養(yǎng)皿收獲的293細(xì)胞的1/3加到兩塊稀釋液板的每塊上。②-3 Ad5dlX2LD3L和Adex2LD3LCANLacZ的構(gòu)建在將8μg粘粒pAdex2LD3LCAwt DNA(具有插入的loxP和導(dǎo)入其中的一個表達(dá)單位)與1μg事先用AgeI消化過的Ad5d1X DNA-TPC復(fù)合物或1μg事先用AgeI消化過的Adex1CANLacZ DNA-TPC復(fù)合物混合后，用Celfect試劑盒按磷酸鈣方法在6cm培養(yǎng)皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。即，將混合物滴加到6cm培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上，并繼續(xù)培養(yǎng)。
在培養(yǎng)過夜(約16小時)后，第二天早晨交換培養(yǎng)基。然后在當(dāng)天晚上，將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基與含5％FCS的DME一起以0.1ml/孔的量倒入到三個96-孔膠原涂覆板(未稀釋的貯存液、10倍稀釋液和100倍稀釋液)的孔中。為了避免各板之間細(xì)胞計數(shù)上的明顯差異，將從10cm培養(yǎng)皿收獲的293細(xì)胞的1/3加到兩塊稀釋液板的每塊上。
③3或4天和8或10天后，再向每孔中加入50μl含10％FCS的DME。當(dāng)293細(xì)胞系變薄時，應(yīng)將含10％FCS的DME更早地加入到孔中。
在7-20天可觀察到孔中病毒已增殖且細(xì)胞死亡。含有死細(xì)胞的培養(yǎng)基用無菌的巴氏吸管從細(xì)胞完全死亡的每孔中轉(zhuǎn)移到1.5ml無菌管中。將該管迅速在-80℃下冷凍干燥并貯存。
④在15到25天結(jié)束觀察。從裝有培養(yǎng)基的管中挑選出約10支管，所述培養(yǎng)基含有相對較晚的階段死之的細(xì)胞。在超聲波處理后，在5krpm下離心10分鐘。在-80℃下貯存所得到的上清液，用作第一種子。
在較早的階段病毒已開始增殖的孔預(yù)示著由多種病毒株混合感染的較高的可能性。
⑤將293細(xì)胞系裝入24-孔板中，并將5％FCS-DME(0.4ml/孔)和10μl第一病毒種子加入到孔中。設(shè)置二個重復(fù)。
⑥在約3天細(xì)胞完全死亡時，用類似于上述制備第一病毒種子的方法經(jīng)超聲波處理和離心處理從重復(fù)試驗孔之一獲得上清液。將如此獲得的上清液在-80℃下貯存，用作第二種子。將重復(fù)試驗孔另一孔中的死亡細(xì)胞在5000rpm下離心5分鐘，棄去上清液。將單獨的細(xì)胞在-80℃下貯存(細(xì)胞團(tuán))。收集10種病毒株的所述細(xì)胞團(tuán)，按以下方法從感染細(xì)胞抽提完整DNA。向每一細(xì)胞團(tuán)中加入400μl細(xì)胞DNA的TNE(50mM Tris-HCl，PH7.5，100mM Nacl、10mMEDTA)、4μl蛋白酶K(10mg/ml)和4μl 10％SDS。
⑦在50℃下處理1小時后，用苯酚一氯仿抽提兩次，并用氯仿抽提兩次，然后用乙醇沉淀。將用乙醇沉淀重新獲得的核酸溶解在含有20μg/ml核糖核酸酶的50μl TE中。
在用XhoI(它切開表達(dá)單位并識別含CG的位點)消化15μl溶液后，將消化產(chǎn)物與一種表達(dá)盒式粘粒的XhoI消化產(chǎn)物一起在瓊脂糖凝膠(有約15cm長)上電泳一夜。比較由此獲得的電泳帶型。選擇具有表示兩個插入的loxP序列斷裂模式的帶的克隆，所述序列從用XhoI消化loxP中識別位點產(chǎn)生。棄去給出表示未確定DNA序列的許多帶的克隆，因為有可能克隆被有缺失的病毒沾污。
使用如此獲得的插入3 loxP的重組腺病毒Ad5d1X2L3L、Ad5d1X2LA3L或Ad5d1X2LD3L和攜帶有目標(biāo)外源核苷酸表達(dá)單位的一種粘粒，可以按照構(gòu)建重組腺病毒公知的方法構(gòu)建重組腺病毒，該重組腺病毒已插入了外源基因表達(dá)單位和loxP，所述方法例如，JIKKEN IGAKU BESSATSU(Esperimental Medicine，ExtraIssue)，Bio Manual Series No.4，IDENSHI DONYU-TO-HATSUGEN KAISEKI-HO(Study on Gene Transduction andExpression)，page43-58)中描述的COS-TPC方法。
(g)缺失E2A基因腺病毒的構(gòu)建及其結(jié)構(gòu)的證實將重組腺病毒Adex2L3LCANLacZ和Adex1CANCre分別以10和3的多重性感染轉(zhuǎn)染進(jìn)293細(xì)胞，接著進(jìn)行培養(yǎng)。4天后，回收細(xì)胞，按以上描述的方法制備DNA。由兩種方法(即，以下描述的SmaI消化和PCR)證實所形成的Adexd123CANLacZ具有這樣一種結(jié)構(gòu)，即已切去位于兩個loxP序列之間的包含E2A基因的區(qū)域。
對Adex2LA3LCANLacZ和Adex2LD3LCANlacZ，也可以類似地被證實，這些重組腺病毒具有所期望的結(jié)構(gòu)。1.SmaI消化用SmaI消化接著進(jìn)行凝膠電泳導(dǎo)致切除位于兩個loxP序列之間的區(qū)域，形成一個4.7kb的片段。從比較上述4.7kb片段的帶和4.45kb的帶(通常在Adex2L3LCANLacZ、Adex1CANCre和Adexd123CANlacZ中觀察到的)之間的帶密度，確定在回收的重組腺病毒中Adex123CANLacZ占多少百分比。2.PCR證實用0.1ng制備的DNA作為模板，在常規(guī)條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)。將產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。使用的引物優(yōu)選地是寡核苷酸(1)(SEQ ID NO5)、寡核苷酸(2)(SEQ ID NO6)、寡核苷酸(3)(SEQ ID NO7)和寡核苷酸(4)(SEQ ID NO8)，如下所示寡核苷酸(1)5＇-CAACTCCATGCTCAACAGTCCCCAGGTACA-3′
寡核苷酸(2)5＇-GATTTTTAAACGGCGCAGACGGCAAG-3′寡核苷酸(3)5＇-GTGAGCTTAGAAAACCCTTAG-3＇寡核苷酸(4)5＇-AGATACCCCTTTTGCACTGGTGCAAGTTAAC-3′就PCR的反應(yīng)溶液來說，優(yōu)選地是包含50mMKCl、1.5mM MgCl2、0.2mM dNTP混合物和0.2μM每一種引物、0.1ng模板DNA和0.5單位Taq聚合酶的10M Tris-HCl(PH8.3)。
PCR反應(yīng)條件優(yōu)選的例子是，在95℃下分解雙鏈1.5分鐘，在64℃下退火1.0分鐘，在70℃下鏈延長反應(yīng)1.0分鐘，且反應(yīng)循環(huán)30次。
當(dāng)使用寡核苷酸(1)和(4)作為引物時，檢測到一個被假定顯示有393bp序列的帶，表明存在缺失E2A基因的Adexd123CANLacZ。當(dāng)使用寡核苷酸(2)和(3)作為引物時，檢測到一個被假定顯示有221bp序列的帶，說明被Cre基因產(chǎn)物切掉的環(huán)狀E2A基因的存在。由此揭示出，形成了Adexd123CANLacZ，其中，位于loxP序列之間的E2A基因區(qū)已被從Adex2L3LCANLacZ切除。如圖6所示。(2)下面將描述構(gòu)建攜帶一個啟動子、一個重組酶基因和聚(A)序列的重組腺病毒載體的方法。
在下列方法中，使用重組酶Cre基因作為重組酶基因的實施方案以一個實施例描述。然而，該方法對使用其它重組酶基因的實施方案也是適用的。
①分別用限制酶PstI和XbaI(Takara Shuzo Co.，Ltd.)同時消化由PCR制備的重組酶Cre基因和質(zhì)粒pUC19(Takara ShuzoCo.，Ltd.)。將DNA片段混合并相互連接，以獲得具有插入其中的重組酶基因Cre的質(zhì)粒pUCCre。
⑦用限制酶SwaI(Boehringer)消化包含CAG啟動子的盒式粘粒pAdex1CAwt，將所形成的DNA片斷與由用限制酶PstI和XbaI(Takara Shuzo Co.，Ltd.)同時消化pUCCre獲得的DNA片段混合，接著用克列諾酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)使其成平端。然后，沉淀盒式粘粒并用T4 DNA連接酶連接。如此獲得了具有插入其中的重組酶Cre基因的盒式粘粒。
當(dāng)使用除CAG啟動子外的其它啟動子時，以下方法是有利的。首先，從全長腺病毒基因組(36kb)缺失掉1.9kb E3區(qū)和2.9kb E1A.E1B區(qū)(它們對于復(fù)制是非必需的)，以形成具有約31kb基因組DNA的盒式粘粒。另一方面，制備攜帶有一個啟動子重組酶Cre基因和聚(A)序列的質(zhì)粒。用合適的限制酶消化處理上述盒式粘粒和質(zhì)粒，獲得具有在E1A.E1B區(qū)缺失位點插入到腺病毒基因組中的重組酶Cre基因表達(dá)單位的盒式粘粒。
③用Gigapack XL(Stratagene Co.，Ltd.)將如此獲得的盒式粘粒進(jìn)行體外包裝。
④另一方面，制備腺病毒DNA-末端蛋白復(fù)合物(Ad5 d1X DNA-TPC)。使用一種腺病毒DNA，Ad5 d1X(I.Saito et al.，J.Virology，vol.54，711-719(1985))。將Ad5 d1X DNA以10Roux管的量轉(zhuǎn)染進(jìn)Hela細(xì)胞。接著進(jìn)行培養(yǎng)?；厥詹《玖Ｗ樱缓笥名}酸胍處理。用超離心分離并回收DNA-TPC。
用足量的EcoT22I消化如此獲得的Ad5d1X DNA-TPC復(fù)合物，用于以下步驟。
⑤在最后步驟中，將具有插入其中的重組酶Cre基因的盒式粘粒與事先用EcoT22I消化的Ad5d1X DNA-TPC復(fù)合物混合，然后按照磷酸鈣方法用Celfect試劑盒(Pharmacia)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。從培養(yǎng)基(其中細(xì)胞因病毒增殖而死亡)中回收病毒溶液。如此獲得了攜帶啟動子、重組酶基因和聚(A)序列的重組腺病毒載體。
按照本發(fā)明，攜帶有目標(biāo)外源基因表達(dá)單位并完全缺失E2A基因功能的重組腺病毒可以有效地用于治療包括遺傳病在內(nèi)的各種疾病。更詳細(xì)地說，適當(dāng)稀釋含有本發(fā)明的重組腺病毒的高滴度的病毒溶液，該稀釋的溶液可經(jīng)合適的途徑給藥，例如，局部的(中樞神經(jīng)系統(tǒng)、門靜脈)、口腔地(使用包有腸溶衣的)、經(jīng)吸入、經(jīng)皮下等。
此后，參照實施例和參考實施例用于更詳細(xì)地描述本發(fā)明，但不能認(rèn)為是對其的限定。
在實施例中，除非有其它說明，按照Molecular Cloning，ALaboratory Manual，edited by T.Maniatis et al.，secondedition(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory中描述的改進(jìn)的方法進(jìn)行操作噬茵體、質(zhì)粒、DNA、各種酶、大腸桿菌，培養(yǎng)細(xì)胞等的各種步驟。限制酶和修飾酶從Takara Shuzo Co.，Ltd.，New England Biolabs(NEB)、Stratagene或Boehringer購得，并按照其說明使用。實施例1pAdex1CAwt的構(gòu)建含CAG啟動子的質(zhì)粒pCMwCH31的構(gòu)建用EcoRI消化攜帶CAG啟動子的質(zhì)粒pCAGGS(Niwa et al.，Gene，108，193-200，1990)。然后，用克列諾酶填補(bǔ)所形成的DNA片段。此后，用一種連接酶使該DNA片段與SwaI接頭連接。用SalI消化所形成的質(zhì)粒。用克列諾酶使該DNA片段成平端，接著用一種連接酶使其與ClaI接頭連接。在用PstI消化如此獲得的質(zhì)粒后，用克列諾酶將DNA片段填補(bǔ)成平端，并用連接酶使其與XhoI接頭連接。在用各自的限制酶消化后，用瓊脂糖凝膠電泳證實原始限制酶位點消失且插入了每一接頭。②pAdex1c的構(gòu)建(i)含有在缺失了E1基因區(qū)的腺病毒基因組的左端的17％區(qū)段的質(zhì)粒pUAF0-17D的構(gòu)建用S1核酸酶使5型腺病毒DNA成平端，并在平端上連接BamH接頭。用HindIII消化得到具有2.8kb并相應(yīng)于腺病毒基因組左端的8％的目標(biāo)DNA片段。用瓊脂糖凝膠分離并回收該片段，并插入到預(yù)先用BamHI/HindIII消化的pUC19的BamHI/HindIII位點。如此獲得的質(zhì)粒命名為pUAF0-8。
(ii)用HindIII消化腺病毒DNA。從凝膠上回收目標(biāo)3.4kb DNA片段(相應(yīng)于腺病毒基因組左端的8-17％)并在HindIII位點插入到pUC19中。如此獲得的質(zhì)粒命名為pUAF8-17。
在質(zhì)粒pUAF0-8中，用ClaI接頭將相應(yīng)于堿基編號454的PvuII位點轉(zhuǎn)換成ClaI位點。此處提到的堿基編號來源于腺病毒DNA的堿基編號。用BamHI/ClaI消化所述質(zhì)粒。用瓊脂糖凝膠電泳回收454bp BamHI/ClaI片段。
在質(zhì)粒pUAF8-17中，用ClaI接頭將相應(yīng)于堿基編號3328的BglII位點轉(zhuǎn)換成ClaI位點。然后用BamHI/ClaI消化所述質(zhì)粒。用瓊脂糖凝膠電泳回收2.9kb BamHI/ClaI片段。
將得自質(zhì)粒pUAF0-8的454bp BamHI/ClaI片段與得自質(zhì)粒pUAF8-17的2.9kb HindIII-ClaI片段連接。將所形成的連接產(chǎn)物插入到pUC19的BamHI/HindIII位點。如此獲得的質(zhì)粒命名為pUAF0-17D。該質(zhì)粒含有E1基因區(qū)缺失的腺病毒基因組的17％。(iii)腺病毒基因組Bst1107-EcoRI片段(21.6kb)的制備用Bst1107和EcoRI消化5型腺病毒DNA。經(jīng)用瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收目標(biāo)21.6kb片段。(iv)腺病毒基因組EcoRI-SalI片段(6.5kb)的制備用SwaI接頭將pX2S的SalI位點(I.Saito et al.，J.Virology，Vol.54，711-719(1985))轉(zhuǎn)換成SwaI位點。用EcoRI和SwaI消化所形成的pX2W。用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段后，回收目標(biāo)6.5kb片段。(v)卡隆粒chdRBR7-11的制備為了除去卡隆粒9-11(I.Saito & G.Stark，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，83，8664-8668，1986)中KpnI、SmaI和BamHI位點，用Asp718和BamHI消化卡隆粒9-11。用克列諾酶將所形成的DNA片段填平，然后進(jìn)行自連接。使用連接的序列的轉(zhuǎn)化給出目標(biāo)卡隆粒，命名為卡隆粒6-11。將BamHI接頭插入到卡隆粒6-11的EcoRI位點。如此獲得的卡隆粒命名為卡隆粒7-11。(vi)pAdex1C的制備將得自pUAF0-17的2.9kb BamHI-Bst1107片段、得自腺病毒基因組的21.6kb Bst1107-EcoRI片段和得自pX2W的6.5kb EcoRI-SwaI片段與預(yù)先用EcoRI和Ec136I消化的chdRBR7-11連接。將該連接的序列進(jìn)行體外包裝，并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α。從該轉(zhuǎn)化體分離出目標(biāo)粘粒。命名為pAdex1C。(3)盒式粘粒pAdex1CW的構(gòu)建在用20單位ClaI消化后，進(jìn)行乙醇沉淀以回收pAdex1C。將回收的pAdex1(1μg)與0.01μg合成接頭(1)(SEQ ID NO2)混合，所述接頭在5＇末端磷酸化并包含SwaI、Clai、SalI和NruI位點，如下面的描述。
合成接頭(1)5＇-CGATTTAAATCGATTGTCGACTCGCGA-3＇3＇-TAAATTTAGCTAACAGCTGAGCGCTGC-5′將混合物在總共18μl的含有ATP和T4連接酶的溶液中反應(yīng)一夜使其發(fā)生連接。在70℃溫育10分鐘滅活連接酶后，向其中加入20單位的SwaI用來進(jìn)行消化。按該消化，從具有插入其中的多個接頭的產(chǎn)物上切下SwaI片段，獲得其中僅插入一個接頭的粘粒。接著將反應(yīng)溶液用到離心柱(Pharmacia Inc.)上以除去由接頭衍生的小片段。此后，在總共18μl的含有ATP和T4 DNA連接酶的溶液中進(jìn)行連接反應(yīng)過夜，接著經(jīng)自退火環(huán)化。經(jīng)在70℃溫育10分鐘滅活連接酶后，將1μl所形成的產(chǎn)物用于體外包裝。
經(jīng)用BamHI和NruI同時消化證實從每種集落制備的粘粒DNA的構(gòu)建。當(dāng)以預(yù)期的方向插入時，形成一個483bp片段，當(dāng)以相反的方向插入時，形成一個464bp片段。由此證實獲得了目標(biāo)盒式粘粒pAdex1CW，如圖1所示。④盒式粘粒pAdex1pCAw的構(gòu)建用HindIII和ClaI同時消化以上①構(gòu)建的質(zhì)粒pCMwCH31。將DNA片斷用克列諾酶填補(bǔ)，并與預(yù)先在5＇末端磷酸化的PmeI接頭連接。在70℃溫育10分鐘滅活連接酶后，用Psp1406I消化連接產(chǎn)物。經(jīng)消化從具有插入其中的多個接頭的產(chǎn)物上切下Psp1401I片段，以獲得其中在DNA片段的兩端之一插入一個接頭的粘粒。接著，將反應(yīng)溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以切除一段含有2.3kb DNA片段的凝膠。通過電泳從該凝膠上回收DNA片段。接著用ClaI消化pAdex1cw，并經(jīng)應(yīng)用到離心柱(Pharmacia Inc.)上除去所形成的小片段。剩下的DNA片段(1μg)在總共18μl的含有ATP和T4 DNA連接酶的溶液中與0.1μg前面所說的2.3kb DNA片段反應(yīng)過夜，以進(jìn)行連接。在經(jīng)70℃溫育10分鐘天活連接酶后，將總共2μl的ClaI加入到1/4量的反應(yīng)混合物中以消化從自退火形成的環(huán)狀粘粒，1μl DNA片段用于體外包裝。
經(jīng)用BamHI和XhoI同時消化證實從每一集落制備的粘粒DNA的結(jié)構(gòu)。當(dāng)以預(yù)期的方向插入時，形成483bp和4.8kb的兩個片段，當(dāng)以相反的反向插入時，形成2.7kb和2.5kb的兩個片段。由此證實獲得了目標(biāo)盒式粘粒pAdex1pCAw。
⑤盒式粘粒pAdex1CAwt(SAIBO KOGAKU(Cell Engineering)，13(8)，759，1994)的構(gòu)建在用20單位的SwaI消化后，進(jìn)行乙醇沉淀，以回收1μgpAdex1pCAw。將回收的pAdex1pCAw與0.01μg的合成接頭(2)(SEQID NO3)混合，所述接頭在5＇-末端磷酸化，并含有ClaI、XbaI、SpeI、PacI、SwaI和ClaI位點，如下的描述合成接頭(2)5′-ATCGATTCTAGACTAGTTTAATTAATTTAAATCGAT-3＇3′-TAGCTAAGATCTGATCAAATTAATTAAATTTAGCTA-5＇混合物在總量為18μl的含有ATP和T4 DNA連接酶的溶液中反應(yīng)一夜，使發(fā)生連接。在經(jīng)70℃溫育10分鐘使連接酶滅活后，向其中加入20單位的PacI以進(jìn)行消化。經(jīng)消化，從具有插入其中的多個接頭的產(chǎn)物上切下PacI片段，獲得其中僅插入一個接頭的粘粒。接著將反應(yīng)溶液加到離心柱(Pharmacia Inc.)上以除去由接頭衍生的小片段。此后，在總共18μl的含有ATP和T4 DNA連接酶的溶液中進(jìn)行連接反應(yīng)一夜，接著經(jīng)自退火環(huán)化。經(jīng)在70℃溫育10分鐘滅活連接酶后，將1μl所形成的產(chǎn)物用于體外包裝。
經(jīng)用XbaI和XhoI同時消化證實從每種集落制備的粘粒DNA的結(jié)構(gòu)。當(dāng)以預(yù)期的方向插入時，形成一個522bp的片段，當(dāng)以相反的方向插入時，形成一個568bp的片段，由此證實獲得了目標(biāo)盒式粘粒pAdex1CAwt，如圖2所示。實施例2 插入3 loxP的質(zhì)粒的構(gòu)建①質(zhì)粒pA60X99X的制備在于20μl反應(yīng)溶液中用15單位的BamHI消化0.5μl盒式粘粒pAdex1CAwt后，在70℃下加熱15分鐘使BamHI滅活。使用1/4量的反應(yīng)混合物在總量為20μl的含有ATP和T4 DNA連接酶的連接酶緩沖液中進(jìn)行連接反應(yīng)過夜。用10μl反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并從所形成的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA，以獲得目標(biāo)質(zhì)粒pA60X99X。②質(zhì)粒pA60X99(除去了XbaI位點，不同于腺病毒)的制備5μl質(zhì)粒pA60X99X于50μl含10單位XbaI的溶液中反應(yīng)5分鐘后，將反應(yīng)混合物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。切下一段含有23.8kb DNA片段(由僅在兩個XbaI位點中一個位點消化而制備)的凝膠，經(jīng)電泳從該凝膠回收所述DNA片段。接著，將0.2μg該片段在50μl包含5單位的克列諾酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)的反應(yīng)系統(tǒng)中反應(yīng)，以用酶填補(bǔ)兩端。然后，將1/5量的反應(yīng)混合物在總量為20μl的含ATP和T4 DNA連接酶的溶液中反應(yīng)一夜，以發(fā)生連接。用10μl該反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，從如此獲得的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA。用BsrGI和XbaI同時消化這些質(zhì)粒，獲得一個6.2kb的DNA片段，命名為質(zhì)粒pA60X99，如圖3所示。③質(zhì)粒pA2L60X99(loxP插入到BsrGI位點)的制備用150單位XhoI于125μl反應(yīng)溶液中消化按以下方法制備的30μg質(zhì)粒pULL2r后，在70℃下加熱15分鐘滅活XhoI。接著在該反應(yīng)系統(tǒng)中用12單位的克列諾酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)填補(bǔ)DNA片段的兩端。用苯酚-氯仿(1∶1)抽提，接著進(jìn)行乙醇沉淀。離心收集該沉淀，并溶解在TE緩沖液(由將1mMEDTA加入到10mM Tris-鹽酸(PH7.5)獲得)中。然后，使反應(yīng)混合物的一半在總量為50μl的含ATP和T4 DNA連接酶的連接酶反應(yīng)溶液中與0.2μg 5＇-末端磷酸化的KpnI接頭(Takara Shuzo Co.，Ltd.)反應(yīng)過夜，以發(fā)生連接。在70℃下加熱15分鐘滅活連接酶后，用100單位Asp718在80μl反應(yīng)系統(tǒng)中消化連接產(chǎn)物。將反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。切下一段含64bp的攜帶loxP的DNA片段的凝膠，并經(jīng)電泳從該凝膠回收所述的DNA片段。
按如下方法制備上面使用的質(zhì)粒pULL2r。用限制酶Ecl136II消化質(zhì)粒pUC119(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，接著用堿性磷酸酶處理。然后進(jìn)行tpUC119-Ecl136II片段與以下合成DNA片段(SEQ IDNO4)之間的連接5’-CGAACGCGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTCGAGTCG-3’3’-GCTTGCGCATATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATAGAGCTCAGC-5’其中，下面劃線的序列表示loxP位點。該合成DNA片段攜帶在其末端具有MluI位點和XhoI位點的loxP序列，且當(dāng)Mlui和XhoI位點相連時，將該DNA設(shè)計成形成NruI位點。這樣，獲得了其中已插入兩個合成DNA片段的質(zhì)粒pULL2r。
另一方面，用包含在50μl溶液中的50單位BsrGI消化10μg質(zhì)粒pA60X99。此后，將反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以切下一段含23.8kb DNA片段的凝膠。經(jīng)電泳從該凝膠回收所述的DNA片段。在總量為25μl的含有ATP和T4 DNA連接酶的溶液中使回收的DNA片段與前面所說的64bp的攜帶loxP的DNA片斷反應(yīng)一夜，使發(fā)生連接。向反應(yīng)混合物的一半中加入無菌水和用于BsrGI消化的緩沖液，使總體積為18μl。將反應(yīng)混合物在70℃下溫育10分鐘以滅活連接酶。在將20單位的BsrGI(總終體積20μl)加入到反應(yīng)混合物中后，使混合物在37℃下反應(yīng)1小時以消化產(chǎn)生的由自退火形成的環(huán)狀pA60X99。用10μl該反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。從如此獲得的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA。
為了證實插入的loxP的取向，取ApaI和MluI同時消化質(zhì)粒DNA，將反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。當(dāng)以預(yù)期的方向插入時，形成366bp和219bp的兩個片段，當(dāng)以相反的方向插入時，形成334和251bp的兩個片段。在用NruI消化的情況下，當(dāng)以預(yù)期的方向插入時，形成一個573bp的片段，當(dāng)以相反的方向插入時，形成一個533bp的片段。另外，在用DraI和KpnI同時消化的情況下，當(dāng)一個loxP以預(yù)期的方向插入時，形成一個320bp片段，當(dāng)兩個loxP序列以相反的方向插入時，形成一個384bp片段。這樣獲得了符合所有上述三種情況的目標(biāo)質(zhì)粒，即，目標(biāo)質(zhì)粒pA2L60X99，僅一個loxP以預(yù)期的取向插入其中。如圖4所示。④質(zhì)粒pA2L3L6099(loxP插入到XbaI位點)的制備經(jīng)在100μl包含100單位XhoI的溶液中反應(yīng)而消化20μg質(zhì)粒pULL2r后，在70℃下加熱15分鐘滅活所述酶。接著，使形成的DNA片段在含8單位克列諾酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)的溶液中反應(yīng)，以用酶填補(bǔ)兩端。用苯酚-氯仿(1∶1)抽提反應(yīng)混合物，接著用乙醇沉淀。離心收集沉淀并溶解在30μl TE緩沖液中。使全部體積的溶液在包含ATP和T4 DNA連接酶的連接酶溶液(總終體積50μl)中與0.4μg 5＇-末端磷酸化的SpeI接頭(Takara Shuzo Co.，Ltd.)反應(yīng)過夜而實現(xiàn)連接。在70℃下加熱10分鐘滅活連接酶。在再加入54單位SpeI進(jìn)行消化后，將反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。切下一段含有64bp的攜帶loxP的DNA片段的凝膠，并經(jīng)電泳從該凝膠回收所述的DNA片段。
另一方向，使10μg質(zhì)粒pA2L60X99在50μl含10單位XbaI的溶液中反應(yīng)，以進(jìn)行消化。將反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。切下一段含有23.8kb DNA片段的凝膠，經(jīng)電泳從該凝膠回收所述DNA片段。然后，將0.5μg所述DNA片段在總量為16μl的含ATP和T4 DNA連接酶的連接酶溶液中與0.005μg前面所說的64bp的攜帶loxP的DNA片段反應(yīng)過夜，使發(fā)生連接。向反應(yīng)混合物中加入14μl稀釋5倍的TE，并在70℃下加熱10分鐘滅活連接酶。此后，將總量為20μl的20單位XbaI加入到1/4體積的反應(yīng)混合物中，以消化由自退火形成的環(huán)狀pA2L60X99。使用10μl該反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。從如此獲得的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA。
為了證實插入loxP的取向，用BglII和MluI同時消化質(zhì)粒DNA。將反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。當(dāng)以預(yù)期的取向插入時，形成366bp和503bp的兩個片段。當(dāng)以相反的取向插入時，形成398bp和471bp的兩個片段。在用ApaI和MluI同時消化的情況下，當(dāng)以預(yù)期的取向插入時，形成一個660bp片段，當(dāng)以相反的取向插入時，形成一個628bp片段。另外，在用EcoNI和MluI同時消化的情況下，當(dāng)以預(yù)期的取向插入時，形成一個311bp片段，當(dāng)以相反的取向插入時，形成一個343bp片段。此外，在用HpaI和SacI同時消化的情況下，當(dāng)一個loxP以預(yù)期的取向插入時，形成一個397bp片段，當(dāng)兩個loxP序列以預(yù)期的取向插入時，形成一個461bp片段。如此獲得了如圖5所示的符合所有上述四種情況的目標(biāo)質(zhì)粒，即，僅有一個loxP以預(yù)期的取向插入其中的目標(biāo)質(zhì)粒pA2L3L6099。⑤盒式粘粒pAdex2L3LCAwt的構(gòu)建在100μl含40單位Csp45I的反應(yīng)溶液中消化10μg盒式粘粒pAdex1CAwt后，將30單位的BamHI和40單位的EcoRI連續(xù)加入到反應(yīng)溶液中。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來檢測。切下一段含有21kbDNA片段的凝膠，從該凝膠上經(jīng)電泳回收所述的DNA片段。當(dāng)回收到21kbBamHI-DNA片段時，用Csp45I和EcoRI進(jìn)行消化，以防沾污其它片段。
在50μl含30單位的BamHI的溶液中消化5μg質(zhì)粒pA2L3L6099后，用苯酚-氯仿(1∶1)抽提DNA片段，用預(yù)先以TE平衡的葡聚糖凝膠G25將水層進(jìn)行凝膠過濾。然后，在總量為18μl的含ATP和T4 DNA連接酶的溶液中將0.5μg回收的DNA片段與0.5μg前述的21kbDNA片段連接過夜。在70℃溫育10分鐘滅活連接酶后，1μl盒式粘粒用于體外包裝。
即，以1/4的量使用一種入體外包裝試劑盒——Gigapack XL(Stratagene Co.，Ltd.，USA)，將剩下的溶液在-80℃下凍干。因為Gigapack XL對42kb或更小的粘粒提供低的包裝效率，所以該試劑盒能在某種程度上選擇經(jīng)包含插入序列變得更大的粘粒。在這一實驗中，當(dāng)收集10個集落時，它們中大多數(shù)包含插入序列。因此，能夠容易地獲得具有所期望的取向的克隆(即，其中腺病毒基因組被適當(dāng)?shù)剡B接的克隆。用Izumu Saito，et al.，JIKKEN IGAKU(Experimental Medicine)，7，183-187(1989)中描述的常規(guī)方法處理粘粒。
將所述包裝過的粘粒轉(zhuǎn)染進(jìn)大腸桿菌DH5α(GIBCO BRL)。即，將粘粒以1/200、1/20、1/2和剩余部分的量分別接種到三塊Ap+瓊脂板(外加了氨芐青霉素)的每一塊上和5ml Ap+LB(池)中，接著溫育過夜。
從池中抽提并制備小劑量的DNA，以便經(jīng)限制酶DraI消化檢測具有插入序列的粘粒的比率。將茵落與瓊脂板一起挑取，在Ap+LB中培養(yǎng)一夜，以制備小劑量的DNA。
接著用DraI消化證實從每一菌落制備的粘粒的結(jié)構(gòu)。當(dāng)以預(yù)期的取向插入時，形成一個891bp的片段，當(dāng)以相反的取向插入時，形成一個1.4kb的片段。由此證實獲得了目標(biāo)盒式粘粒pAdex2L3LCAwt。實施例3腺病毒DNA-末端蛋白質(zhì)復(fù)合物(Ad5 d1X DNA-TPC和Adex1CANLacZDNA-TPC)的制備①使用Ad5dlX(I.Saito et al.，J.Virologyvol.54，711-719(1985))或Adex1CANLacZ作為腺病毒DNA。將Ad5 dlx DNA和Adex1CANLacZ分別轉(zhuǎn)染進(jìn)Hela細(xì)胞(以10 Roux管的量)和293細(xì)胞，接著培養(yǎng)。
即，以0.2ml/Roux管的量轉(zhuǎn)染Ad5-dlx或Adex1CANLacZ的病毒溶液(～109PFU/ml)。3天后將細(xì)胞去膜并離心收集。大多數(shù)腺病毒粒子不存在于培養(yǎng)基中，而存在于細(xì)胞核中，因此，該病毒易于從感染細(xì)胞純化。
在無菌狀態(tài)下進(jìn)行下列過程。
②將如此獲得的細(xì)胞懸浮在Tris-HCl(PH8.0)中，用封閉型超聲波發(fā)生器進(jìn)行超聲波處理，以破壞細(xì)胞從而釋放出病毒。
③在經(jīng)離心除去由此獲得的碎片后，將上清液覆蓋于裝在超速離心機(jī)SW28管中的氯化銫溶液(比重為1.43)上。接著用墊層離心法進(jìn)行濃縮。
④將界面下緊靠界面的病毒層轉(zhuǎn)移到SW50.1管中。一般來說，界面下緊靠界面的病毒層是肉眼可見的。收集5ml病毒層。同時另一支管裝滿氯氣銫溶液(比重為1.34)。
將這些管于35k rpm、4℃下離心過夜，收集如此形成的表明病毒存在的白色層，并轉(zhuǎn)移到事先形成梯度的管中。將該管進(jìn)一步在35krpm，4℃下超離心4小時。
⑤收集表明病毒存在的白色層，并以相同的量與8M鹽酸胍混合。此外，將4M鹽酸胍飽和的氯化銫加入到混合物中。所形成的混合物裝入到VTi65管中。用4M鹽酸胍使顆粒蛋白變性以引起分解，從而釋放出DNA-TPC復(fù)合物。
⑥將以上所述的管在55k rpm于15℃下超離心一夜，接著以0.2ml分餾。從每一級份中取出1μl，與1μg/ml溴化乙錠水溶液混合，用熒光染色證實DNA存在或不存在。收集含有DNA的兩或三個級份。
⑦所述級份對500ml TE透析過夜兩次，然后在-80℃下貯存。以測定DNA的常規(guī)方法據(jù)OD260值測定如此獲得的Ad5dlX DNA-TPC復(fù)合物或Adex1CANLacZ DNA-TPC復(fù)合物的量。
③以足量的AgeI消化所形成的Ad5dlX DNA-TPC復(fù)合物或Adex1CANLacZ DNA-TPC復(fù)合物2小時在經(jīng)葡聚糖凝膠G25柱的凝膠過濾后，將該復(fù)合物在-80℃下貯存。
同時，可將該DNA-TPC復(fù)合物使用限制酶的消化、透析和凝膠過濾，但不進(jìn)行電泳、苯酚處理和乙醇沉淀。氯化銫平衡離心僅可作為一種濃縮方法使用。因此，在盡可能在高的濃度下保持DNA-TPC復(fù)合物。從10Roux管的感染細(xì)胞可獲得約300μg的DNA-TPC復(fù)合物。
⑨收集DNA-TPC復(fù)合物溶液，向其中加入10μl用于電泳的BPB緩沖液。然后向混合物中加入1μl蛋白酶K(10mg/ml)。將所形成的混合物在37℃下溫育10分鐘以消化DNA-TPC復(fù)合物的末端蛋白質(zhì)。在苯酚處理后，經(jīng)瓊脂糖上的電泳分離上清液，以證實消化完成。
在經(jīng)離心凝膠過濾除去EcoT221-消化的DNA-TPC中的限制酶緩沖液后，將所形成的產(chǎn)物分別裝入管中，并在-80℃下貯存。實施例4插入了loxP的重組腺病毒(Ad5dlX2L3L和Adex2L3LCANLacZ)的制備通過將SV40的核轉(zhuǎn)移信號序列加入到大腸桿菌LacZ基因的5＇-末端獲得NLacZ基因。
①向直徑為6cm和10cm的每個培養(yǎng)皿中裝入在加有10％FCS的DME中培養(yǎng)過的293細(xì)胞。
②在將8μg插入了loxP的粘粒pAdex2L3LCAwt DNA(具有導(dǎo)入其中的表達(dá)單位)與1μg事先用AgeI消化過的Ad5dlX DNA-TPC復(fù)合物或1μg事先用AgeI消化過的Adex1CANLacZ混合后，用Celfeet試劑盒(Pharmacia)按磷酸鈣方法在6cm培養(yǎng)皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。即，將混合物滴加到6cm培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上，并繼續(xù)培養(yǎng)。
在培養(yǎng)過夜(約16小時)后，第二天早晨交換培養(yǎng)基。然后在當(dāng)天晚上，將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基與含5％FCS的DME一起以0.1ml/孔的量倒入到三個96-孔膠原涂覆板(未稀釋的貯存液、10倍稀釋液和100倍稀釋液)的孔中。為了避免各板之間細(xì)胞計數(shù)上的明顯差異，將從10cm培養(yǎng)皿收獲得的293細(xì)胞的1/3加到兩塊稀釋液板的每塊上。
③3或4天和8或10天后，再向每孔中加入50μl含10％FCS的DME。當(dāng)293細(xì)胞系變薄時，應(yīng)將含10％FCS的DME更早地加入到孔中。
在7-20天可觀察到孔中病毒已增殖且細(xì)胞死亡。含有死細(xì)胞的培養(yǎng)基用無菌的巴氏吸管從細(xì)胞完全死亡的每孔中轉(zhuǎn)移到1.5ml無菌管中。將該管迅速在-80℃下冷凍干燥并貯存。
④在15到25天進(jìn)行觀察。從裝有培養(yǎng)基的管中挑選出約10支管，所述培養(yǎng)基含有相對較晚的階段死亡的細(xì)胞。在超聲波處理后，在5k rpm下離心10分鐘。在-80℃下貯存所形成的上清液，用作第一種子。
在較早的階段病毒已開始增殖的孔預(yù)示由多種病毒株混合感染的較高的可能性。
⑤將293細(xì)胞系裝入24-孔板中，并將5％FCS-DME(0.4ml/孔)和10μl第一病毒種子加入到孔中。設(shè)置二個重復(fù)。
⑥在約3天細(xì)胞完全死亡時，用類似于上述制備第一病毒種子的方法經(jīng)超聲波處理和離心處理從重復(fù)試驗孔之一獲得上清液。將如此獲得的上清液在-80℃下貯存，用作第二種子。將重復(fù)試驗孔另一孔中的死亡細(xì)胞在5000rpm下離心5分鐘，棄去上清液。將單獨的細(xì)胞在-80℃下貯存(細(xì)胞團(tuán))。收集10種病毒株的所述細(xì)胞團(tuán)，按以下方法從感染細(xì)胞抽提全DNA。向每一細(xì)胞團(tuán)中加入400μl細(xì)胞DNA TNE(50mM Tris-HCl，PH7.5，100mM NaCl、10mM EDTA)、4μl蛋白酶K(10mg/ml)和4μl 10％SDS。
⑦在50℃下處理1小時后，用苯酚-氯仿抽提兩次，并用氯仿抽提兩次，然后用乙醇沉淀。將用乙醇沉淀重新獲得的核酸溶解在含有20μg/ml核糖核酸酶的50μl TE中。
在用識別含GC的位點的XhoI將15μl溶液消化后，將消化產(chǎn)物與表達(dá)粘粒盒的XhoI表達(dá)消化后一起在瓊脂糖凝膠(有約15cm長)上電泳一夜。比較由此獲得的電泳帶型。選擇顯示表示插入其中的兩個loxP序列的消化模式的帶的克隆。棄去提供表示未確定DNA序列的許多帶的克隆，因為有可能克隆被有缺失的病毒沾污。實施例5缺失E2A基因的腺病毒的構(gòu)建及其結(jié)構(gòu)的證實將重組腺病毒Adex2L3LCANLacZ和AdexlCANCre以10的復(fù)合感染轉(zhuǎn)染進(jìn)293細(xì)胞，接著進(jìn)行培養(yǎng)。通過將SV40的核酸轉(zhuǎn)移信號序列加入到Cre基因的5＇-末端獲得NCre基因。
4天后按以下描述的方法制備DNA。由兩種方法(即，以下描述的SamI消化和PCR)證實所形成的Adex123CANLacZ具有這樣一種結(jié)構(gòu)，即已切去位于兩個loxP序列之間的包含E2A基因的區(qū)。1.用SmaI消化用SmaI消化后，進(jìn)行凝膠電泳。結(jié)果是被注意到，切去了位于兩個loxP序列之間的區(qū)，因此形成了一個4.7kb的片段。從比較上述4.7kb的帶和4.45kb的帶(通常在Adex2L3LCANLacZ、Adex1CANCre和Adexd123CANLacZ中觀察到的)之間的帶密度，確定回收的重組腺病毒中約30％區(qū)段是Adexd123CANLacZ。2.PCR證實用0.1ng制備的DNA作為模板，在常規(guī)條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)。產(chǎn)物用瓊脂糖凝肢上的電泳分析。使用的引物優(yōu)選地是如下所示的寡核苷酸(1)(SEQ ID NO5)、寡核苷酸(2)(SEQ ID NO6)、寡核苷酸(3)(SEQ ID NO7)、寡核苷酸(4)(SEQ ID NO8)。寡核苷酸(1)5，-CAACTCCATGCTCAACAGTCCCCAGGTACA-3＇寡核苷酸(2)5，-GATTTTTAAACGGCGCAGACGGCAAG-3＇寡核苷酸(3)5′-GTGAGCTTAGAAAACCCTTAG-3＇寡核苷酸(4)5′-AGATACCCCTTTTGCACTGGTGCAAGTTAAC-3＇用于PCR的反應(yīng)溶液的組成(總體積20μl)Tris-HCl(PH8.3) 10mMKCl 50mMMgCl21.5mMdNTP混合物0.2mM引物 各0.2μM模板DNA 0.1ng
Taq聚合酶 0.5單位PCR的反應(yīng)條件為分解雙鏈的溫度為95℃，1.5分鐘退火溫度為64℃，1.0分鐘鏈延長反應(yīng)的溫度為70℃，1.0分鐘反應(yīng)循環(huán)30次結(jié)果示于圖6中。
當(dāng)使用寡核苷酸(1)和(4)作為引物時，檢測到一個被假定表現(xiàn)393bp序列的帶，表明存在缺失E2A基因的Adexd123CANLacZ。如圖6中第1泳道所示。
當(dāng)使用寡核苷酸(2)和(3)作為引物時，檢測到一個被假定表現(xiàn)221bp序列的帶，說明被Cre基因產(chǎn)物切掉的環(huán)狀E2A基因的存在。如圖6中第2泳道所示。
以上1和2的結(jié)果揭示出形成了Adexd123CANLacZ，其中，位于loxP序列之間的E2A基因區(qū)已被從Adex2L3LCANLacZ切除。參考實施例1攜帶重組酶Cre基因和CAG啟動子的重組腺病毒載體的構(gòu)建(1)表達(dá)重組酶Cre基因的盒式粘粒的構(gòu)建用包含重組酶Cre基因的大腸桿菌噬菌體P1(ATCC 11303-B23)DNA作為模板。以下寡核苷酸(SEQ ID NO9)作為5＇-引物、以下寡核苷酸(SEQ ID NO10)作為3＇-引物、和VentR(由NEB制造)作為熱穩(wěn)定聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。該PCR反應(yīng)在以下給出的條件下進(jìn)行。該產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠上的電泳，從瓊脂糖凝膠上切下一個指示約1kb的帶，以獲得約1kb的攜帶重組酶Cre基因的DNA片段。5＇-引物5’-CGTCTGCAGTGCATCATGAGTAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGC-3’3＇-引物3’-GACCTTCTACCGCTAATCGGTAATTCGCGAGATCTCGG-5’下面劃線的部分表示限制酶的識別位點。PCR條件緩沖液10mM KCl、20mM Tris-HCl(PH8.8)、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1％曲通x-100(使用NEB提供的緩沖液)聚合酶2單位dNTP400μM引物1μMP1噬菌體DNA1ng分解雙鏈的溫度為95℃，1.5分鐘退火溫度為60℃，1.5分鐘鏈延長反應(yīng)的溫度為74℃，2.0分鐘反應(yīng)循環(huán)20次在用限制酶PstI(Takara Shuzo Co.，Ltd.，)和XbaI(TakaraShuzo Co.，Ltd.)消化如此獲得的各種DNA片段和pUC19(Takara Shuzo Co.，Ltd.，Japan)后，回收消化產(chǎn)物。將來源于DNA片段的產(chǎn)物與來源于pUC19的產(chǎn)物以約3∶1的摩爾比混合。然后用T4 DNA連接酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)連接該混合物。用該反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株(ATCC 53323)。將處理過的大腸桿菌細(xì)胞接種到補(bǔ)充有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂板上，選擇生長在瓊脂上的轉(zhuǎn)化體，獲得攜帶有重組酶Cre基因的質(zhì)粒pUCCre。
接著，用SwaI消化包含CAG啟動子的盒式粘粒pAdex1CAwt。然后將1μg該消化產(chǎn)物與0.1μg約1kb DNA片段混合，所述DNA片段是由用PstI和XbaI消化質(zhì)粒pUCCre并用克列諾酶(Takara ShuzoCo.，Ltd.)使成平端獲得的。
②將乙醇加入到以上獲得的混合物中以沉淀粘粒。經(jīng)離心回收該沉淀，并溶解在稀釋5倍的TE溶液(10mM Tris-HCl(PH7.5)，補(bǔ)充1mM EDTA)中。
③將所形成的含有粘粒的溶液用ATP和T4 DNA連接酶在緩沖溶液中(終體積為1μl)進(jìn)行連接反應(yīng)過夜。將無菌水和用于SwaI反應(yīng)的緩沖溶液加入其中，使總體積達(dá)48μl，然后在70℃下加熱10分鐘使連接酶滅活。
與質(zhì)粒不同，粘粒通常可以高效地包裝大分子DNA，所述DNA是由相互以線性串聯(lián)形式而不是環(huán)狀形式連接形成的。
④在加入2μl SwaI(Boehringer)后，在25℃下進(jìn)行粘粒的消化反應(yīng)1小時。下文中給出了用SwaI消化粘粒的理由。
如果盒式粘粒在其中未包含一個表達(dá)單位的情況下再連接，就會再生SwaI識別位點。這樣，用SwaI消化能再切割其中未包含表達(dá)單位的粘粒，導(dǎo)致不形成集落。這是一種選擇僅一種其中具有插入序列的盒式粘粒的可能的方法。
⑤按照Molecular Cloning，vol.3，E.34中所述的常規(guī)方法將盒式粘粒進(jìn)行苯酚抽提、離心和凝膠過濾。
⑥再次用SwaI進(jìn)行消化，即將5μg SwaI加入到用于SwaI反應(yīng)的緩沖液中，在25℃下消化該粘粒2小時。由于以上解釋的原因進(jìn)行上述消化。
⑦將所形成的粘粒(1μl)進(jìn)行體外包裝。
即，以1/4的量使用一種入體外包裝試劑盒-Gigapack XL(Stratagene Co.，Ltd.，USA)，將剩下的溶液在-80℃下冷干。因為Gigapack XL對42Kb或更小的粘粒給出低的包裝效率，所以該試劑盒能在某種程度上選擇由于包含插入序列而變得更大的粘粒。在這一實驗中，當(dāng)收集10個集落時，它們中大多數(shù)包含插入序列。因此，能夠容易地獲得具有預(yù)期的取向(即，指從E3基因區(qū)到E1基因區(qū)的朝左側(cè)的取向)的克隆按照Izumu Saito et al.，JIKKEN IGAKU(ExperimentalMedicine)，vol.7，183-187，1989中描述的常規(guī)方法操作粘粒。
⑧將所述包裝過的粘粒轉(zhuǎn)染進(jìn)大腸桿菌DH1(ATCC 33849)。
即，將粘粒以1/200、1/20、1/2和剩余部分的量分別接種到三塊Ap+瓊脂板(補(bǔ)加了氨芐青霉素)的每一塊上So 5ml AP+LB(池)中，接著溫育過夜。
從池中抽提并制備小量制備出的DNA。按全酶消化方法檢測具有插入序列的粘粒的比率。挑取連帶瓊脂板的集落，在1.5ml Ap+LB中培養(yǎng)一夜，以制備小量的DNA。
⑨用限制酶消化證實包含在粘粒中的表達(dá)單位的取向和結(jié)構(gòu)。
用NruI和連接酶制備攜帶表達(dá)單位但缺失大多數(shù)腺病毒DNA的質(zhì)粒。然后為最終證實cDNA克隆，從該質(zhì)粒制備一種DNA片段。(2)腺病毒DNA-蛋白復(fù)合物(Ad5 dlX DNA-TPC)的制備①使用載體Ad5 d1X(I.Saito et al.，J.Virology，vol.54，711-719(1985))作為腺病毒DNA。將載體Ad5 d1X DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)HeLa細(xì)胞(以10Roux管的量)，接著培養(yǎng)。
即，以0.2ml/Roux管的量轉(zhuǎn)染Ad5-d1X的病毒溶液(～109PFU/ml)。3天后將細(xì)胞去膜并離心(1500rpm，5分鐘)收集。大多數(shù)腺病毒粒子不存在于培養(yǎng)基中而存在于細(xì)胞核中，因此，該病毒易于從感染細(xì)胞純化。
在無菌狀態(tài)下進(jìn)行下列過程。
②將如此獲得的細(xì)胞懸浮在20ml 10mM Tris-HCl(PH8.0)中，用封閉型超聲波發(fā)生器在200W下超聲處理2分鐘(30秒×4)，以殺滅細(xì)胞從而釋放出病毒。
為了從細(xì)胞釋放病毒，當(dāng)細(xì)胞懸液體積為5ml或更小時，重復(fù)冷凍-融化5次便足夠了。然而，當(dāng)具有大的體積時，超聲波發(fā)生器對釋放病毒是有利的。在這種情況下，必須使用具有專用杯的密封型超聲波發(fā)生器。即使操作在安全櫥中進(jìn)行，普通增添型(throw-intype)也是危險的。
③在經(jīng)離心(10k rpm，10分鐘)除去由此獲得的細(xì)胞碎片后，將上清液覆蓋于裝在超速離心機(jī)(SW28管)中的15ml氯化銫溶液(比重1.43)上。接著經(jīng)離心(25k rpm，1小時，4℃)進(jìn)行濃縮。
④將界面下緊靠界面的病毒層轉(zhuǎn)移到SW50.1管中。一般來說，界面下緊靠界面的病毒層是肉眼可見的。收集5ml病毒層。同時另一支管裝滿氯化銫溶液(比重為1.34)。
將這些管于35k rpm、4℃下離心過夜，收集如此形成的表明病毒存在的白色層，并轉(zhuǎn)移到事先形成梯度的管中。將該管進(jìn)一步在35krpm，4℃下超離心4小時。
⑤收集表明病毒存在的白色層，并以相同的量與8M鹽酸胍混合。此外，將4M鹽酸胍飽和的氯化銫加入到混合物中。所形成的混合物裝入到VTi65管中。用4M鹽酸胍使顆粒蛋白變性以引起分解，從而釋放出DNA-TPC復(fù)合物。在這一實驗中也可以使用溴化乙錠，但還沒有建立除去使用的溴化乙錠的任何方法。
⑥將以上所述的管在55k rpm于15℃下超離心一夜，接著用0.2ml分級。從每一級份中取出1μl，與1μg/ml溴化乙錠水溶液混合，用熒光染色證實DNA存在或不存在。收集含有DNA的兩或三個級份。
⑦所述級份對500ml TE透析過夜兩次，然后在-80℃下貯存。以測定DNA的常規(guī)方法據(jù)OD260值測定如此獲得的Ad5dlX DNA-TPC復(fù)合物的量。
⑨用足量的EcoT22I消化所形成的Ad5dlX DNA-TPC復(fù)合物2小時，然后在-80℃下貯存。
同時，可將該DNA-TPC復(fù)合物進(jìn)行使用限制酶的消化、透析和凝膠過濾，但不進(jìn)行電泳、苯酚處理和乙醇沉淀。氯化銫平衡離心僅可作為一種濃縮方法使用。因此，在盡可能在高的濃度下保持DNA-TPC復(fù)合物。從10Roux管的感染細(xì)胞可獲得約300μg的DNA-TPC復(fù)合物。
⑨收集DNA-TPC復(fù)合物溶液，向其中加入10μl用于電泳的BPB緩沖液。然后向混合物中加入1μl蛋白酶K(10mg/ml)。將所形成的混合物在37℃下溫育10分鐘以消化DNA-TPC復(fù)合物的末端蛋白質(zhì)。在苯酚處理后，經(jīng)瓊脂糖上的電泳分離上清液，以證實消化完成。
在經(jīng)離心凝膠過濾除去EcoT221-消化的DNA-TPC中的限制酶緩沖液后，將所形成的產(chǎn)物分別裝入管中，并在-80℃下貯存。(3)重組病毒的分離和高滴度病毒溶液的制備①向直徑為6cm和10cm的每培養(yǎng)皿中裝入在加有10％FCS的DME中培養(yǎng)過的293細(xì)胞。
②在將8μg(3μg到9μg是適宜的)pAdex1W DNA(具有導(dǎo)入其中的表達(dá)單位)與1μg事先用EcoT22I消化過的Ad5d1X DNA-TPC復(fù)合物混合后，用Celfect試劑盒(Pharmacia)按磷酸鈣方法在6cm培養(yǎng)皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。即，將混合物滴加到6cm培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上，并繼續(xù)培養(yǎng)。
在培養(yǎng)一夜(約16小時)后，第二天早晨交換培養(yǎng)基。然后在當(dāng)天晚上，將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基與含5％FCS的DME一起倒入到三個96-孔膠原涂覆板(未稀釋的貯存液、10倍稀釋液和100倍稀釋液)的孔中。為了避免各板之間細(xì)胞計數(shù)上的明顯差異，將從10cm培養(yǎng)皿收獲得的293細(xì)胞的1/3加到兩塊稀釋液板的每塊上。
③3或4天和8或10天后，再向每孔中加入50μl含10％FCS的DME。當(dāng)293細(xì)胞系變薄時，應(yīng)將含10％FCS的DME更早地加入到孔中。
在7-15天可觀察到孔中病毒已增殖且細(xì)胞死亡。用無菌的巴氏吸管將含有死細(xì)胞的培養(yǎng)基從細(xì)胞完全死亡的每孔中轉(zhuǎn)移到1.5ml無菌管中。將該管迅速在-80℃下冷凍干燥并貯存。
④在15到18天結(jié)束觀察。從裝有培養(yǎng)基的管中挑選出約10支管，所述培養(yǎng)基含有相對較晚的階段死亡的細(xì)胞。在重復(fù)6次冷凍-融化后，在5k rpm下離心10分鐘。在-80℃下貯存所形成的上清液，用作第一種子。
在較早的階段病毒已開始增殖的孔預(yù)示由多種病毒株混合感染的較高的可能性。
⑤將293細(xì)胞系裝入24-孔板中，并將5％FCS-DME(0.4ml/孔)和10μl第一病毒種子加入到孔中。設(shè)置二個重復(fù)。
⑥在約3天細(xì)胞完全死亡時，用類似于上述制備第一病毒種子的方法經(jīng)重復(fù)六次冷凍-融化和離心處理從重復(fù)試驗孔之一獲得上清液。將如此獲得的上清液在-80℃下貯存，用作第二種子。第二病毒溶液的滴度為約107到108PFU/ml。將重復(fù)試驗孔另一孔中的死亡細(xì)胞在5000rpm下離心5分鐘，棄去上清液。將單獨的細(xì)胞在-80℃下貯存(細(xì)胞團(tuán))。收集10種病毒株的所述細(xì)胞團(tuán)，按以下方法從感染細(xì)胞抽提全DNA。向每一細(xì)胞團(tuán)中加入400μl細(xì)胞DNA TNE(50mM Tris-HCl，PH7.5，100mM NaCl、10mM EDTA)、4μl蛋白酶K(10mg/ml)和4μl 10％SDS。
⑦在50℃下處理1小時后，用苯酚-氯仿抽提兩次，并用氯仿抽提兩次，然后用乙醇沉淀。將用乙醇沉淀重新獲得的核酸溶解在含有20μg/ml核糖核酸酶的50μl TE中。
在用能識別含GC的位點的XhoI將15μl溶液消化后，將消化產(chǎn)物與表達(dá)粘粒盒的XhoI表達(dá)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠(有約15cm長)上電泳一夜。比較由此獲得的電泳帶型。選擇顯示表示從表達(dá)單位中切割位點到腺病毒基因組左端的精確DNA序列的克隆。棄去給出表示未確定DNA序列的許多帶的克隆，因為有可能克隆被有缺失的病毒沾污。
腺病毒一般以10,000拷貝/細(xì)胞水平上增殖。因此，可以抽提包含天然細(xì)胞DNA和腺病毒DNA的整DNA，并用限制酶消化，然后進(jìn)行電泳，由此，觀察表示得自腺病毒DNA片段的帶。對含CG的位點特異性的限制酶(例如XhoI)幾乎不消化細(xì)胞DNA。結(jié)果是，當(dāng)上樣進(jìn)行電泳時，其模式是易于觀察和辨認(rèn)的。當(dāng)使用其它酶時，需要以非感染293細(xì)胞系DNA為對照。在這種情況下，有得自人細(xì)胞的重復(fù)序列的一個帶。
⑧將由XhoI消化證實的第二種子溶液以0.1ml的量轉(zhuǎn)染進(jìn)293細(xì)胞系，所述細(xì)胞系裝在盛有25ml培養(yǎng)基的150cm2的膠原涂覆瓶中。
當(dāng)三天內(nèi)細(xì)胞死亡時，用密封型超聲波發(fā)生器以200W的最大輸出功率無菌處理含死亡細(xì)胞的培養(yǎng)基2分鐘(30秒×4)，以釋放病毒。
經(jīng)在3k rpm于4℃離心10分鐘除去沉淀，并將獲得的上清液以2ml的量裝入13支5ml冷凍管的每支中。用干冰迅速冷凍各管，并在-80℃下貯存，以制備第三種子溶液。包含本發(fā)明的重組腺病毒載體的第三種子溶液表現(xiàn)出高達(dá)109PFU/ml的滴度。
在將5μl第三種子溶液轉(zhuǎn)移到24孔板上的包含293細(xì)胞系的一個孔中后，用限制酶消化增殖的病毒DNA，然后進(jìn)行電泳。用以上描述的方法證實所形成的帶型。當(dāng)對所述病毒混有缺失病毒或親代病毒有任何懷疑時，就棄去所有的第三種子。這是因為缺失病毒(已存在于第二病毒溶液中)有以高得可感覺到的水平迅速增殖的可能性。因此，用另一個第二種子溶液再次進(jìn)行上述步驟。另一種可選擇方法，經(jīng)按照有限稀釋的方法處理第一種子溶液而純化所述病毒溶液。
本發(fā)明提供了重組DNA病毒，使用該病毒，可將一種外源基因以穩(wěn)定的形式轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)各種動物細(xì)胞中。本發(fā)明也提供了一種產(chǎn)生重組DNA病毒的簡單方法。特別是，本發(fā)明的重組腺病毒對治療遺傳病是有效的。
日本專利申請7-84891號和7-276335號全部公開的內(nèi)容在此一并作為參考。
序列表SEQ ID NO1長度34個堿基對類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型基因組DNA假設(shè)否反義否原始來源大腸桿菌噬菌體P1 DNA特征識別方法S序列描述SEQ ID NO1ATAACTTCGT ATAGCATACA TTATACGAAG TTATSEQ ID NO2長度27個堿基對類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(可以是合成DNA)假設(shè)是反義否特征識別方法S序列描述SEQ ID NO2CGATTTAAAT CGATTGTCGA CTCGCGASEQ ID NO3
長度36個堿基對類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(可以是合成DNA)假設(shè)是反義否特征識別方法S序列描述SEQ ID NO3ATCGATTCTA GACTAGTTTA ATTAATTTAA ATCGATSEQ ID NO4長度52個堿基對類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(可以是含有部分基因組DNA的DNA)假設(shè)是反義否原始來源大腸桿菌噬菌體P1 DNA特征識別方法S序列描述SEQ ID NO4CGAACGCGTA TAACTTCGTA TAGCATACAT TATACGAAGT TATCTCGAGTCGSEQ ID NO5長度30個堿基對類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(可以是包含部分基因組DNA的DNA)假設(shè)是反義否特征識別方法S序列描述SEQ ID NO5CAACTCCATG CTCAACAGTC CCCAGGTACASEQ ID NO6長度26個堿基對類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(可以是含部分基因組DNA的DNA)假設(shè)是反義否特征識別方法S序列描述SEQ ID NO6GATTTTTAAA CGGCGCAGAC GGCAAGSEQ ID NO7長度21個堿基對類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(可以是包含部分基因組DNA的DNA)假設(shè)是反義否特征識別方法S序列描述SEQ ID NO7GTGAGCTTAG AAAACCCTTA GSEQ ID NO8長度31個堿基對類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(可以是包含部分基因組DNA的DNA)假設(shè)是反義否特征識別方法S序列描述SEQ ID NO8AGATACCCCT TTTGCACTGG TGCAAGTTAA CSEQ ID NO9長度53個堿基對類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(可以是包含部分基因組DNA的DNA)假設(shè)是反義否原始來源大腸桿菌噬菌體P1 DNA特征識別方法S序列描述SEQ ID NO9CGTCTGCAGT GCATCATGAG TAATTTACTG ACCGTACACC AAAATTTGCCTGCSEQ ID NO10長度38個堿基對類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(可以是包含部分基因組DNA的DNA)假設(shè)是反義否原始來源大腸桿菌噬菌體P1 DNA特征識別方法S序列描述SEQ ID NO10GGCTCTAGAG CGCTTAATGG CTAATCGCCA TCTTCCAGSEQ ID NO11長度119個堿基對類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(可以是包含部分基因組DNA的DNA)假設(shè)是反義否原始來源大腸桿菌噬菌體P1 DNA特征識別方法S序列描述SEQ ID NO11CATGTAATTT AAATCTCGAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATACGCGTATTTAAATGT AAAAATAATG TACTAGAGAC ACTTTCAATA AAGGCAAATG CTTTTATTTSEQ ID NO12長度115個堿基對類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(可以是包含部分基因組DNA的DNA)假設(shè)是反義否原始來源大腸桿菌噬菌體P1 DNA特征識別方法S序列描述SEQ ID NO12GTACACTCTC GGGTGATTAT TTACCCCCAC CCTTGCCGTC TGCGCCGATT TAAATCTCGAGATAACTTCG TATAATGTAT GCTATACGAA GTTATACGCG TATTTAAATC CGTTT
權(quán)利要求
1.一種用于轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞的重組DNA病毒，該病毒攜帶有外源基因的調(diào)節(jié)所述外源基因表達(dá)的啟動子，其中E2A基因的功能被全部缺失。
2.按照權(quán)利要求1的重組DNA病毒，其中所說的DNA病毒是腺病毒。
3.按照權(quán)利要求1或2的重組DNA病毒，其中E2A基因區(qū)的部分或全部被缺失。
4.按照權(quán)利要求1-3的任一重組DNA病毒，其中所說的外源基因和所說的調(diào)節(jié)所述外源基因表達(dá)的啟動子以朝左側(cè)的方向被插入。
5.按照權(quán)利要求2-4的任一重組DNA病毒，其中所述腺病毒基因組已被缺失包含E1A基因區(qū)在內(nèi)的1.3到9.3％的區(qū)段。
6.按照權(quán)利要求5的重組DNA病毒，其中所說的外源基因和所說的調(diào)節(jié)所述外源基因表達(dá)的啟動子被插入在所述的區(qū)段已被缺失的位點。
7.按照權(quán)利要求6的重組DNA病毒，其中所說的腺病毒基因組已被進(jìn)一步缺失包含E3基因區(qū)在內(nèi)的79.6到84.8％的區(qū)段。
8.按照權(quán)利要求1-7的任一重組DNA病毒，其中所說的調(diào)節(jié)外源基因表達(dá)的啟動子是包含巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子、雞β-肌動蛋白啟動子、兔β-珠蛋白剪接受體和聚(A)序列的雜交啟動子(CAG啟動子)。
9.一種用于轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞的重組DNA病毒，該病毒以相同的方向攜帶位于E2A基因區(qū)兩側(cè)的兩個重組酶識別序列。
10.按照權(quán)利要求9的重組DNA病毒，其中所說的DNA病毒是一種腺病毒。
11.按照權(quán)利要求9和10的重組DNA病毒，其中所說的兩個重組酶識別序列之一位于E2A基因的和L3基因的終止密碼子之間，而不缺失兩種基因聚(A)附加信號的功能。
12.按照權(quán)利要求11的重組DNA病毒，其中兩個重組酶識別序列的另一個位于腺病毒基因組的從79.6到84.4％的讀框內(nèi)。
13.按照權(quán)利要求9-12的任一重組DNA病毒，其中所說的重組酶是得自大腸桿菌P1噬菌體的重組酶Cre。
14.按照權(quán)利要求9-13的任一重組DNA病毒，其中所說的重組酶序列的每一種是作為重組酶Cre底物的loxP的DNA序列(SEQ ID NO1)。
15.按照權(quán)利要求9-14的任一重組DNA病毒，該病毒攜帶外源基因。
16.按照權(quán)利要求15的重組DNA病毒，該病毒攜帶調(diào)節(jié)所述外源基因表達(dá)的啟動子。
17.按照權(quán)利要求16的重組DNA病毒，其中所說的外源基因和所說的調(diào)節(jié)所述外源基因表達(dá)的啟動子以朝左側(cè)的方向被插入。
18.按照權(quán)利要求10-17的任一重組DNA病毒，其中所說的腺病毒基因組已被缺失包含E1A基因區(qū)在內(nèi)的1.3到9.3％的區(qū)段。
19.按照權(quán)利要求18的重組DNA病毒，其中所說的外源基因和所說的調(diào)節(jié)所述外源基因表達(dá)的啟動子被插入在所述的區(qū)段已被缺失的位點。
20.按照權(quán)利要求19的重組DNA病毒，其中所說的腺病毒基因組已被進(jìn)一步缺失包含E3基因區(qū)在內(nèi)的79.6到84.8％的區(qū)段。
21.按照權(quán)利要求16-20的任一重組DNA序列，其中所說的調(diào)節(jié)外源基因表達(dá)的啟動子是包含巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子、雞β-肌動蛋白啟動子、兔β-珠蛋白剪接受體和聚(A)序列的雜交啟動子(CAG啟動子)。
22.一種構(gòu)建完全缺失E2A基因功能的重組DNA病毒的方法，該方法包括以下步驟將一種載體(a)和一種重組DNA柄毒(b)轉(zhuǎn)導(dǎo)到動物細(xì)胞系中，所說的載體(a)是有插入其中的啟動子、重組酶基因和聚(A)序列，所說的重組DNA病毒(b)攜帶位于E2A基因區(qū)兩側(cè)相同方向的重組酶識別序列，和切掉位于兩個重組酶識別序列之間的E2A基因區(qū)。
23.按照權(quán)利要求22的構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的重組DNA病毒(b)是一種腺病毒。
24.按照權(quán)利要求23的構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的載體(a)是一種腺病毒。
25.按照權(quán)利要求22-24的任一構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的兩個重組酶識別序列之一位于E2A基因的和L3基因的終止密碼子之間，而不缺失兩種基因聚(A)附加信號的功能。
26.按照權(quán)利要求22-25的任一構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的重組酶是得自大腸桿菌P1噬菌體的重組酶Cre。
27.按照權(quán)利要求22-26的任一構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的重組酶識別序列的每一種是作為重組酶Cre底物的loxPDNA序列(SEQ ID NO1)。
28.按照權(quán)利要求22-27的任一構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的重組DNA病毒(b)攜帶外源基因。
29.按照權(quán)利要求28的構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的重組DNA病毒(b)還攜帶調(diào)節(jié)所述外源基因表達(dá)的啟動子。
30.按照權(quán)利要求29的構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的外源基因和所說的調(diào)節(jié)所述外源基因表達(dá)的啟動子以朝左側(cè)方向被插入。
31.按照權(quán)利要求24-30的構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的載體(a)和重組DNA病毒(b)的腺病毒基因組已被缺失包含E1A基因區(qū)在內(nèi)的1.3到9.3％的區(qū)段。
32.按照權(quán)利要求31的構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的外源基因和所說的調(diào)節(jié)重組DNA病毒(b)的外源基因表達(dá)的啟動子在所述的區(qū)段已被缺失的位點被插入。
33.按照權(quán)利要求32的構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的重組DNA病毒(b)的腺病毒基因組已被進(jìn)一步缺失包含E3基因區(qū)在內(nèi)的79.6到84.8％的區(qū)段。
34.按照權(quán)利要求29-33的任一構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中所說的調(diào)節(jié)外源基因表達(dá)的啟動子是包含細(xì)胞病毒增強(qiáng)子、雞β-肌動蛋白啟動子、兔β-珠蛋白剪接受體和聚(A)序列的雜交啟動子(CAG啟動子)。
35.按照權(quán)利要求22的構(gòu)建重組DNA病毒的方法，其中E1A基因在載體(a)和重組DNA病毒(b)兩者中的功能已被缺失，其中動物細(xì)胞系是表達(dá)E1A基因的動物細(xì)胞系。
36.一種用于轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞的重組DNA病毒，該病毒攜帶有插入E2A基因的和L3基因終止密碼子之間的外源基因。
全文摘要
一種用于轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞并攜帶有外源基因和能夠調(diào)節(jié)該外源基因表達(dá)的啟動子的重組DNA病毒，該病毒的E2A基因功能被完全缺失。因此該重組DNA病毒能穩(wěn)定地將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到各種動物細(xì)胞中，導(dǎo)致外源基因在動物細(xì)胞中連續(xù)表達(dá)。外源基因的連續(xù)表達(dá)能使遺傳病得到有效的治療。
文檔編號C12N15/861GK1141340SQ9610728
公開日1997年1月29日 申請日期1996年3月14日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月15日
發(fā)明者齋藤泉, 鐘江裕美, 中井通雄 申請人:住友制藥株式會社