專利名稱：Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變檢測方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類醫(yī)學(xué)衛(wèi)生領(lǐng)域，是一種檢測Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的方法及其試劑盒。
Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變是母系遺傳的一種并不少見的眼病。常在青春期發(fā)病，男性多見，主要表現(xiàn)為視神經(jīng)受損，即雙眼先后或同時(shí)出現(xiàn)中心視力的急劇下降，數(shù)月后呈現(xiàn)視神經(jīng)萎縮。此病的臨床癥狀及眼底表現(xiàn)與急性球后視神經(jīng)炎、視盤血管炎很相象，因此臨床上常易誤診。臨床上為明確診斷主要依靠家族遺傳史(見1.《Leber氏病一家四例報(bào)告》中華眼科病雜志1993年第9卷第2期；2.《Leber氏家族遺傳性視神經(jīng)萎縮》實(shí)用眼科雜志1991年第9卷第11期)，但是有些患者很難問出家族遺傳史，另外目前我國實(shí)行人口控制，大多數(shù)為獨(dú)生子女，家族遺傳史不易顯露。到目前為止，還未見有拋開家族遺傳史而檢測Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的方法。
本發(fā)明的目的在于為臨床提供一種不需依靠家族遺傳史就能檢測Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的方法及其試劑盒。
本發(fā)明的發(fā)明人根據(jù)近年來國內(nèi)外和自己對本病從分子遺傳學(xué)研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的患者存在線粒體的點(diǎn)突變。由于線粒體點(diǎn)突變的存在，使得正常線粒體DNA中人類高度保守的限制性內(nèi)切酶SfaNI的識別位點(diǎn)喪失。進(jìn)而，使得線粒體產(chǎn)能效率下降，導(dǎo)致細(xì)胞氧化和呼吸功能障礙，尤其是使最易受線粒體產(chǎn)能影響的前部視神經(jīng)無髓纖維、視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突，因細(xì)胞供能不足以維持它們的完整結(jié)構(gòu)與功能，最后發(fā)生退行性變化。線粒體的點(diǎn)突變被視為與本病致病有關(guān)，利用PCR方法檢測出線粒體的點(diǎn)突變，就能達(dá)到明確檢測本病的目的。
本發(fā)明提供的檢測Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的方法和使用本試劑盒，是在采取患者的1毫升靜脈血中，加入特定的抗凝劑，經(jīng)變性法提取總DNA(包括線粒體DNA)，以PCR方法擴(kuò)增特異的mtDNA片段，再用SfaNI限制性內(nèi)切酶切割。正常人，經(jīng)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物能被SfaNI限制性內(nèi)切酶切割，而Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變患者，其PGR擴(kuò)增產(chǎn)物則不能被SfaNI限制性內(nèi)切酶切割，從限制性內(nèi)切酶SfaNI的識別位點(diǎn)喪失可查出線粒體的點(diǎn)突變，因而對本病可作明確檢測。
下面進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體制備與操作步驟。
本發(fā)明的Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變檢測試劑盒的試劑和溶血液制備或生產(chǎn)單位1、特定的抗凝劑EDTANa 2gNaCl0.85g加水至 100ml室溫溶解，每100微升特定抗凝劑抗凝1毫升靜脈血。
2、一對引物由上海植物生理研究所或上海生物化學(xué)研究所提供成品。
5′AGCCCTCGTAGTAACAGCCA-3′輕鏈POS.11641～11660，每微升500納克。
5′GGAGTATAGGGCTGTGACTA-3′重鏈POS.11980～11961，每微升500納克。
3、PCR試劑dNTP200毫微克10×Buffer 5微升TaqDNA多聚酶1.2單位4、限制性內(nèi)切酶SfaNI(New England Biolabs產(chǎn))NEBuffer3(New England Biolabs產(chǎn))5、溶血液Tris-Hcl 10mmol/L PH7.5 NaCl 10mmol/L，MgCl25mmol/L.
本發(fā)明的Leber氏遺傳性視神經(jīng)檢測試劑盒的組成1、特定的抗凝劑一管2、一對引物各一管3、dNTP一管4、TaqDNA多聚酶一管5、10×Buffer一管6、限制性內(nèi)切酶SfaNI一管7、NEBuffer3一管8、溶血液一管本發(fā)明的具體操作方法如下；抽取患者外周靜脈血1毫升，加入特定抗凝劑100微升中，輕輕混勻后成抗凝血，再取抗凝血50微升置于400微升溶血液中輕輕混勻，靜置5分鐘，經(jīng)4000rpm離心5分鐘后棄上清，加入100微升生理鹽水混勻，置100℃沸水7分鐘，4000rpm短暫離心(不超過1分鐘)，取上清10微升作模板(即0.2微克DNA)加入一對引物各20pmol，dNTP200毫微克，10×Buffer 5微升，再加雙蒸水至50微升，放入PCR熱循環(huán)儀中擴(kuò)增95℃變性4分鐘，待溫度按程序自動降至70℃時(shí)取出，加入TaqDNA多聚酶1.2單位，然后繼續(xù)以94℃變性40秒、55℃復(fù)性40秒、70℃延伸30秒為一個(gè)循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃繼續(xù)延伸7分鐘。取經(jīng)PCR擴(kuò)增后的特異性DNA片段20微升，以SfaNI內(nèi)切酶1個(gè)單位、2.3微升NEBuffer3置37℃水浴箱內(nèi)消化6小時(shí)，取10微升加2％溴化乙錠電泳儀下分析，正常者呈現(xiàn)190bp、150bp兩個(gè)片段，而Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變患者因其DNA不能被SfaNI限制性內(nèi)切酶切割而只呈現(xiàn)340bp一個(gè)片段。
本發(fā)明的有益效果是解決了以往只能靠家族遺傳史來診斷Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的問題，為臨床明確檢測Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變提供了一個(gè)簡便、可靠的方法和試劑盒。
權(quán)利要求
1.一種臨床檢測Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的試劑盒，其特征在于由抗凝劑、溶血液、一對引物、dNTP、TaqDNA多聚酶、10×Buffer、SfaNI限制性內(nèi)切酶、NEBuffer3各一管組成，具體為(1.1)特定抗凝劑EDTANa22gNaCl 0.85g加水至100ml(1.2)一對引物各一管5′AGCCCTCGTAGTAACAGCCA-3′輕鏈POS.11641～11660，每微升500納克。5GGAGTATAGGGCTGTGACTA-3′重鏈POS.11980～11961，每微升500納克。(1.3)dNTPdNTP 200毫微克；(1.4)TaqDNA多聚酶；TaqDNA多聚酶1.2單位(1.5)10×Buffer10×Buffer 5微升；(1.6)SfaNI限制性內(nèi)切酶SfaNI(New England Biolabs產(chǎn))(1.7)NEBuffer3NEBuffer3(New England Biolabs產(chǎn))′(1.8)溶血液Tris-Hcl 10mmol/L.pH7.5NaCl 10mmol/L，MgCl25mmol/L。
2.一種臨床檢測Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的方法，其特征在于依次包括如下步驟(2.1)抽取患者外周靜脈血1毫升，加入特定抗凝劑100微升中，輕輕搖勻，成抗凝血；(2.2)取抗凝血50微升置于400微升溶血液中輕輕搖勻，靜置5分鐘，經(jīng)4000rpm離心5分鐘后棄上清，加入100微升生理鹽水混勻，置100℃沸水7分鐘，4000rpm短暫離心，取上清10微升作模板；(2.3)模板10微升中加入一對引物各20pmol，dNTP200毫微克，10xBuffer 5微升，再加雙蒸水至50微升，置PCR熱循環(huán)儀中循環(huán)95℃變性4分鐘，待溫度按程序自動降至70℃時(shí)取出，加入TaqDNA多聚酶1.2單位，然后繼續(xù)以94℃變性40秒、5 5℃復(fù)性40秒、70℃延伸30秒為一個(gè)循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃繼續(xù)延伸7分鐘，成為經(jīng)PCR擴(kuò)增后的特異性DNA片段；(2.4)取經(jīng)PCR擴(kuò)增后的特異性DNA片段20微升，以SfaNI內(nèi)切酶1個(gè)單位和2.3微升NEBuffer3置37℃水浴箱內(nèi)消化6小時(shí)；(2.5)取步驟(2.4)中最后生成物10微升，加2％溴化乙錠，在電泳儀下分析，正常者呈現(xiàn)190dp、150dp兩個(gè)片段，而Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變患者只呈現(xiàn)340dp一個(gè)片段。
全文摘要
本發(fā)明是一種臨床檢測Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的方法及其試劑盒。根據(jù)本病患者存在線粒體點(diǎn)突變致使正常線粒體DNA中限制性內(nèi)切酶SfaNI識別位點(diǎn)喪失的特點(diǎn)，利用特定的抗凝劑、溶血液和一對引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物不能被SfaNI限制性內(nèi)切酶消化切割而檢測本病。本發(fā)明的有益效果是解決了以往只能靠家族遺傳史來診斷Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的問題，為臨床明確檢測本病提供了一種簡便、可靠的方法和試劑盒。
文檔編號C12Q1/00GK1143117SQ9611629
公開日1997年2月19日 申請日期1996年4月1日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月1日
發(fā)明者周海林, 鄒祝英, 胡育新 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)