專利名稱：中國靈芝保健飲料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及非酒精飲料，特別涉及利用中國靈芝(Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang)菌種深層發(fā)酵技術(shù)所制的飲料。
自古以來中國就把靈芝視為吉祥之物，稱之為仙草。靈芝用于臨床已有悠久歷史，在《(神農(nóng)本草經(jīng))》中有這樣的記載“紫芝味甘、溫。主耳聾，利關(guān)節(jié)，保神，益精氣，堅(jiān)筋骨，好顏色。久服輕身，不老，延年?！币虼耍`芝是久經(jīng)考驗(yàn)的滋補(bǔ)強(qiáng)身、扶正固本的珍貴藥材。但是，靈芝為野生藥材，采集頗為困難，并且數(shù)量有限，如采用人工栽培，其栽培周期長并且勞動(dòng)強(qiáng)度大，產(chǎn)量低而成本高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。同時(shí)，靈芝菌絲中有效成分靈芝多糖比其子實(shí)體含量高二倍。因此，探索靈芝工業(yè)化生產(chǎn)方法成為開辟靈芝資源的重要途徑。
中國發(fā)明專利申請(qǐng)公開說明書CN1105208A公開了一種用靈芝菌種發(fā)酵制成的靈芝系列保健食品。在該發(fā)明中將從靈芝子實(shí)體分離的菌種經(jīng)深層發(fā)酵，利用深層發(fā)酵液制成靈芝飲料或口服液，用制作靈芝飲料中濾剩的濾渣為食品添加劑，制成靈芝食品。這個(gè)發(fā)明有較好的效果，但是其所用的深層發(fā)酵技術(shù)中有如下缺點(diǎn)1、所選品種沒有固定品種，品種不夠優(yōu)化，因此其產(chǎn)品質(zhì)量難以控制，從而其產(chǎn)品的保健功能也就有差別；2、在該發(fā)明的發(fā)酵產(chǎn)物中作為有效物質(zhì)的靈芝多糖含量低，一般不高于250mg/100ml；3、在該發(fā)明的深層發(fā)酵工藝中使用以大米和大豆粉作為主要氮源和碳源的液體培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基的配方不適于大工業(yè)生產(chǎn)，因?yàn)樽鳛榕囵B(yǎng)基原料的大米要經(jīng)過蒸煮、磨漿，制作程序復(fù)雜，耗時(shí)、耗工，大豆粉也要經(jīng)過復(fù)雜的處理過程，同時(shí)受地區(qū)限制，購買不易，成本也高，從而有礙靈芝保健飲料的大工業(yè)化生產(chǎn)；4、在發(fā)酵后處理的過濾過程中，把靈芝發(fā)酵液中的靈芝菌絲過濾掉是一種浪費(fèi)，因?yàn)殪`芝菌絲中也含有一部分有效成分，同時(shí)菌絲纖維有促進(jìn)消化的作用。
本發(fā)明的目的在于提供一種菌種優(yōu)化的靈芝保健飲料，利用所篩選出的品種中國靈芝菌種經(jīng)過深層發(fā)酵制成質(zhì)量高而有保證的產(chǎn)品；在深層發(fā)酵中不使用制造程序復(fù)雜的大米或大豆粉作為培養(yǎng)基的原料；發(fā)酵后不經(jīng)過濾，使有效成分得以最大限度保留；獲得含有靈芝多糖量高而成本低的靈芝飲料。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的提供一種以靈芝菌株經(jīng)深層發(fā)酵，以其發(fā)酵液制作靈芝飲料，所用的靈芝采用中國靈芝CGMCC0270。本菌種的株名為60593(M)靈芝屬，本菌種已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)申請(qǐng)菌種保藏，保藏日期1996年8月23日，保藏號(hào)CGMCC No.0270。中國靈芝這個(gè)菌種是從近百種靈芝品種中經(jīng)篩選、培養(yǎng)、研究后優(yōu)選出來的獨(dú)具特色的菌種。該種靈芝子實(shí)體特征為菌蓋呈半圓形、近圓形或近匙形，2.5～9.5×2.2～8cm，有時(shí)可更大，厚0.4～1.2cm，表面紫黑色到近黑色，有時(shí)紫褐色，有似漆樣光澤，具明顯或不明顯的同心環(huán)溝和縱皺；邊緣薄或鈍，常近似截形，與菌蓋同色，較淡或呈黃褐色。菌肉均勻褐色到深褐色，厚0.1～0.3cm，菌管長0.3～1cm，褐色、深褐色或灰褐色?？酌嫖郯咨?、淡褐色到褐色；管口略圓形，每毫米5～6個(gè)。菌柄側(cè)生、背側(cè)生或偏生，圓柱形或略扁平，長7～19cm，粗0.5～1cm，與菌蓋同色或顏色更深，有光澤。
擔(dān)孢子卵圓形，頂端臍凸或稍平截，雙層壁，外壁透明無色、平滑，內(nèi)壁淡褐色，具明顯小刺，擔(dān)孢子大小為9～13.8×6.5～8.1μm。
中國靈芝生于林中闊葉樹或針葉樹木樁上，產(chǎn)地在中國海南。
中國靈芝菌種的生物學(xué)特征是純白色，絨毛狀，在固體培養(yǎng)基上初期白色，后期部分變淺黃色。在平面培養(yǎng)基上一般7天即可長滿；在顯微鏡下菌絲無色、纖細(xì)并具分枝、橫膈膜和鎖狀聯(lián)合；菌絲在液體培養(yǎng)時(shí)比固體培養(yǎng)時(shí)粗，原生質(zhì)豐富，橫膈膜和鎖狀聯(lián)合多而清晰，在發(fā)酵液中呈乳黃色菌球懸浮；在-18℃下菌絲變粗，原生質(zhì)聚集，仍有橫膈膜和鎖狀聯(lián)合，但形態(tài)改變，4天死亡。
對(duì)此菌種采用如下深層發(fā)酵工藝(1)菌種斜面培養(yǎng)，是在斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行斜面種子靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27～28℃，培養(yǎng)時(shí)間一般需要7天，所用斜面培養(yǎng)基是綜合PDA培養(yǎng)基，其組成是土豆10～20％、葡萄糖2～4％、磷酸二氫鉀0.2～0.4％，硫酸鎂0.15～0.3％、維生素B1 0.1～0.2％，瓊脂1.8～2％
(2)搖瓶培養(yǎng)用斜面培養(yǎng)的種子制成菌懸液，在搖瓶培養(yǎng)基中，溫度26-28℃下，在轉(zhuǎn)速為180-200轉(zhuǎn)/分鐘的搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，所用搖瓶培養(yǎng)基為蔗糖1～3％、酵母粉1～2％、磷酸二氫鉀0.2～0.4％、硫酸鎂0.15～0.3％、維生素B10.1～0.2％、PH值自然。其中，一級(jí)搖瓶培養(yǎng)5～7天，二級(jí)搖瓶培養(yǎng)4～5天。
(3)種子罐培養(yǎng)將二級(jí)搖瓶種子接種到種子罐培養(yǎng)液中，接種量為10％，培養(yǎng)溫度為26～28℃，通氣量為1∶0.7～1(V/V)，攪拌轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間40～45小時(shí)，所用種子罐培養(yǎng)液與搖瓶培養(yǎng)液相同。
(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)用種子罐的種子按10％的接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度26～28℃，通氣量為1∶0.7～1(V/V)，攪拌轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間2～3天，發(fā)酵罐培養(yǎng)液與搖瓶培養(yǎng)液相同。
(5)將發(fā)酵罐培養(yǎng)的發(fā)酵液加熱至80℃，加熱10分鐘滅活后冷卻，稀釋，加入調(diào)味料，即制成靈芝保健飲料，或不經(jīng)稀釋，加入調(diào)味料，即制成靈芝保健口服液。
本發(fā)明具有良好的效果，本飲料和口服液的外觀、香味、口感很好；含有豐富的比現(xiàn)有技術(shù)高3～5倍的靈芝多糖，達(dá)1000～1500mg/100ml，以及豐富的氨基酸、微量元素；在飲料中含有豐富的靈芝菌絲構(gòu)成的纖維素，對(duì)消化有促進(jìn)作用；經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，對(duì)提高人體免疫機(jī)能有較好的效果，還對(duì)愛滋病毒HIV有一定的抑制作用，抑制率達(dá)56.4％；培養(yǎng)基采用蔗糖培養(yǎng)基，蔗糖易于購買，便于大工業(yè)化生產(chǎn)。
附圖的圖面說明

圖1.中國靈芝子實(shí)體的正面圖；圖2.中國靈芝子實(shí)體的背面圖；圖3.中國靈芝菌種在平面培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天的狀態(tài)；圖4.中國靈芝菌種在平面培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天的狀態(tài)；圖5.在顯微鏡下菌絲的橫隔膜1和鎖狀聯(lián)合2的狀態(tài)；圖6.本發(fā)明菌絲體A與子實(shí)體B的5S RNA(核糖體RNA)PCR(DNA聚合酶體外擴(kuò)增反應(yīng))擴(kuò)增產(chǎn)物酶切分析圖譜。本圖譜用于在分子水平上進(jìn)行分類。
圖7.中國靈芝在斜面培養(yǎng)4天②和培養(yǎng)7天①的狀態(tài)；以下對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例結(jié)合附圖作進(jìn)一步描述
圖1是中國靈芝子實(shí)體正面照片，圖2是中國靈芝子實(shí)體背面照片，其子實(shí)體特征如前所述。
圖3為本菌種在平面培養(yǎng)基中培養(yǎng)培養(yǎng)4天后，菌落呈放射性展開的形態(tài)；圖4為本菌種在平面培養(yǎng)基中培養(yǎng)培養(yǎng)7天后，菌落長滿培養(yǎng)基表面的狀態(tài)。圖5為菌絲細(xì)胞間的橫隔膜1和鎖狀聯(lián)合2的電子顯微鏡照片。以上三幅圖說明中國靈芝菌種的生物學(xué)特征，具體內(nèi)容如前所述。
圖6為本發(fā)明菌絲體A與子實(shí)體B的5S RNA(核糖體RNA)PCR(DNA聚合酶體外擴(kuò)增反應(yīng))擴(kuò)增產(chǎn)物酶切分析圖譜。該圖譜用于在分子水平上進(jìn)行分類其中A為菌絲體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，B為子實(shí)體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，本圖譜說明本發(fā)明深層發(fā)酵技術(shù)中采用的菌種的菌絲和子實(shí)體是屬于同一菌株。
菌種的培養(yǎng)過程及飲料的配制方法(1)菌種的斜面培養(yǎng)是在斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行斜面種子靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27～28℃，培養(yǎng)時(shí)間一般需7天，所用的斜面培養(yǎng)基是綜合PDA培養(yǎng)基，其組成是土豆10～20％、葡萄糖2～4％、磷酸二氫鉀0.2～0.4％，硫酸鎂0.15～0.3％、維生素B1 0.1～0.2％，瓊脂1.8～2％圖7是中國靈芝菌種在斜面培養(yǎng)4天②及7天①的狀態(tài)，其中②培養(yǎng)4天后，菌落以接種部位為中心呈放射狀向外擴(kuò)展。①培養(yǎng)7天后，菌落長滿培養(yǎng)基表面。
(2)搖瓶培養(yǎng)用斜面培養(yǎng)的種子制成菌懸液，在搖瓶培養(yǎng)液中，溫度26～28℃下，在轉(zhuǎn)速為180～200轉(zhuǎn)/分鐘的搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，所用搖瓶培養(yǎng)液為蔗糖1～3％、酵母粉1～2％、磷酸二氫鉀0.2～0.4％、硫酸鎂0.15～0.3％、維生素B10.1～0.2％、PH值自然。其中，一級(jí)搖瓶培養(yǎng)5～7天，二級(jí)搖瓶培養(yǎng)4～5天。250ml三角瓶搖瓶發(fā)酵結(jié)果如表1所示，可見其中含有豐富的靈芝多糖。
表1 250ml三角瓶搖瓶發(fā)酵結(jié)果
(3)種子罐培養(yǎng)用二級(jí)搖瓶種子液接種到種子罐培養(yǎng)液中，接種量為10％，溫度為26～28℃，通氣量為1∶0.7～1(V/V)，攪拌轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間40～45小時(shí)，所用種子罐培養(yǎng)液與搖瓶培養(yǎng)液相同。
(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)將種子罐的種子按10％的比例接種到發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度26～28℃，通氣量為1∶0.7～1(V/V)，攪拌轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間2～3天，發(fā)酵罐培養(yǎng)液與搖瓶培養(yǎng)液相同。
(5)將發(fā)酵罐培養(yǎng)的發(fā)酵液加熱至80℃，加熱10分鐘滅活后冷卻，稀釋，加入調(diào)味料，即制成靈芝保健飲料。
本發(fā)明飲料的配制方法如下將上述中國靈芝發(fā)酵液加4～5倍水，加入2～5％的蔗糖或蛋白糖，加1～2％的乳酸，經(jīng)攪拌后即成為靈芝飲料。也可將原發(fā)酵液不加水加入調(diào)味料制成保健口服液。
本發(fā)明靈芝飲料外觀、香味和口感均佳，含有豐富的靈芝多糖、氨基酸和微量元素；飲料中含有豐富的靈芝菌絲構(gòu)成的纖維素，能促進(jìn)消化；經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，能提高人體免疫機(jī)能，對(duì)愛滋病毒HIV的抑制率達(dá)56.4％。表2是由北京市營養(yǎng)源研究所作的氨基酸分析結(jié)果，使用的儀器是日立835-50型色譜儀。色氨酸以4.2N的NaOH的水解法測(cè)定，以過甲酸氧化法處理測(cè)定胱氨酸，其余氨基酸以6N的HCl水解測(cè)定，上柱體積為50微升，表2說明氨基酸含量豐富；表3是由北京市營養(yǎng)源研究所就微量元素所作的分析結(jié)果除表上所列的豐富的微量元素外，未檢出作為有害元素的鉛和砷，因此，對(duì)人體健康有益而無害。此外，經(jīng)南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程所對(duì)本發(fā)明菌種深層發(fā)酵產(chǎn)物1025B用合胞體檢定、細(xì)胞存活率檢定和Luc活力檢測(cè)三種方法檢測(cè)證實(shí)本發(fā)明菌種的深層發(fā)酵產(chǎn)物具有一定的抑制合胞體形成的作用，以AZT作正對(duì)照藥物證實(shí)本發(fā)明菌種的深層發(fā)酵產(chǎn)物1025b對(duì)愛滋病毒HIV有一定的抑制作用，抑制率為56.4％。
表2 氨基酸分析結(jié)果(mg/100mg樣品)
表3 微量元素分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.中國靈芝保健飲料，以靈芝菌株經(jīng)深層發(fā)酵，以其發(fā)酵液制成靈芝飲料，其特征在于采用中國靈芝(Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang)CGMCC No.0270，本菌種子實(shí)體的菌蓋呈半圓形、近圓形或近匙形，2.5～9.5×2.2～8cm，有時(shí)可更大，厚0.4～1.2cm，表面紫黑色到近黑色，有時(shí)紫褐色，有似漆樣光澤，具明顯或不明顯的同心環(huán)溝和縱皺；邊緣薄或鈍，常近似截形，與菌蓋同色，較淡或呈黃褐色；菌肉均勻褐色到深褐色，厚0.1～0.3cm，菌管長0.3～1cm，褐色、深褐色或灰褐色；孔面污白色、淡褐色到褐色；管口略圓形，每毫米5～6個(gè)；菌柄側(cè)生、背側(cè)生或偏生，圓柱形或略扁平，長7～19cm，粗0.5～1cm，與菌蓋同色或顏色更深，有光澤；擔(dān)孢子卵圓形，頂端臍凸或稍平截，雙層壁，外壁透明無色、平滑，內(nèi)壁淡褐色，具明顯小刺，擔(dān)孢子大小為9～13.8×6.5～8.1μm；中國靈芝生于林中闊葉樹或針葉樹木樁上，產(chǎn)地在中國海南；中國靈芝菌種的生物學(xué)特征是純白色，絨毛狀，在固體培養(yǎng)基上初期白色，后期部分變淺黃色；在平面培養(yǎng)基上一般7天即可長滿；在顯微鏡下菌絲無色、纖細(xì)并具分枝、橫膈膜和鎖狀聯(lián)合；菌絲在液體培養(yǎng)時(shí)比固體培養(yǎng)時(shí)粗，原生質(zhì)豐富，橫膈膜和鎖狀聯(lián)合多而清晰，在發(fā)酵液中呈乳黃色菌球懸浮；在-18℃下菌絲變粗，原生質(zhì)聚集，仍有橫膈膜和鎖狀聯(lián)合，但形態(tài)改變，4天死亡；此菌種采用如下深層發(fā)酵工藝(1)菌種斜面培養(yǎng)，是在斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行斜面種子靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27～28℃，培養(yǎng)時(shí)間一般需要7天，所用斜面培養(yǎng)基是綜合PDA培養(yǎng)基，其組成是土豆10～20％、葡萄糖2～4％、磷酸二氫鉀0.2～0.4％，硫酸鎂0.15～0.3％、維生素B10.1～0.2％，瓊脂1.8～2％(2)搖瓶培養(yǎng)用斜面培養(yǎng)的種子制成菌懸液，在搖瓶培養(yǎng)液中，在溫度26～28C下，在轉(zhuǎn)速為180～200轉(zhuǎn)/分鐘的搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，所用搖瓶培養(yǎng)液為蔗糖1～3％、酵母粉1～2％、磷酸二氫鉀0.2～0.4％、硫酸鎂0.15～0.3％、維生素B10.1～0.2％、PH值自然；其中，一級(jí)搖瓶培養(yǎng)5～7天，二級(jí)搖瓶培養(yǎng)4～5天；(3)種子罐培養(yǎng)將二級(jí)搖瓶種子接種到種子罐培養(yǎng)液中，接種量為10％，培養(yǎng)溫度為26～28℃，通氣量為1∶0.7～1(V/V)，攪拌轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間40～45小時(shí)，所用種子罐培養(yǎng)液與搖瓶培養(yǎng)液相同；(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)將種子罐的種子按10％的接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度26～28C，通氣量為1∶0.7～1(V/V)，攪拌轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間2～3天，發(fā)酵罐培養(yǎng)液與搖瓶培養(yǎng)液相同；(5)將發(fā)酵罐培養(yǎng)的發(fā)酵液加熱至80℃，加熱10分鐘滅活后冷卻，稀釋，加入調(diào)味料，即制成靈芝保健飲料。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用中國靈芝菌種深層發(fā)酵技術(shù)所制靈芝保健飲料。本發(fā)明將從中國靈芝的子實(shí)體分離的菌株經(jīng)深層發(fā)酵，將發(fā)酵液經(jīng)滅活、稀釋并加入輔料制成靈芝保健飲料。所用搖瓶培養(yǎng)基采用蔗糖培養(yǎng)基，便于大工業(yè)生產(chǎn)，本發(fā)明所用菌種優(yōu)化，采用中國靈芝(Ganoderma sinense Zhao，Xuet Zhang)，發(fā)酵產(chǎn)物中含靈芝多糖高，較現(xiàn)有技術(shù)高3～5倍，含氨基酸及微量元素豐富，能增強(qiáng)人體免疫力，保健強(qiáng)身，是一種口味、香味均好的保健飲料。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1151847SQ9610909
公開日1997年6月18日 申請(qǐng)日期1996年8月28日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月28日
發(fā)明者張小青, 邱秀寶 申請(qǐng)人:海南保麗康生物科技食品有限責(zé)任公司