專利名稱：重組核酸序列和檢測(cè)樣品的基因毒性與誘變性以及基因毒性的動(dòng)力學(xué)的方法
目前有多種不同的使用微生物篩選基因毒性和/或毒性化合物的方法。Ames測(cè)試(Maron and Ames,1983)似乎是一種最廣泛使用的測(cè)定毒性化合物的方法并因而在世界范圍內(nèi)被推薦使用。但完成該測(cè)試要花費(fèi)大約三天的時(shí)間，同時(shí)該方法還伴有一些明顯的缺點(diǎn)。
已引入了某些可短時(shí)間內(nèi)完成的方法，這些方法包括，根據(jù)lacZ基因表達(dá)的β半乳糖苷酶的量來(lái)檢測(cè)因DNA損傷引起的SOS反應(yīng)，其中所說(shuō)的lacZ基因位于SOS調(diào)節(jié)的umuD、C或sfiA應(yīng)激誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的下游。這些測(cè)試分別稱為使用鼠傷寒沙門(mén)氏菌作為宿主微生物的umu測(cè)試(Oda等，1985)和使用大腸桿菌作為宿主微生物的SOS顯色測(cè)試(Quillardat等，1982)。在umu測(cè)試和SOS顯色測(cè)試中，在待檢樣品存在下培養(yǎng)宿主微生物，繼之破壞該宿主微生物。然后加入β半乳糖苷酶的底物，約10分鐘后加入抑制劑終止隨后的反應(yīng)，然后在兩個(gè)波長(zhǎng)處進(jìn)行OD測(cè)量并計(jì)算β半乳糖苷酶活性。這些測(cè)試克服了Ames測(cè)試耗時(shí)長(zhǎng)的問(wèn)題，但它們也有自身的缺點(diǎn)，即靈敏度低而且檢測(cè)時(shí)間仍需7-8小時(shí)，特別是硝基芳烴和多環(huán)芳烴的檢測(cè)靈敏度低。另外，該檢測(cè)方法還需要大量的操作和加入各種不同的試劑，從而使該方法很復(fù)雜并且花費(fèi)高。由于為了檢測(cè)任何誘導(dǎo)作用而必須破碎細(xì)胞，所以只可能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行一種檢測(cè)。
EP-A-0649905述及，將SOS基因放在表達(dá)熒光素酶活性的基因上游，以使熒光素酶的表達(dá)與SOS基因的表達(dá)同時(shí)發(fā)生，從而可以克服上述測(cè)試的缺點(diǎn)。然后通過(guò)檢測(cè)發(fā)光可在短時(shí)間里檢測(cè)或測(cè)定誘變物質(zhì)。據(jù)稱任何SOS基因都是有用的，并且在實(shí)施例中以u(píng)muD、C基因(當(dāng)用于umu測(cè)試中時(shí))為例作了說(shuō)明。另外，與SOS顯色測(cè)試和umu測(cè)試等常規(guī)測(cè)試相比，由于該測(cè)試中檢測(cè)所需的樣品體積較小，所以認(rèn)為其提高了檢測(cè)的靈敏度。除了其必須是SOS可誘導(dǎo)型外，再?zèng)]有與待用啟動(dòng)子相連的序列。又因?yàn)榘l(fā)光是即刻的，所以可以比使用Lac系統(tǒng)更早地進(jìn)行檢測(cè)，從而縮短了檢測(cè)時(shí)間。
WO94/13831(DuPont)中還公開(kāi)了與發(fā)光基因復(fù)合物結(jié)合使用應(yīng)激誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，以提供基因工程微生物。他們指出，“雖然已證明應(yīng)激反應(yīng)在檢測(cè)各種環(huán)境危害中是有用的，但它須與易于檢測(cè)的靈敏報(bào)道基因相連接”。DuPont公司提供了一個(gè)廣泛的現(xiàn)有技術(shù)中已知的應(yīng)激誘導(dǎo)型啟動(dòng)子清單，這些啟動(dòng)子可能是有用的，但本發(fā)明不只限于這些。所列清單包括下列調(diào)節(jié)系統(tǒng)的啟動(dòng)子熱休克、SOS、過(guò)氧化氫、超氧化物、脂肪酸饑餓、通用應(yīng)激、靜止?fàn)顟B(tài)、應(yīng)急、分解代謝產(chǎn)物活化、P利用和N利用。在實(shí)施例中，他們使用了熱休克調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)啟動(dòng)子dnaK和grpE、SOS調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子recA和uvrA、氧化損傷調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子katG和micF、通用應(yīng)激啟動(dòng)子uspA、靜止期啟動(dòng)子xthA、來(lái)自氨基酸饑餓系統(tǒng)的his啟動(dòng)子、涉及碳饑餓系統(tǒng)的lac啟動(dòng)子、來(lái)自磷酸鹽限制系統(tǒng)的phoA啟動(dòng)子和來(lái)自氮限制系統(tǒng)的glnA啟動(dòng)子。估計(jì)他們從很寬范圍的不同調(diào)節(jié)方式的啟動(dòng)子中舉出如此多的例子，是要說(shuō)明他們的系統(tǒng)具有寬范圍的適用性。其中未指出或可推斷中優(yōu)選使用某個(gè)特定組的啟動(dòng)子或任何個(gè)別啟動(dòng)子。只在其中的一個(gè)實(shí)施例(專利申請(qǐng)的實(shí)施例12)中明顯地列舉了一個(gè)特定的SOS調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，其中給出了SOS調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子recA得到的結(jié)果。使微生物與加有誘變劑溴乙錠(濃度為0.25mg/ml)的樣品接觸，于加入誘變劑后180分鐘測(cè)得誘導(dǎo)率為1.9。加入0.5μg/ml絲裂霉素C,100分鐘后測(cè)定誘導(dǎo)率。依據(jù)所用測(cè)試菌株的不同，誘導(dǎo)率在4.7至20之間變動(dòng)。根據(jù)DuPont的專利申請(qǐng)的實(shí)施例12可明顯看到上述結(jié)果。
我們已不可預(yù)見(jiàn)地發(fā)現(xiàn)了一個(gè)應(yīng)激誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的亞組，即一個(gè)SOS調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的亞組，其與發(fā)光報(bào)道基因結(jié)合用于微生物系統(tǒng)估測(cè)致突變性得到了改善的結(jié)果。該亞組并不包括SOS調(diào)節(jié)的RecA啟動(dòng)子。該亞組具有許多優(yōu)于DuPont RecA-熒光素酶系統(tǒng)及本領(lǐng)域已知的其它微生物毒性測(cè)試系統(tǒng)的特點(diǎn)。在以特定方式使啟動(dòng)子突變而進(jìn)一步測(cè)試和開(kāi)發(fā)這些新的系統(tǒng)中，我們能夠更大程度地改善其性能。此外還完成了新的測(cè)試方法。這些新測(cè)試方法使我們能夠獲得迄今任何已有的微生物毒性測(cè)試中未曾述及的、更多更好的數(shù)據(jù)。
本發(fā)明涉及包含誘導(dǎo)率高于40的、SOS調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的重組核酸序列，所說(shuō)的啟動(dòng)子被有效地連接到編碼報(bào)道分子的核酸序列上，所編碼的報(bào)道分子能產(chǎn)生可以發(fā)光形式測(cè)定的信號(hào)。在根據(jù)本發(fā)明，重組核酸序列中優(yōu)選含有更高誘導(dǎo)率的、特別是高于50的誘導(dǎo)率的啟動(dòng)子。可按照諸如M.Schnurr等人在Biochimie(1991)73,423-431中公開(kāi)的方法檢測(cè)誘導(dǎo)率。另外，也可選用Peterson K.R.和Mount D.W.(1987)，分子生物學(xué)雜志，193,27-40中所述的方法。這些公開(kāi)內(nèi)容均列為本文參考文獻(xiàn)?，F(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)的與熒光素酶聯(lián)合使用的recA啟動(dòng)子并不落入這一大類中，因?yàn)閞ecA的誘導(dǎo)率要低得多。其在30°的誘導(dǎo)溫度下為11X。誘導(dǎo)率是一個(gè)本領(lǐng)域公認(rèn)的術(shù)語(yǔ)，并且可按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法確定。該文獻(xiàn)的實(shí)施例中給出了如何確定誘導(dǎo)率的方法，并確定了大量啟動(dòng)子的許多數(shù)值及誘導(dǎo)率。recA的低誘導(dǎo)率可能是它為什么不特別適用于基于啟動(dòng)子誘導(dǎo)作用的靈敏檢測(cè)系統(tǒng)的原因。在SOS調(diào)節(jié)的系統(tǒng)中，RecA啟動(dòng)子是最早被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。因代謝物缺乏而產(chǎn)生的信號(hào)被RecA蛋白質(zhì)所識(shí)別。其也可能在誘變中具有第二種功能即能輔助DNA聚合酶繞過(guò)損傷。在DNA損傷后的前20分鐘內(nèi)，uvrA、B、C、D基因被激活，開(kāi)始切割修復(fù)。然后在大約40分鐘的時(shí)間內(nèi)稱為RecF重組途徑的重組性修復(fù)途徑很活躍。最后才得以誘導(dǎo)涉及umuD、C的SOS誘變途徑。
上述專利申請(qǐng)中舉例的DuPont系統(tǒng)所使用的絲裂霉素C的最低水平是500ng/ml。其中沒(méi)有給出可檢測(cè)更低誘變劑水平的指征和提示。而在本系統(tǒng)中則可以檢測(cè)到7ng/ml的絲裂霉素。因此本系統(tǒng)要比DuPont系統(tǒng)中所指出的靈敏度要高大約80倍。我們發(fā)現(xiàn)，在我們的系統(tǒng)中從7.5ng/ml的濃度得到的誘導(dǎo)率高于2。
我們第一次舉例說(shuō)明了聯(lián)機(jī)檢測(cè)。因?yàn)橛肧OS或Ames系統(tǒng)需要破壞細(xì)胞，所以用這些系統(tǒng)進(jìn)行聯(lián)機(jī)檢測(cè)是不可能的。所描述的其他測(cè)試也只是用于單一點(diǎn)檢測(cè)。我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，有可能分辨樣品中存在的多種誘變劑，并確定這些物質(zhì)的誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)?？傮w上不可預(yù)見(jiàn)的是，若定時(shí)檢測(cè)發(fā)光，多種誘變劑的存在將提供不同的可檢測(cè)信號(hào)。人們可能預(yù)計(jì)的是反面情況，即出現(xiàn)累積效應(yīng)。但其清楚地說(shuō)明，SOS調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子構(gòu)成了一組表現(xiàn)出這種調(diào)節(jié)特征的啟動(dòng)子，即對(duì)于各種不同的誘導(dǎo)性化學(xué)物質(zhì)來(lái)說(shuō)，誘導(dǎo)方式多有不同，因而存在著有差異的可檢測(cè)信號(hào)。該新的方法應(yīng)用上極為簡(jiǎn)單，而且可實(shí)現(xiàn)信號(hào)檢測(cè)的自動(dòng)化。該新方法只需培養(yǎng)包含SOS調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的微生物，所說(shuō)的啟動(dòng)子被可效連接到編碼報(bào)道分子的核酸序列上，所說(shuō)的報(bào)道分子能產(chǎn)生可以發(fā)光形式測(cè)定的信號(hào)，并使微生物與待測(cè)樣品接觸，然后-測(cè)定培養(yǎng)物中的發(fā)光，所說(shuō)的測(cè)定是在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行的，-確定在所說(shuō)時(shí)間點(diǎn)上的信號(hào)-噪音比，-對(duì)數(shù)據(jù)作圖，所說(shuō)的數(shù)據(jù)代表所說(shuō)樣品的基因毒性的動(dòng)力學(xué)，其中多個(gè)峰指示具有不同的誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)的多種基因毒性化合物。發(fā)光檢測(cè)最好是連續(xù)進(jìn)行的。優(yōu)選聯(lián)機(jī)完成該方法。實(shí)施例和


這樣一個(gè)事實(shí)在含有多種誘變劑的樣品中可檢測(cè)出多個(gè)峰。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，發(fā)光檢測(cè)是連續(xù)進(jìn)行的。從實(shí)現(xiàn)檢測(cè)多種基因毒性劑存在的自動(dòng)化和精確度的角度看，這一點(diǎn)是特別令人感興趣的。信號(hào)噪音比越高測(cè)試系統(tǒng)就越靈敏。感興趣的其他因素是誘導(dǎo)速度、表達(dá)程度和信號(hào)噪音比的波動(dòng)程度。這些因素的變動(dòng)不僅取決于所選擇的啟動(dòng)子，而且取決于宿主菌株及基因毒性劑的性質(zhì)。實(shí)際使用中，2種濃度毒性化合物的信號(hào)噪音比將等于或高于2?；谏鲜龅囊粋€(gè)或多個(gè)特征，本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇最適于它們的狀態(tài)的系統(tǒng)。下述實(shí)施例舉例說(shuō)明了新的生物傳感器系統(tǒng)的廣泛適用性。本發(fā)明新的生物傳感器所顯示的結(jié)果構(gòu)成大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌中本發(fā)明新的DNA序列的各種實(shí)施方案。測(cè)試的所有新的生物系統(tǒng)都比基于鼠傷寒沙門(mén)氏菌和大腸桿菌菌株的標(biāo)準(zhǔn)Ames和SOS顯色測(cè)試好。本發(fā)明的系統(tǒng)更快速、更準(zhǔn)確而且更靈敏。我們針對(duì)那些在SOS顯色測(cè)試和Ames測(cè)試中已知給出假陰性結(jié)果的毒性劑作清楚的舉例說(shuō)明，即已知測(cè)試確實(shí)給出假陰性結(jié)果的，本發(fā)明的系統(tǒng)提供陽(yáng)性結(jié)果。特別是對(duì)新生霉素、疊氮化鈉、絲裂霉素C、萘啶酮酸(naladixic acid)、過(guò)氧化氫、芘和菲(phenantrene)作了舉例說(shuō)明。本發(fā)明的測(cè)試系統(tǒng)特別適于檢測(cè)PAH(多芳烴)的存在。
此外本發(fā)明的系統(tǒng)不需要為了提供檢測(cè)而破壞細(xì)胞，因而可在繼后用于進(jìn)一步的測(cè)試，并且更重要的是可在一定時(shí)間內(nèi)提供可檢測(cè)的信號(hào)。因此可追蹤并確定樣品的誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)。
本發(fā)明的一個(gè)重要實(shí)施方案是賴于這樣的事實(shí)，即現(xiàn)在首次可以獲得一種檢測(cè)樣品中多種基因毒性化合物存在的方法，所說(shuō)的方法包括以下步驟-培養(yǎng)包含帶有SOS調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的核酸序列的宿主微生物，其中所說(shuō)的啟動(dòng)子被有效地連接到編碼報(bào)道分子的核酸序列上，所編碼的報(bào)道分子能產(chǎn)生可以發(fā)光形式測(cè)定的信號(hào)，-測(cè)定培養(yǎng)物的發(fā)光，所說(shuō)的測(cè)定是在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行的，優(yōu)選是連續(xù)檢測(cè)，并且在所說(shuō)的時(shí)間點(diǎn)上檢測(cè)信號(hào)噪音比，然后對(duì)這些數(shù)據(jù)作圖，所說(shuō)的數(shù)據(jù)代表所說(shuō)樣品的基因毒性動(dòng)力學(xué)，其中多個(gè)峰表明存在多種具有不同的誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)的基因毒性化合物。
由于選擇了新的DNA序列并將其應(yīng)用于可提供新的生物傳感系統(tǒng)的宿主細(xì)胞中，我們還創(chuàng)造了很靈敏和快速的生物系統(tǒng)，可以在5分鐘至2小時(shí)的時(shí)間內(nèi)確定樣品的基因毒性。
因此本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括確定樣品中基因毒性化合物存在的方法，所說(shuō)的方法包括以下步驟-培養(yǎng)宿主微生物，所說(shuō)的宿主微生物包括一包含誘導(dǎo)率大于20的SOS調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的核酸序列，所說(shuō)的啟動(dòng)子被有效地連接到編碼報(bào)道分子的核酸序列上，所編碼的報(bào)道分子能產(chǎn)生可以發(fā)光形式測(cè)定的信號(hào)；-在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上測(cè)定培養(yǎng)物的發(fā)光，-確定培養(yǎng)物的發(fā)光是否發(fā)生了改變，增加發(fā)光是存在基因毒性化合物的指征。優(yōu)選啟動(dòng)子的誘導(dǎo)率為40或更高，最適為50或更高。在前述檢測(cè)樣品中基因毒性化合物存在的方法中，優(yōu)選的實(shí)施方案包括在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定發(fā)光。連續(xù)檢測(cè)則更好。另外，最好還有下列步驟-在所說(shuō)的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)發(fā)光的信號(hào)噪音比，-將發(fā)光信號(hào)對(duì)噪音數(shù)據(jù)作圖，所說(shuō)的圖代表樣品的基因毒性動(dòng)力學(xué)，可用于測(cè)定所說(shuō)樣品的基因毒性動(dòng)力學(xué)。最好用本發(fā)明的生物傳感器完成上述方法。這樣的生物傳感器包括宿主菌株，所說(shuō)的菌株含有如本說(shuō)明書(shū)中其它地方所限定的本發(fā)明的新核酸序列。宿主菌株較好是微生物，例如大腸桿菌或鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌株。具體地說(shuō)，已應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的鼠傷寒沙門(mén)氏菌Ames測(cè)試菌株作為宿主菌株，并且為本發(fā)明的生物傳感器提供了很適當(dāng)?shù)膶?shí)施方案。本發(fā)明的菌株具有吸引力在于其適用于基因毒性和毒性測(cè)試中。Ames測(cè)試菌株的例子是TA98、TA100、TA102、TA104、TA1535和TA1538，或新的鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌株TA7001至TA7006和TA7046(Gee等，1994)。另外Ames菌株還是世界醫(yī)藥工藝中普遍接受的菌株。對(duì)于包含作為宿主菌株的Ames菌株的本發(fā)明生物傳感器來(lái)說(shuō)，該菌株不僅能按照本發(fā)明用于基因毒性測(cè)試中，而且還可相繼用于Ames測(cè)試中。其他可成為多功能菌株的適用宿主菌株是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的。
實(shí)施例中對(duì)適于應(yīng)用于本發(fā)明的生物傳感器的本發(fā)明核酸序列的各種實(shí)施方案作了舉例說(shuō)明。包含誘導(dǎo)率高于40的SOS調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的核酸序列是本發(fā)明一部分，所說(shuō)的啟動(dòng)子被有效地連接到編碼報(bào)道分子的核酸序列上，所編碼的報(bào)道分子能產(chǎn)生可以發(fā)光形式測(cè)定的信號(hào)。本發(fā)明的生物傳感器包含本文所公開(kāi)的各個(gè)實(shí)施方案中任一個(gè)的核酸序列。另外，這樣的DNA序列可適用于完成本文所公開(kāi)的本發(fā)明的所有方法。
重組性修復(fù)啟動(dòng)子中的適用啟動(dòng)子包括RecF、RecJ、RecN、RecO、RecQ、ruv和uvrD啟動(dòng)子。實(shí)施例中舉例說(shuō)明了RecN啟動(dòng)子。另一個(gè)適用的啟動(dòng)子是SfiA啟動(dòng)子，它也在實(shí)施例中作了舉例說(shuō)明。此外，可在重組修復(fù)期間誘導(dǎo)、誘導(dǎo)率高于40的上述SOS調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子組的突變啟動(dòng)子也是本發(fā)明的適當(dāng)實(shí)施方案。這樣的突變體可能具有更強(qiáng)的啟動(dòng)子強(qiáng)度或調(diào)節(jié)作用，但極為重要的是SOS調(diào)節(jié)作用未被破壞。特別適用的突變的一個(gè)例子包括在至少一個(gè)LexA結(jié)合位點(diǎn)中發(fā)生的突變，而至少另有一個(gè)LexA結(jié)合位點(diǎn)保留活性。這種類型的優(yōu)選突變將在所說(shuō)的至少另一個(gè)LexA結(jié)合位點(diǎn)具有不改變野生型啟動(dòng)子序列的突變。這種類型的突變體的例子是具有序列ID No.7的RecN突變體(RecN1-3)。帶有LexA突變這種類型的突變體特別適用于檢測(cè)有多個(gè)基因毒性劑存在的方法中，并適用于按本說(shuō)明書(shū)別處公開(kāi)的本發(fā)明方法來(lái)檢測(cè)這類樣品的誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)。這樣的突變體也是極其靈敏和快速的。它們特別適用于檢測(cè)基因毒性中間體降解或代謝產(chǎn)物的出現(xiàn)和/或聚積。這可以是在污染物和其降解物的田間例如生物改造土壤中，也可用于藥物測(cè)試中。
已發(fā)現(xiàn)可提供有用特征的另一種類型的突變體是含有啟動(dòng)子增效突變的突變體。啟動(dòng)子增效突變是一個(gè)公認(rèn)的技術(shù)術(shù)語(yǔ)，突變的結(jié)果是啟動(dòng)子序列更加相似于RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)的一致序列。這種類型的突變可在啟動(dòng)子-35區(qū)域含有突變。實(shí)施例中以具有序列ID No.8的RecN2-4突變體形式提供了RecN啟動(dòng)子的這類突變實(shí)例。我們還提供了具有LexA和啟動(dòng)子增效突變的組合突變體的實(shí)例，其為具有序列ID No.9的RecN3-4突變體。原則上其他改進(jìn)也是可能的，例如-10啟動(dòng)子區(qū)域的突變以及-35和-10區(qū)域之間更好的間距。后兩種選擇對(duì)于recN來(lái)說(shuō)并不相關(guān)，因?yàn)檫@種啟動(dòng)子已表現(xiàn)出與σ35啟動(dòng)子序列具有良好一致性。鑒于該-35不是最佳的，所以我們舉例說(shuō)明能提供與σ35一致啟動(dòng)子序列有更密切相符性的突變可導(dǎo)致功能的改善。
除了啟動(dòng)子序列外，本發(fā)明的核酸序列還包括編碼報(bào)道分子的核酸序列，該核酸序列編碼的報(bào)道分子能產(chǎn)生可以發(fā)光形式測(cè)定的信號(hào)。這樣的序列是本領(lǐng)域中已知的。由含有熒光素酶A和B基因的編碼報(bào)道分子的核酸序列構(gòu)成了適當(dāng)?shù)膶?shí)施方案。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所說(shuō)的序列還包括熒光素酶C、D和E基因，這些基因是產(chǎn)生可用于再循環(huán)的有限脂肪酸底物所必需的。有關(guān)這些序列的詳細(xì)描述可見(jiàn)于1992年2月28日提交的PCT/EP專利申請(qǐng)9200445中。
本發(fā)明的優(yōu)選方法包括在如本文所述的本發(fā)明的任何一種方法中應(yīng)用適于作為Ames測(cè)試菌株的微生物，所說(shuō)的微生物進(jìn)一步包含本發(fā)明的新的核酸序列，然后進(jìn)行傳統(tǒng)的Ames測(cè)試，從而提供一種使用同一菌株進(jìn)行基因毒性誘變性和毒性測(cè)試的方法。
本發(fā)明的新的核酸序列另一個(gè)應(yīng)用在于使用包含所說(shuō)序列的微生物以檢測(cè)毒性。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是能夠產(chǎn)生高噪音信號(hào)的細(xì)胞。例如具有如上文所述啟動(dòng)子增效突變的本發(fā)明的核酸序列似乎很適合于這一應(yīng)用。這種應(yīng)用可以得出毒性產(chǎn)物的IC50計(jì)算值。換句話說(shuō)，這種應(yīng)用可構(gòu)成一種檢測(cè)樣品中毒性化合物存在的方法，該方法包括以下步驟-培養(yǎng)宿主微生物，所說(shuō)的宿主微生物是本文任一個(gè)實(shí)施例中公開(kāi)的本發(fā)明的宿主微生物，-測(cè)定培養(yǎng)物的發(fā)光，以及-確定培養(yǎng)物的發(fā)光是否已發(fā)生了改變，發(fā)光降低即指示存在包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的毒性化合物。
總之，本發(fā)明可能具有下列優(yōu)點(diǎn)-有可能鑒別出樣品中存在的呈現(xiàn)不同誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)的至少兩種基因毒性化合物。-有可能在代謝期間利用諸如S9或在降解期間如生物除污中及時(shí)鑒定出中間體基因毒性產(chǎn)物的形成。-可利用同一細(xì)胞聯(lián)機(jī)檢測(cè)基因毒性及一般毒性動(dòng)力學(xué)。-可在5分鐘至4小時(shí)內(nèi)，優(yōu)選在3小時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選在2小時(shí)內(nèi)迅速完成測(cè)試，并給出明確的結(jié)果。-在信號(hào)檢測(cè)前不需對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行預(yù)先處理。-在聯(lián)機(jī)檢測(cè)基因毒性化合物或液態(tài)溶液的一般毒性時(shí)不需要破壞細(xì)胞。-可用根據(jù)本發(fā)明的菌株進(jìn)一步檢查在4小時(shí)內(nèi)，優(yōu)選在3小時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選在2小時(shí)內(nèi)發(fā)現(xiàn)有基因毒性的選用物質(zhì)，以用同樣的細(xì)胞按照Ames方法檢查移碼突變或堿基對(duì)取代。-由于基礎(chǔ)發(fā)光降低是一般毒性的指征，所以檢測(cè)毒性時(shí)不需內(nèi)部對(duì)照。-由于實(shí)驗(yàn)的測(cè)試時(shí)間有限，所以不需要嚴(yán)格的無(wú)菌條件。-由于實(shí)驗(yàn)的測(cè)試時(shí)間有限，所以不需要對(duì)測(cè)試樣品進(jìn)行化學(xué)穩(wěn)定性測(cè)試。

圖1啟動(dòng)子探針載體pMOL877(圖1a)和在該載體中克隆了sfiA啟動(dòng)子的衍生物pMOL890(圖1b)的限制性圖譜。
圖2啟動(dòng)子探針載體pMOL877和在該載體中克隆了recN啟動(dòng)子(pMOL1066,recN1-2)、帶有失活的LexA2位點(diǎn)的recN啟動(dòng)子(pMOL1067,recN1-3)、帶有啟動(dòng)子增效突變的recN啟動(dòng)子(pMOL1068,rec2-4)、以及同時(shí)帶有失活的Lex A2位點(diǎn)和啟動(dòng)子增效突變的啟動(dòng)子(pMOL1069,recN3-4)的衍生物pMOL1066(圖2a)、pMOL1067(圖2b)、pMOL1068(圖2c)和pMOL1069(圖2d)的限制性圖譜。
圖3以經(jīng)64ppm MMS處理的含pMOL890、pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069的大腸桿菌ED8739的信號(hào)/噪音比給出的光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)。發(fā)光是在2小時(shí)的期間內(nèi)測(cè)定的。
圖4以經(jīng)64ppm MMS處理的含有pMOL890、pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069的大腸桿菌ED8739的信號(hào)/噪音比給出的光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)。發(fā)光是在5小時(shí)的期間內(nèi)測(cè)定的。
圖5對(duì)含有pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069的大腸桿菌，以最大信號(hào)/噪音比對(duì)濃度的形式給出了MMS(濃度為0.5-128ppm)的劑量-效應(yīng)曲線。
圖6對(duì)含有pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069的大腸桿菌ED87391106，以最大信號(hào)/噪音比對(duì)照射時(shí)間的形式給出了紫外光(照射時(shí)間為2-10秒)的劑量-效應(yīng)曲線。
圖7以經(jīng)64ppm MMS處理的含有pMOL1067或pMOL1068的鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA98和TA104的信號(hào)/噪音比形式給出的光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)。發(fā)光是在5小時(shí)的期間內(nèi)測(cè)定的。
圖8以經(jīng)25.6ppb 4-NQO處理的含pMOL1067或pMOL1068的鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA98和TA104的信號(hào)/噪音比形式給出的光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)。發(fā)光是在5小時(shí)的時(shí)間內(nèi)測(cè)定的。
圖9用TA98(pMOL1067)測(cè)試MMS和新生霉素的組合。在圖示符號(hào)中，第一個(gè)數(shù)值代表MMS的量(ppm數(shù))，其后是新生霉素值(ppm數(shù))。
圖10用TA104(pMOL890)測(cè)試MMS和新生霉素的組合。圖示符號(hào)中，第一個(gè)數(shù)值代表MMS的量(ppm數(shù))，其后是新生霉素值(ppm數(shù))。
圖11以使用菌株TA98(pMOL1067)得到的總信號(hào)/噪音比的函數(shù)形式排列的MMS和新生霉素組合的基因毒性。
圖12以使用菌株TA104(pMOL890)得到的總信號(hào)/噪音比的函數(shù)形式排列的MMS和新生霉素組合的基因毒性。
圖13當(dāng)TA98(pMOL1067)與不同濃度的毒性產(chǎn)物R116一起保溫時(shí)，該菌株的信號(hào)/噪音比隨時(shí)間的降低情況。
圖14當(dāng)TA98(pMOL1068)與不同濃度的毒性產(chǎn)物R116一起保溫時(shí)，該菌株的信號(hào)/噪音比隨時(shí)間的降低情況。
圖15在PAH污染的土壤的生物除污過(guò)程中取得的樣品的基因毒性值。該實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)是使用TA104(pMOL890)得到的。經(jīng)S9提取物代謝激活后檢測(cè)基因毒性。使用TA104(pMOL1067)或TA104(pMOL1068)得到相似的數(shù)據(jù)。
圖16在用菌株LB208降解熒蒽期間基因毒性降解中間體的出現(xiàn)。該實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)是使用TA104(pMOL890)得到的，但使用TA104(pMOL1067)或TA104(pMOL1068)也獲得了相似的結(jié)果。基因毒性增加表明有基因毒性中間體降解產(chǎn)物形成。以最大信號(hào)/噪音比表示基因毒性。于pH2.5下提取基因毒性中間體。在不用或用(#)S9代謝激活的情況下確定基因毒性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)啟動(dòng)子-lux融合體的構(gòu)建大腸桿菌的sfiA啟動(dòng)子sfiA-lux融合體的構(gòu)建細(xì)菌SOS反應(yīng)處于許多調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的控制之下，其中最重要的是RecA蛋白質(zhì)(蛋白酶)和LexA阻抑蛋白?；蚨拘援a(chǎn)物的存在導(dǎo)致DNA損傷。其將激活DNA修復(fù)系統(tǒng)，并且部分激活作用是從無(wú)活性的RecA蛋白質(zhì)改變成有活性的蛋白酶。這種RecA蛋白酶對(duì)LexA阻抑蛋白具有高度親和性，由于RecA的蛋白酶解作用使之逐漸被失活。LexA失活后與其在LexA調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)解離，從而導(dǎo)致啟動(dòng)子的活化和其相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。處于LexA控制下的啟動(dòng)子之一是sfiA啟動(dòng)子。sfiA啟動(dòng)子具有一個(gè)LexA結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)與-10區(qū)域和該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)有所重疊，并且其轉(zhuǎn)錄激活需要LexA的解離。還知道sfiA啟動(dòng)子是處于細(xì)菌SOS反應(yīng)控制下的最強(qiáng)的啟動(dòng)子，其誘導(dǎo)率為100。以PCR片段形式克隆sfiA啟動(dòng)子。基于已公開(kāi)的sfiA序列，按RCR片段將側(cè)翼接有HindⅢ和EcoRⅠ限制性位點(diǎn)的方式設(shè)計(jì)引物(Beck和Bremer,1980)。引物94C79(Seq.ID No.1)識(shí)別從位置59到87的sfiA序列TTTAAGCTTCCCGTCACCAACGACAAAATTTGCGAGGC下劃線部分是HindⅢ限制性位點(diǎn)，而sfiA序列則以斜體字母示出。引物94C96(Seq.ID No.2)識(shí)別從位置400到376的互補(bǔ)sfiA:AAGAATTCCCGACTCAGTTTTTGTTGCGG下劃線的是EcoRⅠ限制性位點(diǎn)，而互補(bǔ)sfiA序列則以斜體字母表示。
在大腸桿菌HB101染色體DNA上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生352bp的平頭PCR片段。將此片段克隆到pMOL877的單一EcoRⅠ位點(diǎn)中。質(zhì)粒pMOL877衍生于IncQ質(zhì)粒RSF1010，并除了四環(huán)素抗性標(biāo)記外還含有無(wú)啟動(dòng)子的LuxCDABE操縱子。單一的EcoRⅠ位點(diǎn)位于該操縱子的上游。用EcoRⅠ消化后，使用Klenow DNA聚合酶將EcoRⅠ位點(diǎn)的粘性末端填成平頭。連接后用反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ED8739的電感受態(tài)細(xì)胞(Murray等，1977)。根據(jù)細(xì)胞在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)能力選擇轉(zhuǎn)化體，用牙簽將轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)接到兩份含有四環(huán)素的豐富培養(yǎng)基中，然后用紫外光照射一個(gè)平板。使用放射自顯影法可看到顯示紫外光誘導(dǎo)型發(fā)光的陽(yáng)性克隆。分析(限制性酶切分析和PCR)4個(gè)陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒包含物，所有克隆均顯示含有同樣的重組質(zhì)粒。將含有處于sfiA啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制下之LuxCDABE基因的基于pMOL877的衍生質(zhì)粒定名為pMOL890。圖1a和1b中分別給出了pMOL877和pMOL890的限制性酶切圖譜。
作為sfiA啟動(dòng)子的適當(dāng)?shù)目纱梦铮梢詫⑻幱贚exA控制下的并可在SOS反應(yīng)期間被激活的其他啟動(dòng)子序列克隆到Lux報(bào)道基因系統(tǒng)的上游。如此可得到作為發(fā)光的函數(shù)顯示基因毒性的新的構(gòu)建體。特別有用的是具有高于40的誘導(dǎo)率的SOS-啟動(dòng)子。令人感興趣的是不參與SOS誘變，但部分地參與RecF重組修復(fù)途徑的SOS-啟動(dòng)子。這一組啟動(dòng)子包括recF、recJ、recN、recO、recQ、ruv和uvrD(以前稱為recL)。鑒于SOS誘變啟動(dòng)子RecA和umu分別只有11和28的低誘導(dǎo)率，所以認(rèn)為它們不是太有用的。在研究了文獻(xiàn)之后，選擇下列候選啟動(dòng)子序列作進(jìn)一步的研究-大腸桿菌的recN啟動(dòng)子；-大腸桿菌的ruv啟動(dòng)子；-大腸桿菌質(zhì)粒pHM101的muc啟動(dòng)子。
從這些候選啟動(dòng)子中選擇recN進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)工作，因?yàn)镽ecN是誘導(dǎo)SOS反應(yīng)后細(xì)胞的主要構(gòu)成成份，并且已知道LexA對(duì)它具有嚴(yán)格調(diào)節(jié)作用(Finch等，1985；Picksly等，1985)。大腸桿菌的recN啟動(dòng)子recN-lux融合體的構(gòu)建recN啟動(dòng)子具有三個(gè)LexA結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)與-35區(qū)域重疊，另一個(gè)與-10區(qū)域和該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)重疊。推測(cè)第三個(gè)LexA結(jié)合位點(diǎn)位于編碼區(qū)內(nèi)。在這方面它不同于只有一個(gè)LexA結(jié)合位點(diǎn)的sfiA啟動(dòng)子。recN啟動(dòng)子具有下列序列(Seq ID No.3；Rostas等，1987)，其中指出了-35和-10區(qū)域(斜體字)的位置及兩個(gè)LexA結(jié)合位點(diǎn)(下劃線部分)的位置GCCTCTTTACTTGTATATAAAACCAGTTTATACTGTACACAATAACAGTAA-35 LexA1-10 LexA2該啟動(dòng)子與一致的啟動(dòng)子序列(Seq.ID No.4)“TTGACA-16/17bp-TATAAT”具有相似性，但-35區(qū)的重要的G被T取代。因此，在誘導(dǎo)條件下recN的表達(dá)可能比-35區(qū)域的序列為T(mén)TGATC的sfiA啟動(dòng)子稍弱。
根據(jù)這一信息進(jìn)行下列克隆實(shí)驗(yàn)-用PCR擴(kuò)增法克隆野生型recN啟動(dòng)子。合成兩個(gè)均引入EcoRⅠ限制性位點(diǎn)的引物，即啟動(dòng)子區(qū)上游的引物1序列ID No.5和下游的引物2序列ID No.6。引物1位于recN序列的位置28-49。引物2位于recN序列的位置550-526(互補(bǔ)的)。引物中的GAATTC指示EcoRⅠ位點(diǎn)。Rostas等人(1987)公開(kāi)了recN序列。這些限制性位點(diǎn)是在pMOL877 lux報(bào)道基因載體中克隆啟動(dòng)子片段所需要的。-從啟動(dòng)子序列中除去LoxA2結(jié)合位點(diǎn)。為此目的，選擇具有序列IDNo.7(AAAGAATTCTTATTGTGTACAGTATAAACTGG)的引物3，該引物在LexA2結(jié)合位點(diǎn)的最后三個(gè)堿基對(duì)處作了修飾。這三個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成一個(gè)一致序列，并且在大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的所有Lex結(jié)合位點(diǎn)上都是保守的。引物3的5′末端以斜體字顯示的堿基對(duì)并不符合野生型DNA序列，選擇這種序列以引入一個(gè)EcoRⅠ限制性位點(diǎn)。為了PCR擴(kuò)增recN啟動(dòng)子，必須將此引物與引物1結(jié)合使用。引物3互補(bǔ)于recN序列的位置360-338(Rostas等，1987)。
使用具有序列ID No.8(相當(dāng)于Rostas等1987所述的recN上的位置294-331)AAAAGAATTCTAATTTTACGCCAGCCTCTTGACTGTAT的引物4導(dǎo)入“啟動(dòng)子增效”突變。該引物在-35區(qū)的一致位置上引入一個(gè)G(黑體字)并且還在啟動(dòng)子區(qū)的5′末端引入一個(gè)EcoRⅠ限制性位點(diǎn)。這樣，引物4的5′端以斜體字表示的堿基對(duì)就不與野生型DNA序列相符合。recN啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增中，必須聯(lián)合使用該引物與引物2。-從啟動(dòng)子序列中除去LexA2結(jié)合位點(diǎn)，并導(dǎo)入“啟動(dòng)子增效”突變。為此可使用引物3和4聯(lián)合進(jìn)行recN啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增。
使用上述各對(duì)引物擴(kuò)增recN基因的啟動(dòng)子區(qū)。也導(dǎo)入了額外的突變。由此得到下列PCR片段*recN1-2，野生型recN啟動(dòng)子(=序列ID No.3)*recN1-3，缺少LexA2位點(diǎn)的recN啟動(dòng)子(=序列ID No.9)*recN2-4，帶有啟動(dòng)子增效突變的recN啟動(dòng)子(=序列ID No.10)*recN3-4，帶有缺少LexA2位點(diǎn)之啟動(dòng)子增效突變的recN啟動(dòng)子(=序列ID No.11)。
用EcoRⅠ消化這些PCR片段并克隆到用EcoRⅠ切成線性的luxCDABE表達(dá)載體pMOL877中。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ED8739(Met-,RecA+)。RecA+表型是獲得啟動(dòng)子-lux融合體的SOS誘導(dǎo)表達(dá)所必需的。使用如前所述用于檢測(cè)sfiA-lux融合體的紫外光照射誘導(dǎo)光發(fā)射，以鑒定含有所需的啟動(dòng)子-lux融合體的轉(zhuǎn)化體。對(duì)于每種啟動(dòng)子構(gòu)建體，均分別鑒定出顯示有紫外光誘導(dǎo)之光發(fā)射的陽(yáng)性克隆。如此得到下列質(zhì)粒和大腸桿菌菌株*菌株CM2081中的pMOL1066，其含有recN1-2 lux融合體(野生型recN啟動(dòng)子)。*菌株CM2082中的pMOL1067，其含有recN1-3 lux融合體(缺少LexA2位點(diǎn)的recN啟動(dòng)子)。*菌株CM2083中的pMOL1068，其含有recN2-4 lux融合體(帶有啟動(dòng)子增效突變的recN啟動(dòng)子)。*菌株CM2084中的pMOL1069，其含有recN3-4 lux融合體(帶有缺少LexA2位點(diǎn)之啟動(dòng)子增效突變的recN啟動(dòng)子)。
圖2a-d中給出了recN-lux融合體質(zhì)粒pMOL1066至pMOL1069的限制性酶切圖譜。使用啟動(dòng)子-lux構(gòu)建體在大腸桿菌中進(jìn)行發(fā)光測(cè)試為了使用細(xì)菌SOS系統(tǒng)檢查不同的啟動(dòng)子構(gòu)建體的可誘導(dǎo)性，按照下文提供的方法，使用64ppm MMS進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。取未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞作為對(duì)照。結(jié)果以信號(hào)/噪音比示于圖3和4中。
根據(jù)這些結(jié)果可得出以下結(jié)論*含有野生型sfiA啟動(dòng)子的pMOL890(sfiA)在SOS誘導(dǎo)后得到很好的誘導(dǎo)和表達(dá)(圖3和圖4)。此外，誘導(dǎo)曲線與使用recN-lux融合體pMOL1066(recN1-2)和pMOL1067(recN1-3)觀察到的曲線十分相似(見(jiàn)圖4)。
*含有野生型recN啟動(dòng)子的pMOL1066(recN1-2)，在SOS誘導(dǎo)后比其衍生物的表達(dá)要差一些(也是關(guān)于總發(fā)光量)(圖3和圖4)。誘導(dǎo)曲線與使用sfiA-lux融合體pMOL890和pMOL1067(recN1-3)觀察到的曲線十分相似(見(jiàn)圖4)。
*含有缺少LexA2位點(diǎn)之recN啟動(dòng)子的recN1-3，在SOS誘導(dǎo)后得到很好的誘導(dǎo)和表達(dá)。此外，其誘導(dǎo)曲線與用sfiA-lux融合體觀察到的曲線很相似(圖3和圖4)。
*含有帶啟動(dòng)子增效突變之recN啟動(dòng)子的recN2-4，在SOS誘導(dǎo)后得以很好地誘導(dǎo)和表達(dá)。使用該構(gòu)建體的總發(fā)光量以及起始誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)甚至比使用pMOL890和pMOL1067更快(圖3)。然而，由信號(hào)/噪音比表示的誘導(dǎo)曲線比使用pMOL890和pMOL1067時(shí)表現(xiàn)有更大的波動(dòng)(見(jiàn)圖4)。因此該構(gòu)建體是檢測(cè)基因毒性化合物存在的很好的候選構(gòu)建體，但它似乎不太適合用于檢測(cè)混合物中的單個(gè)基因毒性化合物的存在。
*含有缺少LexA2位點(diǎn)之啟動(dòng)子增效突變的recN啟動(dòng)子的recN3-4具有很強(qiáng)的發(fā)光，但信號(hào)噪音比例較差。因此，該構(gòu)建體不適于用作基因毒性生物傳感器(圖3和圖4)。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)系列中，分別針對(duì)MMS(濃度為0.5-128ppm)和紫外光照射(照射時(shí)間為2-10秒)檢測(cè)含有pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069之大腸桿菌1106的劑量-效應(yīng)曲線。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖5和6中。
在兩實(shí)驗(yàn)中，用pMOL1068(recN2-4)得到了最好的結(jié)果，而pMOL1069(recN3-4)則給出最低的信號(hào)/噪音比。使用pMOL890中的sfiA-lux融合體得到了相似的結(jié)果?；谶@些結(jié)果，決定在鼠傷寒沙門(mén)氏菌Ames測(cè)試菌株TA98、TA100、TA104、TA1535和TA1538中導(dǎo)入這四個(gè)recN啟動(dòng)子-Lux融合構(gòu)建體(pMOL1066-pMOL1069)，以及sfiA-lux融合體(pMOL890)，并測(cè)試它們的作為SOS反應(yīng)(由于基因毒性產(chǎn)物的存在而誘發(fā)的)的函數(shù)的誘導(dǎo)作用。在鼠傷寒沙門(mén)氏菌中導(dǎo)入啟動(dòng)子-lux融合構(gòu)建體并進(jìn)行測(cè)試在Ames測(cè)試用鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌株TA98、TA100、TA104、TA1535和TA1538中導(dǎo)入所有五種質(zhì)粒，pMOL890和pMOL1066至pMOL1069。由此說(shuō)明Ames測(cè)試菌株的總體轉(zhuǎn)化的普遍可行性。在鼠傷寒沙門(mén)氏菌中進(jìn)行誘變性測(cè)試為了檢查導(dǎo)入pMOL890、pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069是否對(duì)用于誘變測(cè)試的鼠傷寒沙門(mén)氏菌的特征有所影響(根據(jù)在存在或不存在誘變產(chǎn)物的情況下從His-到His+的回復(fù)頻率所確定的)，用原始Ames測(cè)試菌株和它們的含有上述質(zhì)粒的衍生菌株進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)Ames測(cè)試。按照Maron和Ames(1983)所描述的步驟，對(duì)MMS、4-NQO、呋喃唑酮(furazolidone)、2-AF和苯并-α-芘進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果示于表1A至1G中。并未全部給出用原始Ames測(cè)試所得到的結(jié)果，但從表中給出的結(jié)果以及表1A與1B、1C與1D之間的比較可以得出這樣的結(jié)論導(dǎo)入質(zhì)粒并沒(méi)有改變重組菌株的His回復(fù)特征。因此，可以使用重組菌株進(jìn)行傳統(tǒng)的Ames測(cè)試。在鼠傷寒沙門(mén)氏菌中進(jìn)行發(fā)光測(cè)試為了用鼠傷寒沙門(mén)氏菌的細(xì)菌SOS系統(tǒng)檢查不同的大腸桿菌啟動(dòng)子構(gòu)建體的可誘導(dǎo)性，按照下述公開(kāi)的方法使用64ppm MMS或25.6ppb4-NQO進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。取未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞作為對(duì)照。圖7和8中給出了使用recN-lux融合體pMOL1067和pMOL1068得到的以信號(hào)/噪音比表示的結(jié)果。
從這些附圖(圖7和圖8)中可以看出，用pMOL1068(RecN2-4)測(cè)得的誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)稍快于就pMOL1067(RecN1-3)所觀察到的誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)，但用pMOL1067(RecN1-3)得到的最大信號(hào)/噪音比要高于pMOL1068(RecN2-4)。因此對(duì)于基因毒性測(cè)試，兩構(gòu)建體都是有用的并且是互為補(bǔ)充的。發(fā)現(xiàn)用pMOL890(sfiA)觀察到的結(jié)果與用pMOL1067的結(jié)果相似。
測(cè)定13種產(chǎn)物的最小可檢測(cè)濃度(MDC,nmol/測(cè)定)，其中使用含有pMOL890、pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069的鼠傷寒沙門(mén)氏菌Ames測(cè)試菌株。表2中給出了用含有pMOL890、pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069的鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA104，以及含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA98得到的結(jié)果。此外還給出了文獻(xiàn)中用SOS顯色測(cè)試和Ames測(cè)試測(cè)得的MDC值。對(duì)于某些產(chǎn)物，無(wú)法計(jì)算出Ames測(cè)試的MDC值，而只指示出陽(yáng)性(pos)或陰性(neg)反應(yīng)。表1A用鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌株TA98,TA100,TA104,TA1535和TA1538對(duì)MMS進(jìn)行Ames測(cè)試
表1B用含有pMOL890的鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌株TA98*,TA100*,TA104*,TA1535*和TA1538*對(duì)MMS進(jìn)行Ames測(cè)試
表1C用鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌株TA98,TA100,TA104,TA1535和TA1538對(duì)4-NQO進(jìn)行Ames測(cè)試
表1D用含有pMOL890的鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌株TA98*,TA100*,TA104*,TA1535*和TA1538*對(duì)4-NQO進(jìn)行Ames測(cè)試<
表1E用含有pMOL890的鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌株TA98*,TA100*,TA104*,TA1535*和TA1538*對(duì)呋喃唑酮進(jìn)行Ames測(cè)試
表1F用含有pMOL890的鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌株TA98*,TA100*和TA104*對(duì)2-AF進(jìn)行Ames測(cè)試
在有(+S9)或沒(méi)有(-S9)進(jìn)行代謝活化的情況下進(jìn)行測(cè)試表1G用含有pMOL890的鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌株TA98*,TA100*和TA104*對(duì)苯并-α-芘進(jìn)行Ames測(cè)試
在有(+S9)或沒(méi)有(-S9)進(jìn)行代謝活化的情況下進(jìn)行測(cè)試
表2用含有pMOL890,pMOL1066,pMOL1067,pMOL1068或pMOL1069的鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌株TA104，和含有pMOL890,pMOL1066,pMOL1067,pMOL1068或pMOL1069的鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌株TA98確定13種產(chǎn)物的最小可檢測(cè)濃度(MDC，以nmol/測(cè)試表示)。還給出了SOS顯色測(cè)試和Ames測(cè)試的文獻(xiàn)值。表3
藥物
抗微生物劑
殺蟲(chóng)劑、除草劑
無(wú)機(jī)化合物
多環(huán)芳烴(PAH)<
實(shí)驗(yàn)室化學(xué)物質(zhì)
不可測(cè)*由于存在組氨酸溶劑，燃料，…
電磁波
>
選擇兩種產(chǎn)物，即酪蛋白氨基酸和CdCl2作為陰性對(duì)照。因?yàn)槔业鞍装被嶂泻薪M氨酸，所以不可能用Ames測(cè)試檢測(cè)它。
從表2中可以看出，用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的菌株可得到最好的結(jié)果。用所有構(gòu)建體得到的結(jié)果均好于用SOS顯色測(cè)試得到的結(jié)果，其中例外的是ICR191給出相似的結(jié)果。這些結(jié)果也大大好于用Ames測(cè)試得到的結(jié)果，其中例外的是2,4,5,7-四硝基-9-芴酮。因此可以認(rèn)為，在鼠傷寒沙門(mén)氏菌Ames測(cè)試菌株中使用sfiA和recN-lux基因融合體(pMOL890、pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069)檢測(cè)基因毒性時(shí)提供了一條比SOS顯色測(cè)試和Ames測(cè)試更快速、更靈敏的途徑。
表3給出了用含有pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株進(jìn)行的基因毒性測(cè)試的結(jié)果。因?yàn)橛眠@些菌株得到的測(cè)試結(jié)果相似，所以只給出最后的測(cè)試結(jié)果(陽(yáng)性或陰性)。SOS顯色測(cè)試(SOS)和Ames測(cè)試也得到相似的結(jié)果。所測(cè)試的試劑是下面幾類中的通常視為代表性的試劑藥物、抗微生物劑、殺蟲(chóng)劑、除草劑、無(wú)機(jī)化合物、多芳烴、實(shí)驗(yàn)室化學(xué)物質(zhì)、溶劑、燃料及電磁射線。從該表中可以看出，可使用雜合的TA Ames測(cè)試菌株檢測(cè)所有各類被試產(chǎn)物的基因毒性，并且與使用SOS顯色測(cè)試和Ames測(cè)試得到的結(jié)果只有很小差異。
當(dāng)將用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株得到的結(jié)果與用SOS顯色測(cè)試得到的結(jié)果相比較時(shí)，可以得出如下結(jié)論當(dāng)產(chǎn)物在用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株所作測(cè)試中是陰性時(shí)，用SOS顯色測(cè)試也是陰性。然而，可能有基因毒性的新生霉素和疊氮化鈉在SOS顯色測(cè)試中是陰性，但在使用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株所作的測(cè)試中則是陽(yáng)性。因此可以認(rèn)為用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株所作的測(cè)試，對(duì)于基因毒性測(cè)試來(lái)說(shuō)，因?yàn)闆](méi)有得到假陰性結(jié)果，所以比SOS顯色測(cè)試更為準(zhǔn)確。當(dāng)產(chǎn)物在用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株所作測(cè)試中是陰性時(shí)，其在Ames測(cè)試中也是陰性。所不同的是環(huán)磷酰胺和亞乙基硫脲在用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株所作測(cè)試中是陰性的。這一現(xiàn)象是可以理解的，因?yàn)檫@些產(chǎn)物并不誘發(fā)細(xì)菌SOS反應(yīng)。
發(fā)現(xiàn)在Ames測(cè)試中呈假陰性的基因毒性產(chǎn)物，例如絲裂霉素C、萘啶酮酸、過(guò)氧化氫、芘和菲，在用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株所作測(cè)試中為陽(yáng)性。因此可以認(rèn)為，用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株所作的測(cè)試不僅如Ames測(cè)試一樣好，而且在PAH等環(huán)境污染物的測(cè)試中要更加準(zhǔn)確。組合的基因毒性產(chǎn)物的測(cè)試檢查測(cè)試樣品中存在一種以上基因毒性產(chǎn)物時(shí)不同構(gòu)建體的反應(yīng)。這是一個(gè)很重要的方面，因?yàn)榄h(huán)境樣品常常含有一種以上的基因毒性污染物。另外，有許多必須進(jìn)行基因毒性測(cè)試的藥物產(chǎn)品可能是不同的活性基因毒性物質(zhì)(如抗腫瘤或抗愛(ài)滋病藥物)的組合。使用含有pMOL1067或pMOL890的TA98和TA104進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。選擇這兩種構(gòu)建體是因?yàn)樗鼈冊(cè)谑髠抽T(mén)氏菌中顯示有相似的誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)和最好的信號(hào)/噪音比(見(jiàn)圖7和圖8)。作為測(cè)試產(chǎn)物，可采用MMS與新生霉素的幾種組合。選擇使用這些產(chǎn)物是因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)它們有不同的誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)(例如，用pMOL1067,MMS在2小時(shí)后給出最大值，而用新生霉素則在4小時(shí)后觀察到最大信號(hào)噪音比)。圖9和10中列出了這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果實(shí)例。
從這些結(jié)果可以看出，用含有pMOL890(sfiA-lux)或pMOL1067(recN 1,3-lux)的菌株，可在基因毒性化合物的混合物中檢測(cè)出至少兩種單個(gè)基因毒性化合物。這正好與所預(yù)期的情況相反，因?yàn)轭A(yù)期的是最大信號(hào)的增加而不是兩個(gè)單個(gè)的最大值。
還檢查了在以前實(shí)驗(yàn)中用MMS與新生霉素組合得到的數(shù)據(jù)是否會(huì)產(chǎn)生所用不同組合的基因毒性排序，并且這種排序是否與用不同的測(cè)試菌株[例如用TA98(pMOL1067)和TA104(pMOL890)]所得結(jié)果一樣。為此，計(jì)算所測(cè)試的每種組合的總信號(hào)/噪音比，然后將它們從低至高進(jìn)行排序。結(jié)果可見(jiàn)不同的測(cè)試菌株產(chǎn)生合理的、完全相同的排序。有關(guān)例子示于圖11和12中。毒性測(cè)試不同的構(gòu)建體在沒(méi)有基因毒性產(chǎn)物的情況下也產(chǎn)生本底光信號(hào)，這稱為噪音。這種噪音信號(hào)可用作檢測(cè)毒性而不是基因毒性化合物的度量信號(hào)。特別是認(rèn)為可顯示相對(duì)較高噪音的、含pMOL890和pMOL1068的菌株很適合于這種毒性測(cè)試(在4小時(shí)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中它們的噪音可從100升高到13000相對(duì)光單位)，而具有低噪音的含pMOL1066或pMOL1067的菌株則用處不大(在4小時(shí)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中它們的噪音從20升高到750相對(duì)光單位)。如圖13和14中所示，當(dāng)用不同濃度的毒性產(chǎn)物R116處理時(shí)，觀察到含有pMOL1067或pMOL1068的TA98菌株的發(fā)光量降低。
比較圖13和14可見(jiàn)，用TA98(pMOL1068)觀察到的信號(hào)/噪音比例遠(yuǎn)比用TA98(pMOL1067)所檢測(cè)到的更為恒定。由于菌株TA98(pMOL1068)有高得多的基礎(chǔ)發(fā)光量，所以發(fā)光量的測(cè)量中的誤差重要性不太大，進(jìn)而導(dǎo)致計(jì)算的信號(hào)/噪音數(shù)據(jù)的波動(dòng)也較小。菌株TA98(pMOL1068)，還有其他含有pMOL890或pMOL1068的菌株對(duì)于毒性產(chǎn)物的IC50計(jì)算值是很有用的。優(yōu)選的菌株將表現(xiàn)出至少與菌株TA98(pMOL1068)一樣的基礎(chǔ)發(fā)光量。環(huán)境樣品的測(cè)試因?yàn)閷?duì)純的產(chǎn)物所作測(cè)試顯示含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的菌株在測(cè)試潛在的環(huán)境污染物(如PAH)時(shí)比傳統(tǒng)的Ames測(cè)試更靈敏，所以使用這些菌株來(lái)測(cè)試環(huán)境樣品。給出的實(shí)例是-估測(cè)對(duì)PAH污染的土壤的生物除污-水溶性PAH降解產(chǎn)物的出現(xiàn)用500ppm混合物(含有萘、菲、蒽、熒蒽、芘和苯并-α-芘的Borneff混合物)污染土壤樣品。然后在生物反應(yīng)器中處理該土壤以刺激細(xì)菌降解PAH。為了估計(jì)對(duì)土壤的生物除污并檢查基因毒性的降低，在3周的期間內(nèi)取10g土壤樣品。用己烷(1ml/g土壤)提取這些樣品，并將提取物濃縮100倍。將濃縮的提取物稀釋1至8倍，并用于基因毒性測(cè)試中(有或沒(méi)有代謝激活)。作為(最高陽(yáng)性稀釋度時(shí)高于2的信號(hào)/噪音比)×(稀釋倍數(shù))的乘積計(jì)算每種樣品的基因毒性值。例如，如果稀釋4倍時(shí)發(fā)現(xiàn)信號(hào)/噪音比為2.8，則該樣品的基因毒性值為11.2。對(duì)基因毒性值作圖，這可對(duì)此被污染土壤的基因毒性作出很好的評(píng)價(jià)。圖15中給出了有關(guān)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
從圖15中可以看出，隨著時(shí)間的推移，PAH污染的土壤的基因毒性出現(xiàn)降低。這證明含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的菌株很適用于跟蹤和估測(cè)污染了基因毒性產(chǎn)物的土壤的生物除污效果。一般含具有誘導(dǎo)率高于40之SOS調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的序列的菌株均可用于本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，其中所說(shuō)的啟動(dòng)子與編碼報(bào)道分子的核酸序列有效相連，所編碼的報(bào)道分子會(huì)產(chǎn)生可以發(fā)光形式測(cè)定的信號(hào)。權(quán)利要求的任何宿主微生物均適用于這樣的測(cè)試中。
為了分析水溶性中間體PAH降解產(chǎn)物的生成，對(duì)菲、芴和熒蒽的降解進(jìn)行了檢測(cè)。為此，用0.1％PAH飽和未加額外碳源的基本M9培養(yǎng)基，并接種能夠降解PAH的菌株。每3天取出樣品(200ml)，并按照Grifoll等人(1994)的方法濃縮之。在pH2.5或pH7條件下進(jìn)行提取并將樣品濃縮至5ml。于37℃干燥每種樣品各1ml，并重新懸浮于100μl DMSO中。取其中1μl用于基因毒性測(cè)試中。觀察到菲的基因毒性先是增加，然后又降低；芴未顯示出基因毒性的明顯增加，但可見(jiàn)熒蒽的基因毒性增加。這表明有基因毒性中間體化合物的形成和聚積。圖16中給出了估測(cè)菌株LB208降解熒蒽的結(jié)果。只給出pH2.5條件下進(jìn)行提取的數(shù)據(jù)。
從該實(shí)驗(yàn)中可以看出，含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的菌株適用于估測(cè)基因毒性污染物的降解，以及基因毒性中間體降解產(chǎn)物的出現(xiàn)和聚積。總之，可將含具有誘導(dǎo)率高于20、優(yōu)選高于40、最優(yōu)選高于50之SOS調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的序列的菌株用于優(yōu)選實(shí)施方案中，其中所說(shuō)的啟動(dòng)子與編碼報(bào)道分子的核酸序列有效相連，所編碼的報(bào)道分子能產(chǎn)生可以發(fā)光形式測(cè)定的信號(hào)。權(quán)利要求的任一種宿主微生物均可適用于這樣的測(cè)試中。正如對(duì)gazoline污染之土壤的DMSO提取物的分析所證明的，也有可能對(duì)環(huán)境樣品進(jìn)行毒性測(cè)試。提取物的濃度越高使毒性越趨增加(數(shù)據(jù)未示出)。用recN-lux細(xì)菌測(cè)試基因毒性的標(biāo)準(zhǔn)操作方法1．引言該測(cè)試是基于含有作為SOS系統(tǒng)一部分的費(fèi)氏弧菌lux操縱子的細(xì)菌，其中所說(shuō)的lux操縱子處于recN基因的轉(zhuǎn)錄控制下。將細(xì)胞與基因毒性產(chǎn)物一起保溫后，recN啟動(dòng)子將解除阻抑，導(dǎo)致lux操縱子的表達(dá)。這種表達(dá)基因以毒性的函數(shù)形式產(chǎn)生發(fā)光。然而，使用sfiA-lux菌株完成的測(cè)試也按同樣的方法進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員也能夠使用這一方法，對(duì)本發(fā)明的含有SOS調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的其它系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試。
2．菌株-TA104 recN1-3-TA104 recN2-4-TA98 recN1-3-TA98 recN2-43．材料3.1培養(yǎng)基3.1.1869培養(yǎng)基(pH=7)每升去離子水含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g,NaCl 5g，葡萄糖D1g,CaCl2·2H2O 0.345g，半胱氨酸30mg。
將培養(yǎng)基于120℃高壓滅菌20分鐘。加入四環(huán)素(20μg/ml)和氨芐青霉素(100μg/ml)。將培養(yǎng)基貯存于4℃?zhèn)溆谩?br> 3.1.2貧瘠869培養(yǎng)基(pH=7)每升去離子水含有胰蛋白胨2g，酵母提取物1g,NaCl5g，葡萄糖D1g,CaCl2·2H2O 0.345g，半胱氨酸30mg。
3.2 S9成分3.2.1 S9使用標(biāo)準(zhǔn)方法從大鼠肝中得到芳氯物誘導(dǎo)的微粒體組分S9。可從藥廠得到之。
3.2.2 KCl/MgCl2溶液
KCl6.15g,MgCl2·6H2O 4.7g，加蒸餾水至100ml。高壓滅菌并于室溫下貯存。
3.2.3 0.1M β-NADPβ-NADP 500mg，加無(wú)菌蒸餾水6.53ml，以每份500μl于冷凍管中貯存于-20℃。
3.2.4 1M葡萄糖-6-磷酸(G6P)G6P 282mg，加無(wú)菌蒸餾水1ml，在冷凍管中貯存于-20℃。
3.2.5磷酸鹽緩沖液0.2M(pH=7.4)60ml 0.2M NaH2PO4·H2O,440ml 0.2M Na2HPO4，調(diào)pH至7.4并以100ml等份高壓滅菌，貯存于室溫下。
3.3化學(xué)物質(zhì)-DMSO疏水產(chǎn)物的溶劑-MMS未經(jīng)代謝情況下所作測(cè)試的陽(yáng)性對(duì)照-4NQO未經(jīng)代謝情況下測(cè)試疏水產(chǎn)物的陽(yáng)性對(duì)照-2AF經(jīng)S9代謝情況下所作測(cè)試的陽(yáng)性對(duì)照3.4設(shè)備96孔微量滴定板光度計(jì)，其為計(jì)算機(jī)控制的，可將數(shù)據(jù)記錄在工作行程紙上。
4．測(cè)試方法4.1培養(yǎng)物的維持和起始4.1.1維持刮下很少量冷凍的永久培養(yǎng)物并接種于25ml 869培養(yǎng)基(見(jiàn)3.1.1)中。在旋轉(zhuǎn)搖床(170rpm)上37℃培養(yǎng)過(guò)夜(ON)。次日早晨加入2.5mlDMSO。將細(xì)菌懸液分裝到冷凍試管中并于-80℃保存。取一個(gè)試管用于測(cè)試作為推薦為Ames菌株(rfa、pKM101等)的細(xì)菌。
4.1.2起始測(cè)試培養(yǎng)物用40μl細(xì)菌原液(見(jiàn)4.1.1)接種5ml 869培養(yǎng)基(見(jiàn)3.1.1)，并于37℃在旋轉(zhuǎn)搖床(170rpm)上培養(yǎng)過(guò)夜。次日早晨，將20μl過(guò)夜培養(yǎng)物接種于2.5ml貧瘠869培養(yǎng)基(見(jiàn)3.1.2)中。37℃晃動(dòng)(170rpm)下培養(yǎng)1小時(shí)。
4.2測(cè)試產(chǎn)物的稀釋4.2.1貯備溶液作為溶解度和所需最高濃度的函數(shù)選擇貯備液的濃度。在小瓶?jī)?nèi)稱入幾毫克產(chǎn)物(Amg)并加入所需體積(Vml)的溶劑，以得到所需的濃度(Smg/ml)，計(jì)算式為V=A/S。
4.2.2測(cè)試產(chǎn)物的稀釋向8個(gè)小瓶(1-8號(hào))內(nèi)各加入50μl溶劑(H2O或DMSO)。向1個(gè)小瓶(9號(hào))內(nèi)加入100μl貯備液。從9號(hào)小瓶轉(zhuǎn)移50μl至8號(hào)小瓶中，用取液器混合5次并取50μl轉(zhuǎn)移到7號(hào)小瓶?jī)?nèi)依此類推，直到2號(hào)小瓶。混合后從2號(hào)(#2)中棄去50μl。
向各小瓶?jī)?nèi)加入450μl貧瘠869培養(yǎng)基。從各小瓶取10μl轉(zhuǎn)入96孔板內(nèi)-從1號(hào)小瓶移入欄1、2和3(=溶劑對(duì)照)，-從2號(hào)小瓶移入欄4，從3號(hào)小瓶移入欄5，如此直到欄11。
4.2.3陽(yáng)性對(duì)照物的制備陽(yáng)性對(duì)照物的應(yīng)用參見(jiàn)3.3節(jié)。
2AF(8ppm)制備在DMSO中的6400ppm溶液；在50μl DMSO中兩倍稀釋直至800ppm；加入450μl貧瘠869培養(yǎng)基(=80ppm)；向孔E12、F12、G12、H12中各轉(zhuǎn)移10 l。
4NQO(4ppb)制備在DMSO中的1000ppm溶液；向40μl該溶液內(nèi)加入960μl DMSO(=40ppm)；向10μl該溶液內(nèi)加入990μl DMSO(=0.4ppm)；向50μl該0.4ppm溶液內(nèi)加入450μl貧瘠869培養(yǎng)基(=40ppb)；轉(zhuǎn)移10μl至孔A12、B12、C12、D12中。
MMS(16ppm)將5μl MMS加到995μl H2O(=6400ppm)；在50μl H2O中稀釋2倍直至1600ppm；向50μl該1600ppm溶液內(nèi)加入450μl貧瘠869培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)移10μl至孔A12、B12、C12、D12中。
4.3加或不加S9混合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)
4.3.1加S9混合物一般在加入到細(xì)菌中之前新鮮制備S9混合物在管中輕輕混合100μl KCl:MgCl2(3.2.2)、100μl β-NADP(3.2.3)、50μl G6P(3.2.4)、2500μl磷酸鹽緩沖液(3.2.5)、2500μl貧瘠869培養(yǎng)基(3.1.2)、132μl S9。-加入細(xì)菌輕輕混合140μl細(xì)菌懸液(4.1.2)、860μl貧瘠869培養(yǎng)基、400μl S9混合物。
轉(zhuǎn)移90μl至孔E1到E12:TA104 recN1-3孔F1到F12:TA104 recN2-4孔G1到G12:TA98 recN1-3孔H1到H12:TA98 recN2-44.3.2不加S9混合物向140μl細(xì)菌懸液(4.1.2)中加入1260μl貧瘠869培養(yǎng)基。
轉(zhuǎn)移90μl至孔A1到A12:TA104 recN1-3孔B1到B12:TA104 recN2-4孔C1到C12:TA98 recN1-3孔D1到D12:TA98 recN2-45．測(cè)定將96孔平板放在光度計(jì)上并開(kāi)始測(cè)定(1秒/孔；每循環(huán)一次300秒；60個(gè)循環(huán)；30℃)。
6．計(jì)算完成測(cè)定后，將數(shù)據(jù)貯存在工作進(jìn)程表上。將這組數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移到自動(dòng)計(jì)算信/噪比的大紙上，制作圖表并作出最后報(bào)告。
7．評(píng)價(jià)在下列情況下認(rèn)為產(chǎn)物是有基因毒性的1)至少在2個(gè)濃度下，信號(hào)/噪音比等于或高于2；
2)有清楚的劑量-效果反應(yīng)。參考文獻(xiàn)-Beck E.，和Bremer E.(1980)。編碼大腸桿菌K12的外膜蛋白Ⅱ*的ompA基因的核苷酸序列。核酸研究，8:3011-3027。-Finch P.W.,Chambers P.和Emmerson P.T.1985.大腸桿菌recN基因產(chǎn)物鑒定為主要的SOS蛋白。細(xì)菌學(xué)雜志，164:653-658。-Gee P.,Maron D.M.，和Ames B.N.(1994).突變劑的檢測(cè)和分類一套堿基特異性沙門(mén)氏菌測(cè)試菌株。美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，91:11606-11610。-Grifoll M.,Selifonov S.A.和Chapman P.J.(1994)。由假單胞菌種降解芴的新途徑的證據(jù)。應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)，60:2438-2449。-Maron D.M.和Ames B.N.(1983).沙門(mén)氏菌誘變性測(cè)試的改進(jìn)方法。突變研究，113:173-215。-Murray N.E.,Brammar W.J.和Murray K.(1977).可簡(jiǎn)化體外重組體回收的λ噬菌體。Mol.Gen Genet.,150:53-61。-Oda Y.,Nakamura S.,Oki I.,Kato T.和Stinagawa H.(1985)。檢測(cè)環(huán)境突變劑和致癌劑的新系統(tǒng)(umu測(cè)試)的評(píng)估。突變研究，147:219-229。-Peterson K.R.和Mount D.W.(1987).不穩(wěn)定的LexA41(Ts1-1)蛋白對(duì)SOS基因的分化阻抑導(dǎo)致大腸桿菌K12的分裂表型。分子生物學(xué)雜志，193:27-40。-Picksly S.M.,Morton S.J.和Lloyd R.G.(1985).大腸桿菌K12的recN位點(diǎn)其基因產(chǎn)物的分子分析和鑒定。Mol.Gen.Genet.,201:301-307。-Quillardet P.,Huisman O.,D′Ari.R.和Hofnung M.(1982).SOS顯色測(cè)試，一種在大腸桿菌K12中SOS功能誘導(dǎo)直接測(cè)定基因毒性的方法。美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，79:5971-5975。-Rostas K.,Morton S.J.,Picksley S.M.和Lloyd R.G.(1987).大腸桿菌recN基因的核苷酸序列和LexA調(diào)控。核酸研究，15:5041-5049。-Schnarr M.,Oertel-Buchheit P.,Karmaier M.和Granger-Schnarr M.(1991)LexA阻抑蛋白的DNA結(jié)合特性。Biochemie,73:423-431。
權(quán)利要求
1．包含誘導(dǎo)率高于40的SOS調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的重組核酸序列，所說(shuō)的啟動(dòng)子被有效地連接到編碼報(bào)道分子的核酸序列上，所編碼的報(bào)道分子能產(chǎn)生可以發(fā)光形式測(cè)定的信號(hào)。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的重組核酸序列，其中啟動(dòng)子選自一組由可在重組性修復(fù)期間被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子組成的SOS調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。
3．根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的重組核酸序列，其中啟動(dòng)子選自RecF、RecJ、RecN、RecF途徑的特殊成員、RecO、RecQ、ruv和uvrD。
4．根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的重組核酸序列，其中啟動(dòng)子是RecN(Seq.ID.No.3)。
5．根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的重組核酸序列，其中啟動(dòng)子含有可改善啟動(dòng)子強(qiáng)度或調(diào)節(jié)作用的突變，所說(shuō)的突變不破壞SOS調(diào)節(jié)作用。
6．根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的重組核酸序列，其中啟動(dòng)子含有至少一個(gè)活性LexA結(jié)合位點(diǎn)并在至少另一個(gè)LexA結(jié)合位點(diǎn)中具有突變。
7．根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的重組核酸序列，其中啟動(dòng)子含有至少一個(gè)活性LexA結(jié)合位點(diǎn)，并且在至少另一個(gè)LexA結(jié)合位點(diǎn)中具有突變，所說(shuō)的突變不改變野生型啟動(dòng)子序列。
8．根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的重組核酸序列，其中啟動(dòng)子是有下列核酸序列ID.No.7的突變RecN啟動(dòng)子(=rec1-3)。
9．根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的重組核酸序列，其中啟動(dòng)子含有啟動(dòng)子增效突變。
10．根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的重組核酸序列，其中啟動(dòng)子含有在所說(shuō)的啟動(dòng)子-35區(qū)域中的啟動(dòng)子增效突變。
11．根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的重組核酸序列，其中啟動(dòng)子是具有下列核酸序列ID.No.9的突變的RecN啟動(dòng)子(=rec2-4)。
12．根據(jù)權(quán)利要求1的重組核酸序列，其中啟動(dòng)子是sfiA。
13．根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的重組核酸序列，其中編碼報(bào)道分子的核酸序列中含有熒光素酶A和B基因。
14．根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的重組核酸序列，其中編碼報(bào)道分子的核酸序列中含有熒光素酶A和B基因，以及產(chǎn)生用于再循環(huán)的有限脂肪酸底物所需的熒光素酶C、D和E基因。
15．含有前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的重組核酸序列的宿主微生物。
16．根據(jù)權(quán)利要求15的宿主微生物，所說(shuō)的宿主微生物是大腸桿菌。
17．根據(jù)權(quán)利要求15的宿主微生物，所說(shuō)的宿主微生物是鼠傷寒沙門(mén)氏菌。
18．根據(jù)權(quán)利要求17的宿主微生物，所說(shuō)的宿主微生物還具有適當(dāng)?shù)腁mes測(cè)試微生物的特征。
19．根據(jù)權(quán)利要求17或18的宿主微生物，所說(shuō)的宿主微生物選自TA98、TA100、TA102、TA104、TA1535、TA1538、TA7001至TA7006，以及TA7041至TA7046。
20．檢測(cè)樣品中多種基因毒性化合物存在的方法，所說(shuō)的方法包括以下步驟-培養(yǎng)宿主微生物，所說(shuō)的宿主微生物包含帶有SOS調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的核酸序列，所說(shuō)的啟動(dòng)子被有效地連接到編碼報(bào)道分子的核酸序列上，所編碼的報(bào)道分子會(huì)產(chǎn)生可測(cè)定為光發(fā)生的信號(hào)，-測(cè)定培養(yǎng)物的發(fā)光，所說(shuō)的測(cè)定是在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行的，最好是連續(xù)地測(cè)定，并在所說(shuō)的時(shí)間點(diǎn)上檢測(cè)信號(hào)/噪音比，對(duì)所得數(shù)據(jù)作圖，所說(shuō)的數(shù)據(jù)代表所說(shuō)樣品的基因毒性動(dòng)力學(xué)，其中多個(gè)峰表明存在有多種具有不同誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)的基因毒性化合物。
21．檢測(cè)樣品中基因毒性化合物存在的方法，所說(shuō)的方法包括以下步驟-培養(yǎng)宿主微生物，所說(shuō)的宿主微生物包含帶有誘導(dǎo)率高于20的SOS調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的核酸序列，所說(shuō)的啟動(dòng)子被有效地連接到編碼報(bào)道分子的核酸序列上，所編碼的報(bào)道分子能產(chǎn)生可以發(fā)光形式測(cè)定的信號(hào)，-在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，最好是連續(xù)地測(cè)定培養(yǎng)物的發(fā)光，并-確定培養(yǎng)物的發(fā)光是否發(fā)生了改變，增加發(fā)光即表明存在基因毒性化合物。
22．檢測(cè)樣品的基因毒性動(dòng)力學(xué)的方法，所說(shuō)的方法包括完成權(quán)利要求21中所限定的步驟，其中在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上、最好是連續(xù)地測(cè)定發(fā)光，另外還完成下述步驟-在所說(shuō)的時(shí)間點(diǎn)上檢測(cè)發(fā)光的信號(hào)/噪音比，以及-將發(fā)光信號(hào)/噪音數(shù)據(jù)作圖，所說(shuō)的圖代表所說(shuō)樣品的基因毒性的動(dòng)力學(xué)。
23．根據(jù)權(quán)利要求20、21或22的方法，其中宿主微生物是根據(jù)權(quán)利要求15-19中任何一項(xiàng)的宿主微生物。
24．檢測(cè)樣品的基因毒性和誘變性的方法，所說(shuō)的方法包括完成權(quán)利要求23的方法，然后完成傳統(tǒng)的Ames測(cè)試。
25．檢測(cè)樣品中毒性化合物存在的方法，所說(shuō)的方法包括以下步驟-培養(yǎng)宿主微生物，所說(shuō)的宿主微生物是根據(jù)權(quán)利要求15-19中任何一項(xiàng)的宿主微生物，-測(cè)定培養(yǎng)物的發(fā)光，以及-確定培養(yǎng)物的發(fā)光是否發(fā)生了改變，發(fā)光降低即表明存在毒性化合物。
全文摘要
公開(kāi)了包含誘導(dǎo)率高于40的SOS調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的重組核酸序列,所說(shuō)的啟動(dòng)子被有效地連接到編碼報(bào)道分子的核酸序列上,所編碼的報(bào)道分子能產(chǎn)生可以發(fā)光形式測(cè)定的信號(hào)。還公開(kāi)了包含這樣的核酸序列的生物傳感器,以及使用這種生物傳感器檢測(cè)基因毒性和多種基因毒性化合物的存在的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1219974SQ96180308
公開(kāi)日1999年6月16日 申請(qǐng)日期1996年4月25日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月25日
發(fā)明者D·范德勒列, B·M·F·伯雷曼斯, A·I·A·普羅沃斯特, L·A·L·J·B·里格尼爾斯, L·P·E·沃斯查夫 申請(qǐng)人:佛蘭芒技術(shù)研究所