專(zhuān)利名稱(chēng)：能用于包裝重組腺病毒伴隨病毒的單皰病毒載體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能用于包裝重組腺病毒伴隨病毒(Adeno-associated virus，AAV)的I型單純皰疹病毒載體(HSV-1)及其用途，特別涉及將AAV全基因組但不包含其兩端反向重復(fù)(Inverted terminal repeats，ITR)的19--4484核苷酸共約4.3kb序列，克隆于以HSV-1病毒的復(fù)制起點(diǎn)區(qū)及包裝位點(diǎn)序列元件為基礎(chǔ)的質(zhì)粒型HSV-1載體而產(chǎn)生的HSV-AAV嵌合質(zhì)粒，當(dāng)它轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在HSV-1病毒存在時(shí)，可產(chǎn)生一種混合毒株，其中含有野生型的HSV-1病毒和復(fù)制缺陷含多拷貝HSV-1復(fù)制元件和AAV基因組連結(jié)體的HSV-1假型病毒。此混合毒株中，野生型HSV-1病毒充當(dāng)重組AAV包裝的輔助病毒，復(fù)制缺陷的HSV-1假型病毒表達(dá)AAV基因組編碼的蛋白以提供反式功能，兩者結(jié)合起來(lái)可用于包裝攜帶外源基因的重組腺病毒伴隨病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)?；蜣D(zhuǎn)到攜帶rAAV原病毒的培養(yǎng)人傳代細(xì)胞系用于拯救出rAAV。
AAV屬于微小病毒科，它的基因組是單鏈DNA，由4682個(gè)核苷酸組成，兩端各有145個(gè)核苷酸的反向重復(fù)序列，是與AAV基因組的復(fù)制起點(diǎn)和與復(fù)制及整合染色體相關(guān)的順式序列元件的所在，病毒基因組的編碼信息從蛋白的功能可分成兩部分，左端編碼與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄必需的蛋白，右端編碼的是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。
AAV是非自主復(fù)制的病毒，它的產(chǎn)毒性復(fù)制需要有輔助病毒如腺病毒ADV或單純皰疹病毒HSV的協(xié)助才能進(jìn)行。當(dāng)輔助病毒不存在時(shí)，AAV感染人細(xì)胞后，病毒DNA整合于宿主染色體的特定位置，會(huì)建立了一種隱性感染的狀態(tài)，不會(huì)產(chǎn)生子代病毒；但當(dāng)宿主細(xì)胞被腺病毒或單純皰疹病毒感染時(shí)，可將AAV從整合于染色體的原病毒狀態(tài)激活并從中拯救出來(lái)，從而破壞了AAV的隱性感染，復(fù)制產(chǎn)生子代AAV毒粒。
AAV分子生物學(xué)的一個(gè)重要特點(diǎn)是被克隆化于大腸桿菌質(zhì)粒的AAV全基因組，轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的時(shí)候，當(dāng)存在腺病毒或單純皰疹病毒的感染，質(zhì)粒中的AAV基因也可被拯救出來(lái)，進(jìn)行產(chǎn)毒性復(fù)制，產(chǎn)生野生型的AAV毒粒。這一特性構(gòu)成了制備重組AAV病毒載體的理論基礎(chǔ)。
克隆了AAV全基因組的質(zhì)粒，通過(guò)遺傳工程的方法，去除了基因組中用于編碼病毒蛋白的部分或全部序列元件，但保留AAV基因組中兩端的ITR，插入了相當(dāng)于被刪去AAV基因片段大小的外源DNA，可得到含外源基因的重組AAV病毒表達(dá)載體質(zhì)粒(I)；同時(shí)，除去克隆化AAV全基因組兩端的ITR，保留其編碼病毒蛋白的全部基因序列，可得到用于輔助重組AAV載體包裝的助手包裝質(zhì)粒(II)，它轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在輔助病毒如ADV或HSV存在下，可表達(dá)與AAV輔助和包裝必需的病毒蛋白，但由于缺失了復(fù)制必需的順式元件，不能進(jìn)行復(fù)制和包裝出野生型AAV毒粒。而當(dāng)感染了輔助病毒的細(xì)胞共轉(zhuǎn)染I和II這兩種質(zhì)粒時(shí)，(轉(zhuǎn)染方法可以是磷酸鈣共沉淀發(fā)或脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染)，助手包裝質(zhì)粒II表達(dá)的反式蛋白，識(shí)別重組AAV病毒表達(dá)載體質(zhì)粒I中AAV的ITR順式作用元件，將重組AAV兩端的ITR連同外源基因一起從質(zhì)粒I中拯救出來(lái)，進(jìn)行復(fù)制和包裝出重組AAV病毒顆粒。采用化學(xué)或物理手段除去和滅活輔助病毒，得到的重組AAV毒?？勺鳛橐环N轉(zhuǎn)導(dǎo)性載體，通過(guò)病毒感染的方式將外源基因?qū)氲郊?xì)胞中，并可整合于宿主染色體得到穩(wěn)定的表達(dá)。與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，重組AAV載體能轉(zhuǎn)導(dǎo)有絲分裂后細(xì)胞和分化終端細(xì)胞，AAV具有超感染的特性，可進(jìn)行重復(fù)感染，同時(shí)在人類(lèi)至今還為發(fā)現(xiàn)于AAV直接相關(guān)的疾病，這些特點(diǎn)使它具有在人類(lèi)疾病的基因治療的應(yīng)用前景。
目前制備重組AAV毒粒的方法基本上是按上述原理進(jìn)行，也就是采用兩種不同的AAV質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，一種載體提供AAV的反式作用蛋白，另一種提供復(fù)制和包裝必需的順式序列元件和外源基因，在輔助病毒的協(xié)助下，獲得攜帶外源基因的AAV毒粒。
為提高重組AAV載體的包裝效率，Samulski將克隆化野生型AAV基因組的兩端ITR以腺病毒5型基因組兩端的重復(fù)序列所取代，獲得的AAV包裝質(zhì)粒pAd8，(Samulski etalHelper free stocks of recombinant adeno-associated virusnormal intergration does not requireviral gene expression.J.Virology 633822-3828)，雖然ADV的末端重復(fù)能允許被導(dǎo)入已感染ADV的細(xì)胞中的pAd8按腺病毒復(fù)制的機(jī)制進(jìn)行有限的擴(kuò)增，但還未能離開(kāi)上述的工作模式，盡管這過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，但操作起來(lái)較為繁瑣，表現(xiàn)為由于沒(méi)有獲得一種能支持重組AAV復(fù)制和包裝的細(xì)胞系的存在，每次操作都需要將兩種載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，由于共轉(zhuǎn)染兩種載體同時(shí)到大量的細(xì)胞個(gè)體的頻率較低，因此也影響到產(chǎn)生高滴度重組AAV病毒的效率。
Lebkowski等人(Applied Immune Science，Inc.)，提出了一種改進(jìn)，他們將缺失兩端ITR的AAV全基因組的序列重組于腺病毒E3區(qū)的重組腺病毒時(shí)，該重組腺病毒不僅能提供輔助病毒的功能，同時(shí)也表達(dá)出AAV包裝所必需的反式蛋白，用于rAAV的包裝(US5173414，US5354678)。這過(guò)程看起來(lái)相當(dāng)簡(jiǎn)化，免卻了產(chǎn)生rAAV需要共轉(zhuǎn)染兩種載體的傳統(tǒng)方法，通過(guò)了工作效率。但需要用到細(xì)胞內(nèi)同源重組，及重組病毒的篩選等繁瑣的操作才能獲得可供應(yīng)用重組腺病毒，用于產(chǎn)生rAAV載體。
本發(fā)明的目的是提供一種能用于組建重組腺病毒伴隨病毒包裝系統(tǒng)的復(fù)制缺陷型HSV-1載體，它克隆了不含兩端包裝信號(hào)ITR的AAV全基因組編碼序列，利用此載體可以簡(jiǎn)單地產(chǎn)生用于包裝rAAV載體的輔助病毒混合毒株。載體被導(dǎo)入細(xì)胞后，在野生性的HSV-1病毒存在下，質(zhì)粒DNA以其攜帶的HSV復(fù)制元件為基礎(chǔ)，進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制，并以連結(jié)體的形式被包裝成含十多個(gè)AAV基因組拷貝的復(fù)制缺陷型HSV-1假型病毒，從而獲得一種HSV-1混合毒株，其中野生型的HSV-1病毒提供類(lèi)似腺病毒功能的輔助病毒的作用，假型病毒中攜帶的十幾個(gè)拷貝的AAV基因組序列可表達(dá)以提供重組AAV的復(fù)制蛋白和結(jié)蛋白的反式功能，以支持?jǐn)y帶外源基因的重組AAV載體包裝成重組AAV病毒顆粒。特別是該載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在野生型HSV-1的輔助下，一步就可獲得混合毒株，不需進(jìn)行同源重組及重組病毒的分離，大大簡(jiǎn)化了工作步驟。當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染進(jìn)含外源基因的重組AAV載體質(zhì)粒，再以此混合毒株轉(zhuǎn)導(dǎo)該細(xì)胞，就能從將重組AAV載體從質(zhì)粒中拯救出來(lái)并包裝成重組病毒。
本發(fā)明的特點(diǎn)是采用HSV-1復(fù)制子載體荷載AAV的基因組序列，在野生型HSV-1存在時(shí)可獲得一種混合毒株，此混合毒株的產(chǎn)生不需進(jìn)行同源重組、重組病毒的篩選和純化，其中，野生型HSV-1病毒充當(dāng)重組AAV包裝的輔助病毒，類(lèi)似于傳統(tǒng)方法中腺病毒的功能；每個(gè)復(fù)制缺陷的HSV-1假型病毒攜帶了含十幾個(gè)ITR缺失的AAV全基因組序列，可表達(dá)AAV基因組編碼的蛋白以提供反式功能。與傳統(tǒng)方法細(xì)胞更為簡(jiǎn)便易行，可有效提高rAAV的包裝效率。
本發(fā)明的用于包裝重組腺病毒伴隨病毒的單皰病毒載體，由以下DNA元件組成1，AAV病毒蛋白編碼序列AAV基因組191--4484核苷酸。
2，HSV-1病毒復(fù)制起點(diǎn)區(qū)HSV Ori。
3，HSV-1病毒包裝位點(diǎn)序列a’。
4，大腸桿菌質(zhì)粒骨架(包括大腸桿菌復(fù)制子和氨芐青霉素抗性β內(nèi)酰胺酶基因)。
本發(fā)明的用于包裝重組腺病毒伴隨病毒的單皰病毒載體，有兩種，見(jiàn)附

圖1，都是將AAV的全基因(除去兩端ITR的191--4484)的序列，克隆于復(fù)制缺陷型的HSV復(fù)制子載體中，一種是AAV的病毒蛋白編碼序列的轉(zhuǎn)錄方向與質(zhì)粒骨架上β內(nèi)酰胺酶基因的轉(zhuǎn)錄方向一致的pHSV-AAV(+)，另一種是AAV的病毒蛋白編碼序列的轉(zhuǎn)錄方向與質(zhì)粒骨架上β內(nèi)酰胺酶基因的轉(zhuǎn)錄方向相反的pHSV-AAV(-)(兩種質(zhì)粒均寄存于大腸桿菌DH5α株，含該質(zhì)粒的菌種命名為Escherichia coli DH5α/pHSV-AAV(+)和Escherichia coli DH5α/pHSV-AAV(-)，已于1996年12月11日保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，登記入冊(cè)的編號(hào)為CGMCC NO.0284)本發(fā)明用于構(gòu)建可組建重組腺病毒伴隨病毒包裝系統(tǒng)的自主復(fù)制載體pHSV-AAV(+)和pHSV-AAV(-)的原始質(zhì)粒有pSub201Samulski et al，A recombinant plasmid from which an infectious adeno-associated virus genome can be excited in vitro and its use to study viral replication。
pHSV-apl楊天忠、顏?zhàn)臃f等，中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?6 104958.8，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，登記入冊(cè)的編號(hào)為CGMCC NO.0263)。
從pSub201中以XbalI酶切，回收4.293bp的AAV基因組191--4484核苷酸片段，插入pHSV-apl質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)的XbalI處，通過(guò)限制酶切分析，得到AAV轉(zhuǎn)錄方向與pHSV-apl載體上β內(nèi)酰胺酶基因的轉(zhuǎn)錄方向相同或相反的pHSV-AAV(+)和pHSV-AAV(-)。
本發(fā)明提出的用于包裝重組腺病毒伴隨病毒的I型單純皰疹病毒載體pHSV-AAV(+)和pHSV-AAV(-)，可轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)細(xì)胞系中，在野生型HSV-1存在時(shí)，產(chǎn)生一種包括野生型HSV-1和攜帶含十幾個(gè)拷貝的AAV基因組的DNA連結(jié)體的HSV-1假型病毒的混合毒株；此毒株轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)染了重組AAV載體的細(xì)胞后，野生型HSV-1提供AAV復(fù)制的輔助功能，而假型病毒表達(dá)AAV基因組編碼的蛋白以提供反式功能，從而包裝出攜帶外源基因的AAV病毒顆粒。
本發(fā)明提出的用于包裝重組腺病毒伴隨病毒的I型單純皰疹病毒載體pHSV-AAV(+)和pHSV-AAV(-)，可寄存在大腸桿菌DH5α株，含pHSV-AAV(+)質(zhì)粒的菌株命名為大腸桿菌DH5α/pHSV-AAV(+)(Escherichia coli DH5α/pHSV-AAV(+)；含pHSV-AAV(-)質(zhì)粒的菌株命名為大腸桿菌DH5α/pHSV-AAV(-)(Escherichia coli DH5α/pHSV-AAV(-)，上述兩菌種均可在含50----100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(1％ tryptone，0.5％ yeastextract，1％ NaCl)傳代培養(yǎng)。
以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的用于包裝重組腺病毒伴隨病毒的I型單純皰疹病毒載體pHSV-AAV(+)和pHSV-AAV(-)的制備和用途作了詳細(xì)說(shuō)明，但不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。在實(shí)施例中，所用的重組AAV載體質(zhì)粒pAAVlac是pSub201質(zhì)粒中AAV編碼病毒蛋白部分4.3kb XbalI片段為一片段大小相同的β半乳糖苷酶的表達(dá)單位所取代，BHK-21細(xì)胞是金黃地鼠腎細(xì)胞系(ATCC CCL10)，A549是人肺癌上皮細(xì)胞系(ATCC CCL185)。野生型HSV-1 ts株來(lái)自英國(guó)病毒研究所(Genetic studies with HSV-1.the isolation of temperature-sensitive mutants，their arrangement into complementation groups and recombination analysisleading to linkage map.J.Gen.Virol.1973，632260～2269)實(shí)施例1質(zhì)粒的制備。
大腸桿菌DH5α/pHSV-AAV(+)或大腸桿菌DH5α/pHSV-AAV(-)接種于200ml LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，離心收菌體，加5ml溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA，pH8.0)重懸菌體，冰浴下加10ml溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，5分鐘后加7.5ml溶液III(100ml中含5mol/L乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml〕混勻，15000rpm離心15分鐘，上清加0.6倍體積異丙醇沉淀。沉淀以2ml TE溶液(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH5.0)溶解，等體積酚-氯仿-異戊醇(24∶24∶1，v/v)抽提除蛋白質(zhì)，然后在Sepharose 4B柱(15.0×1.0cm)凝膠過(guò)濾，收集流出的質(zhì)粒峰。
實(shí)施例2HSV-1病毒ts株的制備HSV-1病毒ts株為溫度敏感型毒株，其允許溫度為31℃，高于此溫度會(huì)影響其活性。病毒的制備同常規(guī)病毒的制備，取0.5ml病毒液感染已長(zhǎng)成單層的A549細(xì)或BHK-21細(xì)胞，31℃吸附2小時(shí)，倒掉病毒液，加入含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，31℃培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)90-100％病變。將細(xì)胞反復(fù)凍融三次，離心，除去細(xì)胞殘?jiān)?，所得上清液即為病毒液?？捎檬砂叩味ǚy(cè)定病毒液的滴度。
實(shí)施例3HSV-AAV假型病毒混合毒株的產(chǎn)生。
pHSV-AAV(+)或pHSV-AAV(-)質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞或BHK-21細(xì)胞，48小時(shí)后倒掉培養(yǎng)液，加入0.5ml HSV-1病毒液，31℃吸附2小時(shí)，倒掉病毒液，加入含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，31℃培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)90-100％病變。將細(xì)胞反復(fù)凍融三次，離心，除去細(xì)胞殘?jiān)?，所得上清液即為混合病毒液?br> 實(shí)施例4以混合毒株包裝重組AAV質(zhì)粒制備重組AAV病毒顆粒。
重組AAV質(zhì)粒pAAVlac用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞或vero細(xì)胞，48小時(shí)后倒掉培養(yǎng)液，加入0.5ml含有HSV-AAV假型病毒的混合病毒液，31℃吸附2小時(shí)，倒掉病毒液，加入含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，2-3天后，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變時(shí)，收獲混有混合毒株HSV-AAV的重組AAV病毒。收毒時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞都回收，反復(fù)凍融或以超聲處理使細(xì)胞完全裂解，離心去掉細(xì)胞碎片，65℃加熱1小時(shí)以滅活HSV-1病毒和HSV-AAV假病毒，再經(jīng)0.22μm醋酸纖維膜過(guò)濾除菌，得到可用與轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的重組AAVlac病毒。
實(shí)施例5重組AAVLac病毒顆粒感染培養(yǎng)人細(xì)胞系。
實(shí)施例4所獲的帶報(bào)道基因β半乳糖苷酶的重組腺病毒伴隨病毒顆粒AAVlac可用于感染人養(yǎng)細(xì)胞系。重組AAV-Lac病毒感染A549細(xì)胞，48小時(shí)后，以細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)β半乳糖苷酶的表達(dá)，(Somatic Cell Mol.Genet.，13(3)，253--265，1987.)，細(xì)胞以磷酸鈉緩沖液洗滌2遍，加入含X-Gal的染色液，30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間后觀察，可見(jiàn)被感染細(xì)胞因外源基因的表達(dá)而呈藍(lán)色，其典型的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為當(dāng)病毒滴度為107時(shí)，感染培養(yǎng)有106個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)皿，可見(jiàn)培養(yǎng)皿的細(xì)胞全部變藍(lán)。
實(shí)施例6用HSV-AAV混合毒株從AAVlac轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中拯救出重組AAV病毒顆粒。
重組AAV-Lac病毒感染A549細(xì)胞，48小時(shí)后可加入0.5ml含有HSV-AAV假型病毒的混合病毒液，31℃吸附2小時(shí)，倒掉病毒液，加入含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，2-3天后，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變時(shí)，收獲混有混合毒株HSV-AAV的重組AAV病毒。收毒時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞都回收，反復(fù)凍融或以超聲處理使細(xì)胞完全裂解，離心去掉細(xì)胞碎片，65℃加熱1小時(shí)以滅活HSV-1病毒和HSV-AAV假病毒，再經(jīng)0.22μm醋酸纖維膜過(guò)濾除菌，得到可用與轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的重組AAVlac病毒。經(jīng)此過(guò)程，可使AAVlac的滴度進(jìn)一步提高。
附圖pHSV-AAV(+/-)質(zhì)粒簡(jiǎn)圖HSVorip表示HSV-1病毒復(fù)制起點(diǎn)區(qū)a’表示HSV-1病毒包裝位點(diǎn)序列AAV表示AAV基因組191-4484核苷酸序列AAV基因組方向Amp方向相同為pHSV-AAV(+)AAV基因組方向Amp方向相同為pHSV-AAV(-)Amp表示氨芐青霉素抗性β-內(nèi)酰氨酶基因orip表示大腸桿菌復(fù)制子
權(quán)利要求
1，能用于包裝重組腺病毒伴隨病毒(Adeno-associated virus，AAV)的單純皰疹病毒載體，其特征在于由下列DNA元件組成1，AAV病毒蛋白編碼序列AAV基因組191--4484核苷酸；2，HSV-1病毒復(fù)制起點(diǎn)區(qū)HSV Ori。3，HSV-1病毒包裝位點(diǎn)序列a’。4，大腸桿菌質(zhì)粒骨架(包括大腸桿菌復(fù)制子和氨芐青霉素抗性β內(nèi)酰胺酶基因)。
2，能用于包裝重組腺病毒伴隨病毒(Adeno-associated virus，AAV)的單純皰疹病毒載體載體pHSV-AAV(+)，其特征在于載體上AAV的病毒蛋白編碼序列的轉(zhuǎn)錄方向與質(zhì)粒骨架上β內(nèi)酰胺酶基因的轉(zhuǎn)錄方向一致；能用于包裝重組腺病毒伴隨病毒(Adeno-associated virus，AAV)的單純皰疹病毒載體pHSV-AAV(-)，其特征在于載體上AAV的病毒蛋白編碼序列的轉(zhuǎn)錄方向與質(zhì)粒骨架上β內(nèi)酰胺酶基因的轉(zhuǎn)錄方向相反。
3，能用于包裝重組腺病毒伴隨病毒(Adeno-associated virus，AAV)的單純皰疹病毒載體pHSV-AAV(+)和pHSV-AAV(-)的用途，其特征在于它們中的任一種轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)細(xì)胞系中，在野生型HSV-1存在時(shí)，產(chǎn)生一種包括HSV-1野生型病毒和攜帶含十幾個(gè)拷貝的AAV基因組的DNA連結(jié)體的HSV-1假型病毒的混合毒株；此毒株轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)染了重組AAV載體的細(xì)胞后，HSV-1野生型病毒提供AAV復(fù)制的輔助功能，而假型病毒表達(dá)AAV基因組編碼的蛋白以提供反式功能，可用于生產(chǎn)重組AAV病毒顆粒。
4，根據(jù)權(quán)利要求1和2和3能用于包裝重組腺病毒伴隨病毒(Adeno-associatedvirus，AAV)的單純皰疹病毒載體pHSV-AAV(+)和pHSV-AAV(-)其特征在于它們中的任何一種，都可單獨(dú)轉(zhuǎn)染被HSV-1野生型病毒感染的細(xì)胞，從而產(chǎn)生能用于包裝重組AAV載體的HSV-AAV混合毒株。
5，根據(jù)權(quán)利要求1和2和3和4，能用于包裝重組腺病毒伴隨病毒(Adeno-associatedvirus，AAV)的單純皰疹病毒載體pHSV-AAV(+)和pHSV-AAV(-)在HSV-1野生型病毒存在時(shí)所產(chǎn)生的混合毒株HSV-AAV，其特征在于，此混合毒株感染已轉(zhuǎn)染克隆了外源基因的重組AAV質(zhì)粒載體的人培養(yǎng)細(xì)胞系，可支持重組腺病毒伴隨病毒的包裝，產(chǎn)生攜帶外源基因的重組AAV病毒顆粒。
6，根據(jù)權(quán)利要求1和2和3和4，能用于包裝重組腺病毒伴隨病毒(Adeno-associatedvirus，AAV)的單純皰疹病毒載體pHSV-AAV(+)和pHSV-AAV(-)在HSV-1野生型病毒存在時(shí)所產(chǎn)生的混合毒株HSV-AAV，其特征在于，此混合毒株感染已轉(zhuǎn)導(dǎo)了重組腺病毒伴隨病毒的細(xì)胞系，可支持重組腺病毒伴隨病毒的包裝，從中將重組AAV拯救出來(lái)，產(chǎn)生攜帶外源基因的重組AAV病毒顆粒。
全文摘要
能用于包裝重組腺病毒伴隨病毒的I型單純皰疹病毒載體，是由腺病毒伴隨病毒基因組編碼所有病毒蛋白基團(tuán)的191-4484核苷酸序列元件，HSV-1病毒復(fù)制起點(diǎn)區(qū)和包裝位點(diǎn)序列，和帶大腸桿菌復(fù)制子和氨芐青霉素抗性基因的大腸桿菌質(zhì)粒骨架所組成。它可轉(zhuǎn)染培養(yǎng)人或猴細(xì)胞系，在HSV-1野生型病毒存在時(shí)，可獲得一種HSV混合毒株，其中包括HSV-1野生型病毒和攜帶含十幾個(gè)拷貝的AAV基因組的DNA連結(jié)體的HSV-1假型病毒。此毒株轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)染了重組AAV載體的細(xì)胞后，HSV-1野生型病毒提供輔助AAV復(fù)制和包裝的功能，而假型病毒表達(dá)AAV基因組編碼的蛋白以提供反式功能，可用于生產(chǎn)重組AAV病毒顆粒。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1159480SQ96120549
公開(kāi)日1997年9月17日 申請(qǐng)日期1996年12月13日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月13日
發(fā)明者顏?zhàn)臃f, 舒躍龍, 侯云德 申請(qǐng)人:中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所