專利名稱：避免血紅素影響的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及當用速率分析測顏色反應的光譜吸收時避免血紅素影響(干擾)的方法。
在臨床試驗中進行的生化分析和生化測量中，有兩種方法，一種是使用液體試劑的方法，另一種是使用干試劑(稱為＂干分析元件＂)的方法。在兩種方法中，反應體系的顯色通過使用光反射觀察以探測或確定。尤其速率分析(測量在兩點或多點變化量的方法，從所得反應速率計算出濃度)是一種常用的用于使用干分析元件的光譜吸收測量的分析方法。
在這種方法中，從全血中分離并除去血紅素，所得的血漿或血清作為樣品用于試驗。然而，當從在分離步驟前或期間發(fā)生了紅血球溶血作用的全血制備樣品時，血漿或血清樣品有時被血紅素污染。其后果是該分析所得的數據變得與實際數值差別很大，因為所需組分的數值與血紅素重疊(也稱為＂模糊＂)并且血紅素的吸收隨時間變化。
因此，需要避免血紅素的吸收中隨時間變化的影響。已經提出了一些用于該目的的方法，諸如測量空白樣的方法、使血紅素物理地或化學地變性以防止隨時間變化的方法(例如JP-B-3-58467，此處所用＂JP-B-＂一詞是＂已審查的日本專利公報＂之意)、在血紅素吸收較少的650nm或更大的波長測量光譜吸收的方法(例如JP-A-62-209360，此處所用＂JP-A-＂一詞是＂未審查的公開的日本專利申請＂之意)。
在這些方法中，測量空白樣的方法需要額外的勞動，因為要測空白樣和試樣的光譜吸收。尤其當使用干分析元件時，空白樣的測量很困難，因為所用的所有試劑結合成一體。
同樣地，血紅素變性的方法要求復雜的處理并可以使需要的組分變性而被分析(例如酶)，這樣該方法對于具有處理簡便的優(yōu)點的干分析元件不適用。
在血紅素吸收較少的650nm或更大的波長測量光譜吸收的方法在使用液體試劑時是有效的。即盡管血紅素的吸收在波長650nm或更大可少量測到，當過分稀釋的樣品諸如液體體系在血紅素吸收少的波長(例如680nm)測定時血紅素的模糊不成問題。
然而，當樣品在沒有稀釋的分析中諸如干分析元件的情況下使用時，甚至在600nm或更大的波長血紅素的少量吸收對于測量值產生嚴重的成問題的影響。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種新的用來避免血紅素的影響的方法，其在血紅素的吸收波長不隨時間的變化而偏向并且不產生前述問題。
本發(fā)明的這個目的及其它目的已通過用于避免血紅素影響的方法實現，在此方法中，其影響是當用速率分析測樣品顏色反應的光譜吸收時，在血紅素的吸收波長由隨時間的變化引起的，其中方法包括在517-529nm或580-592nm波長測光譜吸收。


圖1表示血紅素的吸收波長。
圖2表示血紅素在吸收波長隨時間的變化。
在本發(fā)明中，光譜吸收優(yōu)選在520-526nm或583-589nm波長進行測量。
此外，在本發(fā)明中，被測樣品優(yōu)選是干分析元件。但是，如果樣品是液體，也能獲得足夠的效果。既然在光譜吸收中污染的血紅素隨時間的變化可以避免，本發(fā)明的方法優(yōu)選應用速率分析。速率分析是測定在兩點或多點(反應速率)變化的量的方法。這個方法經常使用干分析元件。
同樣，在本發(fā)明中，被測樣品優(yōu)選含有可見的著色劑?？梢姷闹珓┛梢允茄趸珓┗蜻€原著色劑。
本發(fā)明中使用的氧化著色劑的例子包括3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(TMBZ)、N-(3-磺丙基)-3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(TMBZ·PS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、鈉鹽、二水合物(ADOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、鈉鹽、一水合物(ADPS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)苯胺、鈉鹽、一水合物(ALOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺、鈉鹽(ALPS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、鈉鹽(DAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、鈉鹽、一水合物(DAPS)、N-(3-磺丙基)苯胺、鈉鹽、一水合物(HALPS)、N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、鈉鹽(HDAOS)、N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、鈉鹽、一水合物(HDAPS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺、鈉鹽、一水合物(MAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺、鈉鹽、一水合物(MAPS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺、鈉鹽、二水合物(TOOS)和N-磺丙基苯胺(HALPS)。
本發(fā)明中使用的還原著色劑的例子包括四唑鹽類，諸如2-(4-磺苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鹽酸鹽(INT)、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴酸鹽(MTT)、3，3′-(1，1′-二苯基-4，4′二基)-雙(2，5-二苯基-2H-四唑鹽酸鹽)(Neo-TB(Neo-四唑藍))、3，3′-(3，3′-二甲氧基-(1，1′-二苯基)-4，4′二基)-雙(2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鹽酸鹽)(Nitro-TB)(硝基四唑藍))、3，3′-(3，3′-二甲氧基-(1，1′-二苯基)-4，4′二基)-雙(2，5-二苯基-2H-四唑鹽酸鹽)(TB-(四唑藍))、2-(4-磺苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑一鈉鹽(WST-1)和2-(4-磺苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑一鈉鹽(WST-3)。
進一步，本發(fā)明的方法優(yōu)選用于酶活性的測量。
用本發(fā)明的方法測量酶活性的酶的例子包括谷氨酸草酰乙酸轉氨酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸轉氨酶(GPT)、乳酸脫氫酶(LDH)、脂肪酶、亮氨酸氨基肽酶(LAP)、γ-谷氨酰轉氨酶(γGTP)、磷酸肌酸轉移酶(CPK)和丙酮酸激酶(PK)。
圖1表示血紅素的吸收波長(吸光度(OD)為縱坐標，波長(NM)為橫坐標)。既然如圖1所示血紅素的吸收在600nm或更大的波長處很小，通常認為當在該波長測量時測量值無影響。但是，如前文所述，血紅素的吸收隨時間變化并導致在干分析系統條件下不可忽略的誤差。
隨時間變化的例子在圖2中表示。圖2表示在PH11測的血紅素的吸收的變化(吸光度(OD)為縱坐標，波長(nm)為橫坐標)。在一條線和其相鄰線之間的空間表示1分鐘的間隔。如圖2所示，曲線隨時間的推移變得平緩(接近水平)。隨時間的推移色度增加的反應試劑導致在520-590nm波長所測值的負誤差或在其它可見波長的正誤差。另一方面，隨時間的推移色度降低的反應試劑導致在520-590nm波長所測值的正誤差或在其它可見波長的負誤差。即使在溫和條件下，也或多或少地發(fā)生這些變化并導致測量值正或負誤差。在干分析元件情況下這種影響非常明顯。本發(fā)明的重點是在不發(fā)生這些隨時間變化的波長處進行測量。
不發(fā)生血紅素吸收周期性變化的波長優(yōu)選在520-526nm或583-589nm范圍內。但是，范圍可以根據測量條件，諸如溫度多少有些變化。本發(fā)明的測量在20℃-45℃、優(yōu)選在25℃-37℃進行。
本發(fā)明現用下述實施例的方式進行更詳細的說明，但應認為本發(fā)明不能被其限定。實施例1用于GPT(谷氨酸丙酮酸轉氨酶)測量的干分析元件(配方)L-丙氨酸0.9gα-戊酮二酸 0.1g丙酮酸氧化酶20k單位磷酸0.05g過氧化物酶 10k單位4-氨基安替比林 0.05gN-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺鈉鹽0.05g藻酸鈉 2.0g蒸餾水 8.0g磷酸二氫鉀 0.04g磷酸氫二鈉 0.24g上述組分混合以制備試劑涂敷溶液，將試劑涂敷溶液涂在不透明的聚對苯二甲酸乙二酯薄片上，濕的厚度是200μm，在40℃干燥30分鐘，得到試劑層。顯色層的制備(配方)Triton X-100 0.10g蒸餾水 9.90g
一片厚度為0.25mm(Savina Minimax，Kanebo，LTD.商品名)的聚酯衣浸入上述組分混合物中得到顯色層。加工成分析元件上述獲得的濕顯色層壓在前面制備的試劑層上，在40℃干燥30分鐘。如此得到的分層薄片被切成5mm×7mm尺寸，用壓敏粘合劑雙層涂敷小條后嵌入5mm×80mm尺寸的白色聚對苯二甲酸乙二酯薄片尖端，得到分析元件。測量從健康人采集的全血樣品分為兩部分一部分進行人為溶血作用；另一部分不處理。從中制備的每份血清樣品與30單位/1的GPT混合，將6μl所得混合物的部分供給分析元件并在37℃保溫。此后，在保溫開始之后的3-4分鐘期間內在575、585和610nm監(jiān)測每個反射來測定血紅素對測量值的影響。用反射吸收測量儀(SPOTCHEM，Kyoto Daiichi Kagaku CO.，Ltd.商品名)測量和確定血紅素的濃度，發(fā)現溶血作用后的樣品含有300mg/dl的血紅素。
反射根據Kubelka-Munk公式被轉化為K/S值以計算其不同(ΔK/S值)。結果見表1。
表1波長 血紅素濃度 誤差0mg/dl300mg/dl575nmΔ0.025Δ0.021 -14％585nmΔ0.027Δ0.027 ±0％610nmΔ0.025Δ0.026 +4％實施例2用于GPT測量的使用其它成色試劑的干分析元件(配方)L-丙氨酸0.9gα-戊酮二酸 0.1g丙酮酸氧化酶20k單位磷酸0.05g過氧化物酶 10k單位4-氨基安替比林 0.05gN-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺鈉鹽0.05g藻酸鈉 2.0g蒸餾水 8.0g磷酸二氫鉀 0.04g磷酸氫二鈉 0.24g上述組分混合以制備試劑涂敷溶液，將試劑涂敷溶液涂在不透明的聚對苯二甲酸乙二酯薄片上，濕的厚度是200μm，在40℃干燥30分鐘，得到試劑層。
制備顯色層、加工成分析元件和測量用與實施例1中所述方法進行。
結果見表2。
表2波長 血紅素濃度 誤差0mg/dl 300mg/dl500nm Δ0.015 Δ0.018 ＋20％525nm Δ0.016 Δ0.016 ±0％610nm Δ0.017 Δ0.014 －17％表1和2中的結果表明通過設定測量波長為525或585nm可降低測量誤差至0％。
這樣，如前文所述，本發(fā)明的方法不要求空白試驗，故不需要額外的工作；不使血紅素變性，故分析可以簡便地進行而不導致所需成分變性。另外，發(fā)明的方法比在650nm或更大波長測吸光度的在先技術方法準確而且不破壞干分析元件的簡便和易操作。
在已詳細并參照其特例描述本發(fā)明的同時，本領域技術人員應清楚在不離開其精神和范圍條件下可以進行不同的變化和修改。
權利要求
1.用于避免血紅素影響的方法，其中影響是當用速率分析測樣品顏色反應的光譜吸收時在血紅素的吸收波長由隨時間的變化引起的，在本方法中包括在517-529nm或580-592nm波長測光譜吸收。
2.按權利要求1的方法，其中在520-526nm或583-589nm波長測光譜吸收。
3.按權利要求1的方法，其中樣品含有可見的著色劑。
4.按權利要求1的方法，其中樣品是干分析元件。
5.按權利要求1的方法，其中方法用于測量酶活性。
全文摘要
用于避免血紅素影響的方法，其中影響是當用速率分析測試樣品顏色反應的光譜吸收時在血紅素的吸收波長由隨時間的變化引起的，在本方法中包括在517-529nm或580-592nm波長測光譜吸收。
文檔編號C12Q1/52GK1153301SQ96112619
公開日1997年7月2日 申請日期1996年8月7日 優(yōu)先權日1995年8月7日
發(fā)明者水谷智, 田村浩, 西野進 申請人:株式會社京都第一科學