專(zhuān)利名稱(chēng)：：用大腸桿菌生產(chǎn)色氨酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用大腸桿菌生產(chǎn)色氨酸。本發(fā)明提供了一種宿主以及生長(zhǎng)該宿主以便在缺乏抗生素的條件下穩(wěn)定地維持質(zhì)粒，導(dǎo)致發(fā)酵中色氨酸的高產(chǎn)率的方法。它對(duì)以前的方法提供了明顯的改進(jìn)并生產(chǎn)無(wú)任何酪氨酸和苯丙氨酸污染的色氨酸，從而簡(jiǎn)化了下游加工?，F(xiàn)在有許多遺傳操作微生物以制備有效地超額生產(chǎn)特定氨基酸的菌株的例子。本領(lǐng)域一般公認(rèn)的是，如果要成功地獲得特定氨基酸的生產(chǎn)，干擾控制生物合成途徑的基因之表達(dá)的正常調(diào)節(jié)線路，選擇其酶不再受到反饋抑制的突變子并破壞能分解所需產(chǎn)物的酶是必需的。還發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)將質(zhì)粒上額外的基因拷貝導(dǎo)入細(xì)胞來(lái)增加某些生物合成基因的拷貝數(shù)是有用的。這些一般性原則可見(jiàn)Tribe，D.E.andJ.Pit-tard.(1979).Appl.Environ，Microbiol.38181-190.特別是其中涉及的色氨酸生產(chǎn)。在該文章中也說(shuō)明了芳香族途徑中的第一個(gè)酶(DAHP合成酶)及末端色氨酸途徑中的第一個(gè)酶的反饋抑制的意義和取消抑制的必要性。同樣地，很久就已知道滅活抑制色氨酸操縱子基因表達(dá)的trpR阻遏蛋白是必需的。這一點(diǎn)在上面提到的文獻(xiàn)中進(jìn)行了討論。對(duì)于大腸桿菌的色氨酸基因，有一個(gè)第二控制系統(tǒng)稱(chēng)為衰減。即使在trpR細(xì)胞中，色氨酸或更具體地說(shuō)，負(fù)載的色氨酸-tRNA控制色氨酸操縱子的表達(dá)。當(dāng)負(fù)載的色氨酸-tRNA過(guò)量存在時(shí)，在每10個(gè)轉(zhuǎn)錄子中編碼生物合成酶的序列達(dá)到大約9個(gè)前終止trp操縱子基因mRNA的轉(zhuǎn)錄(Yanofsky.c.(1981)，Nature(London)289，751-758)。這種轉(zhuǎn)錄的成熟前終止可經(jīng)各種遺傳操作如克隆在異源啟動(dòng)子之后的trp基因或去掉衰減子基因座來(lái)阻止。Tribe和Pittard(Appl.Envtron.Microbiol.(1979).38181-190)報(bào)道了克服衰減的不同方法，其中他們使用了含部分缺陷型色氨酸-tRNA合成酶的突變子。當(dāng)含trp操縱子的結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒導(dǎo)入這些trp基因的表達(dá)不再受控制且缺乏任何對(duì)質(zhì)粒編碼功能的強(qiáng)選擇之細(xì)胞中時(shí)，隨后對(duì)該細(xì)胞及其子代的操作常導(dǎo)致質(zhì)粒從群體中丟失。如果原始宿主是色氨酸原養(yǎng)型，丟失質(zhì)粒的細(xì)胞比保留質(zhì)粒的細(xì)胞生長(zhǎng)更迅速，遺傳修飾(如缺失或插入)已減少或阻止存在于質(zhì)粒上的trp基因表達(dá)的細(xì)胞也一樣。經(jīng)過(guò)多次傳代，這種缺陷型細(xì)胞(分離子和突變子)成為群體中的主要成員，如果該群體作為發(fā)酵的基礎(chǔ)，則發(fā)酵失敗。為穩(wěn)定質(zhì)粒的遺傳已發(fā)展了各種方法。通常使用的方法包括在質(zhì)粒上的抗生素抗性基因和向發(fā)酵培養(yǎng)液中加抗生素。然而，該方法昂貴且對(duì)環(huán)境有害。使用在為生長(zhǎng)所需的一些化合物生物合成上有缺陷的宿主以及攜帶補(bǔ)償該突變?nèi)毕葜虻馁|(zhì)粒的方法以前已使用(例如見(jiàn)Andersonetal.，美國(guó)專(zhuān)利4,371,614)，但隨著它們繼續(xù)合成該營(yíng)養(yǎng)成份幾代時(shí)分離子會(huì)積累(表型滯后)。由于其所需與積累的營(yíng)養(yǎng)成份相同，分離子也可利用已經(jīng)積累的營(yíng)養(yǎng)成份。使用運(yùn)輸缺陷型宿主已取得了有限的進(jìn)展，但這僅在培養(yǎng)基中色氨酸較低的條件下實(shí)現(xiàn)(Imanaka，專(zhuān)利公開(kāi)ANo.3-43074)。對(duì)能生產(chǎn)高水平的色氨酸的微生物的需要仍然存在。與之相關(guān)的是對(duì)在所說(shuō)的微生物中穩(wěn)定質(zhì)粒遺傳之方法的需要。經(jīng)過(guò)提供具有色氨酸生產(chǎn)能力且在其基因組中包含編碼部分缺陷型色氨酰-tRNA合成酶基因(將溫控性色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型導(dǎo)入宿主)及進(jìn)一步在染色體上破壞由arop.mtr和tnaB編碼的運(yùn)輸系統(tǒng)的突變的E.coliK-12(該菌株含編碼在高色氨酸濃度時(shí)對(duì)反饋抑制有抗性的鄰氨基苯甲酸合成酶的trpE等位基因)來(lái)達(dá)到本發(fā)明的這些和其它目的，這些目的在下文的描述中將會(huì)變得更顯而易見(jiàn)。經(jīng)過(guò)提供經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的另一目的，該方法包含在不同的生長(zhǎng)和生產(chǎn)條件下培養(yǎng)前文所述的細(xì)菌并從培養(yǎng)基中回收產(chǎn)生的L-色氨酸。附圖描述圖1JP7847(trpS+)和JP6006(trpS378)在30℃的生長(zhǎng)速率，作為培養(yǎng)基中色氨酸濃度的函數(shù)。培養(yǎng)基是半強(qiáng)度緩沖液56(Monod，J.，G.Cohen-BazireandM.cohen(1951)，BiochimicaetBiophysicaActa1585-599)補(bǔ)充10μg/ml的硫胺素和0.2％的葡萄糖)。兩個(gè)菌株都是色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，因?yàn)椤鱰rpLE1413缺失，兩個(gè)都在有效吸收色氨酸上有缺陷，因?yàn)閙tr-24，tna-1和aroP519突變。另外它們都是sac+aroF363aroG103(FBR)trpR363tyrR366。圖2產(chǎn)色氨酸菌株(JP6015/pMU91)在不同溫度的瓶中生長(zhǎng)時(shí)的穩(wěn)定性和產(chǎn)率。圖3產(chǎn)色氨酸菌株(JP6015/pMU91)在不同濃度的酵母提取物存在的條件下在30℃的瓶中生長(zhǎng)的穩(wěn)定性和產(chǎn)率。圖4具有野生型trpE等位基因的菌株(JP6768/pMU3018)和具有trpE476突變(JP6768/pMU3019)和trpE483突變(JP6768/pMU3025)的菌株鄰氨基苯甲酸合成酶對(duì)體外反饋抑制的敏感性比較。圖5在42℃下aroB+trps+菌株(JP8820)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以及aroB+trps378菌株(JP1451)在補(bǔ)充了不同水平的色氨酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。圖6pMU3018(圖6a)，pMU3019(圖6b)和pMU3025(圖6c)的限制性圖譜。在每個(gè)例子中載體(pMU578)以黑色表示。使用含trp操縱子5′端的2.9kbSmaI/HindIII片段，用trpE476而不是trpE野生型接與pMU3018相似的方法構(gòu)建pMU3019。pMU3025按實(shí)施例2所述經(jīng)誘變從pMU3018獲得。圖7將trpE483插入trp操縱子中。圖8pMU3028的限制性圖譜。載體(pLG339)以黑色表示。在2步克隆中構(gòu)建(I)將攜帶SerA+的2.6kb片段克隆進(jìn)pLMI339的Smal位點(diǎn)；(II)將攜帶來(lái)自pMU3027(見(jiàn)圖7)的trpE483DCBA的8.1kbSalI片段克隆進(jìn)所得質(zhì)粒的xhoI位點(diǎn)。圖9pMU91的限制性圖譜。本發(fā)明提供了經(jīng)使用E.coliK-12菌株發(fā)酵生產(chǎn)高水平的L-色氨酸的方法。這些具有L-色氨酸生產(chǎn)能力的菌株在其基因組中包含編碼部分缺陷型色氨酰-tRNA合成酶的突變基因，該基因?qū)乜匦陨彼釥I(yíng)養(yǎng)缺陷型導(dǎo)入宿主中并在染色體上進(jìn)一步產(chǎn)生破壞由arop.mtr和tnaB編碼的運(yùn)輸系統(tǒng)的突變，該菌株用含有編碼不受色氨酸的反饋抑制的鄰氨基苯甲酸合成酶的色氨酸操縱子之質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。正如第2部分所述，超額生產(chǎn)特定營(yíng)養(yǎng)成份的菌株存在問(wèn)題，其中穩(wěn)定性的維持僅取決于宿主對(duì)超額生產(chǎn)的營(yíng)養(yǎng)成份的需要，至于分離子繼續(xù)生長(zhǎng)，首先是因?yàn)楸硇蜏?，其次是因?yàn)樗鼈円子诶靡呀?jīng)積累的營(yíng)養(yǎng)成份。即使宿主菌株是營(yíng)養(yǎng)成分有效轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷型的，只有當(dāng)營(yíng)養(yǎng)成份濃度相當(dāng)?shù)蜁r(shí)選擇才會(huì)成功。如圖1所示，例如色氨酸水平為1mM或更大時(shí)，色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型不能有效地運(yùn)輸色氨酸，但隨著正常倍增時(shí)間而生長(zhǎng)。當(dāng)產(chǎn)色氨酸菌株生長(zhǎng)時(shí)，色氨酸濃度迅速達(dá)到1mM或大約0.2g/l，因此在生產(chǎn)條件下迅速失去選擇質(zhì)粒穩(wěn)定性的可能。我們已發(fā)現(xiàn)了具有突變的trp-菌株，特別是例如trpS378，它部分滅活色氨酸-tRNA合成酶，在細(xì)胞內(nèi)需要非常高濃度的色氨酸。圖1表明如果轉(zhuǎn)運(yùn)陰性突變子也攜帶這種trpS378突變，為了出現(xiàn)良好的生長(zhǎng)，即使在30℃它需要至少5mM色氨酸。這意味著在培養(yǎng)基中色氨酸濃度達(dá)到1g/l前，由質(zhì)粒丟失產(chǎn)生的任何分離子將處于生長(zhǎng)劣勢(shì)。在分離子生長(zhǎng)時(shí)充分競(jìng)爭(zhēng)前對(duì)非常高的色氨酸濃度的需要是一種有意義的改進(jìn)，因?yàn)樗粌H在接種物生長(zhǎng)期間，而且在最終發(fā)酵期間的大部分生長(zhǎng)期維持著對(duì)滯留質(zhì)粒的選擇。這種轉(zhuǎn)運(yùn)陰性突變與特別是trpS378的組合與trpS+轉(zhuǎn)運(yùn)陰性組合相比明顯提高了色氨酸產(chǎn)量。所說(shuō)的突變優(yōu)選破壞由arop.mtr.和tnaB編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。典型的菌株包括但不限于含有其特征為aroP579，mtr-24和tnaA1之突變的等位基因的菌株。使用攜帶trpS378等位基因的超額生產(chǎn)型菌株和攜帶編碼反饋抗性鄰氨基苯甲酸合成酶之trpE476DcBA的質(zhì)粒在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中我們證實(shí)了溫度敏感性等位基因trpS378可在有利于穩(wěn)定性或生產(chǎn)能力的選定溫度下有效地使用。我們發(fā)現(xiàn)這種攜帶trpS378的生產(chǎn)菌株在大約30℃時(shí)比大約37℃更穩(wěn)定。在大約37℃時(shí)，生產(chǎn)能力增加而穩(wěn)定性降低。生產(chǎn)菌株JP6015/pMU91的結(jié)果如圖2所示。在這一例子中提供了serA+/-補(bǔ)充，經(jīng)過(guò)選擇培養(yǎng)溫度可明顯提高穩(wěn)定性水平。對(duì)于其它菌株獲得了相似的結(jié)果。我們還發(fā)現(xiàn)加入酵母提取物可進(jìn)一步降低30℃時(shí)的生產(chǎn)能力，這樣色氨酸水平不超過(guò)0.2到0.3g/l。這種穩(wěn)定性明顯增加的結(jié)果如圖3所示。一些菌株在超過(guò)60代時(shí)仍保持穩(wěn)定。鄰氨基苯甲酸合成酶的反饋抑制在大腸桿菌野生型菌株中鄰氨基苯甲酸合成酶活性對(duì)色氨酸的反饋抑制非常敏感，在0.02mM的低色氨酸濃度時(shí)顯示出大約50％的抑制。在各種文獻(xiàn)中已報(bào)道了反饋抗性突變體，例如，Aibaetal.，加拿大專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?182409，TribeandPittard.(1979).AppliedandEnvironmentalMicrobiol.38181-190andEnvironmentalMicrobiol.43289-297。在每個(gè)例子中，這種突變體的分離涉及對(duì)色氨酸類(lèi)似物引起的生長(zhǎng)抑制的抗性選擇。典型地，為超額生產(chǎn)色氨酸的目的而選擇的突變子保留了一些反饋抑制，但50％發(fā)生在大約13mM而不是0.02mM的濃度(見(jiàn)Atba等，加拿大專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?182409)。其中描述了涉及更高反饋抗性的突變子(比20mM抑制值高50％)，它們導(dǎo)致積累的色氨酸下降，很可能是由于反饋抗性酶的活性減少(Aibaetal.(1982).AppliedandEnvi-ronmentalMtcrobiol.43289-297)。我們分離的2個(gè)反饋抗性突變子是以前在色氨酸超額生產(chǎn)中所使用的典型菌株，含有編碼在1mM色氨酸下表現(xiàn)出抑制活性不超過(guò)10％的酶的等位基因trpE476和trpE382(見(jiàn)實(shí)施例2)。當(dāng)具有這種突變的生產(chǎn)菌株在發(fā)酵罐中使用時(shí)，觀察到在發(fā)酵終止時(shí)，每積累1克色氨酸也積累酪氨酸和苯丙氨酸各大約20-60mg。盡管這些氨基酸是芳族產(chǎn)物的一小部分，但它們是在后續(xù)的色氨酸回收中產(chǎn)生主要困難的副產(chǎn)物。在尋找這種積累的基礎(chǔ)時(shí)，發(fā)現(xiàn)色氨酸濃度為128/l(60mM)時(shí)，這兩種反饋抗性鄰氨基苯甲酸合成酶被抑制60-80％。換句話(huà)說(shuō)，在1mM的濃度下出現(xiàn)抗性的酶在工業(yè)發(fā)酵的實(shí)際條件下不能有效地發(fā)揮功能。本領(lǐng)域沒(méi)有文獻(xiàn)涉及具有對(duì)反饋抑制有抗性的酶的超額生產(chǎn)菌株，其抗性爭(zhēng)對(duì)很可能存在于發(fā)酵罐中的極高水平的反饋抑制，同時(shí)維持正常的活性，因而提高了生產(chǎn)能力。為了克服鄰氨基苯甲酸合成酶在高色氨酸濃度時(shí)的抑制問(wèn)題，我們分離了一個(gè)新的反饋抗性突變子(trpE483)。它產(chǎn)生的鄰氨基苯甲酸合成酶在13.5g/l的高色氨酸濃度下表現(xiàn)出不超過(guò)10％的抑制活性(見(jiàn)圖4)。當(dāng)構(gòu)建具有trpE483等位基因的生產(chǎn)菌株并用于在以前每產(chǎn)生1g色氨酸時(shí)產(chǎn)生的酪氨酸和苯丙氨酸各大約為20-60mg的條件下發(fā)酵時(shí)，檢測(cè)不到酪氨酸和苯丙氨酸并保持高色氨酸產(chǎn)量。這與以前Aibaetal(AppliedandEnvironmentalMicrobiol.(1982)43289-297)用顯示出極高水平的色氨酸抗性而色氨酸產(chǎn)率減少的鄰氨基苯丙氨酸合成酶突變子報(bào)道的結(jié)果顯著相反。按實(shí)施例2所述，使用攜帶trp操縱子的質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)了trpE483等位基因的分離。使用已知的技術(shù)，如限制性酶消化、連接和轉(zhuǎn)化(Maniatis，T.，E.F.FritschandJ.Sambrook，MolecularcloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory.(1982))可很容易地構(gòu)建攜帶trp操縱子的這種質(zhì)粒。TRP操縱子可來(lái)自大腸桿菌染色體DNA或來(lái)自特化的轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體，80pt190h(Hershfield.V.etal.(1974).proc.Natl.Acad.Sci.USA.713455-3459)，且可以插入許多合適載體的任何一個(gè)中，這些載體包括但不限于來(lái)自pSC101(Cohen，S.N.andA.C.Chang(1977).J.Bacteriol132，734-737)，R388(Datta，N.andR.W.Hedges(1971).J.GenMicrobiol.72∶349)等的載體。而且，該載體可攜帶以相似技術(shù)克隆的SerA+基因。然后經(jīng)轉(zhuǎn)化將這樣構(gòu)建的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌K-12宿主中。本發(fā)明還涉及生長(zhǎng)和發(fā)酵顯示出高生產(chǎn)能力的所說(shuō)的大腸桿菌K-12菌株的方法。當(dāng)微生物在一批培養(yǎng)物中生長(zhǎng)以產(chǎn)生一種氨基酸時(shí)，氨基酸的實(shí)際生產(chǎn)僅在最終發(fā)酵容器的少數(shù)幾代期間需要。對(duì)于100,0001發(fā)酵罐，在最終發(fā)酵罐中僅需要5至10代，而為接種該容器需要50或更多代。使用所述方法，利用與特定生長(zhǎng)條件相結(jié)合的特定遺傳突變可保證必需菌株的穩(wěn)定性而在最終發(fā)酵罐生長(zhǎng)期間允許得到最大色氨酸生產(chǎn)能力。在最終發(fā)酵中即使不使用抗生素也可實(shí)現(xiàn)色氨酸的高產(chǎn)量(實(shí)施例6)。使用JP4735/pMU3028導(dǎo)致高產(chǎn)率的色氨酸而沒(méi)有酪氨酸和苯丙氨酸的明顯形成。下列大腸桿菌K-12菌株按布達(dá)佩斯條約保藏在DeutscheSammlungVonMtkroorganismenund2ellKulturen(DSM)inBraun-schweig(Germany)培養(yǎng)物保藏中心JP7847保藏號(hào)為DSM101119JP6006保藏號(hào)為DSM10118JP6768/pMU3018保藏號(hào)為DSM10120JP6768/pMU3025保藏號(hào)為DSM10121JP4735/pMU3028保藏號(hào)為DSM10122JP6015/pMU91保藏號(hào)為DSM10123。實(shí)施例1具有trpS基因突變的溫度敏感性色氨酸營(yíng)養(yǎng)突變型的分離以Adelberg，Mandel和Chen(BiochemBiophysResCommum.(1965).18788-795)的方法用誘變劑N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍處理大腸桿菌K-12，KA56(galE-thi-)菌株(Russell，R.R.B.andA.J.Pittard.(1971).J.Bacteriol.108790-798)。用誘變劑處理后，洗滌細(xì)胞并重懸于含酪蛋白氨基酸及作碳源的甘油之基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以及使用本實(shí)驗(yàn)室建立的富集方法(Russell.P.R.B.andA.J.Pittard.(1971).J.Bacteriol.108790-798)。32℃生長(zhǎng)幾小時(shí)后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到42℃并再培養(yǎng)1小時(shí)后加入半乳糖至終濃度為2％。缺乏尿苷二磷酸半乳糖-4-表異構(gòu)酶(即galE-)但能合成半乳糖激酶和半乳糖-1-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶作為對(duì)加入半乳糖的反應(yīng)的細(xì)胞積累UDP半乳糖，它對(duì)細(xì)胞有毒性并引起細(xì)胞溶解(Fuka-sawa，T.，andH.Nikaido.(1959).Nature(London).(841168-1169)。在42℃的甘油半乳糖酪蛋白氨基酸培養(yǎng)基中不能合成新酶的細(xì)胞不形成該化合物并不被殺死。在這些幸存者中可發(fā)現(xiàn)具有trpS基因突變的溫度敏感性營(yíng)養(yǎng)缺陷型。(酪蛋白氨基酸含非常低水平的色氨酸)。在半乳糖存在的條件下42℃培養(yǎng)5小時(shí)后回收細(xì)胞，洗滌并(1)在32℃加入營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基并培養(yǎng)至指數(shù)中期或(2)涂布到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上使每板產(chǎn)生大約200個(gè)集落并在32℃培養(yǎng)48小時(shí)。將每個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂板上的集落復(fù)制到mm和含10-3ML-色氨酸的mm(mm＋trp)的兩個(gè)平板上。(mm代表半強(qiáng)度培養(yǎng)基56(Mon-od，Cohen-BazireandCohen，(1951).Biochim.Biophys.Acta1，585)，使用1％OxoidNo.1瓊脂固化，并含有葡萄糖和硫胺素)。一套平板(mm和mm＋Trp)在32℃培養(yǎng)，另一套在42℃培養(yǎng)。能在32℃的mm上生長(zhǎng)但不能在42℃的mm上生長(zhǎng)且可在42℃的mm+Trp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的集落是潛在的溫度敏感性色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。在這些集落中，為了鑒別trpS基因改變的突變子，必需制備許多克隆的P1轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體并將aroB+轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)aroB-突變子(如AB2826(Pittard，J.andB.J.Wallace.(1966).J.Bacteriol.911494-1508))并在32℃的mm上選擇Aro+轉(zhuǎn)導(dǎo)子。然后試驗(yàn)這些轉(zhuǎn)導(dǎo)子在42℃的mm和mm＋Trp上生長(zhǎng)的能力。在TrpS基因上突變的原始色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型中，大約50％的Aro+轉(zhuǎn)導(dǎo)子在42℃時(shí)生長(zhǎng)需要色氨酸。在一可供選擇的方法中，制備的生長(zhǎng)有培養(yǎng)物的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液在用半乳糖殺死后用于制備P1溶胞產(chǎn)物。再將該溶胞產(chǎn)物與AB2826一起使用以便在32℃的mm上選擇aroB+轉(zhuǎn)導(dǎo)子。然后篩選這種轉(zhuǎn)導(dǎo)子獲得向培養(yǎng)基中加入色氨酸后僅能在42℃的mm上生長(zhǎng)的克隆。圖5顯示了兩個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)子在含不同水平的色氨酸的葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中42℃時(shí)的生長(zhǎng)曲線，一個(gè)是aroB+trpS378(JP1451)，另一個(gè)是aroB+trpS+(JP8820)可見(jiàn)在非隨意的溫度下以高水平的色氨酸可逆轉(zhuǎn)溫度敏感性表型。實(shí)施例2對(duì)極高水平色氨酸的反饋抑制有抗性的鄰氨基苯甲酸合成酶突變子的選擇質(zhì)粒pMU3018(圖6)在2.9kbSmaIHindIII片段上攜帶trp啟動(dòng)子，trpE基因和部分trpD基因。pMU3018來(lái)自pMV578，它是攜帶galK′-Lae′Za融合體的單拷貝TpR質(zhì)粒，與啟動(dòng)子克隆載體pMU575(AndrewsA.E.，B.Lawley，andA.J.Pittard.(1991).J.Bar-teriol.173，5068-5078)相似，但用SmaIEcoRIBglII接頭代替SmaI位點(diǎn)，卻掉DraI片段并缺失LacY和LacA。如果用這工種酶消化pMU3018DNA并以低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳片段，可以簡(jiǎn)便地分離并純化trpEtrpD′2.9kb片段及更大的13kb載體片段。除了向誘變混合物中加入精胺(1mM)外，按照Ray等(Ray，J.M.，C.YanofskyandR.Bauerle.(1988).J.Bacteriol.1705500-5506)的方法用50mM亞硝酸誘變這一2.9kb的片段60分鐘。誘變后，將該片段與較大的13kb片段重新連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)菌株JP6768。它是一種trpR-的大腸桿菌菌株，其中染色體上的trpE基因缺失，但trpDCB和A具有充分功能(△trpLE1413(Miozzari，G.F.andC.Yanofsky.(1978).J.Bacteriol.1331457-1466)。在含三甲氧芐二氨嘧啶的Luria瓊脂上選擇大約2,000個(gè)轉(zhuǎn)化子。這些篩選的轉(zhuǎn)化子在補(bǔ)充了15mM色氨酸類(lèi)似物與氟色氨酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。生長(zhǎng)的克隆是鄰氨基苯甲酸合成酶改變的潛在的反饋抗性突變子。在極高色氨酸水平(13.5g/l)存在的條件下使用Cho.K-O和C.Yanofsky.(1988).J.Mol.boil.20441-50描述的試驗(yàn)檢測(cè)每個(gè)克隆的鄰氨基苯甲酸合成酶活性。在抗性突變子中鑒定出在極高水平色氨酸存在時(shí)顯示出抑制不超過(guò)10％的鄰氨基苯甲酸合成酶活性的克隆。存在于該菌株中的突變等位基因稱(chēng)為trpE483。在比較中，等位基因trpE476編碼的鄰氨基苯甲酸合成酶在1g/l色氨酸時(shí)具有較好的抗性但在13.5g/l色氨酸時(shí)抑制超過(guò)60％。圖4比較了具有野生型等位基因的菌株(JP6768/pMU3018)和具有trpE483等位基因(JP6768/pMU3025)和trpE476等位基因(JP6768/pMU3019)的菌株鄰氨基苯甲酸合成酶的反饋敏感性。為了用trpE483等位基因重新構(gòu)建trp操縱子，將攜帶該等位基因的2.9kb的片段連接到來(lái)自pMU575的pMU1881的21kbHindIIISmaI片段上，pMU1881攜帶trpDCBA基因。由此產(chǎn)生質(zhì)粒pMU3027。圖7概述了這一過(guò)程。接著將插入了trpE483的新trp操縱子轉(zhuǎn)移到攜帶SerA+來(lái)自pSC101的pLG339(Stoker.N.G.etal(1982).Gene18，335-341)上以產(chǎn)生pMU3028，如圖8所示。在具有trpE476等位基因的菌株積累酪氨酸和苯丙氨酸的條件下，具有trpE483等位基因的菌株產(chǎn)生根本檢測(cè)不到的酪氨酸(見(jiàn)實(shí)施例6)。無(wú)副產(chǎn)物(如酪氨酸和苯丙氨酸)的培養(yǎng)液優(yōu)選用于進(jìn)一步的純化程序，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。實(shí)施例3具有溫敏性trpS等位基因及阻止色氨酸運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞的正?；钚灾蛔兊拇竽c桿菌菌株的構(gòu)建已鑒定，克隆和測(cè)序編碼將色氨酸有效地運(yùn)輸進(jìn)大腸桿菌的各種系統(tǒng)的基因(Sarsero.J.P.，P.J.Wookey.P.Gounick，C.YanofskyandA.J.Pitlard.(1991)，J.Bacteriol.1733231-3234；andHonore，N.andS.T.Cole.(1990).NucleicAcidsResearch18∶653)。也描述了這些系統(tǒng)(TnaB，Mtr和AroP)中各個(gè)缺陷型突變子。經(jīng)過(guò)在tnaA基因(tnaA)上發(fā)生突變可阻止TnaB蛋白質(zhì)的表達(dá)，tnaA基因?qū)naB表達(dá)具有極性作用(Stewart，V.andC.Yanofsky.(1985).J.Bacteriol.164731-740)。這是一種特別有用的突變，因?yàn)橥瑫r(shí)失活的tnaA基因編碼可降解色氨酸的色氨酸酶。已描述了mtr基因的各種突變，根據(jù)對(duì)色氨酸類(lèi)似物5-甲基—色氨酸的抗性選擇突變子。Hiraga最先描述了一個(gè)這樣的突變mtr-24(Hiraga，S.，K.Ito，T.Matsuyama，H.OzekiandT.Yura.(1968).J.Bacteriol.961880-1881)。經(jīng)過(guò)選擇對(duì)芳香氨基酸類(lèi)似物的抗性也可分離一般芳香族運(yùn)輸系統(tǒng)的突變。Brown(BrownK.D.(1970).J.Bacteriol.104177-188)描述了aroP579突變。使用轉(zhuǎn)座子Tn10和噬菌體P1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)容易構(gòu)建具有trpS基因突變和色氨酸運(yùn)輸系統(tǒng)各基因突變的菌株。用λTn10轉(zhuǎn)座子λNK370感染原養(yǎng)型菌株W3110并接Kleckner，N.，D.F.Barker，D.G.RossandD.Botstein.(1978)，Genetics90427-450所述選擇四環(huán)素抗性菌落。經(jīng)過(guò)使用P1轉(zhuǎn)導(dǎo)，獲得TMO與aroP519，mtr-24和tnaAl緊密相連的分離物。然后P1溶胞產(chǎn)物用于將各種突變依次導(dǎo)入trpS菌株中，并根據(jù)Bochner，B.R.，H.C.Huang，G.L.ShievenandB.N.Ames.(1980).J.Bacteriol.143926-1033的方法選擇四環(huán)素敏感性衍生菌株。經(jīng)過(guò)用trps+克隆的溶胞產(chǎn)物轉(zhuǎn)導(dǎo)并在42℃含0.5mM色氨酸的平板上生長(zhǎng)進(jìn)行選擇可獲得這種突變子的TrpS+衍生菌株。實(shí)施例4trpS378與色氨酸有效運(yùn)輸及其生物合成缺陷型trpS+菌株的生長(zhǎng)速率比較具有野生型trpS等位基因且能將色氨酸有效運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞的色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型在補(bǔ)充了5×10-5M低水平的色氨酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以較高速率生長(zhǎng)。有效運(yùn)輸色氨酸缺陷的色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型最適生長(zhǎng)需要的水平更高(～10-3M)，而還具有trpS378突變的菌株在達(dá)到最大生長(zhǎng)速率前需要5×10-3M的高濃度。圖1比較了trpS378與還具有失活Mtr.AroP和TnaB蛋白質(zhì)突變的色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型trpS+衍生物(△trpLE1413)對(duì)色氨酸的生長(zhǎng)反應(yīng)。JP6006來(lái)自JP4153，它使用Tn10作連接標(biāo)記以P1轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)入△trpLE1413并分離四環(huán)素敏感性變異體，接著使用P1溶胞產(chǎn)物在Sac+菌株GA122上生長(zhǎng)經(jīng)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)入Sac+(alaeddinoglu，N.G.andH.P.Charles.(1979).J.Gen.Microbiol.11047-59)。JP4153是aroF363aroG103(FBR)aroH371(FBR)trpE382(FBR)tr-pR363tyrR366trpS378aroP579mtr24tna-1.JP784是JP6006的trps+衍生物，以P1轉(zhuǎn)導(dǎo)分離。細(xì)胞在30℃下在補(bǔ)充了不同水平的色氨酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。用Klett比色計(jì)測(cè)光密度來(lái)測(cè)量生長(zhǎng)，從每個(gè)生長(zhǎng)曲線的指數(shù)期計(jì)算倍增時(shí)間。實(shí)施例5溫度和添加酵母提取物對(duì)菌株穩(wěn)定性和生產(chǎn)能力的影響經(jīng)過(guò)測(cè)量攜瓶中培養(yǎng)物的色氨酸和鄰氨基苯甲酸的生產(chǎn)能力可試驗(yàn)菌株的穩(wěn)定性，其中每24小時(shí)進(jìn)行1％的系列轉(zhuǎn)移。以磷酸鹽濃度，以可從酵母提取物中獲得的磷酸鹽或以?xún)烧叩幕旌蠈⑸锪肯薅榇蠹s0.4mg/ml。在該系列中通過(guò)各瓶傳代代表細(xì)胞數(shù)增加100倍或6.7代。對(duì)于許多瓶，色氨酸生產(chǎn)能力特征性地保持接近菌株正常值的100％，且檢測(cè)到的鄰氨基苯甲酸可忽略不計(jì)。在沿該系列某一位置的瓶中，色氨酸生產(chǎn)能力一般突然下降到40％-50％。且伴隨著出現(xiàn)鄰氨基苯甲酸。細(xì)胞計(jì)數(shù)表明以高色氨酸生產(chǎn)能力且無(wú)鄰氨基苯甲酸向低色氨酸生產(chǎn)能力且含鄰氨基苯甲酸的轉(zhuǎn)變與分離子或突變子從0-10％增加到40-70％的相對(duì)應(yīng)。從如下無(wú)菌貯液制備每個(gè)菌株的培養(yǎng)基葡萄糖(20％)或蔗糖(20％)10mlMOPS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(X10)*20mlB1(硫胺素)(0.01％)0.2ml磷酸鹽(15mMKH2PO4)2.0ml四環(huán)素(10mg/ml)，如果需要的話(huà)0.2ml無(wú)菌蒸餾水170ml*MOPS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(X10)每升含167.44gMOPS，1.41g檸檬酸三鈉2H2O，0.13gFeSO4.7H2O，19.2gNH4Cl，4.0gMgSO4.7H2O，2.4gKCl，0.15mgCaCl2.2H2O和微量元素(14μgCoCl2.6H2O，5μgCuSO4.5H2O，48μgH3BO3，57μgZnSO4，7H2O，32μgMnCl2.4H2O和8μg(NH4)6MO7O24，4H2O)。用新鮮試驗(yàn)菌株接種10ml培養(yǎng)液，在30℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜。從轉(zhuǎn)化到這一時(shí)期的過(guò)程大約經(jīng)歷34代，在分析中不包括這些代。過(guò)夜的培養(yǎng)物用于接種該系列中的第一瓶。以24小時(shí)的間隔進(jìn)行1％的轉(zhuǎn)移(100μl轉(zhuǎn)移進(jìn)10ml中)，直到培養(yǎng)物的色氨酸生產(chǎn)能力下降，同時(shí)出現(xiàn)鄰氨基苯甲酸。在這些實(shí)驗(yàn)條件下轉(zhuǎn)移前每個(gè)培養(yǎng)物達(dá)到靜止期，每瓶經(jīng)歷大約6.7代。在第6瓶中色氨酸和鄰氨基苯甲酸水平出現(xiàn)顯著變化，例如穩(wěn)定性記錄為5×6.7或33.5代。在每次轉(zhuǎn)移時(shí)測(cè)定24小時(shí)培養(yǎng)物的光密度，離心樣品，使用注射器將上清液過(guò)濾通過(guò)一次應(yīng)用的濾膜(Milli-pore，0.45μm)。以HPLC測(cè)定色氨酸和鄰氨基苯甲酸的濃度。瓶中生產(chǎn)能力(YP/X)的測(cè)量在所需溫度下?lián)u動(dòng)生長(zhǎng)試驗(yàn)菌株，24小時(shí)和48小時(shí)后，測(cè)量生產(chǎn)能力。培養(yǎng)基與在穩(wěn)定性試驗(yàn)中所用的相同。從新鮮小批量中接種10ml培養(yǎng)物，搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜。將它用于接種含15ml相同培養(yǎng)基的試驗(yàn)瓶。24小時(shí)后取樣。使用分光光度計(jì)在660λ下測(cè)光密度并使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算干重。離心，過(guò)濾樣品，使用合適的標(biāo)準(zhǔn)品以HPLC測(cè)量色氨酸，酪氨酸和鄰氨基苯甲酸濃度。生產(chǎn)能力(YP/X)定義為色氨酸產(chǎn)量(g/l)除以生物量或干重產(chǎn)量(g/l)。培養(yǎng)溫度對(duì)攜帶trpS378等位基因和含編碼反饋抗性鄰氨基苯甲酸合成酶的trp操縱子之質(zhì)粒的超額生產(chǎn)菌株穩(wěn)定性和生產(chǎn)能力的影響如圖2所示。低溫有利于高穩(wěn)定性和低生產(chǎn)能力，而高溫有利于生產(chǎn)能力，但有損于穩(wěn)定性。這可用不同第一選擇在各種生產(chǎn)菌株中得到證實(shí)。圖2的資料顯示的是JP6015/pMU91，第一選擇是Ser+。JP6015來(lái)自JP4153(見(jiàn)實(shí)施例4)，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)入Sac+，且經(jīng)過(guò)用緊密相連的Tn10轉(zhuǎn)座子共轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)入SerA-，并隨后選擇四環(huán)素敏感性變異體。pMU91是來(lái)自pSc101的質(zhì)粒(Cohen，S.N.andA.C.Chang(1977)/J.Bacteriol.132734-737)攜帶TeR，trpE476DCBA和SerA+(見(jiàn)圖9)。使用特化轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體80pt190h分離trpE476DCBA等位基因(Herschfielol.V.etal(1974).Proc.Natl.Acad.Sci.USA713455-3459)。將攜帶80pt190h的trpE-菌株涂布到含(mM5-甲基色氨酸(5MT)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上。經(jīng)紫外線誘導(dǎo)細(xì)胞收集物產(chǎn)生隨后用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的溶胞產(chǎn)物，選擇trp+5MTR轉(zhuǎn)導(dǎo)子。其中的一些用于試驗(yàn)鄰氨基苯甲酸合成酶活性，trpE476DCBA等位基因的特征為編碼在10mML-色氨酸時(shí)具有70％完全活性的鄰氨基苯甲酸合成酶。將在7.9kbXhoI/SalI片段上的trp基因克隆進(jìn)pSC101的XhoI位點(diǎn)。將serA+基因?qū)?19kbSalI片段的xhoI位點(diǎn)。在各種色氨酸超額生產(chǎn)菌株中還證實(shí)了存在或不存在酵母提取物對(duì)穩(wěn)定性和生產(chǎn)能力的影響。資料如圖3所示，使用JP6015/pMU91和Ser+第一選擇證實(shí)了酵母提取物的使用降低生產(chǎn)能力且增加穩(wěn)定性。實(shí)施例6用大腸桿菌JP6015/pMU9生產(chǎn)色氨酸經(jīng)過(guò)在30℃培養(yǎng)48小時(shí)在補(bǔ)充了葡萄糖(2g/l)，酵母提取物(5g/l)和四環(huán)素(5mg/l)的MM瓊脂(見(jiàn)實(shí)施例1)上生產(chǎn)大腸桿菌K-12菌株JP6015/pMU91的單個(gè)菌落。經(jīng)過(guò)在30℃和250rpm(每分種轉(zhuǎn)數(shù))下培養(yǎng)大約16小時(shí)在10ml培養(yǎng)物(100ml瓶)中進(jìn)一步增殖一個(gè)單菌落。從無(wú)菌貯液如下制備用于培養(yǎng)物的培養(yǎng)基葡萄糖(20％)10mlMOPS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(X10)20ml(見(jiàn)實(shí)施例5)酵母提取物(20％)1ml四環(huán)素(10mg/l)0.1ml無(wú)菌蒸餾水170ml將1ml大腸桿菌K-12菌株JP6015/pMU91的培養(yǎng)物接種到裝于2000ml體積的Erlenmeyer氏瓶的300ml種子培養(yǎng)基(表1顯示了其組成)中，在30℃150rpm的攜床上搖動(dòng)培養(yǎng)24小時(shí)。將70ml所得的種子培養(yǎng)物接種到700ml容于21發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基(表2顯示了其組成)中，在30℃培養(yǎng)24小時(shí)。以25％氨水控制PH值為6.7；經(jīng)過(guò)以1/3vvm的速率通氣和用280至380rpm之間的速率攪拌使PO2保持在40％以上。將所得的OD值為20(在660nm下測(cè)量)的預(yù)培養(yǎng)物接種到容于101發(fā)酵罐中的6.31具有表3所示組成的主要發(fā)酵培養(yǎng)基中。在33℃下以0.5vvm通氣，經(jīng)在700至1200rpm之間攪動(dòng)培養(yǎng)物使PO2保持在40％以上進(jìn)行發(fā)酵；使用25％氨水將pH維持在7.0。6.5小時(shí)后，將620g/l(W/V)葡萄糖溶液連續(xù)加到培養(yǎng)基中，加入方式是使發(fā)酵罐中葡萄糖的濃度值不超過(guò)17g/l。32小時(shí)后完成發(fā)酵。以高效液相色譜定量測(cè)定積累的L-色氨酸和副產(chǎn)物L(fēng)-苯丙氨酸和L-酪氨酸的量。結(jié)果在表4中列出。實(shí)施例7用大腸桿菌JP4735/pMU3028生產(chǎn)色氨酸經(jīng)過(guò)在30℃培養(yǎng)48小時(shí)在補(bǔ)充了葡萄糖(2g/l)。酵母提取物(5g/l)和四環(huán)素(2.5mg/l)的MM瓊脂(見(jiàn)實(shí)施例1)上生產(chǎn)大腸桿菌K-12菌株JP4735/pMU3028的單個(gè)菌落。經(jīng)過(guò)在30℃，250rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))下培養(yǎng)大約16小時(shí)將一個(gè)單菌落在10ml培養(yǎng)物(100ml瓶)中進(jìn)一步增殖。從無(wú)菌貯液如下制備培養(yǎng)物的培養(yǎng)基葡萄糖(20％)10mlMOPS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(X10)20ml(見(jiàn)實(shí)施例5)酵母提取物(20％)1ml四環(huán)素(10mg/l)0.05ml無(wú)菌水170ml將1ml大腸桿菌K-12菌株JP4735/pMU3028的培養(yǎng)物接種到容于2000ml體積的Erlenmeyer氏瓶中的300ml種子培養(yǎng)基(表1顯示了其組成中，在30℃下，在150rpm的搖床上搖動(dòng)培養(yǎng)24小時(shí)。將70ml所得的種子培養(yǎng)物接種到容于21發(fā)酵罐的700ml預(yù)發(fā)酵培養(yǎng)基(表2顯示了其組成中，在30℃培養(yǎng)24小時(shí)。以25％氨水控pH值為6.7；以1/3vvm速率通氣和用280至380rpm之間的速率攪拌將PO2保持在40％以上。將所得的OD值為20(在660nm下測(cè)定)的預(yù)培養(yǎng)物接種到容于101發(fā)酵罐中的表3所示組成的6.31發(fā)酵培養(yǎng)基中。在33℃下，以0.5vvm通氣且以700至1200rpm之間攪拌培養(yǎng)物保持PO2在40％以上的條件下進(jìn)行發(fā)酵，使用25％氨水將pH維持在7.0。6.5小時(shí)后，將620g/l(w/v)葡萄糖溶液連續(xù)加到培養(yǎng)物中，加入方式是使發(fā)酵罐中葡萄糖濃度值不超過(guò)27g/l。45小時(shí)后完成發(fā)酵。以高效液相色譜定量測(cè)定積累的L-色氨酸量。結(jié)果在表4中列出。表1種子培養(yǎng)基的組成葡萄糖*H2O4g/l酵母提取物1.1g/l嗎啉代丙烷磺酸16.7g/l檸檬酸三鈉*2H2O0.14g/lFeSO4*7H2O13mg/lMgSO4*7H2O0.4g/l(NH4)2SO41.29g/lKCI0.24g/lKH2PO41.05g/l鹽酸硫胺素5mg/l四環(huán)素2.5mg/l微量元素2ml/l用25％氨水將pH調(diào)至大約7.0微量元素包括Na2MoO4*H2O0.15g/lH3BO32.5g/lCoCl2*6H2O0.7g/lCuSO4*5H2O0.25g/lMnCl2*4H2O1.6g/lZnSO4*7H2O0.3g/l表2預(yù)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成葡萄糖*H2O27.5g/l酵母提取物7.5g/l檸檬酸三鈉*2H2O1g/lFeSO4*7H2O1.1g/lMgSO4*7H2O3.15g/l(NH4)2SO48.65g/lKH2PO40.75g/l鹽酸硫胺素24mg/l四環(huán)素2.5mg/lK2SO42.3g/l微量元素(見(jiàn)表1)2ml/l表3主發(fā)酵培養(yǎng)基的組成葡萄糖*H2O27.5g/l檸檬酸三鈉*2H2O1g/lFeSO4*7H2O1.4g/lMgSO4*7H2O3.15g/l(NH4)2SO48.65g/lKH2PO41.5g/lK2SO42.3g/l微量元素(見(jiàn)表1)4ml/l表4</tables>權(quán)利要求1.L-色氨酸產(chǎn)率增加的大腸桿菌菌株，在其基因組中包含編碼部分缺陷型色氨酰-tRNA合成酶的突變基因，當(dāng)該基因存在于非生產(chǎn)型菌株中時(shí)，其特征為溫度依賴(lài)性色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，且該大腸桿菌菌株還在其染色體上具有選自mtr，aroP，tnaA或traB一組中的一個(gè)或多個(gè)基因的突變。2.根據(jù)權(quán)利要求1的大腸桿菌菌株，其中所說(shuō)的導(dǎo)致缺陷性色氨酸吸收的突變是aroP579，mtr-24和tnaA1。3.根據(jù)權(quán)利要求1和2的大腸桿菌菌株，其中所說(shuō)的編碼部分缺陷型色氨酰tRNA合成酶的突變基因是trpS378等位基因，可以保藏在DSM(DeutscheSammlungfurMrkroorgamismen，Braun-schweig，Germany)的保藏號(hào)為DSM10118的大腸桿菌JP6006獲得。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的大腸桿菌菌株，所說(shuō)的菌株被攜帶編碼不受色氨酸反饋抑制的鄰氨基苯甲酸合成酶的色氨酸操縱于的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4的大腸桿菌菌株，它具有選自trpEDC-BA組的一個(gè)或多個(gè)基因的突變，當(dāng)trpEDCBA存在于非生產(chǎn)型菌株中時(shí)，使細(xì)胞成為色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。6.根據(jù)權(quán)利要求4的大腸桿菌菌株，其中所說(shuō)的質(zhì)粒是pMU3025且攜帶trpE483等位基因，所說(shuō)的質(zhì)粒在圖6c中表示且可以保藏在DSM，保藏號(hào)為DSM10/21的大腸桿菌JP6768/pMU3025中獲得。7.根據(jù)權(quán)利要求4和5的大腸桿菌菌株，其中所說(shuō)的質(zhì)粒是pMU3028且攜帶trpE483等位基因，trpDCBA基因和SerA+，所說(shuō)的質(zhì)粒在圖8中表示且可以以保藏號(hào)DSM10122保藏在DSM的大腸桿菌JP4735/pMU3028中獲得。8.根據(jù)權(quán)利要求3、4和5的大腸桿菌菌株，其中所說(shuō)的質(zhì)粒是pMU91且攜帶trpE476DCBA基因和SerA+，所說(shuō)的質(zhì)粒在圖9中表示且可以以保藏號(hào)DSM10123保藏在DSM的大腸桿菌JP6015/pMU91中獲得。9.根據(jù)權(quán)利要求1至8的大腸桿菌菌株，它且有一個(gè)或多個(gè)下列trpR.tyrR，SerA，aroG(導(dǎo)致DAHP合成酶(Phe)對(duì)反饋抑制產(chǎn)生抗性)，aroH(導(dǎo)致DAHP合成酶(Trp)對(duì)反饋抑制產(chǎn)生抗性)，trpE(導(dǎo)致鄰氨基苯甲酸合成酶對(duì)反饋抑制產(chǎn)生抗性)的突變。10.一種用于穩(wěn)定根據(jù)權(quán)利要求1的具有L-色氨酸產(chǎn)率的大腸桿菌之特征的方法，在接種物生長(zhǎng)期間向大腸桿菌菌株基因組中導(dǎo)入編碼部分缺陷型色氨酰tRNA合成酶的突變基因，當(dāng)該基因存在于非生產(chǎn)型菌株中時(shí)，其特征是溫度依賴(lài)性色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，且還在其染色體上導(dǎo)入aroP，mtr，tnaA或tnaB基因的突變并在低溫，例如27-30℃下培養(yǎng)所說(shuō)的菌株。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所說(shuō)的突變是aroP579，mtr-24和tnaA1。12.根據(jù)權(quán)利要求10和11的方法，其中所說(shuō)的大腸桿菌菌株攜帶一個(gè)質(zhì)粒。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所說(shuō)的質(zhì)粒攜帶trpE483等位基因。14.根據(jù)權(quán)利要求10至13的方法，其中在接種物生長(zhǎng)期間加入酵母提取物。15.一種經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法，它包括在大約30℃下優(yōu)選在酵母提取物存在的條件下根據(jù)權(quán)利要求1至9的大腸桿菌菌株的接種物生長(zhǎng)(培養(yǎng))，在合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中以可獲得的磷酸鹽濃度的限制生長(zhǎng)，在33℃至37℃的溫度范圍內(nèi)，在缺乏酵母提取物的條件下發(fā)酵，以及在所得的培養(yǎng)液中回收積累的色氨酸。16.根據(jù)權(quán)利要求15的生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其中所說(shuō)的發(fā)酵在缺乏抗生素的條件下進(jìn)行。全文摘要本發(fā)明涉及以大腸桿菌菌株生產(chǎn)L-色氨酸。本發(fā)明提供了一種宿主和生長(zhǎng)該宿主以便在缺乏抗生素的條件下可穩(wěn)定保留質(zhì)粒，導(dǎo)致發(fā)酵中色氨酸高產(chǎn)率的方法。它對(duì)以前的方法進(jìn)行了明顯的改進(jìn)并產(chǎn)生無(wú)任何酪氨酸和苯丙氨酸污染的色氨酸，從而簡(jiǎn)化了下游加工。文檔編號(hào)C12N1/21GK1156180SQ9611197公開(kāi)日1997年8月6日申請(qǐng)日期1996年8月30日優(yōu)先權(quán)日1996年8月30日發(fā)明者H·卡瑪卡里斯,P·科萬(wàn),J·皮塔爾德申請(qǐng)人:底古薩股份公司