專利名稱：：發(fā)酵生產(chǎn)維生素b6的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及發(fā)酵生產(chǎn)維生素B6的方法。本申請中所用的“維生素B6”包括吡哆醇，吡哆醛和吡哆胺。維生素B6是動物，植物和微生物營養(yǎng)所必需的。并用在醫(yī)藥和食品中。本發(fā)明的目的是提供高效的維生素B6發(fā)酵生產(chǎn)方法。對維生素B6的生產(chǎn)已經(jīng)有很多研究，而且已知糖酵母，畢赤氏酵母，克雷白氏桿菌，無色桿菌，芽孢桿菌和黃桿菌均產(chǎn)生維生素B6。但是還從未報道用屬于根瘤菌屬的微生物積累大量的維生素B6。本發(fā)明使其以高產(chǎn)率生產(chǎn)維生素B6成為可能。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)屬于根瘤菌屬的微生物能夠在培養(yǎng)液中積累大量的維生素B6，從該培養(yǎng)液中可以以令人滿意的純度回收維生素B6。因此，本發(fā)明涉及生產(chǎn)維生素B6的方法，包括培養(yǎng)屬于根瘤菌屬并能夠在有氧條件下在培養(yǎng)基中生產(chǎn)維生素B6的微生物，然后從發(fā)酵液中分離所得的維生素B6。可以用卡爾斯伯糖酵母ATCC9080[TheanalysisofNutrientsinFoods，academicPress，London，224-227(1978)]檢測發(fā)酵液中維生素B6的含量，而且還可以用高效液相色譜分別測量發(fā)酵液中維生素B6組分，如吡哆醇，吡哆醛和吡哆胺的含量[Vitain，63,349-369(1989)]。為了完成本發(fā)明，在含有微生物生長所必需的可吸收碳源，可消化氮源，無機(jī)鹽和其他營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)根瘤菌屬的微生物。可以使用的碳源有，如葡萄糖，果糖，乳糖，半乳糖，蔗糖，麥芽糖，淀粉，糊精或甘油?？墒褂玫牡从腥珉?，大豆粉，玉米漿，肉提取物，硫酸銨，硝酸銨，脲或其混合物。此外可以使用的無機(jī)鹽有，鈣，鎂，鋅，錳，鈷或鐵的硫酸鹽，鹽酸鹽或磷酸鹽。而且如果需要，還可以補(bǔ)充常規(guī)營養(yǎng)因子或抗泡劑如動物油，植物油或礦物油。適宜的培養(yǎng)基pH為約5.0-約9.0，優(yōu)選的是6.5-7.5。適宜的培養(yǎng)溫度為約10-40℃，優(yōu)選的是26-30℃。培養(yǎng)時間適宜為1-14天，優(yōu)選2-7天。在培養(yǎng)過程中，通氣和攪拌通常會得到有利的結(jié)果。丙酮酸鹽，D-甘油醛，乙醇醛，甘氨酸，1-脫氧-D-蘇-戊酮糖，4-羥基-L-蘇氨酸或其適當(dāng)?shù)慕M合在培養(yǎng)基中的存在對維生素B6的滴定度更有利，因此其存在是優(yōu)選的。作為維生素B6生產(chǎn)的補(bǔ)充，1-脫氧-D-蘇-戊酮糖和4-羥基-L-蘇氨酸的組合的特別有效的。還可以通過在有適當(dāng)pH的緩沖液中培養(yǎng)從培養(yǎng)液中分離的根瘤菌屬微生物來生產(chǎn)維生素B6，所述緩沖液含有適當(dāng)組合的D-甘油醛，乙醇醛，甘氨酸，1-脫氧-D-蘇-戊酮糖，4-羥基-L-蘇氨酸。培養(yǎng)后，從培養(yǎng)液中分離生產(chǎn)的維生素B6，然后純化。為了達(dá)到該目的，利用維生素B6的特性可以使用從培養(yǎng)液中分離維生素B6的常用方法。因此，如從培養(yǎng)液中除去細(xì)胞后，用離子交換樹脂或相似的方法純化在濾液中的所需物質(zhì)。洗脫后，從醇中再結(jié)晶所需的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明所用的微生物包括屬于根瘤菌屬的所有菌株，它們能夠生產(chǎn)維生素B6并且被保藏在任何人要求后均可得到的公開的保藏機(jī)構(gòu)(收集中心)，如InstituteofFermintationOsaka，Japan(IFO)，theMinistryofagricuture，F(xiàn)orestryandFeshery，Japan(MAFF)或theInstituteofAppliedMicrobiology，theUniversityofTokyo，Japan(IAM)；所述保藏菌株的實(shí)例是苜蓿根瘤菌IFO14782，苜蓿根瘤菌MAFF303040，苜蓿根瘤菌MAFF303047，苜蓿根瘤菌MAFF303097，RhizobiumtrropiciIFO15247，RhizobiumhuakuiiIFO15243，豌豆根瘤菌IFO14778，RhizobiumgalegaeIFO14965，RhizobiumfrediiIFO14780，RhizobiumlotiIFO14998，Rhizobiumsp.IAM13623和Rhizobiumsp.IAM13631。在根瘤菌屬的這些菌株中特別優(yōu)選的是苜蓿根瘤菌IFO14782和RhizobiumtrropiciIFO15247。苜蓿根瘤菌IFO14782和RhizobiumtrropiciIFO15247還于1995年9月4日被保藏在德國的DSM(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkultrenGmbH)，保藏號分別為DSM10226和10227。通過下列實(shí)施例將更詳細(xì)地說明本發(fā)明；但是應(yīng)理解本發(fā)明不限于這些特定的實(shí)施例。實(shí)施例1將在含0.1％酵母提取物(Difco)，0.5％甘露醇，0.07％K2HPO4，0.01％KH2PO4，0.1％MgSO4·7H2O和1.5％瓊脂(pH7.0)的瓊脂培養(yǎng)基上生長的一菌環(huán)量苜蓿根瘤菌IFO14782(DSMNo.10226)接種到含5ml種子培養(yǎng)基的試管中，所述種子培養(yǎng)基含1％葡萄糖，0.5％聚胨(NipponSeiyakuCo.，Japan)，0.2％酵母提取物(Difco)，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.001％MnSO4·5H2O和0.001％FeSO4·7H2O，然后在28℃將試管在往復(fù)振蕩器(285rpm)上振蕩17小時。將4ml種子培養(yǎng)物接種到帶2個隔板，含200ml培養(yǎng)基的500-ml燒瓶中，所述培養(yǎng)基含4％葡萄糖，4％聚胨S(NipponSeiyakuCo.，Japan)，0.8％酵母提取物(Difco)，0.05％MgSO4·7H2O，0.05％MnSO4·5H2O，0.001％FeSO4·7H2O和一滴消泡劑CA-115(NipponSeiyakuCo.，Japan)，然后在28℃旋轉(zhuǎn)振蕩(180rpm)培養(yǎng)燒瓶。培養(yǎng)168小時后，按如下所述，用卡爾斯伯糖酵母ATCC9080，通過濁度法檢測培養(yǎng)上清液維生素B6的含量。用蒸餾水將所述上清液和吡哆醇(0-100mg/l)標(biāo)準(zhǔn)溶液系列稀釋到1.731×10-4。依次將200μl稀釋的溶液，1.5ml蒸餾水和40μ1.155NH2SO4加到試管中。于120℃高壓滅菌20分鐘后，將1.5ml含卡爾斯伯糖酵母ATCC9080的維生素B6的檢測培養(yǎng)基(NissriCo.，Japan)加到試管中，在28℃以30°角培養(yǎng)。培養(yǎng)17小時后，通過加入5ml0.2N的鹽酸使細(xì)胞停止生長，然后測量在660nm的吸收值。將樣品的濁度與卡爾斯伯糖酵母ATCC9080的標(biāo)準(zhǔn)生長曲線比較，從而確定樣品中的維生素B6量。結(jié)果，168小時培養(yǎng)液的上清液每升含84mg維生素B6。此外，將100μl4’-脫氧-吡哆醇(100mg/l)作為內(nèi)物質(zhì)加到168小時培養(yǎng)液的上清液中后，在CapcellpakC18SG120柱(4.6×250mm，ShiseidoCo.，Japan)上，用HPLC系統(tǒng)，在λ＝292nm，以1.0ml/分的流速用0.1M高氯酸鈉，0.1M磷酸鉀和2％乙腈(pH3.5)混合溶劑分析混合物，所述HPLC系統(tǒng)由WatersModel600E系統(tǒng)控制器，WatersModel600F泵，WatersModel99J光敏二極管箭頭指示標(biāo)記，WatersModel700衛(wèi)星WISP樣品注射器和Waters5200打印機(jī)組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所述上清液每升含有78.6mg吡哆醇。實(shí)施例2用與實(shí)施例1中所述相似的方法，培養(yǎng)苜蓿根瘤菌MAFF303040，苜蓿根瘤菌MAFF303047，苜蓿根瘤菌303097，RhizobiumhuakuiiIFO15243，豌豆根瘤菌IFO14778，RhizobiumtrropiciIFO15247(DSMNo.10227)RhizobiumgalegaeIFO14965，RhizobiumfrediiIFO14780，RhizobiumlotiIFO，Rhizobiumsp.IAM13623和Rhizobiumsp.IAM13631。在每個菌株均培養(yǎng)168小時后，通過使用卡爾斯伯糖酵母ATCC9080的濁度法，檢測培養(yǎng)液上清液中維生素B6的含量。結(jié)果示于表1。表1用根瘤菌菌株生產(chǎn)維生素B6</tables>實(shí)施例3從與實(shí)施例1所述相同的條件下制備的苜蓿根瘤菌IFO14782(DSMNo.10226)的培養(yǎng)液中回收維生素B6。通過使用卡爾斯伯糖酵母ATCC9080的濁度法確定各純化步驟中維生素B6的濃度。將1升168小時的培養(yǎng)液以8000rpm離心10分鐘。用1N鹽酸將所得上清液的pH調(diào)到3.1，然后將上清液加到裝有350mlAmberliteCG120(H+形式，100-200目，OrganoCo.Ltd)的柱(3.6×40cm)。用300ml去離子水洗滌該柱，然后用5％氫氧化銨洗脫。減壓濃縮維生素B6組分。將由此所得的殘留物溶解在10ml0.01M甲酸銨(pH3.2)中。將該溶液加到裝有180mlDowex50wx8(銨形式，200-400目，DowChemicalCo.LtdU.S.A.)的柱(2.4×40cm)上。用200ml0.01M甲酸銨(pH3.2)洗柱。然后用200ml0.05M甲酸銨(pH4.25)的起始緩沖液，接著用200ml各0.05M和0.5M甲酸銨(pH7.0)緩沖液的線性梯度將柱展開。色譜得到有抗卡爾斯伯糖酵母ATCC9080生長活性的一個主峰和2個小峰。將主峰的組分減壓濃縮到小體積，用1N鹽酸將溶液pH調(diào)到3.1，然后將溶液加到裝有75mlAmberliteCG120(H+形式，100-200目)的柱(1.8×40cm)上。用150ml去離子水洗滌該柱，然后用5％氫氧化銨洗脫。減壓濃縮具有抗卡爾斯伯糖酵母ATCC9080生長活性的組分。將固體殘留物溶解在少量熱乙醇中，將所述溶液在4℃過夜保持。通過過濾收集所得的沉淀，真空干燥以得到51mg的粗晶體。將這些從乙醇中再結(jié)晶以得到44mg熔點(diǎn)為160℃的白色晶體。產(chǎn)物的紅外吸收值，UV吸收值和NMR譜與真正的吡哆醇的一致。另一方面，在實(shí)施例1中所述的分析條件下用HPLC分析與有抗卡爾斯伯糖酵母ATCC9080生長活性的兩個小峰，并且證明分別是吡哆胺和吡哆醛。實(shí)施例4在與實(shí)施例1相同的培養(yǎng)條件下制備RhizobiumtrropiciIFO15247(DSMNo.10227)的種子培養(yǎng)物。將4ml種子培養(yǎng)物接種到兩個含200ml培養(yǎng)基的500ml燒瓶中，所述培養(yǎng)基含有2％葡萄糖，1％聚胨，0.2％酵母提取物(Difco)，0.05％MgSO4·7H2O，0.05％MnSO4·5H2O和0.001％FeSO4·7H2O和一滴消泡劑CA-115。另外將4ml含1％1-脫氧-D-蘇-戊酮糖(下文稱為DTP)和1％4-羥基-L-蘇氨酸(下文稱為HT)的滅菌水加到一個燒瓶中，將4ml滅菌水加到另一燒瓶中。在28℃旋轉(zhuǎn)振蕩器(180rpm)上振蕩這兩個燒瓶。在28℃培養(yǎng)96小時后，按實(shí)施例1中所述，通過使用卡爾斯伯糖酵母ATCC9080的濁度法檢測培養(yǎng)液上清液中維生素B6的含量。正如表2中所總結(jié)的，在含用DTP和HT補(bǔ)充的培養(yǎng)基的燒瓶中每升生產(chǎn)45mg維生素B6，而在不含DTP和HT的培養(yǎng)基的燒瓶中每升只生產(chǎn)3.16mg維生素B6。此外，用實(shí)施例3中描述的方法，從1升用各0.02％的DTP和HT補(bǔ)充的96小時培養(yǎng)液中分離得到了19.3mg熔點(diǎn)為159.5℃白色晶體。所述產(chǎn)物的紅外吸收值，UV吸收值和NMR與真正吡哆醇的一致。表2用RhizobiumtrropiciIFO15247(DSMNo.10227)生產(chǎn)的維生素R6DTP1-脫氧-D-蘇-戊酮糖，HT4-羥基-L-蘇氨酸實(shí)施例5在與實(shí)施例1所述相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)苜蓿根瘤菌IFO14782(DSMNo.10226)。在28℃培養(yǎng)72小時后，以8000rpm離心10分鐘收集細(xì)胞，用100ml滅菌的0.85％氯化鈉溶液洗滌兩次，然后懸浮在88ml滅菌蒸餾水中。于28℃在含10ml0.1MTris-HCl緩沖液(pH8.0)的試管中往復(fù)振蕩(285rpm)完成維生素B6的生產(chǎn)，所述緩沖液含有0.02％DTP，0，24％乙醇醛，0.24％甘氨酸和細(xì)胞懸浮液(在600nm的最后光密度＝20/ml)。在28℃振蕩24小時后，在與實(shí)施例1所述相同的分析條件下用HPLC確定反應(yīng)混合物上清液中的維生素B6。正如在表3中所總結(jié)的，從DTP，乙醇醛和甘氨酸生產(chǎn)出9.66mg/l吡哆醇。表3用苜蓿根瘤菌IFO14782(DSMNo.10226)從DTP，乙醇醛和甘氨酸生產(chǎn)吡哆醇DTP1-脫氧-D-蘇-戊酮糖實(shí)施例6用與實(shí)施例5所述相同的方法制備苜蓿根瘤菌IFO14782(DSMNo.10226)的洗滌的細(xì)胞懸浮液。在28℃含10ml0.1MTris-HCl緩沖液(pH7.6)和洗滌的細(xì)胞懸浮液(在60nm的最后光密度＝20/ml)的試管中往復(fù)振蕩(285rpm)完成維生素B6的生產(chǎn)，所述緩沖液由0.24％丙酮酸鹽，0.24％D-甘油醛和0.02％HT組成。在28℃培養(yǎng)24小時后，按實(shí)施例1中描述的分析條件用HPLC得到反應(yīng)混合物上清液中的維生素B6。正如表4中所總結(jié)的，從丙酮酸鹽，D-甘油醛，和HT每升生產(chǎn)了9.66mg吡哆醇。表4用苜蓿根瘤菌IFO14782(DSMNo.10226)從丙酮酸鹽，D-甘油醛，和HT生產(chǎn)吡哆醛實(shí)施例7用與實(shí)施例5所述相同的方法制備苜蓿根瘤菌IFO14782(DSMNo.10226)的洗滌的細(xì)胞懸浮液。在28℃含10ml0.1MTris-HCl緩沖液(pH7.6)和洗滌的細(xì)胞懸浮液(在600nm的最終光密度為20/ml)的試管中往復(fù)振蕩(285rpm)完成維生素B6的生產(chǎn)，所述緩沖液由0.24％丙酮酸鹽，0.24％D-甘油醛、0.24％乙醇醛和0.24％甘氨酸組成。在28℃培養(yǎng)24小時后，按實(shí)施例1中描述的分析條件用HPLC得到反應(yīng)混合物上清液中的維生素B6。正如表5中所總結(jié)的，從丙酮酸鹽，D-甘氨酸醛，乙醇醛和甘氨酸每升生產(chǎn)了9.66mg吡哆醇。表5用苜蓿根瘤菌IFO14782(DSMNo.10226)從丙酮酸鹽，D-甘氨酸醛，乙醇醛和甘氨酸生產(chǎn)吡哆醛</tables>權(quán)利要求1.生產(chǎn)維生素B6的方法，包括培養(yǎng)屬于根瘤菌屬并能夠在有氧條件下在培養(yǎng)基中產(chǎn)生維生素B6的微生物，然后從培養(yǎng)液中分離所得的維生素B6。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)是在含微生物生長所必需的可吸收碳源，可消化氮，無機(jī)鹽和其他營養(yǎng)成分以及存在丙酮酸，D-甘氨酸醛，乙醇醛，甘氨酸，1-脫氧-D-蘇-戊酮糖，4-羥基-L-蘇氨酸或其混合物的培養(yǎng)基中完成的。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述培養(yǎng)是在含微生物生長所必需的可吸收碳源，可消化氮，無機(jī)鹽和其他營養(yǎng)成分以及存在1-脫氧-D-蘇-戊酮糖，4-羥基-L-蘇氨酸或其混合物的培養(yǎng)基中完成的。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一方法，其中所述培養(yǎng)是在pH為約5.0到約9.0完成的。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述培養(yǎng)是在pH為約6.5到約7.5完成的。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的任一方法，其中所述培養(yǎng)是在溫度為約10-40℃完成的。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述培養(yǎng)是在溫度為約26-30℃完成的。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7的任一方法，其中所述培養(yǎng)是1-14天。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述培養(yǎng)是2-7天。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9的任一方法，其中所述微生物是苜蓿根瘤菌IFO14782(DSMNo.10226)或RhizobiumtropiciIFO15247(DSMNo.10227)。全文摘要一種生產(chǎn)維生素B6的方法，包括培養(yǎng)屬于根瘤菌屬并能夠在有氧條件下在培養(yǎng)基中生產(chǎn)維生素B6的微生物，然后從培養(yǎng)液中分離所得的維生素B6。其中所述培養(yǎng)是在含微生物生長所必需的可吸收碳源，可消化氮，無機(jī)鹽和其他營養(yǎng)成分，所述培養(yǎng)基還可含有丙酮酸，D-甘氨酸醛，乙醇醛，甘氨酸，1-脫氧-D-蘇-戊酮糖，4-羥基-L-蘇氨酸或其混合物。本方法提供了高產(chǎn)率的維生素B6，維生素B6是動物，植物和微生物營養(yǎng)所必需的，而且在醫(yī)藥和食品中也是有用的。文檔編號C12P17/10GK1153823SQ9611297公開日1997年7月9日申請日期1996年9月24日優(yōu)先權(quán)日1995年9月30日發(fā)明者朝倉敬子,星野達(dá)雄,田副正明申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司