專利名稱：抑制性卡巴B蛋白(IkB)的截短形式，及其重組產(chǎn)物和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及掏轉(zhuǎn)錄因子，尤其是轉(zhuǎn)錄因子NFkB的激活的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及這些蛋白質(zhì)的重組產(chǎn)物，特別是體內(nèi)重組產(chǎn)物，以及涉及編碼這些蛋白質(zhì)的核酸，其表達及其傳遞載體，其治療和預防的應(yīng)用，特別是通過基因治療的方法來治療成年呼吸窘迫綜合征(ARDS)，哮喘、同種異體移植，排斥反應(yīng)，脈管炎，和血管再狹窄，及其他主要由NFkB的抑制造成的疾病。
在炎癥過程中，相當多的各種基因的表達在上皮細胞和內(nèi)皮細胞中被上調(diào)，這些基因包括那些編碼白細胞介素、轉(zhuǎn)錄因子、粘附分子，和血系統(tǒng)成分的基因。許多這些基因的轉(zhuǎn)錄涉及到轉(zhuǎn)錄因子NFkB。
轉(zhuǎn)錄因子NFkB在細胞質(zhì)中被組成型表達。翻譯后的修飾允許已完成轉(zhuǎn)錄的因子從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞核中，從而使得NFkB一樣蛋白可誘地基因的轉(zhuǎn)錄。所述轉(zhuǎn)運受一種被稱為IkB的抑制蛋白的磷酸化和降解的控制，所述IkB與NFkB形成復合物，從而可在細胞質(zhì)中得以維持。用適當?shù)男盘柎碳ぜ毎蓪е翴kB的修飾，這反過來會使IkB與NFkB解離。
IrB蛋白與NFkB的結(jié)合遮掩了NFkB的核定位信號(NLS)。根據(jù)細胞的類型和細胞發(fā)育的不同時期，用特異性的試劑刺激細胞，IkB就受到某種方式的修飾使它不能結(jié)合NFkB，從而使NFkB從IkB上解離下來。據(jù)信能導致這種修飾作用的信號涉及氧自由基的產(chǎn)生，或激酶的活化并引起IkB在其特殊部位的磷酸化；特別是在32Ser，36Ser和42Tyr這幾個位點上的磷酸化。結(jié)果是其NLS被曝露出來，而NFkB易位至細胞核，在那里它能在控制基因表達的區(qū)段內(nèi)結(jié)合特異性DNA序列。與這些位點結(jié)合的NFkB就引起與炎癥過程有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄。
轉(zhuǎn)錄因子NFkB最初是從成熟B細胞分離出的，在B細胞中，NFkB結(jié)合在K輕鏈增強子中的一段+聚體序列的基序上。盡管最初認為NFkB只是特異性地針對這種細胞類型和細胞發(fā)育的這個時期，但從那以后從很多類型的細胞中都鑒定出了NFkB一樣蛋白，而且正如上文討論過的，已顯示出NFkB更廣泛地涉及基因轉(zhuǎn)錄的誘導。在幾個可誘導的基因中鑒定出有功能活性的NFkB結(jié)合位點進一步支持了上述觀點。
NFkB是一種異二聚體蛋白，由一個50KD的亞單元(P50)和一個65KD的亞單位(P65)組成。P50和P65的cDNA已被克隆并顯示在一段含300個氨基酸的區(qū)段上有同源性。P50亞單位與分離自哺乳動物和鳥類的C-rel原癌基因產(chǎn)物有顯著同源性，并與果蠅背腹的基因產(chǎn)物有同源性。近來，已從血清刺激的成纖維細胞中將NFkB家族的另一個成員，relB克隆成一種立即早期反應(yīng)基因。
p50和p65都能形成同源二聚體，盡管經(jīng)們的特性不同p50的同源二聚體有較強的DNA結(jié)合親和力但不能反式激活轉(zhuǎn)錄，而p65同源二聚體雖只能微弱地結(jié)合DNA卻能反式激活轉(zhuǎn)錄。p50被合成為110KD的前體(p110)的氨基末端部分，此p110并無結(jié)合DNA和形成的二聚體的活性。p110的羧基末端部分有8個錨蛋白重復單位，這是在幾種涉及細胞周期控制和分化的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的一種基序。對與4kb p50前體RNA同時誘導的一段較短(2.6kb)的RNA類進行克隆發(fā)現(xiàn)，不管是經(jīng)交替剪切或是用有區(qū)別的啟動子，都能各自獨立地表達110KD蛋白質(zhì)的C末端部分。
現(xiàn)已鑒定出五種IkB家族的成員IkBα，IkBβ，p105/IkBγ，p100/IkBΔ，和IkBε(Baeuerle and Baltimore，Cell 87，13-20(1996))。所有IkB樣家族成員均含有多個錨蛋白重復單位，它是抑制NF-kB激活所必需的。
所有三種IkBα樣蛋白均有5個錨蛋白重復單位。RL/IF-1已被克隆并顯示能表達在經(jīng)肝切除術(shù)后30分鐘內(nèi)再生的肝中。對缺失突變的研究揭示pp40的5個錨蛋白重復單位中的4個是抑制DNA結(jié)合活性和與C-rel結(jié)合所必需的，研究還顯示C末端區(qū)也是必需的。有關(guān)以110KD p50前體進行的單特并抗體研究已證實C末端部分(有IkB活性的部分)遮住了位于p50的氨基末端區(qū)中的核定位信號(NLS)。Brown等人在Science 267，1485-1488(1995)中報道了一個IkB的缺失突變體，它缺少54個NH2-末端氨基酸，該突變既未被信號作蛋白酶解，也未被信號磷酸化，并仍能完全抑制NFkB.Scheinman等人和Auphan等人報道由糖皮質(zhì)激素誘導的免疫抑制是通過誘導IkB合成而介導的(Science，270，283-286 and 286-290(1995))。
本發(fā)明的一個目的是提供IkB樣突變蛋白，它在體內(nèi)不會失活，并因此仍能抑制NFkB和阻礙或防止對炎癥的誘導。本發(fā)明因此提供了一種生物活性蛋白質(zhì)，上述蛋白質(zhì)通過抑制核因子卡巴B(NFkB)介導的對炎癥反應(yīng)的激活作用來模擬IkB的活性，該蛋白質(zhì)選自由具有SEQID NO1序列的IkBα的Δ(290-317)，Δ(281-317)，Δ(267-317)，Δ(243-317)和Δ(1-44)截短蛋白組成的組。
本發(fā)明的一個較優(yōu)選方面是提供了能編碼截短蛋白的cDNAs。一個更為優(yōu)選的方面是提供了編碼Δ(1-44)IkBα蛋白的cDNA(SEQ IDNO2)。
另一方面，本發(fā)明涉及治療哺乳動物的呼吸系統(tǒng)疾病，特別是成年呼吸窘迫綜合癥(ARDS)，同種異體移植物排斥反應(yīng)，哮喘，炎性關(guān)節(jié)炎，脈管炎及再狹窄的方法，通過對需要這樣的治療的哺乳動物施以治療有效劑量的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)選自由IkBα的Δ(290-317)，Δ(281-317)，Δ(267-317)，Δ(243-317)和Δ(1-44)截短蛋白組成的組，這是通過在體內(nèi)或體外將能編碼選自由IkBα的Δ(290-317)，Δ(281-317)，Δ(267-317)，Δ(243-317)和Δ(1-44)截短蛋白組成的組的一種蛋白質(zhì)的核酸傳遞至哺乳動物細胞中，使之在細胞中表達以產(chǎn)生治療有效量的蛋白質(zhì)來實現(xiàn)的。在一個優(yōu)選實施方案中，該核酸是能編碼Δ(1-44)截短蛋白的核酸(SEQ ID NO2)。


圖1.本發(fā)明的IkBα N末端截短的突變蛋白的氨基酸序列(SEQID NO1(Δ1-44))和編碼這種IkB突變蛋白的cDNA核酸序列。
圖2.IkB突變蛋白在Uzos細胞中抑制NFkB的激活。
圖3.IkB突變蛋白對激活作用誘導的蛋白水解的抗性。
圖4.IkB突變蛋白在LacI報道基因共轉(zhuǎn)染實驗中對gelB啟動子活性的抑制作用。
圖5.人內(nèi)皮細胞中以逆轉(zhuǎn)錄病毒為基礎(chǔ)的表達。
圖6.抑制細胞因子誘導的CAM表達。
圖7.抑制趨化因子的產(chǎn)生。
圖8體內(nèi)預防性基因治療。
陳述以下定義是為了說明和解釋本文描述本發(fā)明所用到的各種術(shù)語的意義和范圍。
術(shù)語“治療”意指對哺乳動物某一疾病的任一種治療，包括(i)防止疾病，即，便疾病的臨床癥狀不再發(fā)展；(ii)抑制疾病，即，限制臨床癥狀的發(fā)展；和/或(iii)緩解疾病，即，使臨床癥狀消退。
術(shù)語“有效量”意指對正接受治療的疾病發(fā)展期足以能提供治療效果的劑量。此劑量隨病人，病情和受影響的治療效果的不同而改變。
本文用到的術(shù)語“轉(zhuǎn)化的”和“轉(zhuǎn)染的”表示在靶細胞中引入一段編碼一種IkB突變蛋白的多降核苷酸，如cDNA。
“可操作地連接”指使各成分能行使正常功能的連接。因此，一編碼序列“可操作地連接”至一個調(diào)控序列是指某種構(gòu)型，其中編碼序列能在這些序列的控制下被表達。
“調(diào)控序列”指在某一特殊宿主生物體中表達一個可操作地連接的編碼序列所必需的DNA序列。
“表達系統(tǒng)”是指DNA序列含有可操作地連接的所需編碼序列和調(diào)控序列，以使被這些序列轉(zhuǎn)化的細胞就能產(chǎn)生編碼蛋白。為實現(xiàn)轉(zhuǎn)化，表達系統(tǒng)可能包含在一個載體上；然而，有關(guān)的DNA也可能整合進宿主染色體。
“載體”是指由單鏈，雙鏈、環(huán)狀或超螺旋DNA組成的一個DNA分子。載體上含有，以恰當?shù)木嚯x可操作地連接的因子，以便能允許功能性基因表達，所述因子為啟動子，5′mRNA前導序列，轉(zhuǎn)錄起始位點，核酸盒，3′未翻譯區(qū)和聚腺苷酸化位點。在特殊應(yīng)用中可除去一個或多個這些因子。核酸盒中可包含一個限制性酶切位點以便插入需表達的核酸序列。在功能性載體中核酸盒包括的需要表達的核酸序列帶有翻譯起始和終止位點。
如本文所用到的，術(shù)語“藥學可接受的”指一種載體介質(zhì)，它不受活性成分的生物活性的效力的干擾，對它所施予的宿主沒有毒性。
如本文所用到的，術(shù)語“藥學可接受的”指一種載體介質(zhì)，它不受活性成分的生物活性的效力的干擾，對它所施予的宿主沒有毒性。
如上所述，本發(fā)明涉及抑制性卡巴B蛋白(IkBα)的截短形式，它選自由IkBα(SEQ ID NO1)的Δ(290-317)，Δ(281-317)，Δ(267-317)，Δ(243-317)，和Δ(1-44)截短蛋白組成的組。一個較優(yōu)選的實施方案是抑制性卡巴B蛋白的N末端截短形式Δ(1-44)(表示為IkB-NT)，其序列見圖1。這些IkB蛋白的截短形式(IkBΔ290，IkBΔ281，IkBΔ267，IkBΔ243，和IkB-NT)能抵抗炎癥誘導的蛋白酶的水解作用，并保留結(jié)合NFkB和抑制其轉(zhuǎn)錄活性的能力。這些特點使重組的IkB蛋白截短形式能作為NFkB激活的有效抑制物而發(fā)揮功能，因而暗示它將具有顯著的抗炎活性。編碼IkB-NT的cDNA可在肺毛細管內(nèi)皮細胞中表達以治療成年呼吸窘迫綜合征(ARDS)，哮喘，脈管炎和炎性關(guān)節(jié)炎。此外，移植的器官或靜脈移植物可用此制劑處理以抑制同種異體移植排斥反應(yīng)。血管內(nèi)皮可在PTCA后通過一個導管而用某種截短蛋白處理以抑制再狹窄。
IkB-NT截短突變體(編碼第45-第17位氨基酸)有超過作為NFkB激活作用的抑制物的IkB分子和IkB突變蛋白的好幾種顯著優(yōu)點，這種截短為體缺IkBα的44個NH2末端的氨基酸，它們調(diào)節(jié)該蛋白的信號依賴性降解作為對活性信號的反應(yīng)。第32和36位殘基的絲氨酸被磷酸化，第22和23位的賴氨酸被遍在蛋白化(Scherer etal.，PNAS(USA)92，11259-11263(1995))，而第42位的酪氨酸(Imbert etal.，Cell86，787-798(1996))被磷酸化以對活化信號作出反應(yīng)。這些事件致使IkBα從NFkB上分離，從而使NFkB激活而IkBα降解。因此，在IkB-NT截短突變體上所有三個關(guān)鍵信號位點的缺失就產(chǎn)生了一種NFkB抑制物，它能抵抗依賴于激活作用的蛋白水解降解作用。此外，這種截短突變體在作為基因治療方式被表達時將比帶氨基酸取代基的IkkBα突變體免疫原性更弱。此外，IkBβ應(yīng)首先被磷酸化才能抑制NFkB的激活，而未磷酸化的IkBα就能抑制NFkB(Kremer et al.，J.BiolChem 271，16310-16316(1996))。
本文所述的IkB突變蛋白由具有規(guī)定的化學結(jié)構(gòu)的蛋白物質(zhì)組成。然而，其精確的結(jié)構(gòu)取決于很多因素，特別是已知發(fā)生在蛋白質(zhì)上的化學修飾作用。例如，由于所有蛋白質(zhì)均帶有可電離的氨基和羧基，則顯然抑制物應(yīng)以酸性或堿性鹽形式，或中性形式被獲得。更為明顯的是，通過用糖分子衍生化(糖基化作用)或其他化學衍生化作用，一級氨基酸序列可被擴大所述化學衍生化作用包括將諸如脂，磷酸，乙酰基及類似的基因與抑制物共價接合或離子接合，常通過與糖類的結(jié)合出現(xiàn)這種情況。這些修飾作用可以在體外或體內(nèi)發(fā)生，在體內(nèi)發(fā)生是由一個宿主細胞通過后的加工系統(tǒng)完成。應(yīng)理解，不管這種修飾作用是如何發(fā)生的，只要IkB突變蛋白活性的未被破壞，就打算在限定IkB突變蛋白時包括它。當然我們期望這種修飾作用能增加或減弱分子的生物活性，而這樣的經(jīng)化學修飾過的分子也將包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
編碼人全長IkB(1-317個氨基酸)的cDNA分離自一個cDNA序，該序是用標準的PCR擴增方法從人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的mRNA中制備出的。該cDNA用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和XbaI消化后被連接至一個真核表達質(zhì)粒(pBJneo)中，產(chǎn)生了質(zhì)粒pIkB-fl。用編碼全長人IkB的質(zhì)粒作模板經(jīng)PCR擴增而構(gòu)建IkB截短突變體(編碼氨基酸1-289，1-280，1-266和45-317。較優(yōu)選的缺失突變體(IkB-NT)缺少至少最初44個氨基末端的氨基酸；預期一直缺失到des-Ser70的N末端缺失突變體也有效，des-Ser70是第一個錨蛋白重復單位的起點。
有關(guān)克隆，擴增、表達和純化的其他方法對于熟練技術(shù)人員而言是顯而易見的。代表性的方法揭示在Sambrook，F(xiàn)ritsch，and Maniatis，分子克隆，實驗室手冊，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)。
本發(fā)明的表達產(chǎn)物，即IkB突變蛋白，對防止和治療各種哺乳動物疾病是有用的，其中顯示出抗炎癥的作用。尤其是，本發(fā)明的突變蛋白顯示出可預防和治療人的成年呼吸窘迫綜合征(ARDS)，同種異體移植物排斥，哮喘，炎性關(guān)節(jié)炎，脈管炎和血管再狹窄。
本發(fā)明的突變蛋白同樣可用于IkB抗體的產(chǎn)生及它們隨后用作診斷和藥物篩選工具的用途。表達載體可用于生產(chǎn)被NFkB抑制哺乳動物細胞，以此來評價免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的另一方面涉及藥物組合物，它含有作為活性成分的本發(fā)明蛋白質(zhì)或其藥物可接受的鹽類，并與藥物可接受的天毒的載體相混合。這種組合物可被制備成非腸道用藥(皮下，肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)注射)的形式，特別是制備成液體溶液或懸浮液形式；也可制備成口服或經(jīng)面頰用藥，特別是片劑或膠囊形式；也可制備成肺或鼻內(nèi)用藥，特別是粉末，滴鼻液或氣霧劑形式；還可制備成直腸或穿皮用藥的形式。
該組合物可以以單位劑量形式很方便地用藥，并可以用藥學領(lǐng)域已知的任何方法制備，例如在Remingtoris Parmaceutical Sciences，17thed.，Mack Publishing Company，Easton，PA.，(1985)中所描述的方法。
可將本發(fā)明的化合物經(jīng)預期的一段等時間傳遞給受試對象，比如，經(jīng)一周至一年的時間，這一過程可通過單獨施用一個受控制的釋放系統(tǒng)(它帶有足以應(yīng)付所需釋放時期的活性成分)來完成。為了這個目的，可利用各種受控釋放系統(tǒng)，如單結(jié)石或貯式微囊，儲存移植片，滲透泵，泡膠囊，脂質(zhì)體，穿皮補片，離子電滲裝置，和其他可注射的劑量形式。定位于需要傳遞活性成分的位點是某些受控釋放裝置的一種附加特征，它有利于治療某些疾病。
受控放制劑的形式之一包括分散或用膠囊包裹在一個緩慢降解的，無毒，無抗原性聚合物(如共聚酶(乳酸/羥基乙酸))中的蛋白質(zhì)或其鹽，正如Kent，Lewis，Sanders and Tice在其探索性工作美國專利No.4,675,189中所述。該化合物，或最好是其相對不溶性鹽，也可配制在膽固醇或其他以脂為基質(zhì)的小丸，或以Silastomer為基質(zhì)的移植片中。其他的緩慢釋放，儲存移植片或注射的制存劑對于熟練技術(shù)人員來說是顯而易見的。例如，見，《持續(xù)的控制中的藥物傳遞系統(tǒng)的釋放》，J.R.Robinson編輯，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978以及R.W.Baker，《生物活性因子的受控釋放》，John Wiley & Sons，NewYork，1987。
盡管有可能傳遞一有效劑量的突變蛋白自身至靶組織，蛋白降解作用和低傳遞效率的問題使我們更希望在原位最好是在胞質(zhì)中表達本發(fā)明的突變蛋白，借此，NFkB介導的轉(zhuǎn)錄激活有可能通過阻止NFkB遷移進核內(nèi)而被抑制。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一個并源cDNA序列，正如本文所述，它在靶細胞中被組成型表達并編碼一種IkB突變蛋白。該IkB突變蛋白編碼序列與一個并源啟動子序列可操作地連接，以致突變蛋白被持續(xù)表達。典型的啟動子包括但不限于CMV，SV40和熱激蛋白。
在另一個實施方案中編碼本發(fā)明的突變蛋白一個cDNA序列被可操作地連接上一個并源可誘導的啟動子序列，以使表達可被專一性的外源刺激物發(fā)動。適當?shù)耐庠创碳の锛瓤赏ㄟ^補體級聯(lián)自然增加提供，也可通過將外來藥物引入靶細胞而提供，還可通過某些其他的非化學的外在刺激物，如照射而提供。代表性的可誘導啟動子系統(tǒng)是，描述在U.S.Patent No.5,364,791(Vegeto et al)的類固醇“基因開關(guān)”技術(shù)，由Gossen et al.，在PNAS 89，5547-5551(1992)所報道的四環(huán)素敏感系統(tǒng)。
我們期望本發(fā)明在體內(nèi)或體外均可實施，只要是適合于所治療的病癥，所用到的治療制度，和病人的整體健康。根據(jù)所選擇的治療方案，很多技術(shù)均可用于介導cDNA進入靶細胞。其中很多技術(shù)在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)染中同樣有用；然而，熟練的技術(shù)人員應(yīng)理解某種技術(shù)更適合于具體情況并能被相應(yīng)地引導。總而言之，這些技術(shù)可分為物理類、化學類和生物類，下文將更詳細地討論。
生物轉(zhuǎn)染技術(shù)中包括對逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒，痘病毒和細胞質(zhì)粒的應(yīng)用。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來自逆轉(zhuǎn)錄病毒，它們是經(jīng)隨機地整合自己的基因組到宿主基因組中而復制出的。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體比其他病毒載體可攜帶更大的遺傳信息。但，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有其固有的安全問題包括已在病人體內(nèi)存在的污染病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因而產(chǎn)生病毒產(chǎn)物。它們能使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體重新，獲得其復制潛力并成為一個有完整功能的病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在肌肉，腦和其他不增殖的細胞中很有用。合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體描述在WO92/07573中。
腺病毒是一種線性，雙鏈DNA病毒。一方面腺病毒血清型與呼吸道感染有關(guān)，另一方面也存在非傳染性血清型。腺病毒有一個中等大小的基因組，可在細胞核內(nèi)復制。腺病毒通過受體進入細胞，而其病毒DNA再轉(zhuǎn)移至細胞核并被表達。它們對呼吸道上皮有親和力，可能有用于肺病和氣管病的治療。它們也可用于出靶上皮細胞。它們可產(chǎn)生高滴度，而且相對較穩(wěn)定，由于它們是DNA病毒，故可以用一種氣溶膠來傳送。這些病毒應(yīng)用起來相對較簡便，而且因為它們不進入染色體，也就減少了對有關(guān)插入誘變的擔心。對腺病毒載體的應(yīng)用和發(fā)展有一些限制。由于腺病毒的基因組是線性的，它們就不太穩(wěn)定并更易發(fā)生轉(zhuǎn)錄錯誤。用于產(chǎn)生腺病毒載體的細胞系只生產(chǎn)出低水平的感染性病毒載體，并留存有天然，野生型病毒。更有甚者，腺病毒的抗體有可能針對這些被轉(zhuǎn)化的腺病毒而發(fā)揮作用。較適用的腺病毒載體均描述在Rosenfeld etal.，Science，252，432(1991)。
腺相關(guān)病毒(AAV)屬于細小病毒家族并由一個約4至6kb的單鏈DNA組成。AAV載體在宿主細胞中很穩(wěn)定，并無證據(jù)表明AAV改變了細胞基因表達或引起了基因重排。AAV所能攜帶的遺傳物質(zhì)的最小量有限，只有約5kb的DNA能被包裝進一個AAV載體。
痘病毒載體是大病毒并有幾個可插入基因的位點。它們具有熱穩(wěn)定性，可在室溫保存。安全性研究表明痘病毒載體有復制缺陷，不能從宿主轉(zhuǎn)到宿主或轉(zhuǎn)到環(huán)境中。與其他病毒一樣，它也有其固有的重組和形成感染性顆粒的安全問題。痘病毒經(jīng)吞噬作用被吸收，并因此將進入不同類型的細胞中。
質(zhì)粒是，發(fā)現(xiàn)于細胞中的，雙鏈DNA其復制，轉(zhuǎn)錄，翻譯均獨立于細菌基因組之外。已發(fā)現(xiàn)細菌來源的質(zhì)粒是足以傳遞基因的載體。從質(zhì)粒上除去復制基因以防止它傳給子代細胞。例如，當質(zhì)粒被注射進肌肉組織時，它就被細胞吸收。它并不整合進染色體，而是自主地轉(zhuǎn)錄和翻譯。
化學和物理載體避免了應(yīng)用生物載體所帶來的有關(guān)安全的擔心。本發(fā)明的實踐中應(yīng)用的方法包括，但不限于脂質(zhì)體，脂，和兩親物，細胞受體，磷酸鈣或DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染，顯微注射，電穿孔，以及多肽-DNA復合物。
脂質(zhì)體是中空，球形載體，由磷脂組成。全身注射時，脂質(zhì)體在肝、脾、肺和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中與細胞膜融合或被吸入細胞內(nèi)。為增加擊靶的專一性，將直接針對特殊細胞受體的單克隆抗體或配體附著在脂質(zhì)體表面。
脂質(zhì)體內(nèi)的DNA受到保護，不會被降解。此外，應(yīng)用脂質(zhì)體克服了細胞屏障的限制帶來的問題。脂質(zhì)體有進行生物插入的好處，而且它不象病毒那樣會產(chǎn)生復制的危險。
細胞受體靶向的基因傳遞是另一種方法。所有細胞在其表面均有能結(jié)合很多種因子或配體的一般性受體和獨特的受體。結(jié)合受體的配體常常被吸收并成為基因激活的信號傳導途徑的一部分。通過擊靶一個獨特的受體，結(jié)合在配體上的一個基因被特異的細胞吸收，這時并無需考慮不需要的細胞類型，或者說也不必克服進入細胞時細胞表面的抗性。
磷酸鈣或DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染是廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)染方法。被轉(zhuǎn)染的DNA經(jīng)吞噬或吞飲進入胞質(zhì)。根據(jù)細胞類型的不同，最多有20％的培養(yǎng)細胞類型能在任何時候被轉(zhuǎn)染。
當核酸以磷酸鈣-DNA共沉淀物形式存在時培養(yǎng)中的細胞對DNA的吸收受到明顯促進。Graham和Van der Eb(1973)(他們發(fā)展了將腺病毒和SV40的DNA導入粘附細胞的方法)描述了在中性PH條件下(pH7.05)最適于形成磷酸鈣-DNA共沉淀物的鈣濃度(125mM)和DNA濃度(5-30μg/ml)。此外，他們確定了沉淀反應(yīng)的最佳時間(20-30分鐘)以及隨后將細胞暴露于沉淀物的最佳時間(5～24小時)。他們的工作為將克隆的DNA導入許多不同種的哺乳動物細胞打好了基礎(chǔ)，并直接引導出細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)化及克隆DNA瞬時表達的可靠方法。對該方法的許多小改動已有描述，大多數(shù)均涉及在沉淀反應(yīng)中混合各組分的順序和方式的變更。通過結(jié)合另外的步驟，如在轉(zhuǎn)染程序之后甘油振蕩和/或氯奎處理，均能增加該方法的功效。用丁酸鈉處理也顯示能增強猴和人細胞中帶有SV40增強子的持粒的表達。
DEAE-葡聚糖最初可用作易化劑以將脊髓灰質(zhì)炎病毒RNA和SV40還有多瘤病毒的DNA導入細胞。這個方法，稍經(jīng)改動后繼續(xù)被廣泛用于轉(zhuǎn)染病毒的基因組和攜帶病毒序列的質(zhì)粒。盡管DEAE-葡聚糖的作用機制尚不清楚，但我們認為該聚合物有可能結(jié)合至DNA上并抑制核酸酶的作用，和/或該聚合物結(jié)合至細胞并促進細胞內(nèi)吞DNA。
經(jīng)DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染與經(jīng)磷酸鈣共沉淀物介導的轉(zhuǎn)染在三個重要的方面有不同。第一，DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染一般只用于克隆基因的瞬時表達而不用于細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。第二，它作用于諸如BSC-1，CV-1和COS這樣的細胞系時效力很高，但許多對其他類型的細胞結(jié)果不理想，可能是由于這種聚合物有毒。第三，用DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染所用的DNA量比用磷酸鈣共沉淀時的少。用100-200ng超螺旋質(zhì)粒DNA可獲得105猴細胞的最大轉(zhuǎn)染效力；若DNA用量再大些(＜2-3μ)就能產(chǎn)生抑制作用。與經(jīng)磷酸鈣介導的轉(zhuǎn)染相反，磷酸鈣介導的轉(zhuǎn)染需要高濃度的DNA以促進沉淀的形成，而在DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法中從不應(yīng)用載體DNA。
已描述了DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染的很多變異形成。其中有兩種重要的改變對方法的效力產(chǎn)生了很大影響所用的DEAE-葡聚糖的濃度以及細胞暴露于DEAE-葡聚糖混合物的時間長度。既可用相對較高的DEAE-葡聚糖濃度(1mg/ml)作用較短時間(30分鐘至1.5小時)，也可用較低濃度(250μg/ml)作用較長時間(達8小時)。第一個轉(zhuǎn)染方法較為有效，但它涉及當細胞暴露于易化劑時監(jiān)控細胞對外界壓力的早期信號的反應(yīng)。第二種技術(shù)較不嚴格，也因此而更可信。
聚陽離子PolybreneTM能使低分子量DNA(如質(zhì)粒DNA)有效而穩(wěn)定地導入用其它方法較難成功轉(zhuǎn)染的細胞條中。
Polybrene已被用作DNA轉(zhuǎn)染入某類細胞的易化劑，該類細胞已被證實對用磷酸鈣共沉淀進行的轉(zhuǎn)染有相對抗性。這種方法在用質(zhì)粒DNA對CHO細胞進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化時很有效，產(chǎn)生了比磷酸鈣-DNA共沉淀法多約15倍的轉(zhuǎn)化子。不過兩種方法在高分子量DNA轉(zhuǎn)化的效力中并無區(qū)別。目前尚不知Polybrene介導的轉(zhuǎn)染到底是能用于克隆DNA的瞬時表達還是適于對除CHD以外的其他細胞系的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
原生質(zhì)體融合是將本發(fā)明的cDNA導入靶細胞的另一種方法。在這個方法中，由帶有高拷貝目的質(zhì)粒的細菌衍生而得的原生質(zhì)體直接與培養(yǎng)的哺乳動物細胞混合。細胞膜融合之后，(通常借助聚乙二醇，PEG)，細菌的內(nèi)含物被傳至哺乳動物細胞的胞質(zhì)中，而質(zhì)粒DNA則被轉(zhuǎn)移至核。對許多通常用于瞬時表達試驗的細胞系而言，原生質(zhì)體融合并不象轉(zhuǎn)染一樣有效，但對那些不能有效的內(nèi)吞DNA的細胞系原生質(zhì)體融合則是有用的。原生質(zhì)體融合常產(chǎn)生隨機整合到宿主染色體上的多拷貝的質(zhì)粒DNA。
可通過將原生質(zhì)體(從攜帶目的質(zhì)粒DNA的細菌制備而得)與培養(yǎng)的哺乳動物細胞融合，而將克隆的DNA導入哺乳動物細胞中。在有氯霉素存在時培養(yǎng)細菌以擴增質(zhì)粒DNA，然后用溶菌酶處理去掉細胞壁。得到的原生質(zhì)體在哺乳動物單層細胞上離心，所得的混合物用聚乙二醇(PEG)處理以促進融合。該過程中，細菌DNA和質(zhì)粒DNA均被轉(zhuǎn)移至哺乳動物細胞內(nèi)。再除去PEG，細胞在含卡那霉素的新鮮細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)以抑制任何幸存細菌的生長。原生質(zhì)體融合既被用于克隆基因的瞬時表達，也被用于建立哺乳動物細胞的穩(wěn)定細胞系。
原生質(zhì)體融合已被用于將免疫球蛋白基因穩(wěn)定導入B細胞以及將珠蛋白基因?qū)胄∈蠹t白血病細胞。此方法的好處就是其高效性，但操作很費時，而共轉(zhuǎn)化通常是不可能的。因而目的基因必須總是攜帶在含有所需的可選擇的標記的質(zhì)粒上。
電穿孔涉及到對哺乳動物細胞施用短時、高壓電泳沖以便在胞質(zhì)膜上形成納米大小的孔。DNA可通過這些孔，也可以作為伴隨著孔的關(guān)閉而重新分布膜成分的結(jié)果直接被導入細胞質(zhì)中。電穿孔可能非常有效，且它既可用于克隆基因的瞬時表達，也可用于建立攜帶有整合的目的基因拷貝的細胞系。與磷酸鈣介導的轉(zhuǎn)染和原生質(zhì)體融合相比，電穿孔常產(chǎn)生帶有外源DNA的一個，或至多幾個整合拷貝的細胞系。
該方法被用于瞬時表達和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，但轉(zhuǎn)染效力差別很大。必須完成一系列預備實驗以確定對某一特定的細胞系能導致可接受的瞬時表達或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化水平的條件。
電穿孔轉(zhuǎn)染效力受很多因素的影響1)所用電場的強度。低電壓下，培養(yǎng)的細胞的胞質(zhì)膜的改變不足以讓DNA分子通過；在較高電壓下，細胞被不可逆地損壞了。對大多數(shù)哺乳動物細胞系而言，在電壓介于250V/cm和750v/cm之間時可達到瞬時表達的最高水平(例如用CAT活性試驗來測量)。典型情況下，有20％至50％的細胞在此處理中幸存。2)電脈沖的長度。通常，一個單一的電脈沖可穿透細胞。有些電穿孔設(shè)備允許實驗人員控制脈沖的長度和形狀；在其他設(shè)備中，脈沖的特性僅決定于所提供的電源的電容?？衫玫臄?shù)據(jù)指示電穿孔所需的最佳電脈沖長度是20-100毫秒。如果細胞暴露于電脈沖后在電穿孔室中再溫育1-2分鐘就能增加瞬時表達的效力。3)溫度。一些研究人員報道當細胞在電穿孔期間維持在室溫下可獲得瞬時表達的最高水平；其他人將細胞維持在0℃而獲得了更好的結(jié)果。這些矛盾可能是因為同類型的哺乳動物細胞對穿過電流的反應(yīng)不同造成的，也可能是電穿孔期間用大電壓(＞1000v/cm)和/或延長的電脈沖(＞100毫秒)產(chǎn)生的熱量不同造成的。4)DNA的構(gòu)象和濃度。盡管線性或環(huán)狀DNA均可經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染，但用線性DNA時獲得了瞬時表達和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的較高水平。用濃度范圍為1μg/ml至40μg/ml的DNA可獲得有效轉(zhuǎn)染。5)培養(yǎng)基的離子組成。細胞懸浮于緩沖鹽溶液(如HEPES緩沖的鹽小)比懸浮于非離子物質(zhì)(如甘露醇或蔗糖)緩沖溶液中轉(zhuǎn)染效力要高很多倍。電穿孔有一個主要的優(yōu)點對于其他技術(shù)，如磷酸鈣-DNA共沉淀技術(shù)效果打折扣的細胞系，電穿孔可以很好地發(fā)揮作用。然而，仍需進行周密的工作以確定所研究的特殊細胞系的最佳條件。現(xiàn)已有許多不同電穿孔儀器可以商購，而廠家亦為它們的應(yīng)用提供了詳細的操作說明。
將DNA導入細胞的另一個重要方法是將DNA與化學修飾的蛋白質(zhì)結(jié)合。這些修飾過的蛋白質(zhì)能通過化學附著的合成多聚賴氨酸肽結(jié)合DNA，并結(jié)合至靶細胞上的特異受體。當這些復合物經(jīng)特并受體介導的內(nèi)吞作用被吸收后，DNA編碼的基因可被靶細胞表達。用轉(zhuǎn)鐵蛋白/多聚賴氨酸/DNA復合物以及脫唾液酸糖蛋白/多聚賴氨酸/DNA復合物都做了實驗。使用共價，化學結(jié)合的天然配體(1)將DNA特異地靶向不同組織；(2)提供更有效的吸收過程。這些方法的使用受限，因為它們需用化學或酶方法在體外修飾配體以產(chǎn)生能結(jié)合DNA的化合物。另外也可以應(yīng)用Ledley et al.，描述在WO94/25608中的結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)技術(shù)。
脂質(zhì)體作為體外和體內(nèi)傳遞載體的用途已被染入研究。這些方法大多涉及將DNA或RNA包裹在脂質(zhì)體中，再將脂質(zhì)體與細胞膜融合。然而，也有人揭示了另一種轉(zhuǎn)染方法，其中DNA與一種合成的陽離子脂或兩親物混合并經(jīng)融合被導入細胞。
施用能編碼本發(fā)明的IkB突變蛋白的核酸的一種較優(yōu)選方法是用一種非病毒載體，最好是一種陽離子兩親物(如，DOTMA)來轉(zhuǎn)染，它們描述在美國專利NO.4,897,355，WO95/14381，WO96/18372，WO96/01840，WO96/01841和Proc.Nat.Acad.Sci(USA(93，3176-3181(1996)，在此列入本文參考文獻。
該DNA轉(zhuǎn)染方法可用作治療炎癥的方案的一部分。既可以通過從受感染病人體內(nèi)抽出細胞，體外用合適的基因轉(zhuǎn)染再將成功轉(zhuǎn)染的細胞重新注入病人體內(nèi)來進行治療；也可以通過用合適的使轉(zhuǎn)染能在體內(nèi)發(fā)生的載體對受感染的病人全身性直接施用適當DNA來進行治療。體內(nèi)程序按以下方式進行，它采用自文獻(Anderson，Science 226，401-409(1984)；Williams et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.83，2655-2670(1986))。從病人體內(nèi)提取出適宜量的組織細胞(從107-109)。該組織細胞可來源于各種器官，如肝，脾，血液或皮膚，但最可能是來源于骨髓。對組織進行胰酶消化或其它必需的方式就制備出細胞以便能進行組織培養(yǎng)，細胞在適當?shù)呐囵B(yǎng)基上生長適宜的時間(如1天至2周)，然后加入適于所治療的特殊遺傳病的DNA/DOTMA脂質(zhì)體復合物，以與前面所述的方法一致的組合物進行轉(zhuǎn)染。細胞培育適當?shù)臅r間，約4至72小時，然后洗滌被成功轉(zhuǎn)染的細胞并重新注入受感染病人體內(nèi)。
體內(nèi)轉(zhuǎn)染過程可按Nicolau et al.，Proc，Nat，Acad，Sci 80，1068-1072(1983)所述進行。DNA脂質(zhì)體復合物，或雙包被的DNA復合物，或共價修飾的雙包被復合物按Eppstein et al.文獻同上所描述的來制備。這種共價修飾的復合物將帶有附著的抗體，蛋白質(zhì)，激素，糖類或其他化學修飾以便將它們擊靶特殊的目的細胞。例如，該復合物可帶上皮細胞的抗體，以便將復合物擊靶上皮細胞；或者它們可帶有針對骨髓細胞的某一特殊亞群的抗體，從而將復合物擊靶這些細胞。對受感染病人用藥可以是靜脈內(nèi)注射(IV)，皮下注射(SC)，腹膜內(nèi)注射(IP)，肌肉內(nèi)注射(IM)，局部施用，或經(jīng)氣溶膠至鼻或肺。治療方案既可涉及單一治療，也可經(jīng)常按需要要為多種治療的聯(lián)合，IV劑量可以以團塊形式給予，也可以是慢速輸入。
給出以下實施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能更清楚地理解并實踐本發(fā)明。它們不應(yīng)被看作是對本發(fā)明范圍的限制，而僅僅是作為本發(fā)明的舉例說明和代表。
實施例1構(gòu)建IkB質(zhì)粒用PCR擴增法從人臍靜脈內(nèi)皮細胞cDNA庫(Stategene，LaJolla，(A)中分離編碼人全長IkB(1-317氨基酸)的cDNA。按廠家(GeneAmp kit，Perkin Elmer，NorwalK，CT)提供的條件進行PCR擴增，使用以下寡核苷酸引物(限制性內(nèi)切酶位點均以劃線表示)正向5′ccgcgtctagacagctcgtccgcgccatgttcc 3′(SEQ ID NO3)反向5′ccgccgaattcatacaagtccatgttctttcagcc 3′(SEQ ID NO4)30個擴增循環(huán)，每一次均是94℃1分鐘(變性)，55℃1.5分鐘(退火)，72℃2分鐘(延伸)。該cDNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和Xbal消化后被連接至一個真核細胞表達質(zhì)料pBJneo(Lin et al，Science249，677-679(1990))上從而產(chǎn)生了質(zhì)粒pIkB-fl。IkB-NT截短突變體(編碼氨基的46-317)的構(gòu)建是經(jīng)PCR擴增完成，用到編碼全長人IkB的質(zhì)粒作模板。PCR反應(yīng)的進行(如上所述)用到以下寡核苷酸引物(限制性酶切位點均以劃線表示)正向5′ggctctagaatggtcaaggagctgcaggag 3′(SEQ ID NO5)反向5′ccgccgaattcatacaagtccatgttctttcagcc 3′(SEQ ID NO6)用Xbal和EcoRI限制酶消化885bp的PCR擴增子，并亞克隆到pBJneo真核表達質(zhì)粒以產(chǎn)生質(zhì)粒pIkB-NT。
在羧基端有缺失的IkB的其他類似的截短突變體，亦如上所述按與全長IkB相同的方法制備出來。PCR擴增所用的正向引物與上相同，反向引物如下IkB截短物引物IκB 1-289cgcgaattcatagctctcctcatcctcactctc (SEQ ID NO7)IκB 1-280cgcgaattccagcatctgaaggttttctagtgtc(SEQ ID NO8)IκB 1-266cgcgaattcctgtatccgggtgcttgggcggcc(SEQ ID NO9)IκB 1-242cgcgaattcatcagccccacacttcaacaggag(SEQ ID NO10)實施例2 構(gòu)建對照和標記質(zhì)粒從人基因組DNA中經(jīng)PCR擴增人膠原酶B啟動子區(qū)(核苷酸-670至+7)。人基因組DNA是使用商業(yè)提供的試劑盒(Turbogen，Invitrogen)從一種人EBV轉(zhuǎn)化的B細胞系中得到的。人膠原酶B啟動子區(qū)帶有一個NF-KB識別位點(Sato et al.，Oncogene8395(1993))。PCR擴增如上述按廠家說明進行，用到以下寡核苷酸引物5′gcgaagcttctagaggctgctactgtcccctttactg 3′(SEQ ID NO11)5′cgcgcatgccctccttgacaggcaagtgctgctc 3′(SEQ ID NO12)擴增的DNA經(jīng)Hind3和Sph1限制性內(nèi)切酶消化并連接進能編碼β-半乳糖苷酶的質(zhì)粒pSDK-LacZ(亦稱作pSDK-LacZpA)中，(Logan et al.，Development 117，905-906(1993))，并被稱為pGelB。人、小鼠和突變的小鼠3×NFkB/LacZ質(zhì)粒(pNFkB/LacZ)的制備是通過將以下寡核苷酸連接進質(zhì)粒pSDKLacZ-TK的Hind III和SalI的位點，而質(zhì)粒pSDKLacZ-TK帶有最少的胸腺嘧啶核苷激酶啟動子，它能指導LacZ報道基因的表達人3X NFκB5′agc TTG GGG ATT TCCGAT CGG GAC TTT CCG ATCGGG GAT TTCCGA C CCC TAA AGG CTA GCC CCT AAA GGC TAG CCC CTA AAGGCA GCT 3′(SEQ ID NO13)鼠3x NFκB5′AGC TTG GGA CTT TCCGAT CGG GAC TTT CCG ATCGGG ACT TTCCGAC CCT GAA AGG CTA GCC CTG AAA GGC TAG CCC TGA AAGGCA GCT 3′(SEQ ID NO14)突變小鼠3x NFκB
5′AGC′TTC TCA CTT TCCGAT CCT CAC TTT CCG ATCGTC ACT TTCCGAG AGT GAA AGG CTA GGA GTG AAA GGC TAG GAG TGA AAGGCA GCT 3′(SEQ ID NO15)NFkB識別因子均以劃線表示。插入序列的方向經(jīng)DNA序列分析證實。
實施例3 轉(zhuǎn)染和測定的方法U20S細胞(骨肉瘤細胞系，ATCC登錄號HTB96)在McCyoy′s5A培養(yǎng)基(Gibco/BRL Gaithersburg MD)中在37℃ 5％ CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基中含有10％胎牛血清，并含有青霉素/鏈霉素。在對數(shù)生長期(70％鋪滿)用含2mM EDTA的PBS處理而收獲細胞。離心和洗滌后，將細胞重新懸浮于PBS緩沖液中，其中含有Hepes(1.3g/100ml)，和50μg/ml的質(zhì)粒，細胞濃度為107個細胞/ml。細胞懸浮液在4℃保溫30分鐘，再用107BioRad(Hercules，CA)電穿孔器以250mV，960μF的設(shè)置在室溫下電穿孔。然后細胞中加入6ml組織培養(yǎng)基以稀釋，并在Costar微孔板中培養(yǎng)。20小時后更換培養(yǎng)基。刺激前10小時，培養(yǎng)基用OptiMEM(Gibco/BRL)培養(yǎng)基替代。測定前18小時時，往微孔里加入12-肉豆寇13-乙酸佛波醇(PMA)至終濃度為25ng/ml。
用冷PBS培養(yǎng)基洗滌后，細胞被刮入0.25ml PBS中收集。再洗滌，然后細胞重新懸浮于60μl的溶液中，該溶液含0.25M蔗糖，10mM TrisHcl pH7.4，10mM EDTA。經(jīng)干冰/乙醇浴和37℃融解這樣3個冷凍循環(huán)，細胞被裂解。離心去除細胞核和碎片，取出上清用于測定。細胞裂解物中的蛋白質(zhì)含量用Pierce(Rockford IL)蛋白質(zhì)測定試劑盒按廠家說明進行測定。細胞裂解產(chǎn)物中的β-半乳糖苷酶活性用4-甲基umbelifery β-D半乳糖苷(MUG，Sigma#M1633)作底物進行測定。測定均在96孔板上按說明書進行。與含5μg亙白質(zhì)(1-10μl)的細胞裂解產(chǎn)物保溫后水解出的底物總量用CytoFluorII熒光計(Millipore Bedford，MA)進行熒光測定。
實施例4 NFkB激活的抑制本實施例證實在U20S細胞中IkB-NT抑制了NFkB的激活。被按實施例3所術(shù)，用能編碼全長或截短形式的IkBα的質(zhì)粒(pIKB fl和pIkB-NT，見實施例1)和有LacZ報道序列和人NF-KB識別位點的質(zhì)粒(實施例2的pNFkB/LacZ)。共轉(zhuǎn)染細胞。在未經(jīng)刺激的和經(jīng)PMA刺激的細胞中測量由NFkB驅(qū)動的LacZ活性。作為對照，用pGelB，突變的NFkB識別位點的質(zhì)粒(實施例2)，或pCMV-LacZ(對IkB無反應(yīng))，而不是pNFkB/LacZ共轉(zhuǎn)染細胞。所測得的β-半乳糖苷酶活性與細胞裂解產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)含量統(tǒng)一標準；結(jié)果見圖2。
可見到pGelB細胞可對PMA激活作用起反應(yīng)；IkB-fl和IK-NT均顯著降低了此反應(yīng)。與之相似，表示為3X NF-KB(pNFkB/LacZ)的細胞的反應(yīng)也被IkB-NT顯著地減小。所觀察到的IkB-NT相對于IkB-fl較大的抑制作用被歸結(jié)于前者對降解作用的抗性。如果缺失NF-KB的識別位點，就沒有LacZ的表達和β-半乳糖苷酶活性。已知CMV-LacZ匠表達不依賴IkB。
實施例5本實施例證實IkB突變蛋白可抵抗激活作用誘導的蛋白水解作用。用抗IkBα單克隆抗體經(jīng)免疫印跡來定量U20S細胞被激活0，5，或15分鐘后全長IkBα蛋白和截短的IkBα蛋白含量。用編碼全長以及截短形式的NFkB的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染U20S細胞。再制備出細胞裂解產(chǎn)物，用15％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)再做免疫印跡。
對每一份樣品，用50μg實施例1的質(zhì)粒電穿孔107U20S。36小時后將它們培養(yǎng)在Optimen培養(yǎng)基中，72小時后用50ng/ml TNF-α(Genzyme)刺激0，5，或15分鐘。4℃下，在溶解緩沖液中溶解細胞。所述緩沖液中有50mM Hepes pH7.5，150mM NaCl，10％甘油，1％Triton X-100，1mM EDTA，1.5mM MgCl2，100mM NaF和10mM焦磷酸鈉，1mM PMSF，1mM原釩酸鈉，10μg/ml抑肽酶，10μg/ml亮肽素。離心溶胞產(chǎn)物以去除細胞碎片和胞核，在15％的SDS-PAGE凝膠上的每一泳道中加150μg蛋白質(zhì)。用ECL方法按廠家說明進行免疫印跡?？笽kBα-MAD-3抗體(Santa CruZ Biotechnology#SD-203)被用作全長IkBα和羧基端截短的IkBα的第一抗體，而#SC-271被當作IkB-NT的第一抗體來用。結(jié)果見圖3。
實施例6本實施例證實IkB截短物抑制gelB啟動子的活性。用LacZ報道基因的質(zhì)粒(pGelB)和IkBα全長或截短形式共轉(zhuǎn)染U20S細胞。測量在未刺激或PMA激活的細胞中β-半乳糖苷酶的活性。結(jié)果見圖4。
所有IkB截短物均抑制NFkB活性，其中IkB-NT是最有效的。
實施例7附加型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及病毒的產(chǎn)生帶有全長IkB的附加型逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體(pWZRneo-IkB)或帶截短的IkB-NT的附加型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(PMZRneo-IkB-NT)均按Kinsella and Nolan(Human Gene Therapy 7，1405-1413(1996)的方法來構(gòu)建。對該附加型載體作如下修飾用BspH1切割LZRA-LacZ(A)產(chǎn)生一個7.5kb的片段，其中含有EBV EBNA-1和on序列。pWZLNeo用BspH1切割以除去apmr序列產(chǎn)生一個5.48kb的片段。將7.5kb和5.48kb的片段連接起來就產(chǎn)生一個雜合EBV附加型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(pWZRone)，它有新霉素抗性。
將每種載體轉(zhuǎn)染進高滴度兼嗜性包裝細胞系ФNX-A中(如Kinsella和Nolan所述(文獻同上))，從而產(chǎn)生三種能產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的細胞系Ф-IkB/WT，Ф-IkB/NI和Ф-載體。
實施例8以逆轉(zhuǎn)錄病毒為基礎(chǔ)在人內(nèi)皮細胞中表這IkBα-突變蛋白本實施例證實利用一種逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子在人內(nèi)皮細胞中表達的IkB突變蛋白能抵抗激活作用誘導的蛋白水解作用。人肺微血管內(nèi)皮細胞(HLMVEC)購自Clonetics，在DMEM/F12培養(yǎng)基(含5％胎牛血清和10ng/ml FGF)中，37℃在6.5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。IkB突變蛋白經(jīng)如下的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染作用在HLMVEC中被過度表達。從每種生產(chǎn)者細胞系中收獲逆轉(zhuǎn)錄病毒培養(yǎng)上清，而(培養(yǎng)在T-75培養(yǎng)瓶中)的HLMVEC用10ml的Ф-IkB/WT，Ф-IkB/NT或Ф-vector的逆轉(zhuǎn)錄病毒培養(yǎng)上清進行轉(zhuǎn)錄，并補加12μg/ml DEAE葡聚糖+10ng/mlFGF。16小時后更換培養(yǎng)基，在分析前，感染后細胞還將擴充培養(yǎng)1周。
用免疫印跡法定量測定轉(zhuǎn)錄的HLMVEC±激活中對全長IkBα蛋白和截短IkBα蛋白的表達。轉(zhuǎn)導的HLMVEC培養(yǎng)在T-75瓶中鋪滿，并用新鮮培養(yǎng)基±0.1ng/ml的IL-1和TNFα溫育6小時。細胞溶解產(chǎn)物和免疫印跡按實施例5制備?？笽kBαMAD-3多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology #SC-203)被用于檢測全長IkB，SC-271被用于檢測IkB-NT。結(jié)果見圖5。
實施例9IkBα突變蛋白在體外抑制炎癥介質(zhì)本實施例證實IkB短物的穩(wěn)定表達在細胞因子激活的人肺微血管內(nèi)皮細胞中(HCMVEC)抑制了細胞粘附分子(ICAM，VCAM和e-選擇素)以及MCP-1和IL-8趨化因子的誘導。ICAM，VCAM和e-選擇素按下述用單克隆抗體(R & D Systems，α-ICAM BBA-3，α-vCAM BBA5，和α-ELAM BBA2)，HLMVEC用帶有neo-載體Ф-vector對照的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體轉(zhuǎn)導，或用N末端截短的IkBФ-NT轉(zhuǎn)導，將此HLMVEC在96孔板上加或不加IL-1/TNF(0.1ng/ml)培養(yǎng)6小時。用PBS洗細胞，用4％緩沖的福爾馬林固定10分鐘，用含0.5％BSA的PBS(PBSB)洗3次，再用含10％標準羊血清的PBSB封閉。0.1μg/ml單克隆抗體被加入一式三份的孔中作用90分鐘，再加HRP-偶聯(lián)的羊抗小鼠IgG作用30分鐘。用IPD作底物來檢測免疫反疫活性，并用分光光度計檢測OD值的變化(Molecular Dynamics)。表達表示成在細胞因子刺激的HLMVECФ-vector對照細胞中所測到的最大反應(yīng)的百分率。結(jié)果見圖6。
IE8和MCP-1的表達和分泌在條件培養(yǎng)基中測得，該培養(yǎng)基來自在24孔板上加或不加IL-1/TNF(0.1ng/ml)培養(yǎng)的HLMVEC/Ф-vector或HLMVEC/Ф-NT細胞。在24和48小時時收獲條件培養(yǎng)基，而MPC-1和IL8水平則嚴格按廠家說明用ELISA(R & DSytems)檢測。結(jié)果見圖7。
實施例10IkB-NT突變蛋白在體內(nèi)抑制炎癥本實施例證實IkB-NT的局部應(yīng)用抑制了兔肺部的免疫復合物誘導的急性炎癥。帶有一個CMV啟動子及牛生長激素多聚腺苷酸化序列，并能調(diào)節(jié)IkBα-NT或一個報道基因氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移權(quán)衡利弊(CAT)的質(zhì)粒已構(gòu)建出來。P10管連接至一個30號針經(jīng)氣管將100μg純化質(zhì)粒滴入兔子肺部。滴注質(zhì)粒DNA24小時后，如Mulligan et al.，所述(J.Clin Invest 88，1396-1406)通過形成IgG免疫復合物誘導了肺部炎平。簡而言之，含有3mg兔BSA-IgG的300μl水被滴注通過麻醉兔的氣管，隨后馬上靜脈注射0.5ml含1mg BSA的PBS(尾靜脈)。在肺內(nèi)形成了免疫復合物，而4-24小時后就測到了急性炎癥，方法是測肺的支氣管灌洗液(BAL)中的細胞流入。處死動物，肺滴注10mlPBS以便洗出BAL中的細胞，使用Coulter計數(shù)器通過計數(shù)每100μl一等份樣品中總細胞數(shù)而定量細胞流量，從24小時的時間點得到的結(jié)果見表8，從圖中可見處理組小鼠的BAL細胞計數(shù)比對照組的低一個數(shù)量級。
雖本發(fā)明已就其特殊的實施方案作了描述，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，在不脫離本發(fā)明的真正精神和范圍的前提下可以做各種改變，也可以等價取代。此外，必須進行很多修飾工作以適應(yīng)一種的情況，材料，物質(zhì)的組成，過程，過程的某一步或多步，以符號本發(fā)明的目標、精神和范圍。所有這類修飾均包括在此附加的權(quán)利要求的范圍中。所有上文引用的病人和出版物在此均列入?yún)⒖嘉墨I中。
序列表(1)一般資料(I)申請人a)姓名F.HOFFMANN-LA ROCHE AG(B)街道Grenzacherstrasse 124(C)城市Basle(D)州BS(E)國家Switzerland(F)郵編CH-4070(G)電話061-688 13 95(H)傳真061-688 13 95(I)電傳962292/965542 hlr ch(ii)發(fā)明的題目抑制性卡巴B(IkB)蛋白的截短形式，及其重組產(chǎn)物和應(yīng)用(iii)序列數(shù)15(iv)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機(C)操作系統(tǒng)(D)軟件(2)SEQ ID NO1的資料(I)序列特征(A)長度317氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲構(gòu)型未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO1的序列描述Met Phe Gln Ala Ala Glu Arg Pro Gln Glu Trp Ala Met Glu Gly Pro1 5 10 15Arg Asp Gly Leu Lys Lys Glu Arg Leu Leu Asp Asp Arg His Asp Ser20 25 30Gly Leu Asp Ser Met Lys Asp Glu Glu Tyr Glu Gln Met Val Lys Glu35 40 45Leu Gln Glu Ile Arg Leu Glu Pro Gln Glu Val Pro Arg Gly Ser Glu50 55 60Pro Trp Lys Gln Gln Leu Thr Glu Asp Gly Asp Ser Phe Leu His Leu65 70 75 80Ala Ile Ile His Glu Glu Lys Ala Leu Thr Met Glu Val Ile Arg Gln85 90 95Val Lys Gly Asp Leu Ala Phe Leu Asn Phe Gln Asn Asn Leu Gln Gln100 105 110Thr Pro Leu His Leu Ala Val Ile Thr Asn Gln Pro Glu Ile Ala Glu115 120 125Ala Leu Leu Gly Ala Gly Cys Asp Pro Glu Leu Arg Asp Phe Arg Gly130 135 140Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Cys Glu Gln Gly Cys Leu Ala Ser Val145 150 155 160Gly Val Leu Thr Gln Ser Cys Thr Thr Pro His Leu His Ser Ile Leu165 170 175Lys Ala Thr Asn Tyr Asn Gly His Thr Cys Leu His Leu Ala Ser Ile180 185 190His Gly Tyr Leu Gly Ile Val Glu Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Asp195 200 205Val Asn Ala Gln Glu Pro Cys Asn Gly Arg Thr Ala Leu His Leu Ala210 215 220Val Asp Leu Gln Asn Pro Asp Leu Val Ser Leu Leu Leu Lys Cys Gly225 230 235 240Ala Asp Val Asn Arg Val Thr Tyr Gln Gly Tyr Ser Pro Tyr Gln Leu245 250 255Thr Trp Gly Arg Pro Ser Thr Arg Ile Gln Gln Gln Leu Gly Gln Leu260 265 270Thr Leu Glu Asn Leu Gln Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser275 280 285Tyr Asp Thr Glu Ser Glu Phe Thr Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu Pro290 295 300Tyr Asp Asp Cys Val Phe Gly Gly Gln Arg Leu Thr Leu305 310 315(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度819個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型未知(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO2的序列描述ATGGTCAAGG AGCTGCAGGA GATCCGCCTC GAGCCGCAGG AGGTGCCGCG CGGCTCGGAG60CCCTGGAAGC AGCAGCTCAC CGAGGACGGG GACTCGTTCC TGCACTTGGC CATCATCCAT 120GAAGAAAAGG CACTGACCAT GGAAGTGATC CGCCAGGTGA AGGGAGACCT GGCCTTCCTC 180AACTTCCAGA ACAACCTGCA GCAGACTCCA CTCCACTTGG CTGTGATCAC CAACCAGCCA 240GAAATTGCTG AGGCACTTCT GGGAGCTGGC TGTGATCCTG AGCTCCGAGA CTTTCGAGGA 300AATACCCCCC TACACCTTGC CTGTGAGCAG GGCTGCCTGG CCAGCGTGGG AGTCCTGACT 360CAGTCCTGCA CCACCCCGCA CCTCCACTCC ATCCTGAAGG CTACCAACTA CAATGGCCAC 420ACGTGTCTAC ACTTAGCCTC TATCCATGGC TACCTGGGCA TCGTGGAACT TTTGGTGTCC 480TTGGGTGCTG ATGTCAATGC TCAGGAGCCC TGTAATGGCC GGACTGCCCT TCACCTCGCA 540GTGGACCTGC AAAATCCTGA CCTGGTGTAC CTCCTGTTGA AGTGTGGGGC TGATGTCAAC 600AGAGTTACCT ACCAGGGCTA TTCTCCCTAC CAGCTCACCT GGGGCCGCCC AAGCACCCGG 660ATACAGCAGC AGCTGGGCCA GCTGACACTA GAAAACCTTC AGATGCTGCC AGAGAGTGAG 720GATGAGGAGA GCTATGACAC AGAGTCAGAG TTCACGGAGT TCACAGAGGA CGAGCTGCCC 780TATGATGACT GTGTGTTTGG AGGCCAGCGT CTGACGTTA 819(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類別核酸(c)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO3的序列描述CCGCGTCTAG ACAGCTCGTC CGCGCCATGT TCC 33(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類別核酸(c)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO4的序列描述CCGCCGAATT CATACAAGTC CATGTTCTTT CAGCC 35(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類別核酸(c)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO5的序列描述GGCTCTAGAA TGGTCAAGGA GCTGCAGGAG 30(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類別核酸(c)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO6的序列描述CCGCCGAATT CATACAAGTC CATGTTCTTT CAGCC 35(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類別核酸(c)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO7的序列描述
CGCGAATTCA TAGCTCTCCT CATCCTCACT CTC 33(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類別核酸(c)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO8的序列描述CGCGAATTCC AGCATCTGAA GGTTTTCTAG TGTC 34(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類別核酸(c)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO9的序列描述CGCGAATTCC TGTATCCGGG TGCTTGGGCG GCC 33(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類別核酸(c)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO10的序列描述CGCGAATTCA TCAGCCCCAC ACTTCAACAG GAG 33(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類別核酸(c)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO11的序列描述GCGAAGCTTC TAGAGGCTGC TACTGTCCCC TTTACTG 37(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類別核酸(c)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO12的序列描述CGCGCATGCC CTCCTTGACA GGCAAGTGCT GCTC 34(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長度88個堿基對(B)類別核酸(c)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO13的序列描述AGCTTGGGGA TTTCCGATCG GGACTTTCCG ATCGGGGATT TCCGACCCCT AAAGGCTAGC 60CCCTAAAGGC TAGCCCCTAA AGGCAGCT 88(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長度88個堿基對(B)類別核酸(c)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO14的序列描述AGCTTGGGAC TTTCCGATCG GGACTTTCCG ATCGGGACTT TCCGACCCTG AAAGGCTAGC 60CCTGAAAGGC TAGCCCTGAA AGGCAGCT 88(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長度88個堿基對(B)類別核酸(c)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(xi)SEO ID NO15的序列描述AGCTTCTCAC TTTCCGATCC TCACTTTCCG ATCCTCACTT TCCGAGAGTG AAAGGCTAGG 60AGTGAAAGGC TAGGAGTGAA AGGCAGCT 88
權(quán)利要求
1.一種生物活性蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)通過抑制核因子卡巴B(NFkB)介導的炎癥反應(yīng)的激活而模擬了IkB的活性，該蛋白質(zhì)是IkBα的一種截短形式。
2.權(quán)利要求1的生物活性蛋白質(zhì)選自由具有序列SEQ ID NO1的IkBα的Δ(290-317)，Δ(281-317)，Δ(267-317)，Δ(243-317)和Δ(1-44)組成的組。
3.由SEQ ID NO1Δ(1-44)限定的權(quán)利要求1的生物活性蛋白質(zhì)。
4.一種縮碼權(quán)利要求1至3的蛋白質(zhì)的核酸序列。
5.由SEQ ID NO2限定的權(quán)利要求4的核酸序列。
6.一種表達載體，含有權(quán)利要求4或5的核酸序列，此序列與表達該序列所必需的調(diào)節(jié)因子可操作地連接。
7.權(quán)利要求6的載體，進一步含有一個可誘導的啟動子。
8.權(quán)利要求6或7的載體為質(zhì)粒。
9.權(quán)利要求8的載體，是質(zhì)粒pIkB-NT。
10.一種權(quán)利要求1至3的蛋白質(zhì)的抗體。
11.用于制備權(quán)利要求1至3的生物活性蛋白質(zhì)的方法包括a)用權(quán)利要求6至9的載體轉(zhuǎn)化宿主細胞b)在適于擴增載體并表達蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)該宿主細胞；以及c)從培養(yǎng)基中收獲細胞。
12.權(quán)利要求1至3的生物活性蛋白質(zhì)，作為治療活性劑。
13.權(quán)利要求1至3的生物活性蛋白質(zhì)作為治療活性劑，以治療成人呼吸窘迫綜合癥，同種異體移植物排斥反應(yīng)，哮喘，炎性關(guān)節(jié)炎，脈管炎和(血管)再狹窄。
14.權(quán)利要求6至9表達載體，作為治療活性劑。
15.權(quán)利要求6至9的表達載體，作為治療活性劑，以治療成人呼吸窘迫綜合癥，同種異體移植物排斥反應(yīng)，哮喘、炎性關(guān)節(jié)炎、脈管炎、和(血管)再狹窄。
16.一種藥物組合物，包括權(quán)利要求1至3的蛋白質(zhì)和藥學可接受的載體物質(zhì)。
17.權(quán)利要求1至3的生物活性蛋白質(zhì)，用以制備藥物組合物的用途。
18.權(quán)利要求1至3的一生物活性蛋白質(zhì)，用來制備藥物組合物以治療成人呼吸窘迫綜合癥，同種異體移植物排斥反應(yīng)，哮喘，炎性關(guān)節(jié)炎，脈管炎和(血管)理狹窄的用途。
19.權(quán)利要求6至9的表達載體用以制備治療有效劑量的權(quán)利要求1至3的蛋白質(zhì)的用途。
20.權(quán)利要求4和5的核酸序列，用以產(chǎn)生權(quán)利要求1至3的蛋白質(zhì)的用途。
21.權(quán)利要求4和5的核酸序列用以產(chǎn)生權(quán)利要求6至9的表達載體的用途。
22.權(quán)利要求1至3的生物活性蛋白質(zhì)無論何時都能由權(quán)利要求11中要求的方法制備。
23.基本上由上文所描述到的產(chǎn)物，藥物組合物，過程和方法。
全文摘要
在此提供了抑制性卡巴B蛋白(IkBα)的截短形式，能編碼截短物的核酸，表達和傳遞載體，及其治療性和預防性應(yīng)用。
文檔編號C12N15/12GK1157828SQ9611978
公開日1997年8月27日 申請日期1996年12月13日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月15日
發(fā)明者G·A·皮特茲 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司