專利名稱：重組人糖基化尿激酶原的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是利用生物工程技術(shù)，對以下六種載體如pUC19，pMM-UK，pSV2-dhfr，pSV2-pro-UK，pXMT，pMTSV-dhfr上的有用元件，經(jīng)過重組，構(gòu)建一個(gè)適合在中國地鼠卵母細(xì)胞(CHO)中高效表達(dá)外源基因的新型載體(pMTSV-du)，然后將轉(zhuǎn)染篩選獲得的CHO工程細(xì)胞株CL-11G用微載體(Biosilon，SH-2，Cytopore)灌流培養(yǎng)技術(shù)和低血清培基進(jìn)行高密度培養(yǎng)，并對產(chǎn)品進(jìn)行四步或一步純化，制備一種治療冠狀動(dòng)脈梗塞，腦血栓，中央視網(wǎng)膜動(dòng)靜脈血栓及其他血栓病的藥物—重組人尿激酶原(prourokinase，簡稱pro-UK)，此屬于生物工程技術(shù)。
尿激酶原是尿激酶的前體，是一種糖蛋白，由411個(gè)氨基酸組成，其本身無活性，經(jīng)纖維蛋白溶解酶和激肽酶的激活，使其Lys158-Ile159之間的肽鏈打開形成尿激酶，才能發(fā)揮其溶血拴的效能。
自Bernit1973年發(fā)現(xiàn)pro-UK以來，已有人相繼從人的血液，尿液和各種重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)液中獲得，如用大腸桿菌培養(yǎng)液中獲得的有Holmes，W.E.1985以及安內(nèi).布蘭法茲等(中國專利，CN1042181A，1990-05-16)，用酵母表達(dá)成功的如Melnick，L.M.等(1990)用中國地鼠卵母細(xì)胞(CHO)表達(dá)成功的有Nells，L.等(1987)；Avgerinos，G.C.等(1990)。
本發(fā)明包括1.人尿激酶原全長cDNA基因的克隆，2.構(gòu)建在CHO細(xì)胞高效表達(dá)的轉(zhuǎn)移載體和工程細(xì)胞株，3.對CHO工程細(xì)胞的大量培養(yǎng)，獲得大量尿激酶原原料，并加以純化，其目的在于利用生物工程技術(shù)制備一種適于臨床應(yīng)用的糖基化尿激酶原產(chǎn)品。
本發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)是1.通過對Detroit 562細(xì)胞的誘導(dǎo)和提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和dG·dC接尾構(gòu)建了cDNA文庫，再通過篩選和人工合成寡核苷酸等DNA重組技術(shù)，構(gòu)建了尿激酶原全長cDNA基因并克隆至pUC19質(zhì)粒DNA，獲得pMM-UK重組質(zhì)粒。
2.將幾種表達(dá)載體如pUC19，pMM-UK，pSV2-dhfr，pSV2-proUK，pXMT，pMTSV-dhfr，等載體上的有用元件，經(jīng)多次基因操作和重組，構(gòu)建了一個(gè)適合在CHO細(xì)胞中高效表達(dá)外源基因的新型載體(pMTSV-du)。
3.采用微載體(Biosilon，SH-2，Cytopore)灌流培養(yǎng)技術(shù)和低血清培基高密度培養(yǎng)CL-11G工程細(xì)胞，獲得大量含高活性尿激酶原的原料。
4.采用四步法，即CM陽離子親和層析-MPG吸附層析-Sephacryl S-200凝膠過濾—對氨基苯甲脒色譜，或采用一步法，即用抗體親和層析法純化產(chǎn)品。
實(shí)施例1.人尿激酶原全長cDNA基因的構(gòu)建和克隆采用肉豆寇酯(PMA)誘導(dǎo)Detroit 562細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)尿激酶mRNA含量提高8倍以上，用酸性硫氰胍—酚—氯仿法提取細(xì)胞總RNA，oligo(dT)-纖維素柱層析法分離poly(A+)RNA，通過反轉(zhuǎn)錄和dG·dC接尾重組技術(shù)構(gòu)建了Detroit 562細(xì)胞的cDNA文庫，通過篩選獲得了含有編碼尿激酶基因片段的陽性克隆株。再采用人工合成寡核苷酸片段和DNA重組技術(shù)，構(gòu)建了人尿激酶原全長cDNA基因并克隆至pUC19質(zhì)粒DNA，獲得了pMM-UK重組質(zhì)粒。全序列測定結(jié)果表明，cDNA基因全長為1565bp，含有60bp(20aa)信號肽序列，1233bp編碼序列(1-411aa)和272bp 3’非編碼序列。該基因5’端含有Hind III和EcoR1單一酶切位點(diǎn)，3’端含有Sal I，Xba I，Sma I，Kpn I和Sac I 5個(gè)單一酶切位點(diǎn)，便于尿激原基因的克隆和表達(dá)。
2.中間載體1 pSV2-pro-UK的構(gòu)建將pSV2-dhfr載體用BglII酶切后用Klenow F酶補(bǔ)平，再用Hind III酶切，分離回收載體大片段；從pMM-UK質(zhì)粒DNA中，用Hind III和Sma I雙酶切，分離pro-UK cDNA；將載體大片段與pro-UK cDNA連接形成可表達(dá)pro-UK的重組質(zhì)粒pSV2-pro-UK。
3.中間載體2 pMTSV-dhfr的構(gòu)建將pSV2-dhfr表達(dá)質(zhì)粒用Bgl II酶切，并用Klenow F酶將末端補(bǔ)平，再通過T4DNA連接酶將質(zhì)粒重新環(huán)化并消除了質(zhì)粒中的Bgl II酶切位點(diǎn)。然后將該質(zhì)粒經(jīng)BamH 1和pVU II雙酶切及Klenow F酶將末端補(bǔ)平，通過電泳回收1.9Kb DNA片段(內(nèi)含SV40增強(qiáng)子和二氫葉酸還原酶基因)。將此片段插入經(jīng)EcoR1酶切，Klenow F酶末端補(bǔ)平的pXMT載體中，從而獲得了長度為8.25Kb的中間載體pMTSV-dhfr.
4.新型高效表達(dá)載體pMTSV-du的構(gòu)建將pSV2-pro-UK重組質(zhì)粒經(jīng)Sal I酶切，Klenow F酶末端補(bǔ)平，再通過T4 DNA連接酶將質(zhì)粒重新環(huán)化并消除了質(zhì)粒中的Sal I酶切位點(diǎn)。然后將該質(zhì)粒經(jīng)pVU I和EcoR V雙酶切及Klenow F酶將末端補(bǔ)平，通過電泳回收3.8Kb片段含全長尿激酶原cDNA)，并將該片段插入經(jīng)BglII酶切，Klenow F酶末端補(bǔ)平的pMTSV-dhfr中間載體，從而獲得長度為12Kb，可高效表達(dá)尿激酶原的載體pMTSV-du.該載體的特點(diǎn)是A.將表達(dá)尿激酶原和二氫葉酸還原酶基因的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位置于同一載體，分別受金屬硫蛋白(MT)和SV40早期啟動(dòng)子控制，使之具有用氨甲喋呤(MTX)使基因擴(kuò)增和用金屬Zn++誘導(dǎo)的雙重放大功能，這有利于尿激酶原的高表達(dá)。
B.將SV40增強(qiáng)子置于兩個(gè)啟動(dòng)子之間，為兩個(gè)啟動(dòng)子公用。由于SV40增強(qiáng)子的增強(qiáng)作用廣譜性強(qiáng)，有利于尿激酶原基因在多種細(xì)胞中獲得高效表達(dá)。
C.在載體的非必需區(qū)，有一Sal I單一酶切位點(diǎn)，可方便地進(jìn)行重組載體的線性化，有利于通過電擊介導(dǎo)法獲得多考貝尿激酶原基因，并整合在細(xì)胞染色體上使穩(wěn)定表達(dá)。
D.使表達(dá)尿激酶原和二氫葉酸還原酶的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位轉(zhuǎn)錄方向相反，這可減少dhfr基因轉(zhuǎn)錄時(shí)對尿激酶原基因轉(zhuǎn)錄的影響，有利于尿激酶原的高表達(dá)。
5.轉(zhuǎn)染和篩選高效表達(dá)的CHO工程細(xì)胞將20-40μgpMTSV-du質(zhì)粒DNA通過磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細(xì)胞，先用HAT選擇培基篩選，10天后換成含1-3×10-8M MTX的選擇培基進(jìn)行dhfr和MTX雙重篩選，并對33株表達(dá)有尿激酶原活性的陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞經(jīng)多次亞克隆和MTX加壓擴(kuò)增基因，鋅離子誘導(dǎo)，最終篩選到三株能高效表達(dá)尿激酶原的細(xì)胞株，其中一株CL-11G表達(dá)的活性可達(dá)500-800 IU/106細(xì)胞/天。該株細(xì)胞經(jīng)長期液氮保存和一百多次轉(zhuǎn)代培養(yǎng)，表達(dá)水平基本不變。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)抗原性和Western印跡分析，其分子量為52Kd，較大腸桿菌表達(dá)的分子量(47Kd)大，表明它確與天然的相似，是糖基化了的尿激酶原。
6.CHO工程細(xì)胞的高密度培養(yǎng)采用固體的聚苯乙烯微載體如Biosilon，SH-2，和多孔纖維素微載體如Cytopore，在我們改進(jìn)了的灌流培養(yǎng)控制系統(tǒng)(已獲中國國家專利，專利號ZL91208893.1，1994-08-24)控制下，用攪拌式生物反應(yīng)器(如Celligen)培養(yǎng)，灌流量自0.5個(gè)工作體積/天逐漸增加至2個(gè)工作體積/天，細(xì)胞密度可達(dá)1-2×107/ml，尿激酶原產(chǎn)量可高達(dá)8096 IU/ml。培養(yǎng)時(shí)間可長達(dá)53天。
7.放大生產(chǎn)規(guī)模是利用該細(xì)胞能在微載體之間自動(dòng)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，直接將已長有細(xì)胞的微載體從小反應(yīng)器轉(zhuǎn)入加有3倍，5倍或7倍量培基和新微載體的大反應(yīng)器內(nèi)。
8.研制和采用低血清培基通過對培養(yǎng)過程中培基成份的氨基酸分析，以及通過正交試驗(yàn)，確定以DMEM/F12(1∶1)為基礎(chǔ)培基的低血清培基，佐以天冬氨酸，胱氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，絲氨酸，谷氨酰胺，蛋白胨，葉酸以及抑肽酶(aprotinin)，Hepes，葡萄糖等。血清量從原來的5％減少到1％和0.5％。
9.四步法純化尿激酶原第一步，CM-徑向離子交換法該色譜柱是由聚乙烯與纖維素共聚膜共價(jià)結(jié)合羧甲基繞在多孔軸管上并固定在有機(jī)玻璃柱內(nèi)構(gòu)成。先用0.15mol/L，pH5.7的磷酸緩沖液平衡。尿激酶原原液經(jīng)3000×g，4℃離心后用6mol/L HCl調(diào)pH至5.7后上柱，流速為12-15ml/分(柱床體積250ml)或25-30ml/分(柱床體積700ml)。當(dāng)洗液中蛋白吸收峰值低于0.005以下時(shí)改用0.025mol/L，pH6.8的醋酸緩沖液(含0.75mol/L硫酸銨)，0.005％Tween-80)洗脫，收集活性蛋白峰流出液。
第二步，MPG吸附色譜法它是由微孔高硅玻璃珠組成的色譜柱。將第一步的收集液直接上柱，用0.5mol/LTris-HCl，pH9.5的緩沖液洗去雜蛋白，再用0.02mol/L，pH8.0的磷酸緩沖液(含0.1mol/L NaCl)洗至吸收峰值低于0.005以下后，分別用含1mol/L和2mol/L硫酸銨的0.5mol/L，pH9.25的Tris-HCl緩沖液線性梯度洗脫并收集蛋白吸收峰流出液。
第三步，凝膠色譜Sephacryl S-200 HR高效凝膠色譜先用0.092mol/L，pH5.3(含0.1mol/L NaCl)醋酸緩沖液平衡，然后將第二步的收集液上柱，繼續(xù)用該緩沖液洗柱并收集第二蛋白峰組分。
第四步，對氨基苯甲脒親和色譜先用0.092mol/L，pH5.3(含0.2mol/L NaCl)的醋酸緩沖液平衡，然后將第三步收集液上柱，繼續(xù)用該緩沖液洗柱并收集穿過蛋白流出液。
10.一步抗體親和層析法純化用制備的單克隆抗體和Sepherose 4B偶聯(lián)并裝成層析柱。將收集的尿激酶原原液先與0.002M苯甲醚在室溫保溫0.5h，然后上柱。用0.1M，pH2.2的Gly-HCl緩沖液洗脫，收集活性峰。
11.純化產(chǎn)品的理化性能測定純化后的產(chǎn)品的活性可被抗尿激酶的抗體中和，但不能被DFP抑制。分子量為52Kd，等電點(diǎn)為8.9，N-末端氨基酸序列為SNELHQVPSNCDCLN，這些結(jié)果表明，它與天然的糖基化的尿激酶原完全一致。


圖1.pMTSV-du高效表達(dá)載體的構(gòu)建。
權(quán)利要求
1.一種重組人糖基化尿激酶原的制備方法，其組成包括(1)人尿激酶原全長cDNA基因的構(gòu)建和克隆，(2)構(gòu)建中間載體1(pSV2-pro-UK)，構(gòu)建中間載體2(pMTSV-dhfr)和新型高效表達(dá)載體(pMTSV-du)，(3)轉(zhuǎn)染和篩選高效表達(dá)CHO工程細(xì)胞，(4)高密度培養(yǎng)和放大培養(yǎng)CHO工程細(xì)胞技術(shù)，(5)低血清培基成份配比以及(6)工程細(xì)胞分泌產(chǎn)物的純化技術(shù)，其特征在于利用基因重組技術(shù)，將各種載體(pUC19，pMM-UK，pSV2-dhfr，pXMT，pSV2-pro-UK)上的有用元件，進(jìn)行重組，構(gòu)建一個(gè)適合于在中國地鼠卵母細(xì)胞(CHO)中高效表達(dá)其外源基因的新型載體(pMTSV-du)，通過轉(zhuǎn)染篩選獲得高效表達(dá)的CHO工程細(xì)胞株CL-11G，并用微載體(Biosilon，SH-2，Cytopore)灌流培養(yǎng)技術(shù)高密度培養(yǎng)和放大培養(yǎng)CL-11G工程細(xì)胞及其產(chǎn)物的純化。
2.如權(quán)利要求1所述的一種重組人糖基化尿激酶原的制備方法，其特征在于(1)人尿激酶原全長cDNA基因的克隆，是采用肉豆寇酯(PMA)誘導(dǎo)Detroit 562細(xì)胞，使細(xì)胞中尿激酶mRNA的含量提高8倍以上，用酸性硫氰胍—酚—氯仿法提取細(xì)胞總RNA，oligo(dT)-纖維素柱層析法分離poly(A+)RNA，通過反轉(zhuǎn)錄和dG·dC接尾重組技術(shù)構(gòu)建成Detroit 562細(xì)胞的cDNA文庫，通過篩選而獲得含有編碼尿激酶基因片段的陽性克隆株，采用人工合成寡核苷酸片段和DNA重組技術(shù)，構(gòu)建尿激酶原全長cDNA基因并克隆至pUC19質(zhì)粒DNA，獲得一個(gè)pMM-UK重組質(zhì)粒，經(jīng)全序列測定證明，cDNA基因全長為1565bp，含有60bp(20aa)信號肽序列，1233bp編碼序列(1-411aa)和272bp 3’非編碼序列，該基因5’端含有HindIII和EcoR1單一酶切位點(diǎn)，3’端含有SalI，XbaI，SmaI，KpnI和SacI 5個(gè)單一酶切位點(diǎn)，便于尿激酶原的克隆和表達(dá)，(2)中間載體1(pSV2-pro-UK)的構(gòu)建，是將pSV2-dhfr載體用BglII酶切后用Klenow F酶末端補(bǔ)平，再用Hind III酶切，分離回收載體大片段；從pMM-UK質(zhì)粒DNA中，用Hind III和Sma I雙酶切，分離pro-UK cDNA；再將載體大片段與pro-UK cDNA連接形成可表達(dá)pro-UK的重組質(zhì)粒pSV2-pro-UK，(3)中間載體2(pMTSV-dhfr)的構(gòu)建，是將pSV2-dhfr表達(dá)質(zhì)粒用Bgl II酶切，并用Klenow F酶將末端補(bǔ)平，再通過T4 DNA連接酶將質(zhì)粒重新環(huán)化，并消除質(zhì)粒中的Bgl II酶切位點(diǎn)，然后將該質(zhì)粒經(jīng)BamH 1和pVU II雙酶切及Klenow F酶將末端補(bǔ)平，通過電泳回收1.9Kb DNA片段(內(nèi)含SV40增強(qiáng)子和二氫葉酸還原酶基因)，將此片段插入經(jīng)EcoR1酶切，Klenow F酶末端補(bǔ)平的pXMT載體中，從而獲得了長度為8.25Kb的中間載體pMTSV-dhfr，(4)新型高效表達(dá)載體(pMTSV-du)的構(gòu)建，將pSV2-pro-UK重組質(zhì)粒經(jīng)Sal1酶切，Klenow F酶末端補(bǔ)平，再通過T4 DNA連接酶將質(zhì)粒重新環(huán)化并消除了質(zhì)粒中的Sal1酶切位點(diǎn)，然后將該質(zhì)粒經(jīng)pVU1和EcoR V雙酶切及Klenow F酶將末端補(bǔ)平，通過電泳回收3.8Kb片段(含全長尿激酶原cDNA)，并將該片段插入經(jīng)Bgl II酶切，Klenow F酶末端補(bǔ)平的pMTSV-dhfr中間載體，從而獲得一個(gè)長度為12 Kb，能高效表達(dá)尿激酶原的載體pMTSV-du，3.如權(quán)利要求1所述一種重組人糖基化尿激酶原的制備方法，其特征在于轉(zhuǎn)染和篩選高效表達(dá)的CHO工程細(xì)胞是將20-40μg高效表達(dá)載體(pMTSV-du)質(zhì)粒DNA通過磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細(xì)胞，先用HAT選擇培養(yǎng)基篩選，10天后換成含1-3×10-8M MTX選擇培基進(jìn)行dhfr和MTX雙重篩選，并對33株表達(dá)有尿激酶原活性的陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞多次亞克隆和MTX加壓擴(kuò)增基因，再經(jīng)鋅離子誘導(dǎo)篩選出高效表達(dá)，活性達(dá)到500-800IU/106細(xì)胞/天的尿激酶原工程細(xì)胞株CL-11G，
4.如權(quán)利要求1所述一種重組人糖基化尿激酶原的制備方法，其特征在于CHO工程細(xì)胞的高密度培養(yǎng)是用固體聚乙烯微載體(Biosilon，SH-2)和多孔纖維素微載體(Cytopore)在一個(gè)由改進(jìn)的灌流培養(yǎng)控制裝置(中國專利ZL 91208893.1)的反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行灌流培養(yǎng)，灌流量逐漸增加，使細(xì)胞密度達(dá)1-2×107/ml，尿激酶原的產(chǎn)量隨細(xì)胞密度的增加而增加，
5.如權(quán)利要求1所述一種人重組糖基化尿激酶原的制備方法，其特征在于利用該CHO工程細(xì)胞在培養(yǎng)中能在微載體之間自動(dòng)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，用以放大生產(chǎn)規(guī)模，即直接將小反應(yīng)器內(nèi)已長有細(xì)胞的微載體，轉(zhuǎn)入加有3倍，5倍或7倍量的培養(yǎng)基和新鮮微載體的大反應(yīng)器內(nèi)，繼續(xù)灌流培養(yǎng)，
6.如權(quán)利要求1所述一種人重組糖基化尿激酶原的制備方法，其特征在于低血清培基的研制是通過對培養(yǎng)過程中培基成份的氨基酸分析，以及通過正交試驗(yàn)確定以DMEM/F12(1∶1)培基為基礎(chǔ)，佐以天門冬氨酸，胱氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，絲氨酸，谷氨酰胺，蛋白胨，葉酸，抑肽酶(aprotinin)，Hepes以及葡萄糖等，同時(shí)將原來培基中的小牛血清用量從5％減至1％和0.5％，
7.如權(quán)利要求1所述一種重組人糖基化尿激酶原的制備方法，其特征在于(1)尿激酶原產(chǎn)品采用四步純化方法，如第一步CM-徑向離子交換色譜，色譜柱的構(gòu)成是用聚乙烯與纖維素共聚膜共價(jià)結(jié)合羧甲基繞在多孔軸管上，并固定在有機(jī)玻璃柱內(nèi)，柱層析時(shí)的pH值為5.7，柱床體積700ml時(shí)流速為25-30ml，第二步微孔高硅玻璃珠色譜，用微孔高硅玻璃珠裝填層析柱，層析后收集其蛋白吸收峰流出液，第三步凝膠色譜，收集其第二蛋白峰組份，第四步對氨基苯甲脒親和色譜，層析其第三步的收集液，并繼續(xù)收集穿過蛋白的流出液。(2)或采用一步法，即抗體親和層析法，將尿激酶原先與苯甲脒在室溫保溫0.5小時(shí)，再上單抗與Sepherose 4B偶聯(lián)的層析柱，然后收集活性峰。
全文摘要
本發(fā)明是利用生物工程的方法,通過基因工程技 術(shù)構(gòu)建了一種有雙重放大功能的表達(dá)載體,并獲得一株高效表 達(dá)的CHO工程細(xì)胞。經(jīng)微載體和低血清培基高密度灌流培養(yǎng) 和純化,制備一種治療冠狀動(dòng)脈梗塞,腦血栓,中央視網(wǎng)膜動(dòng)靜脈 血栓和其他血栓病的藥物一重組人糖基化尿激酶原。
文檔編號C12N15/06GK1178244SQ9611983
公開日1998年4月8日 申請日期1996年9月27日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月27日
發(fā)明者方繼明, 肖成祖, 余煒源, 張正光, 李風(fēng)知, 黃子才, 陳昭烈, 葉建新 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所