專利名稱：檢測(cè)微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)微生物的方法，該方法例如用于半導(dǎo)體用洗液的質(zhì)量控制、傳染病的診斷、環(huán)境微生物的檢測(cè)、食品中微生物的檢查等方面。
檢測(cè)微生物是出于各種目的，例如，半導(dǎo)體用洗液的質(zhì)量控制、傳染病的診斷、環(huán)境微生物的檢測(cè)、食品中微生物的檢查。
作為檢測(cè)微生物的方法，可以舉出的例子有①培養(yǎng)法，它包括把試樣直接加入培養(yǎng)基并對(duì)這樣形成的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)；②全細(xì)胞計(jì)數(shù)法，它包括，通過過濾試樣在濾膜上收集試樣中的細(xì)胞，然后固定、熒光染色、顯微觀察法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；③聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法，它包括考察菌株的核酸(多核苷酸)鏈特征的存在；④流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法，它包括，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，再行檢測(cè)；⑤ATP檢測(cè)法，它包括，檢測(cè)細(xì)胞中腺苷5′-三磷酸(ATP)來進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。所有這些方法都存在一些問題，并且不是能進(jìn)行簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)的方法。
例如，培養(yǎng)法的缺點(diǎn)是，由于培養(yǎng)通常需要24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間(在一些情況下，真菌綱的檢測(cè)需要1周或更長(zhǎng)時(shí)間)，該方法不能進(jìn)行快速檢測(cè)。另外的缺點(diǎn)是，在一些情況下，由于不能用常規(guī)方法培養(yǎng)某些細(xì)菌，所以試樣中的微生物被漏掉了。全細(xì)胞計(jì)數(shù)法的缺點(diǎn)在于，為進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)需要象熒光顯微鏡、圖象分析儀等這樣的昂貴設(shè)備。PCR法的缺點(diǎn)是難于計(jì)量微生物細(xì)胞的總數(shù)。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法的缺點(diǎn)在于，例如微生物檢測(cè)極限低，而且由于固定用試劑(例如福爾馬林)的噪音使測(cè)量精度降低。ATP檢測(cè)法的缺點(diǎn)是，為進(jìn)行檢測(cè)需要昂貴的測(cè)量設(shè)備。
為解決這類問題，開發(fā)了一種方法，它包括把要進(jìn)行微生物檢測(cè)的試樣與含有前酚(pro-pheno1)氧化酶系統(tǒng)非活性型因子的昆蟲體液(下文中昆蟲體液縮寫為“PPO試劑”)混合使它們反應(yīng)，例如觀測(cè)由于至少一種微生物細(xì)胞壁成分(例如(1→3)-β-D-葡聚糖(下文簡(jiǎn)稱“β-葡聚糖”)或肽聚糖的染色度，以及根據(jù)觀測(cè)結(jié)果檢測(cè)微生物。不過，由于這種方法涉及象下面這樣的問題，所以也不是優(yōu)選方法。由于該方法中試樣直接與PPO試劑混合，所以檢測(cè)易于受象試樣中鹽濃度這樣的因素影響。具體地說，鹽濃度高時(shí)，檢測(cè)靈敏度降低，這就需要很大精力去確定檢測(cè)條件。為檢測(cè)高鹽濃度試樣中的微生物，通常不可避免的是，微生物檢測(cè)針對(duì)適當(dāng)稀釋的試樣進(jìn)行。因此，降低了檢測(cè)靈敏度和測(cè)量精度。被不是得自微生物的β-葡聚糖所污染的樣品，這種情形中，檢測(cè)結(jié)果可能是假陽性的。
鑒于這些情況，要用本發(fā)明解決的問題是提供一種簡(jiǎn)便、快速且高精度地檢測(cè)各種試樣中微生物的方法。
本發(fā)明提供一種檢測(cè)微生物的方法，該方法包括，把試樣濾過一個(gè)濾膜，洗滌濾膜，把濾膜上的殘留物與含有前酚氧化酶系統(tǒng)非活性型因子的昆蟲體液反應(yīng)，以及根據(jù)由此引起的顏色變化檢測(cè)試樣中的微生物。


圖1表示實(shí)施例1得到的德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)檢測(cè)結(jié)果。
圖2表示實(shí)施例1得到的大腸桿菌(Escherichia coli)檢測(cè)結(jié)果。
圖3表示實(shí)施例2得到的大腸桿菌檢測(cè)結(jié)果。
圖4是表示實(shí)施例3所得結(jié)果的示意圖，其中試樣含有枯草桿菌(Bacillus subtilis)。
圖5是表示實(shí)施例3所得結(jié)果的示意圖，其中試樣含有德氏乳桿菌。
圖6是表示采用了各種細(xì)菌的實(shí)施例3所得結(jié)果的示意圖。
圖7是表示實(shí)施例4所得結(jié)果的示意圖。
圖8是表示對(duì)比例3所得結(jié)果的示意圖。
本發(fā)明檢測(cè)微生物的方法包括，把試樣濾過一個(gè)濾膜，洗滌濾膜，把濾膜上的殘留物與PPO試劑反應(yīng)，以及根據(jù)由此引起的顏色變化檢測(cè)試樣中的微生物。
在探尋用一種PPO試劑簡(jiǎn)便、快速和高精度地檢測(cè)各種試樣中微生物的方法的過程中，本發(fā)明人做出如下的發(fā)現(xiàn)，根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。當(dāng)把試樣濾過一個(gè)孔徑大小適宜的濾膜，洗滌濾膜再與PPO試劑反應(yīng)時(shí)，可以得到下述優(yōu)勢(shì)。(1)采用一種PPO試劑可以簡(jiǎn)便、快速、高精度地檢測(cè)一種或多種微生物，而不會(huì)有下列問題檢測(cè)易受試樣中鹽濃度的影響，并且當(dāng)鹽濃度高時(shí)，檢測(cè)靈敏度降低，這就需要很大精力去確定檢測(cè)條件；在這種情形中，不可避免的是，微生物檢測(cè)針對(duì)適當(dāng)稀釋的試樣進(jìn)行，降低了檢測(cè)靈敏度和測(cè)量精度；在試樣被不是得自微生物的β-葡聚糖所污染的情形中，檢測(cè)結(jié)果可能是假陽性的。(2)將試樣濾過濾膜得以濃縮，這樣就提高了檢測(cè)靈敏度。
對(duì)用于本發(fā)明檢測(cè)方法的試樣沒有特別的限制，只要有必要檢測(cè)試樣中微生物的存在即可。例如，試樣包括半導(dǎo)體用洗液、體液(例如血液、血漿、血清和腦脊髓液)、尿、自來水、工廠廢物、食品、飲料、洗滌象血透儀、醫(yī)療器械等這樣的儀器后的溶液。
對(duì)用于本發(fā)明的濾膜沒有特別的限制，只要它具有適宜的孔徑大小并且不與PPO試劑反應(yīng)(或者與其反應(yīng)但反應(yīng)程度不會(huì)妨礙微生物的檢測(cè))即可。濾膜的優(yōu)選實(shí)例是板式(膜式)濾膜，這些濾膜由象聚偏氟乙烯、聚砜、聚四氟乙烯(PTFE)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚酰胺、尼龍或纖維素衍生物(例如乙酸纖維素、硝酸纖維素或其混合物)這樣的材料制成，而且容易判斷由β-葡聚糖和/或肽聚糖與PPO試劑反應(yīng)引起的顏色。當(dāng)使用一種由通常易于受β-葡聚糖污染的纖維素衍生物制成的濾膜時(shí)，必須檢查濾膜是否受到污染。如果受到污染，最好用常規(guī)手段除去污染物。
可以把可商購(gòu)的濾膜原樣用于本發(fā)明?？缮藤?gòu)的濾膜的具體例子有Durapore(一種聚偏氟乙烯濾膜，Japan Millipore Ltd.生產(chǎn))、HTTuffryn(一種聚砜濾膜，Gelman Sciences Inc.生產(chǎn))、Millex(一種聚四氟乙烯濾膜，Japan Millipore Ltd.生產(chǎn))、Isopore(一種聚乙烯吡咯烷酮濾膜，Japan Millipore Ltd.生產(chǎn))、聚酰胺濾膜(購(gòu)自SartoriusAG)、尼龍濾膜(購(gòu)自Corning Inc.)、乙酸纖維素濾膜和硝酸纖維素濾膜(購(gòu)自Iwaki Glass Co.，Ltd.)以及一種纖維素濾膜MF-Milli-pore(購(gòu)自Japan Millipore Ltd.)。
本發(fā)明中，通過適當(dāng)選擇所用濾膜的孔徑大小，可將待測(cè)微生物的種類限制在一定范圍內(nèi)。例如，要檢測(cè)細(xì)菌和真菌綱時(shí)，孔徑大小為0.2μm或0.45μm的濾膜是優(yōu)選的。要檢測(cè)象酵母和霉菌這樣的真菌時(shí)，孔徑大小為1.2μm～3μm的濾膜是優(yōu)選的。要檢測(cè)霉菌時(shí)，孔徑大小為5μm或更大的濾膜是優(yōu)選的。例如，在試樣含有包括細(xì)菌在內(nèi)的多種微生物的情況下，把試樣濾過一個(gè)孔徑大小為1.2μm～3μm的濾膜，把濾液濾過一個(gè)孔徑大小為0.2μm或0.45μm的濾膜，再對(duì)后一濾膜進(jìn)行本發(fā)明的檢測(cè)，這樣只能檢測(cè)到這些微生物中的細(xì)菌。
作為用于本發(fā)明的濾器，可用下列任一類型的濾器(1)由板式濾膜和支架構(gòu)成的產(chǎn)品，濾膜和支架相互分開，因此可以單獨(dú)滅菌；(2)整體式一次性的滅菌產(chǎn)品。也可使用裝有濾膜的微量滴定板(例如Multiscreen GV Filter Plate，Japan Millipore Ltd.生產(chǎn))。
當(dāng)這類濾膜受到肽聚糖或β-葡聚糖污染時(shí)，最好用常規(guī)手段除去污染物。
可以把任何PPO試劑用作本發(fā)明中所用的PPO試劑，只要該試劑得自昆蟲體液、含有前酚氧化酶系統(tǒng)非活化型因子且能夠與微生物細(xì)胞壁中存在的β-葡聚糖和肽聚糖中的至少一種物質(zhì)反應(yīng)激活酚氧化酶即可。既然PPO試劑可以與微生物細(xì)胞壁中存在的β-葡聚糖和/或肽聚糖反應(yīng)而變黑，PPO試劑自身就可用于本發(fā)明。但是，PPO試劑也可以與所謂的合成底物混合后使用。這種合成底物是一種酶的底物，這種酶能通過PPO試劑與β-葡聚糖和/或肽聚糖反應(yīng)而激活，并由于酶的作用產(chǎn)生一種適宜的有色物質(zhì)或包括熒光物質(zhì)在內(nèi)的類似物質(zhì)。
PPO試劑通常是用常規(guī)方法由昆蟲體液制備的，而且該試劑可以通過由遺傳重組制備的前酚氧化酶系統(tǒng)非活性型因子的適當(dāng)組合來制備。
盡管對(duì)針對(duì)其體液進(jìn)行收集的昆蟲沒有特別的限制，昆蟲是越多越好，而且可以用已有方法養(yǎng)殖。昆蟲包括，例如，鱗翅目，如煙草天娥，Gelleria melonella，Hyalphoma ceropia，家蠶等；雙翅目，如Sar-cophage peregria，家蠅等；直翅目，如飛蝗，migratoria Teleogryllus等；以及鞘翅目，如天牛等。但昆蟲并不局限于這些。作為體液，從體腔收集的血液是最容易得到的，所以通常使用血液。
作為從上面列舉的昆蟲收集體液的方法，可以舉一個(gè)例子。把昆蟲放到冰上以阻止其移動(dòng)；把含蔗糖的生理鹽水注射到體腔內(nèi)，其中蔗糖中含有甘蔗因子，甘蔗因子含有包括葡萄糖、氨基酸和得自甘蔗因子的其它成分在內(nèi)的高分子量物質(zhì)，作為雜質(zhì)或含有甘蔗因子的生理鹽水。把昆蟲放置一會(huì)兒，然后從體腔收集血液。把由此獲得的血液離心使不含血細(xì)胞，再進(jìn)行透析，這樣就得到可用作本發(fā)明PPO試劑的血漿。在這種血漿中，同時(shí)存在一種能與β-葡聚糖發(fā)生特異反應(yīng)以顯示酶活性或誘導(dǎo)酶活性的物質(zhì)和一種能與肽聚糖發(fā)生特異反應(yīng)以顯示酶活性或誘導(dǎo)酶活性的物質(zhì)。所以，把血漿用作PPO試劑時(shí)，有可能檢測(cè)出含有β-葡聚糖或肽聚糖作為細(xì)胞壁成分的所有微生物?？墒褂蒙藤?gòu)試劑作為這種試劑(例如，SLPTM試劑，購(gòu)自Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)。
對(duì)上述昆蟲血漿進(jìn)行適當(dāng)處理，也可以得到一種與β-葡聚糖反應(yīng)但不與肽聚糖反應(yīng)的PPO試劑以及一種與肽聚糖反應(yīng)但不與β-葡聚糖反應(yīng)的PPO試劑。也就是說，制備能特異性檢測(cè)β-葡聚糖的PPO試劑的方法的實(shí)施例披露于JP-A 63-141598(U.S.P.4,970,152)中；制備能特異性檢測(cè)肽聚糖的PPO試劑的方法的實(shí)施例披露于JP-A 63-141599(U.S.P.4,970,152)中。
下面對(duì)這些方法作進(jìn)一步闡述。
按上述方法獲得的血漿中，同時(shí)存在著一種不與內(nèi)毒素反應(yīng)但與β-葡聚糖特異性反應(yīng)以顯示酶活力或誘導(dǎo)酶活力的物質(zhì)以及一種與肽聚糖特異性反應(yīng)以顯示酶活力或誘導(dǎo)酶活力的物質(zhì)。為獲得能特異性檢測(cè)β-葡聚糖的PPO試劑，從上述血漿中除去這種能與肽聚糖反應(yīng)以顯示酶活力或誘導(dǎo)酶活力的物質(zhì)就足夠了。為獲得能特異性檢測(cè)肽聚糖的PPO試劑，從上述血漿中除去這種能與β-葡聚糖反應(yīng)以顯示酶活力或誘導(dǎo)酶活力的物質(zhì)就足夠了。作為從上述血漿中除去能與肽聚糖反應(yīng)以顯示酶活力或誘導(dǎo)酶活力的物質(zhì)的方法，或者從上述血漿中除去能與β-葡聚糖反應(yīng)以顯示酶活力或誘導(dǎo)酶活力的物質(zhì)的方法，可以舉出的例子有生物化學(xué)領(lǐng)域中常用的分離和純化方法。用采用結(jié)合肽聚糖的載體的親和層析可以非常簡(jiǎn)便、有效地除去能與肽聚糖反應(yīng)以顯示酶活力或誘導(dǎo)酶活力的物質(zhì)。采用結(jié)合β-葡聚糖的載體的親和層析可以非常簡(jiǎn)便、有效地除去能與β-葡聚糖反應(yīng)以顯示酶活力或誘導(dǎo)酶活力的物質(zhì)。
例如，本發(fā)明的方法實(shí)際上是下述這樣實(shí)施的。
首先，把適量的試樣濾過一個(gè)如上所述的合適的濾膜，在濾膜上截留包括細(xì)菌和真菌綱(例如，酵母和霉菌)在內(nèi)的微生物。然后，用合適的洗液洗滌濾膜，除去試樣中存在的、除微生物之外的物質(zhì)。把適當(dāng)體積的上述那種PPO試劑滴到經(jīng)上述處理的濾膜上，使反應(yīng)在一定條件(如0～50℃、優(yōu)選20～40℃)下發(fā)生。之后觀察濾膜顏色隨時(shí)間的變化?？梢詸z測(cè)出試樣中微生物的存在或者根據(jù)這種情況下引起的顏色變化和負(fù)對(duì)照試驗(yàn)以及正對(duì)照試驗(yàn)引起的顏色變化的差異可以測(cè)定試樣中微生物濃度。負(fù)對(duì)照試驗(yàn)是這樣進(jìn)行的，即除了使用不含β-葡聚糖和肽聚糖的水、緩沖液或類似物質(zhì)作為試樣外，采用上述相同試劑、使用相同方法。正對(duì)照試驗(yàn)是這樣進(jìn)行的，即除了使用含有適宜濃度微生物的試樣溶液之外，采用上述相同試劑、使用相同方法。在上述測(cè)定中，改變正對(duì)照試驗(yàn)可以進(jìn)行微生物濃度的半定量測(cè)定。
上述方法中，也可進(jìn)行下列步驟把裝有濾膜的微量滴定板(例如Multiscreen GV Filter Plate，Japan Milipore Ltd.生產(chǎn))用作濾器將許多試樣過濾，洗滌濾膜，再與PPO試劑進(jìn)行反應(yīng)，之后用微量滴定板讀數(shù)器觀察濾膜的顏色變化。根據(jù)觀察結(jié)果檢測(cè)出每個(gè)試樣中微生物的存在或每個(gè)試樣中微生物濃度。用這種方法檢測(cè)微生物時(shí)，可對(duì)大量試樣快速地進(jìn)行目標(biāo)檢測(cè)。
另外，由于上述檢測(cè)是這樣進(jìn)行的，即把試樣濾過一個(gè)濾膜，洗滌濾膜，然后使濾膜與一種PPO試劑反應(yīng)，所以，幾乎沒有試樣中的鹽、水溶性β-葡聚糖等影響檢測(cè)的可能性。
對(duì)上述方法中所用洗液沒有特別的限制，只要該洗液未受到β-葡聚糖和肽聚糖的污染而且不會(huì)降低濾膜性能即可。洗液的適宜例子有水和pH6～8、含有10～150mM(優(yōu)選20～40mM)緩沖液(例如，Goods緩沖液或磷酸鹽緩沖液)或鹽(例如NaCl)的溶液。
把一種堿液(10mM～4M，優(yōu)選50mM～1M)用作洗液，可以洗掉水不溶性β-葡聚糖。所以，在估計(jì)含有水不溶性β-葡聚糖的試樣中，可以特異性地檢測(cè)出得自試樣所含細(xì)菌的肽聚糖。方法是用這種洗液洗滌濾膜再選擇性地使用上述那種普通洗液。
在檢測(cè)含脂試樣(如化妝用膏、飼料漿等)或含有機(jī)溶劑的試樣時(shí)，可以消除試樣中這些物質(zhì)的影響。方法是，把適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑用作洗液洗滌濾膜，接著用上述的普通洗液洗滌濾膜。
下面結(jié)合實(shí)施例和對(duì)比例更詳細(xì)地闡述本發(fā)明，這些例子不是限制性的而是用于舉例說明。
實(shí)施例1(1)試劑和裝置·PPO試劑使用一種溶液，該溶液是通過把得自家蠶血液的可商購(gòu)PPO試劑(SLPTM試劑，購(gòu)自Wako Pure Chemical Industries，Ltd.；3ml)溶于6ml裝于SLPTM試劑盒(購(gòu)自Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)中的溶劑中而制備的。
·濾膜使用Millex 4mm GV(Japan Millipore Ltd.生產(chǎn))。
·水和洗液使用Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.生產(chǎn)的注射用水。
·3％氯化鈉水溶液使用一種溶液，該溶液是這樣制備的，即把250℃熱處理2小時(shí)的氯化鈉(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產(chǎn)；特級(jí))溶于注射用水中達(dá)到濃度為3％。(2)試樣把各種懸浮液用作試樣，懸浮液是這樣制備的，即把乳酸菌(德氏乳桿菌)或大腸桿菌以103、104或105細(xì)胞/毫升的量懸浮于注射用水中或3％氯化鈉水溶液中。(3)檢測(cè)方法用2ml洗液洗滌濾膜，接著把每種預(yù)定試樣各1ml濾過經(jīng)洗滌的濾膜。用2ml洗液洗滌該濾膜，之后把0.01ml PPO試劑滴在濾膜上，目視觀察濾膜的著色度。(4)結(jié)果圖1表示把用水制備的不同濃度德氏乳桿菌懸浮液作為試樣時(shí)所得到的結(jié)果。圖2表示把用注射用水制備的不同濃度大腸桿菌懸浮液作為試樣時(shí)所得到的結(jié)果。圖1和圖2都表示出負(fù)對(duì)照試驗(yàn)(NC)的結(jié)果。進(jìn)行負(fù)對(duì)照試驗(yàn)是出于對(duì)比的目的，采用與制備各種試樣時(shí)相同的水作為試樣。
從圖1和圖2可以看出，通過過濾作用而有細(xì)胞截留于其上的濾膜比負(fù)對(duì)照試驗(yàn)(NC)處理過的濾膜著色速率明顯加快，而且反應(yīng)開始10～20分鐘之后可以判斷反應(yīng)是正還是負(fù)。同時(shí)可以看出，即使在103細(xì)胞/毫升的濃度下也能檢測(cè)出德氏乳桿菌；即使在104細(xì)胞/毫升的濃度下也能檢測(cè)出大腸桿菌。
使用由3％氯化鈉水溶液制備的試樣時(shí)，得到如上所述的相同結(jié)果。對(duì)比例1用已知方法檢測(cè)微生物。(1)試劑和裝置·PPO試劑與實(shí)施例1中所用的相同。
·水與實(shí)施例1中所用的相同。
·3％氯化鈉水溶液與實(shí)施例1中所用的相同。
·測(cè)定裝置采用Toxinometer ET-301(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產(chǎn))。(2)試樣與實(shí)施例1中所用的相同。(3)檢測(cè)方法把0.1mlPPO試劑和0.1ml含有濃度為104細(xì)胞/毫升德氏乳桿菌或大腸桿菌的試樣混合并攪拌后，用Toxinometer ET-301測(cè)定Tg值(透射光數(shù)量達(dá)到一個(gè)預(yù)定值所需的時(shí)間)。(4)結(jié)果已用水制成的德氏乳桿菌懸浮液和大腸桿菌懸浮液都用作試樣時(shí)，對(duì)德氏乳桿菌而言，Tg值為32.4分鐘；對(duì)大腸桿菌而言，Tg值為59.4分鐘。因此可以看出，在這些試樣的情形中，在90分鐘測(cè)定時(shí)間內(nèi)反應(yīng)判斷為正的。另一方面，已用3％氯化鈉水溶液制成的德氏乳桿菌懸浮液和大腸桿菌懸浮液都用作試樣時(shí)，對(duì)德氏乳桿菌和大腸桿菌而言，在90分鐘測(cè)定時(shí)間內(nèi)都不能得到Tg值。所以在這些試樣的情形中，反應(yīng)不能判斷為正。
作為負(fù)對(duì)照試驗(yàn)進(jìn)行上述相同測(cè)定時(shí)，即采用制備試樣所用相同注射用水和3％氯化鈉水溶液作為試樣時(shí)，不能得到Tg值。也就是說，在兩種情形中反應(yīng)都不能判斷為正。
由實(shí)施例1和對(duì)比例1的結(jié)果可以看出，應(yīng)用本發(fā)明的方法可以檢測(cè)高鹽濃度溶液中的微生物，而常規(guī)方法是檢測(cè)不出的。
實(shí)施例2(1)試劑和裝置·PPO試劑使用一種溶液作為PPO試劑，該溶液是通過把得自家蠶血液的可商購(gòu)PPO試劑(SLPTM試劑，購(gòu)自Wako Pure Chemical Indus-tries，Ltd.；3ml)溶于6ml裝于SLPTM試劑盒(購(gòu)自Wako PureChemical Industries，Ltd.)中的溶劑中而制備的。
·濾膜使用一次性的無菌針筒式濾膜3mm(尼龍膜，由Corning Inc.生產(chǎn))。
·水和洗液使用Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.生產(chǎn)的注射用水。
·洗滌血透儀之后的溶液用注射用水充滿含有乙酸中空纖維的血透儀(FB-70A，NiproCorp.生產(chǎn))，在室溫下放置1小時(shí)，之后將充滿的水取出，作為洗滌血透儀之后的溶液。(2)試樣把懸浮液用作試樣，懸浮液的制備是把大腸桿菌懸浮于水中或洗滌血透儀之后的溶液中達(dá)到104細(xì)胞/毫升的濃度。(3)檢測(cè)方法用2ml洗液洗滌濾膜，接著把每種試樣各0.5ml濾過經(jīng)洗滌的濾膜。用2ml洗液洗滌該濾膜，之后把0.01mlPPO試劑滴在濾膜上，目視觀察濾膜的著色度。(4)結(jié)果圖3表示使用大腸桿菌懸浮液(用水制備的)所得的檢測(cè)結(jié)果。圖3還表示出負(fù)對(duì)照試驗(yàn)(NC)的結(jié)果。進(jìn)行負(fù)對(duì)照試驗(yàn)是出于對(duì)比的目的，采用與制備上述試樣時(shí)相同的水作為試樣。
從圖3可以看出，通過過濾作用而有細(xì)胞截留于其上的濾膜比負(fù)對(duì)照試驗(yàn)(NC)處理過的濾膜著色速率明顯加快，而且反應(yīng)開始20分鐘之后可以判斷存在104細(xì)胞/毫升濃度的大腸桿菌，判斷反應(yīng)是正還是負(fù)。
當(dāng)采用由洗滌血透儀之后的溶液制備的試樣時(shí)，得到如上所述的相同結(jié)果。對(duì)比例2用已知方法檢測(cè)微生物。(1)試劑和裝置·PPO試劑與實(shí)施例2中所用的相同。
·水與實(shí)施例2中所用的相同。
·洗滌血透儀之后的溶液與實(shí)施例2中所用的相同。
·測(cè)定裝置使用Toxinometer ET-301(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產(chǎn))。(2)試樣與實(shí)施例2中所用的相同。(3)檢測(cè)方法把0.1mlPPO試劑和0.1ml每種試樣混合并攪拌后，用Toxi-nometer ET-301測(cè)定Tg值(透射光數(shù)量達(dá)到一個(gè)預(yù)定值所需的時(shí)間)。(4)結(jié)果把用水制備的大腸桿菌懸浮液用作試樣時(shí)，得到的Tg值為59.4分鐘。把制備大腸桿菌懸浮液所用的相同的水用作負(fù)對(duì)照的試樣時(shí)，在90分鐘測(cè)定時(shí)間內(nèi)得不到Tg值。從這些事實(shí)可以看出，在用水制備的大腸桿菌懸浮液的情形中，可以在90分鐘測(cè)定時(shí)間內(nèi)判定反應(yīng)是正還是負(fù)。
另一方面，把用洗滌血透儀之后的溶液制備的大腸桿菌懸浮液用作試樣時(shí)，以及把制備大腸桿菌懸浮液所用的同一種洗滌血透儀之后的溶液用作負(fù)對(duì)照試樣時(shí)，都得到Tg值約為6分鐘。由此發(fā)現(xiàn)，不能檢測(cè)出試樣(大腸桿菌懸浮液)中微生物的存在?？梢酝茰y(cè)，這一結(jié)果是由于洗滌血透儀之后的溶液中β-葡聚糖的溶解。
從實(shí)施例2和對(duì)比例2的結(jié)果可以看出，應(yīng)用本發(fā)明的方法可以檢測(cè)出洗滌血透儀之后的溶液中的微生物，而用常規(guī)方法是檢測(cè)不出的。
實(shí)施例3(1)試劑和裝置·PPO試劑使用一種溶液，該溶液是通過把得自家蠶血液的可商購(gòu)PPO試劑(SLPTM試劑，購(gòu)自Wako Pure Chemical Industries，Ltd.；3ml)溶于6ml裝于SLPTM試劑盒(購(gòu)自Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)中的溶劑中而制備的。
·濾膜使用Multiscreen GV濾板(購(gòu)自Japan Millipore Ltd.)。
·水和洗液使用Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.生產(chǎn)的注射用水。(2)試樣把各種懸浮液用作試樣，懸浮液的制備是將預(yù)定的細(xì)菌懸浮于注射用水中，達(dá)到預(yù)定的各種濃度(細(xì)胞/毫升)。(3)檢測(cè)方法用0.2ml洗液洗滌過的Multiscreen GV濾板用來過濾0.2ml試樣。過濾0.2ml洗滌水后，一層膜片粘附到濾板的底部。然后，把0.1mlPPO試劑滴于孔中，在30℃下用微量滴定板讀數(shù)器(商標(biāo)為Spectra Max 250，Molecular Devices Co.生產(chǎn))測(cè)定650nm處吸光度的變化，得到起始時(shí)間(達(dá)到650nm處預(yù)定OD(光密度)值0.2所需的反應(yīng)時(shí)間)。(4)結(jié)果圖4表示含有枯草桿菌的各試樣的結(jié)果。圖5表示含有德氏乳桿菌的各試樣的結(jié)果。圖6表示含有各種細(xì)菌的試樣的結(jié)果。
圖6中，線條-·-表示含有Streptococcus mutans(屬于革蘭氏陽性細(xì)菌)的試樣的結(jié)果，線條-▲-表示含有金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，屬于革蘭氏陽性細(xì)菌)的試樣的結(jié)果；線條-□-表示含有嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，屬于革蘭氏陰性細(xì)菌)的試樣的結(jié)果，線條-△-表示含有副溶血弧菌(Vibrioparahaemomolyticus，屬于革蘭氏陰性細(xì)菌)的試樣的結(jié)果。
正如圖4～6結(jié)果所清楚表示的那樣，根據(jù)本發(fā)明可以檢測(cè)各種細(xì)菌的濃度(細(xì)胞/毫升)。
實(shí)施例4(1)試劑和儀器·PPO試劑與實(shí)施例3中所用的相同。
·濾膜與實(shí)施例3中所用的相同。
·水和洗液與實(shí)施例3中所用的相同。(2)試樣把預(yù)定的細(xì)菌懸浮于含有預(yù)定NaCl濃度的注射用水中來制備各試樣，得到預(yù)定濃度(細(xì)胞/毫升)。(3)檢測(cè)方法用0.2ml洗液洗滌過的Multiscreen GV濾板用來過濾0.2ml試樣。過濾0.2ml洗滌水后，一層膜片粘附到濾板的底部。然后，把0.1mlPPO試劑滴于孔中，在30℃下用微量滴定板讀數(shù)器(商標(biāo)為Spectra Max 250，Molecular Devices Co.生產(chǎn))測(cè)定650nm處吸光度的變化，得到起始時(shí)間(達(dá)到650nm處預(yù)定OD值0.2所需的反應(yīng)時(shí)間)。(4)結(jié)果結(jié)果示于圖7。圖7中，線條-○-表示采用不含NaCl的試樣所得到的結(jié)果，線條-■-表示采用含100mM NaCl的試樣所得到的結(jié)果，而線條-△-表示采用含200mM NaCl的試樣所得到的結(jié)果。
對(duì)比例3用已知方法檢測(cè)微生物。(1)試劑和裝置·PPO試劑與實(shí)施例4中所用的相同。
·水與實(shí)施例4中所用的相同。
·微量滴定板使用帶蓋子的96孔微量滴定板(3860-096)，Iwaki Glass Co.，Ltd.生產(chǎn)。(2)試樣按實(shí)施例4中所述相同方式制備試樣，不同的是改變NaCl濃度。(3)檢測(cè)方法把0.1ml PPO試劑和0.1ml試樣混合后，在30℃下用微量滴定板讀數(shù)器(商標(biāo)為Spectra Max 250，Molecular Devices Co.生產(chǎn))測(cè)定650nm處吸光度的變化，得到起始時(shí)間(達(dá)到650nm處預(yù)定OD值0.2所需的反應(yīng)時(shí)間)。(4)結(jié)果結(jié)果示于圖8。圖8中，線條-○-表示采用不含NaCl的試樣所得到的結(jié)果，線條-·-表示采用含25mM NaCl的試樣所得到的結(jié)果，線條-□-表示采用含50mM NaCl的試樣所得到的結(jié)果，線條-■-表示采用含100mM NaCl的試樣所得到的結(jié)果。
通過對(duì)圖7和圖8所示結(jié)果的比較可以清楚地看到，根據(jù)本發(fā)明可以檢測(cè)含高鹽濃度的試樣中的微生物，而用已知方法是不能檢測(cè)到的。
如前所述，本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便、快速、高精確度地檢測(cè)各種試樣中微生物的方法。用本發(fā)明檢測(cè)方法檢測(cè)各種試樣中微生物可以產(chǎn)生下述顯著效果，這種效果是常規(guī)方法所不能具有的。所以本發(fā)明對(duì)本領(lǐng)域作出突出貢獻(xiàn)。
(1)可以快速檢測(cè)微生物。
可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)。
(2)檢測(cè)不受與微生物一起存在于試樣中的物質(zhì)的影響。
PPO試劑易受試樣中鹽濃度和游離β-葡聚糖的影響，造成檢測(cè)靈敏度的下降。但由于本發(fā)明的方法涉及一個(gè)洗滌步驟，因而可以消除這種影響。
(3)可以通過過濾作用濃縮試樣中的微生物。
既然試樣濾過一個(gè)濾膜，試樣中微生物得到濃縮，所以可提高檢測(cè)靈敏度。
(4)適當(dāng)增加正對(duì)照數(shù)目，可以進(jìn)行定量測(cè)定和定性試驗(yàn)(限制試驗(yàn))。
(5)既可檢測(cè)活細(xì)胞，也可檢測(cè)死細(xì)胞。
(6)也可檢測(cè)革蘭氏陽性細(xì)菌。
(7)檢測(cè)不受制備試樣所用溶劑的影響。
甚至對(duì)于只溶于有機(jī)溶劑中的樣品，可以進(jìn)行目的檢測(cè)而不受有機(jī)溶劑的影響。方法是預(yù)先經(jīng)濾膜過濾，并用洗液洗滌。
(8)改變PPO試劑的種類可以測(cè)定細(xì)菌或真菌，或者對(duì)二者進(jìn)行測(cè)定。例如，使用可以與β-葡聚糖和肽聚糖反應(yīng)的PPO試劑，可以測(cè)定細(xì)菌和真菌。
使用可與β-葡聚糖反應(yīng)但不與肽聚糖反應(yīng)的PPO試劑，可以測(cè)定真菌。
使用可與肽聚糖反應(yīng)但不與β-葡聚糖反應(yīng)的PPO試劑，可以測(cè)定細(xì)菌。
(9)改變?yōu)V膜孔徑大小可以選擇待檢測(cè)的微生物。
例如，要檢測(cè)細(xì)菌和真菌時(shí)，孔徑大小為0.2μm或0.45μm的濾膜是優(yōu)選的。要檢測(cè)象酵母和霉菌這樣的真菌時(shí)，孔徑大小為1.2μm～3μm的濾膜是優(yōu)選的。要檢測(cè)霉菌時(shí)，孔徑大小為5μm或更大的濾膜是優(yōu)選的。對(duì)含有包括細(xì)菌在內(nèi)的多種微生物的試樣，僅能檢測(cè)出細(xì)菌，例如，方法是把試樣濾過一個(gè)孔徑大小為1.2μm～3μm的濾膜，把濾液濾過一個(gè)孔徑大小為0.2μm或0.45μm的濾膜，然后再用后一濾膜檢測(cè)微生物。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)微生物的方法，它包括把含有微生物的試樣濾過一個(gè)濾膜，洗滌濾膜，把濾膜上的殘留物與含有前酚氧化酶系統(tǒng)非活性型因子的昆蟲血液反應(yīng)，以及根據(jù)由此引起的顏色變化檢測(cè)試樣中的微生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的昆蟲血液是一種與β-葡聚糖反應(yīng)但不與肽聚糖反應(yīng)的昆蟲血液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的昆蟲血液是一種與肽聚糖反應(yīng)但不與β-葡聚糖反應(yīng)的昆蟲血液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的顏色變化是用目測(cè)觀察的。
全文摘要
一種簡(jiǎn)便、快速、高精度地檢測(cè)微生物的方法，它包括把試樣濾過一個(gè)濾膜，洗滌濾膜，把濾膜上的殘留物與含有前酚氧化酶系統(tǒng)非活性型因子的昆蟲血液反應(yīng)，以及根據(jù)由此引起的顏色變化檢測(cè)試樣中的微生物。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK1149628SQ96109370
公開日1997年5月14日 申請(qǐng)日期1996年7月30日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月31日
發(fā)明者土谷正和 申請(qǐng)人:和光純藥工業(yè)株式會(huì)社