專利名稱：：通過(guò)半連續(xù)培養(yǎng)大量生產(chǎn)紫杉醇的方法
背景技術(shù)：
：發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及從紫杉屬植物細(xì)胞培養(yǎng)物中大量生產(chǎn)紫杉醇的方法，更具體地，本發(fā)明涉及通過(guò)半連續(xù)培養(yǎng)紫杉屬植物細(xì)胞以高產(chǎn)率大量生產(chǎn)紫杉醇的方法。
背景技術(shù)：
：紫杉烷(Taxane)是含有紫杉烷骨架的二萜類化合物，例如，眾所周知，紫杉醇是從太平洋紫杉屬短葉紫杉(Taxusbrevifolia)的樹(shù)皮中分離到的第一個(gè)已鑒定的帶有一個(gè)紫杉烷環(huán)的化合物，其對(duì)于白血病和癌癥有療效。最近已報(bào)道通過(guò)抑制微管的解聚，紫杉醇能分別治愈約30％卵巢癌患者、約50％乳腺癌患者和約20％肺癌患者(見(jiàn)E.K.Rowingsky等，國(guó)立癌癥研究院院刊821247-1259(1990))。另一方面，已采用全化學(xué)合成、半合成和提取方法制備紫杉醇。然而，全化學(xué)合成法尚未實(shí)際應(yīng)用，因?yàn)槠湫枰浅０嘿F的化學(xué)試劑并且收率也不是很高，這一點(diǎn)可從紫杉醇的復(fù)雜化學(xué)結(jié)構(gòu)預(yù)料到。采用前體如10-脫乙酰基漿果赤霉素III的半合成方法已被證明存在一些缺點(diǎn)，因?yàn)槠湫枰獜?fù)雜而繁多的從紫杉屬植物中分離和純化紫杉醇前體并將前體轉(zhuǎn)化成紫杉醇的步驟。考慮到這些方面，現(xiàn)有技術(shù)中主要采用經(jīng)濟(jì)的提取方法，通過(guò)該方法可直接從紫杉屬植物中分離紫杉醇。然而，所述方法已證明也存在令人不滿意之處，即其需要大量的紫杉樹(shù)來(lái)純化紫杉醇，由此最終導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境破壞。因此，用全化學(xué)合成、半合成和提取方法提供用于世界范圍的化學(xué)治療學(xué)用途的紫杉醇得不到保證，仍非常有必要開(kāi)發(fā)生產(chǎn)紫杉醇的其它方法。作為一種很有潛力的解決所述問(wèn)題的方法，細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的方法已在現(xiàn)有技術(shù)中有提議。不同于現(xiàn)有技術(shù)，基于細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)紫杉醇的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)首先，可以以穩(wěn)定的方式生產(chǎn)紫杉醇，而不受枯萎病和害蟲等導(dǎo)致供給的紫杉屬植物不穩(wěn)定的影響；第二，細(xì)胞培養(yǎng)物可在大的生物反應(yīng)器中繁殖，由此通過(guò)控制培養(yǎng)條件可以大量生產(chǎn)紫杉醇；第三，與其它現(xiàn)有技術(shù)方法相比，細(xì)胞培養(yǎng)物能生產(chǎn)光譜較簡(jiǎn)單的化合物，大大地簡(jiǎn)化了分離和純化過(guò)程；第四，細(xì)胞培養(yǎng)法可以比其它方法更好地迅速適應(yīng)需求量的快速變化；第五，細(xì)胞培養(yǎng)法可以生產(chǎn)紫杉醇以及能轉(zhuǎn)化為紫杉醇的紫杉烷前體如漿果赤霉素。現(xiàn)有技術(shù)中已描述了利用培養(yǎng)的植物細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇的方法USP5,019,504公開(kāi)了一種利用短葉紫杉的培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇及其衍生物的方法，然而，其中所述的紫杉醇產(chǎn)量為1-3mg/L，不足以工業(yè)應(yīng)用。另外，通過(guò)該細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)紫杉醇不穩(wěn)定，甚至即使通過(guò)選擇可獲得高產(chǎn)率的初級(jí)細(xì)胞，通過(guò)次級(jí)培養(yǎng)也很難保持其含量(見(jiàn)E.R.M.Wickremesine等，細(xì)胞和組織培養(yǎng)世界會(huì)議(1992))。USP5,015,744教導(dǎo)了一種從漿果赤霉素III(一種生物合成紫杉醇的前體)進(jìn)行半合成的方法，通過(guò)使用植物組織培養(yǎng)物，可以生產(chǎn)用于半合成方法的原料如漿果赤霉素III，因此，該植物組織培養(yǎng)物也可用于通過(guò)上述半合成方法生產(chǎn)紫杉醇。WQ93/17121提供了一種通過(guò)紫杉屬植物的細(xì)胞培養(yǎng)同時(shí)改變培養(yǎng)基的組成、生長(zhǎng)速率和生產(chǎn)速率等而生產(chǎn)紫杉醇的方法，在應(yīng)用中國(guó)紫杉(Taxuschinensis)的情況下，在生物量每2.5天加倍的18天的培養(yǎng)物中可獲得24.1mg/L的紫杉醇。所有這些專利描述的均是通過(guò)采用分批培養(yǎng)大量生產(chǎn)紫杉醇的方法，在所述的專利中沒(méi)有教導(dǎo)也沒(méi)有預(yù)期生產(chǎn)紫杉醇的細(xì)胞系的半連續(xù)培養(yǎng)。在這種情況下，USP5,407,816描述了將中國(guó)紫杉細(xì)胞接種到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中形成懸液，然后培養(yǎng)該懸液以形成懸浮培養(yǎng)物，該懸浮培養(yǎng)物又在其它營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中次級(jí)培養(yǎng)以形成生產(chǎn)培養(yǎng)物，該生產(chǎn)培養(yǎng)物最終以153mg/L的收率生產(chǎn)出紫杉醇和紫杉烷。所述的方法顯著提高了紫杉醇的產(chǎn)率，但是已證明該方法仍有不令人滿意之處，即其需要許多組成非常復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，并且高產(chǎn)率僅在相當(dāng)受限的生長(zhǎng)條件下才能達(dá)到。因此，仍需要開(kāi)發(fā)一種實(shí)用簡(jiǎn)便的生產(chǎn)紫杉醇的方法，該方法應(yīng)能滿足高產(chǎn)率的要求，而這一點(diǎn)是決定該方法能否適于工業(yè)應(yīng)用的主要因素。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)通過(guò)半連續(xù)培養(yǎng)一個(gè)新的生產(chǎn)紫杉醇的細(xì)胞系中國(guó)紫杉SYG-1可以高效生產(chǎn)紫杉醇。本發(fā)明的一個(gè)主要目的在于提供一種通過(guò)半連續(xù)培養(yǎng)大量生產(chǎn)紫杉醇的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一個(gè)從中國(guó)紫杉分離出的新的生產(chǎn)紫杉醇的細(xì)胞系。附圖的簡(jiǎn)述本發(fā)明的上述和其它目的和特征通過(guò)結(jié)合附圖的以下描述而變得清楚，其中圖1示出AgNO3對(duì)紫杉醇產(chǎn)率的影響的圖表。圖2示出檸檬酸銨對(duì)紫杉醇產(chǎn)率的影響的圖表。圖3示出麥芽糖對(duì)紫杉醇產(chǎn)率的影響的圖表。圖4示出在SYG-1半連續(xù)培養(yǎng)中的紫杉醇產(chǎn)率與培養(yǎng)循環(huán)的關(guān)系。發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明基于從中國(guó)紫杉誘導(dǎo)的愈傷組織第一次開(kāi)發(fā)出了一個(gè)紫杉醇生產(chǎn)細(xì)胞系，并將該細(xì)胞系與現(xiàn)有技術(shù)中已知的細(xì)胞系作了比較。從紫杉醇生產(chǎn)細(xì)胞系的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生長(zhǎng)條件的比較研究中確定該新開(kāi)發(fā)的細(xì)胞系是一個(gè)新的細(xì)胞系，其在紫杉醇產(chǎn)率、紫杉醇分泌模式等方面與現(xiàn)有技術(shù)中的細(xì)胞系有所不同。因此，該細(xì)胞系被命名為中國(guó)紫杉SYG-1(以下為方便起見(jiàn)稱為“SYG-1”)，其在1996年3月14日保藏于國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)(IDA)韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，入藏號(hào)為KCTC0232BP。隨后，本發(fā)明人優(yōu)化了本發(fā)明的細(xì)胞系的生長(zhǎng)條件，并確定SYG-1細(xì)胞在B5培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，更優(yōu)選是補(bǔ)加20μMNAA(萘氧基乙酸)、0.4μMBAP(6-芐基氨基嘌呤)、1g/L酪素水解物和30g/L蔗糖的B5培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為溫度24℃，搖瓶速度為150rpm。另外，還檢測(cè)了AgNO3、檸檬酸銨和麥芽糖對(duì)紫杉醇產(chǎn)率的影響，本發(fā)明人總結(jié)出添加這些物質(zhì)能顯著提高紫杉醇的產(chǎn)率。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)采用SYG-1的半連續(xù)培養(yǎng)可以高收率制備紫杉醇，該方法包括(i)將紫杉屬植物細(xì)胞接種到含1-10％(重量/體積)糖的培養(yǎng)基中并保溫培養(yǎng)；以及，(ii)將1/10-1/2體積的步驟(i)得到的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中并重復(fù)步驟(i)，向剩余的培養(yǎng)物中加入1-10％(重量/體積)糖并培養(yǎng)至紫杉醇最大產(chǎn)量時(shí)間。在開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)可以將AgNO3以1-15μM、優(yōu)選5-10μM的濃度加入到紫杉屬植物細(xì)胞培養(yǎng)物中并培養(yǎng)10-20天，更優(yōu)選10-15天。另外，可以在培養(yǎng)后5-30天、更優(yōu)選5-10天將檸檬酸銨和麥芽糖分別以1-15mM、更優(yōu)選1-10mM和1-10％(重量/體積)、更優(yōu)選1-5％(重量/體積)的濃度加入到培養(yǎng)物中。培養(yǎng)5-30天后，將1/10-1/2體積的總培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中開(kāi)始循環(huán)培養(yǎng)，該新鮮培養(yǎng)基的成分與培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)采用的培養(yǎng)基成分相同。然后，向相當(dāng)于總培養(yǎng)物的9/10-1/2體積的剩余的培養(yǎng)物中加入1-10％(重量/體積)、更優(yōu)選1-5％(重量/體積)麥芽糖，培養(yǎng)30-60天，此時(shí)紫杉醇產(chǎn)量達(dá)到最高，培養(yǎng)溫度為24℃、搖瓶速度為150rpm，并在暗處培養(yǎng)。本發(fā)明方法中所用的紫杉屬植物包括短葉紫杉，加拿大紫杉(Taxuscanadensis)，東北紫杉(Taxuscuscidata)，歐洲紫杉(Taxusbaccata)，Taxusglobosa，佛羅里達(dá)紫杉(Taxusfloridana)，喜馬拉雅紫杉(Taxuswallichiana.)，Taxusmedia和中國(guó)紫杉，然而，最優(yōu)選采用的是本發(fā)明人新開(kāi)發(fā)的中國(guó)紫杉SYG-1。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)采用中國(guó)紫杉SYG-1半連續(xù)培養(yǎng)并添加提高紫杉醇產(chǎn)率的AgNO3、檸檬酸銨和麥芽糖時(shí)，在培養(yǎng)42-49天后觀察到紫杉醇的產(chǎn)率達(dá)到300mg/L的水平。紫杉醇的定量分析在下表1所述的具體條件下，用高效液相色譜定量分析根據(jù)本發(fā)明的方法從中國(guó)紫杉SYG-1培養(yǎng)物中生產(chǎn)的紫杉醇。表1紫杉醇定量分析的條件</tables>在下述實(shí)施例中將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，實(shí)施例不應(yīng)看作是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例1從中國(guó)紫杉中誘導(dǎo)并鑒定愈傷組織通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)方式從中國(guó)紫杉中分離本發(fā)明的細(xì)胞系，當(dāng)植物組織在含有激素的合適的培養(yǎng)基上溫育時(shí)會(huì)誘導(dǎo)出未分化的愈傷組織細(xì)胞用自來(lái)水清洗中國(guó)紫杉的樹(shù)皮、針葉、莖和根并用次氯酸鈣溶液消毒20-30分鐘，隨后，用蒸餾水清洗消毒的組織2-3次并截短至1cm長(zhǎng)，在用0.2％(重量/重量)明膠(gelite)固定化后轉(zhuǎn)移到補(bǔ)加20μMNAA(萘氧基乙酸)、0.4μMBAP(6-芐基氨基嘌呤)、1g/L酪素水解物和30g/L蔗糖的B5培養(yǎng)基中，并在暗處于24-26℃溫育2-6周以誘導(dǎo)所需的愈傷組織。通過(guò)將愈傷組織分別轉(zhuǎn)移到現(xiàn)有技術(shù)中公知的幾種培養(yǎng)基中，例如MS(見(jiàn)Murashige，T.和F.Skoog，F(xiàn).，植物生理學(xué)，5473(1962))，SH(見(jiàn)Schenk和Hilderbrandt，加拿大植物學(xué)雜志，50199-204(1972))，WPM(見(jiàn)Lloyd和Mccown，Int.PlantProp.Soc.Proc.，30421-427(1981))和B5培養(yǎng)基(見(jiàn)上述)，并肉眼觀察愈傷組織的生長(zhǎng)模式而選擇愈傷組織的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。從上述結(jié)果可以確定愈傷組織在含20μMNAA、0.4μMBAP和2g/L酪素水解物的B5培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。隨后，對(duì)如此誘導(dǎo)的細(xì)胞系進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生長(zhǎng)條件的研究，并與現(xiàn)有技術(shù)中公知的細(xì)胞系進(jìn)行比較，結(jié)果示于表2和表3。如表2和表3所示，可以確定本發(fā)明開(kāi)發(fā)的細(xì)胞系在紫杉醇產(chǎn)率和紫杉醇分泌模式等方面明顯區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)中的細(xì)胞系。因此，該細(xì)胞系被命名為中國(guó)紫杉SYG-1，并在1996年3月14日保藏于國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)(IDA)韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，入藏號(hào)為KCTC0232BP。表2中國(guó)紫杉SYG-1的形態(tài)學(xué)和生長(zhǎng)條件</tables>表3本發(fā)明的細(xì)胞系與現(xiàn)有技術(shù)的細(xì)胞系的特征比較</tables>實(shí)施例2SYG-1的懸浮培養(yǎng)為選擇用于SYG-1懸浮培養(yǎng)的最優(yōu)選的培養(yǎng)基，將細(xì)胞系分別轉(zhuǎn)移到MS、SH、WPM和B5培養(yǎng)基中，與實(shí)施例1類似觀察生長(zhǎng)模式，其結(jié)果是，與愈傷組織類似，SYG-1細(xì)胞在含20μMNAA、0.4μMBAP和2g/L酪素水解物的B5培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。另外，還確定了SYG-1細(xì)胞在24℃的培養(yǎng)溫度和150rpm的搖瓶速度下生長(zhǎng)良好。在固化培養(yǎng)基的情況下每4周進(jìn)行愈傷組織的系列培養(yǎng)，同時(shí)借助于鑷子將部分轉(zhuǎn)移將一片愈傷組織保留在固體培養(yǎng)基平板上。隨后將保留在固體培養(yǎng)基上的愈傷組織接種到少量B5培養(yǎng)基中，并且隨著細(xì)胞生長(zhǎng)至增加培養(yǎng)物的總體積，向其中補(bǔ)加少量培養(yǎng)基。而后以1/5(體積/體積)的比率將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞系在裝于500mlErlenmeyer培養(yǎng)瓶中的改良的B5培養(yǎng)基中稀釋，并每2周接種到懸浮培養(yǎng)基中。實(shí)施例3AgNO3對(duì)紫杉醇產(chǎn)率的影響業(yè)已熟知AgNO3是作用于植物細(xì)胞生長(zhǎng)和二級(jí)代謝物產(chǎn)生的植物激素乙烯的拮抗劑，因此，本發(fā)明測(cè)試了AgNO3對(duì)SYG-1懸浮培養(yǎng)中紫杉醇的生產(chǎn)的影響。向-250ml錐形培養(yǎng)瓶中加入75ml含10μMAgNO3的B5培養(yǎng)基，將25ml14天的細(xì)胞培養(yǎng)物接種到此培養(yǎng)基中并以實(shí)施例2所述類似的方式培養(yǎng)，然后，將紫杉醇的產(chǎn)率與不含AgNO3的對(duì)照進(jìn)行對(duì)比(見(jiàn)圖1)。如圖1所示，可以很清楚地確定，當(dāng)向培養(yǎng)基中加入AgNO3時(shí)紫杉醇的產(chǎn)率98.95mg/L(-●-)是對(duì)照(-○-)的4.7倍。實(shí)施例4檸檬酸銨對(duì)紫杉醇產(chǎn)率的影響在加入檸檬酸銨后監(jiān)測(cè)SYG-1懸浮培養(yǎng)物中的紫杉醇產(chǎn)率。向-250mlErlenmeyer培養(yǎng)瓶中加入75mlB5培養(yǎng)基，將25ml14天的細(xì)胞培養(yǎng)物接種到此培養(yǎng)基中并以實(shí)施例2所述相同的生長(zhǎng)條件培養(yǎng)，然后，在培養(yǎng)9天后向培養(yǎng)物中加入5mM檸檬酸銨，將紫杉醇的產(chǎn)率與未加檸檬酸銨的對(duì)照進(jìn)行對(duì)比(見(jiàn)圖2)。如圖2所示，可以確定，當(dāng)向培養(yǎng)基中加入檸檬酸銨時(shí)紫杉醇的產(chǎn)率約為103.6mg/L(-●-)，其是對(duì)照(-○-)的4.9倍。實(shí)施例5麥芽糖對(duì)紫杉醇產(chǎn)率的影響已熟知在植物細(xì)胞培養(yǎng)物中提高糖的濃度能導(dǎo)致二級(jí)代謝物的增加，例如，據(jù)報(bào)道在野胡蘿卜(Daucuscarota)的愈傷組織培養(yǎng)物中加入3％(重量/體積)蔗糖和5％(重量/體積)甘露醇提高了單花青苷(antocyanin)的產(chǎn)率(見(jiàn)Knobloch，K.-H.等，ZeiteshriftfurNatruforschung，35c55-556(1981))；在葡萄(Vitisvinifera)的懸浮培養(yǎng)物中加入88mM蔗糖和165mM甘露醇提高了單花青苷的產(chǎn)率(見(jiàn)Rajendran，L等，BiotechnologyLetters，14(8)707-712(1992))。另一方面，還報(bào)道了當(dāng)糖的加入量超過(guò)一定濃度時(shí)生長(zhǎng)和二級(jí)代謝物的產(chǎn)量均下降，這可能是由于滲透應(yīng)力造成(見(jiàn)DO，C.B.和Cormier，F(xiàn).，PlantCellReports，9500-504(1990))。評(píng)價(jià)麥芽糖加入到SYG-1中的效果。向一250ml錐形培養(yǎng)瓶中加入75mlB5培養(yǎng)基，將25ml14天的細(xì)胞培養(yǎng)物接種到此培養(yǎng)基中并以實(shí)施例2所述相同的生長(zhǎng)條件培養(yǎng)，然后，分別在培養(yǎng)9天和21天后向培養(yǎng)物中加入2％(重量/體積)和3％(重量/體積)麥芽糖，將紫杉醇的產(chǎn)率與不含麥芽糖的對(duì)照進(jìn)行對(duì)比(見(jiàn)圖3)。如圖3所示，可以確定，當(dāng)向培養(yǎng)基中加入麥芽糖時(shí)紫杉醇的產(chǎn)率約為112.75mg/L(-●-)，其是對(duì)照(-○-)的5.3倍。實(shí)施例6SYG-1的半連續(xù)培養(yǎng)基于實(shí)施例2-5得到的結(jié)果，采用SYG-1的半連續(xù)培養(yǎng)制備紫杉醇。向一250ml錐形培養(yǎng)瓶中加入80mlB5培養(yǎng)基和20ml14天的細(xì)胞培養(yǎng)物，在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)加入10μMAgNO3，然后，在培養(yǎng)9天后向培養(yǎng)物中加入5mM檸檬酸銨和2％(重量/體積)麥芽糖，培養(yǎng)21天后，將相當(dāng)于總培養(yǎng)物1/5體積的20ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到另一含80ml新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中開(kāi)始另一培養(yǎng)循環(huán)。隨后，向相當(dāng)于總培養(yǎng)物4/5體積的80ml剩余培養(yǎng)物中加入3％(重量/體積)麥芽糖，并再培養(yǎng)21天，此時(shí)紫杉醇產(chǎn)量達(dá)到最大。此時(shí)，培養(yǎng)溫度設(shè)定為24℃，搖瓶速度為150rpm。定期從培養(yǎng)物中取樣以檢測(cè)微生物污染，并且如上所述采用高效液相色譜(HPLC，Waters，U.S.A.)測(cè)定培養(yǎng)物中紫杉醇的產(chǎn)量。結(jié)果是，未觀察到微生物污染并且培養(yǎng)42天后紫杉醇的產(chǎn)率為284mg/L(見(jiàn)圖4)，如圖4所示，紫杉醇的濃度隨著培養(yǎng)循環(huán)的重復(fù)而增加。如上所述，本發(fā)明提供了以高產(chǎn)率通過(guò)半連續(xù)培養(yǎng)紫杉屬植物而大量生產(chǎn)紫杉醇的方法，根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)在半連續(xù)培養(yǎng)中采用中國(guó)紫杉SYG-1并添加提高紫杉醇產(chǎn)率的AgNO3、檸檬酸銨和麥芽糖時(shí)，在培養(yǎng)40-50天后觀察到紫杉醇的產(chǎn)率達(dá)到300mg/L的水平。權(quán)利要求1.一種通過(guò)半連續(xù)培養(yǎng)大量生產(chǎn)紫杉醇的方法，包括下述步驟(i)將紫杉屬植物細(xì)胞接種到含1-10％(重量/體積)糖的培養(yǎng)基中并保溫培養(yǎng)；以及，(ii)將1/10-1/2體積的步驟(i)得到的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中并重復(fù)步驟(i)，向剩余的培養(yǎng)物中加入1-10％(重量/體積)糖并培養(yǎng)至紫杉醇最大產(chǎn)量時(shí)間。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的紫杉屬植物選自由短葉紫杉，加拿大紫杉，東北紫杉，歐洲紫杉，Taxusglobosa，佛羅里達(dá)紫杉，喜馬拉雅紫杉，Taxusmedia和中國(guó)紫杉組成的一組。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的紫杉屬植物細(xì)胞是中國(guó)紫杉SYG-1(KCTC0232BP)。4.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在開(kāi)始細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)以1-15μM的濃度向培養(yǎng)基中加入AgNO3的步驟。5.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在培養(yǎng)5-30天后分別以1-15mM和1-10％(重量/體積)的濃度向培養(yǎng)基中加入檸檬酸銨或麥芽糖或同時(shí)加入兩者的步驟。6.權(quán)利要求1的方法，其中紫杉醇的最大產(chǎn)量時(shí)間是從開(kāi)始細(xì)胞培養(yǎng)后40-50天。全文摘要本發(fā)明涉及以高產(chǎn)率通過(guò)半連續(xù)培養(yǎng)紫杉屬植物而大量生產(chǎn)紫杉醇的方法，根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)采用紫杉屬植物細(xì)胞的半連續(xù)培養(yǎng)可以高產(chǎn)率制備紫杉醇，所述的方法包括(i)將紫杉屬植物細(xì)胞接種到含1-10％(重量/體積)糖的培養(yǎng)基中并保溫培養(yǎng)；以及，(ii)將1/10-1/2體積的步驟(i)得到的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中并重復(fù)步驟(i)，向剩余的培養(yǎng)物中加入1-10％(重量/體積)糖并培養(yǎng)至紫杉醇最大產(chǎn)量時(shí)間。文檔編號(hào)C12R1/91GK1153533SQ96190419公開(kāi)日1997年7月2日申請(qǐng)日期1996年4月27日優(yōu)先權(quán)日1995年4月27日發(fā)明者崔亨均,湯姆·李·亞當(dāng)斯,羅伊·威廉·斯塔爾赫特,金尚翼,尹晶煥,宋鳳圭,金鎮(zhèn)鉉,宋準(zhǔn)錫,洪承緒,李賢秀申請(qǐng)人:(株)三養(yǎng)吉尼克斯