專利名稱：固相雜交酶顯色反應(yīng)對(duì)基因擴(kuò)增產(chǎn)物特異性定量測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種固相雜交酶顯色反應(yīng)對(duì)基因擴(kuò)增產(chǎn)物特異性定量測(cè)定方法，涉及一種對(duì)核酸分子進(jìn)行特異性定量測(cè)定的簡(jiǎn)單方法，屬醫(yī)學(xué)科技領(lǐng)域。
對(duì)樣品中微量核酸分子進(jìn)行特異性定量測(cè)定在生物醫(yī)學(xué)實(shí)踐中有著非常重要的意義。如，最近證實(shí)在艾滋病病毒(HIV)感染中，患者血液中的病毒含量是最重要臨床指標(biāo)，比CD4+細(xì)胞數(shù)能更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)病情發(fā)展。而對(duì)丙型肝炎毒病感染來說，血液中HCV的含量是影響干擾素治療效果的兩個(gè)主要因素之一。這類病毒有兩個(gè)共同特點(diǎn)，一是在被感染者血中含量低，一般的分子雜交定量方法難于檢測(cè)到；二是病毒含量在不同個(gè)體中差異很大，跨度從10考貝/毫升血液到106-7考貝/毫升血液不等，這給對(duì)這類病毒進(jìn)行定量測(cè)定造成了很大困難。至今人們已發(fā)展了幾種微量核酸定量測(cè)定方法，從技術(shù)路線上分為依賴于基因擴(kuò)增技術(shù)的間接定量法和分子雜交直接定量法。目前基于基因擴(kuò)增的定量方法，又分內(nèi)標(biāo)法和雜交——酶聯(lián)顯色法(或熒光標(biāo)記)。內(nèi)標(biāo)法需要定量參比品，使用不方便并且靠主觀判讀，至今沒有被實(shí)際應(yīng)用。而雜交——酶聯(lián)法，由于作為雜交探針的寡核苷酸是通過蛋白質(zhì)介導(dǎo)吸附在微孔反應(yīng)板上，并對(duì)顯色系統(tǒng)的選用造成不良影響，使得最終顯色光密度值與基因擴(kuò)增產(chǎn)物的定量對(duì)應(yīng)關(guān)系不理想。另一方面，分枝DNA雜交技術(shù)，雖然可較好地直接反映被測(cè)樣品中靶基因序列的濃度，但其檢測(cè)敏感性較差，最低檢測(cè)限量為500考貝/毫升。
本發(fā)明的目的在于發(fā)明一種簡(jiǎn)便、特異、快速的定量測(cè)定方法，應(yīng)用耐熱DNA聚合酶和寡核苷酸引物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，可將待測(cè)樣品中含量微少或所占比例少的核酸分子進(jìn)行特異性擴(kuò)增，大大易化了對(duì)各種來源核酸分子的分析。
本發(fā)明通過高效地將寡核苷酸探針共價(jià)固化在微孔反應(yīng)板上，以快速雜交，與生物素標(biāo)記的寡核苷酸引物的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交等幾項(xiàng)技術(shù)組合，建立了一種可特異地對(duì)微少含量核酸進(jìn)行定量檢測(cè)的簡(jiǎn)單方法。并且通過確定微孔反應(yīng)板固化探針的序列，可用來進(jìn)行基因突變及基因型的分析。
共價(jià)固化就是將特定的化學(xué)物質(zhì)，與固相物體表面上的活性基團(tuán)通過共價(jià)鍵相結(jié)合。固相分子雜交就是特異性的基因片段，與固相化的核苷酸探針進(jìn)行的雜交。
本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)及所涉及原理1、按靶基因片段所含序列或所需突變序列合成適當(dāng)長(zhǎng)度寡核苷酸探針，通過化學(xué)反應(yīng)，定向共價(jià)結(jié)合于塑料微孔反應(yīng)板(Covalink Nunc)；2、用生物素標(biāo)記的寡核苷酸引物進(jìn)行DNA聚合酶鏈反應(yīng)；3、擴(kuò)增產(chǎn)物與固相化寡核苷酸探針雜交；4、用辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗——生物素行結(jié)合顯色反應(yīng)，以光密度值反映相應(yīng)的靶基因考貝數(shù)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1、敏感性高定量反應(yīng)基因擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)推算，可測(cè)出5—50考貝/反應(yīng)；2、特異性高擴(kuò)增產(chǎn)物固相雜交，排除了非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的干擾，檢測(cè)反應(yīng)非特異本底低；3、酶反應(yīng)產(chǎn)物密度值與靶基因分子模板考貝數(shù)有良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
以對(duì)血清中丙型肝炎病毒含量定量檢測(cè)為例一、合成HCV5′非編碼區(qū)特異性寡核苷酸30mer5′末端磷酸化，500—5ng/孔，在50—12.5mM碳二亞胺的作用下，應(yīng)用10mM 1-Melm，pH7.0的緩沖液，50℃孵育5小時(shí)，然后用洗液(2×SSC-0.1％SDS)洗板7次共7分鐘，去離子水洗3次，真空抽干密封，4℃存放。
二、取血清50ul，常規(guī)抽提RNA，42℃逆轉(zhuǎn)錄，應(yīng)用特異性的5′末端生物素標(biāo)記的引物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(94℃30sec，55℃30sec，72℃lmin，35cyc1es，72℃8min延伸)。
三、取擴(kuò)增產(chǎn)物10ul，95℃變性10分鐘，后置冰浴冷卻2分鐘，加至包被好的微孔反應(yīng)板中，加雜交液(50％Formamide，5×SSC，1×FPG，25mMKH2PO4，0.2％SDS，5％dextran sulfate，200ug/ml Salmon sperm carrier DNA)至100ul，混勻，37℃雜交60分鐘。然后應(yīng)用上述洗液洗板4次共4分鐘。
四、3％小牛血清白蛋白封閉37℃10—20分鐘，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的SPavidin，2ug/ml 100ul，37℃孵育30分鐘，應(yīng)用洗液(100mM Tris pH7.4，200mM NaCl，0.3％Tween 20)洗板，4次共4分鐘。OPD系統(tǒng)顯色，室溫避光約15分鐘，100ul 2N H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)OD492nm光密度值。
權(quán)利要求
1.一種固相雜交酶顯色反應(yīng)對(duì)基因擴(kuò)增產(chǎn)物特異性定量測(cè)定方法，其特征在于它是用生物素標(biāo)記寡核苷酸引物的基因擴(kuò)增產(chǎn)物與共價(jià)固化在微孔反應(yīng)板上的特異基因片段雜交，經(jīng)酶標(biāo)記的抗生物素行顯色反應(yīng)進(jìn)行基因定量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之測(cè)定方法，其特征在于按靶基因片段所含序列或所需突變序列合成適當(dāng)長(zhǎng)度寡核苷酸探針，通過化學(xué)反應(yīng)，定向共價(jià)結(jié)合于塑料微孔反應(yīng)板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述之測(cè)定方法，其特征在于它適用于各種微量核酸分子進(jìn)行特異性定量測(cè)定。
全文摘要
本發(fā)明為固相雜交酶顯色反應(yīng)對(duì)基因擴(kuò)增產(chǎn)物特異性定量測(cè)定方法，該方法使用生物素標(biāo)記的寡核苷酸引物對(duì)靶基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物與經(jīng)共價(jià)鍵固定在微孔反應(yīng)板上的寡核苷酸進(jìn)行分子雜交，通過抗—生物素—過氧化物酶系統(tǒng)反應(yīng)顯色，對(duì)靶基因進(jìn)行定量。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1147093SQ9610903
公開日1997年4月9日 申請(qǐng)日期1996年7月31日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月31日
發(fā)明者王宇, 王鳳水 申請(qǐng)人:北京醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院