專利名稱：編碼谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶的脫氧核糖核酸及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新穎的脫氧核糖核酸(DNA)及其在載體，宿主生物體與植物的轉(zhuǎn)化，并且產(chǎn)生對除草劑抗性提高的植物中的應用。
目前已經(jīng)公開了植物的基因修飾，從而它們具有對具體的除草劑提高的抗性。這使得采用具有低選擇性但在一些植物的作物中具有其它有益特性的除草劑是可能的，其中的植物在最初非轉(zhuǎn)基因形式下將受到這些除草劑的損傷。因此，抗除草劑植物的提供提高了所能使用的除草劑的選擇性，并且在許多情況下它也可能與相對低的除草劑的應用量有關(guān)，例如當達到特殊的殺傷限度時，是否對不想要的植物的控制僅僅發(fā)生在它們出現(xiàn)以后。因此，相當有必要生產(chǎn)出具有對其它除草劑的抗性提高的新穎的作物植物。
谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶為多功能蛋白，該蛋白對細胞毒物質(zhì)的解毒貢獻非常之大。該酶催化被還原的谷胱甘肽與親電子的疏水底物相結(jié)合，其中該底物來源可以是天然的或合成的。
在植物體中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的生理學底物及其在植物代謝中的作用所知并不詳細。但是，已經(jīng)證實這些酶涉及解毒并且因此涉及許多重要除草劑的選擇性的機理，其中的除草劑選自硫代氨基甲酸鹽，乙酰氯苯胺與S-triacines的組中Mozer T.J.，Tiemeier D.C.，JaworskiE.G.，生物化學，221068-1072(1983)；Moore R.E.，DaviesM.S.，O’Connell K.M.，Harding E.I.，Wiegand R.C.，Tiemeier D.C.，Nucleic Acids Res.147227-7235(1983)；Grove G.，ZarlengoR.P.，Timmermann K.P.，Li N.，Tam M.F.，Tuc C.P.D.，Nucleic Acids Res.16425-438(1988)。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一種編碼新的蛋白質(zhì)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶III c(下文為“GST III c”)的新的脫氧核糖核酸，其具有列于SEQ ID NO2中的氨基酸序列(根據(jù)本發(fā)明的新的DNA下文稱作“GST III c DNA”)。
進一步，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與相應的“起始植物”相比，將新的GST III c DNA插入到其基因組中的植物對除草劑，其中優(yōu)選雜芳氧基乙酰胺除草劑的抗性有所提高。
新的GST III c DNA是從Mutin變種的玉米(Zea mais)中分離出來的。該DNA以顯示在SEQ ID NO2中的氨基酸序列編碼蛋白GSTIII c。在植物細胞中，2分子的蛋白GST III c自發(fā)地形成二聚活性酶(下文稱作“GST III c酶”)，該酶確保所使用的除草劑的解毒并且因此使得該植物對除草劑具有抗性。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的GST III cDNA具有列于SEQ ID NO1中的序列。
根據(jù)本發(fā)明同樣優(yōu)選的是如包含在下文所描述的載體質(zhì)粒pET3a-GST III c與pSS-GST III c上的GST III cDNA。
新的GST III c DNA可以呈單鏈的形式或是呈額外地含有一條互補于該特殊的單鏈的鏈的雙鏈形式。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，GST III c DNA具有一個在5’末端上游插入的、在植物中有效的啟動子。在植物體中通常有效的啟動子可以用于這一目的。可提到的一個實例為核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(rbsc)的小的亞單位的基因啟動子(參見EMBO雜志，第五卷，第九期，2063-2071頁(1986))。優(yōu)選采用來自植物病毒的啟動子，例如所提到的CaMV 35S RNA啟動子。特別優(yōu)選使用沿著5’-3’序列的CaMV 35S增強子與CaMV 35S啟動子的已知的構(gòu)建物(“CaMV35S雙啟動子”)。一個相對應的優(yōu)選的GST III c DNA與CaMV雙啟動子的構(gòu)建物存在于下文所解釋的載體質(zhì)粒pSS-GST III c上。但是，也有可能使用調(diào)節(jié)玉米，Mutin變種中GST III c DNA表達的天然啟動子。
在5’-3’序列跟隨GST III c DNA的3’終止序列的性質(zhì)變化非常之大并且對本發(fā)明并非至關(guān)重要。優(yōu)選采用植物3’-終止序列。也有可能采用例如從玉米，Mutin變種中衍生的GST III c基因的天然終止序列。
同樣，本發(fā)明的一部分為具有顯示在SEQ ID NO2中的氨基酸序列的新的蛋白GST III c及其同樣的新的二聚物(GST III c酶)，該二聚物如上面已經(jīng)提及的，它是在植物細胞內(nèi)蛋白GST III c形成之后自發(fā)地從2分子的蛋白GST III c生成的。
根據(jù)本發(fā)明的DNA與根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)(其中以合適的二聚體的形式存在)在每種情況下也分別包括從這種DNA和這種蛋白質(zhì)衍生的DNA序列與蛋白質(zhì)序列。具有衍生的序列的DNA與蛋白質(zhì)試圖意味著這樣的DNA與蛋白質(zhì)，它們?nèi)匀环謩e具有GST III c DNA與蛋白GSTIII c(其中以合適的二聚體的形式存在，即GST III c酶)的本質(zhì)特征，并且因此在本質(zhì)上具有同樣的效果，也即在植物中產(chǎn)生對根據(jù)本發(fā)明的除草劑達到足夠程度的抗性。在如此衍生的序列中，單個的DNA，密碼子和/或DNA部分序列或單個氨基酸或氨基酸的部分序列的缺失(就DNA而言，例如通過使用限制酶)和/或被具有在本質(zhì)上效果相同的其它DNA，密碼子與DNA的部分序列或氨基酸或氨基酸的部分序列所替代是有可能的。由于基因密碼的簡并或由GST III c DNA或蛋白GST IIIc或GST III c酶調(diào)控的結(jié)果，這些類型的修飾可能是存在的。根據(jù)本發(fā)明的DNA也可以含有促進其調(diào)控的DNA，密碼子或DNA序列，例如所謂的接頭或在調(diào)控之后從這樣的接頭中所保留的(例如用限制酶切割后)。
GST III c DNA與蛋白GST III c或GST III c酶可以是天然來源的或者部分地或完全地呈合成的形式。
本發(fā)明的一部分也為一種重組的原核生物或真核生物的DNA，其中該DNA含有新的GST III c DNA或一種從作為“外源”或“添加”DNA中衍生的DNA?？梢蕴岬降膶嵗秊椴《綝NA，微生物DNA(特別是細菌DNA，諸如來自于大腸桿菌或根瘤農(nóng)桿菌的DNA)與植物DNA。
根據(jù)本發(fā)明的GST III c DNA與由此衍生的DNA序列，以及重組的原核生物或真核生物的DNA與由此衍生的DNA序列可以作為“外源”或“添加”DNA包含在載體(特別是質(zhì)粒，粘?；蚴删w)，經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)基因微生物(優(yōu)選諸如大腸桿菌或根瘤農(nóng)桿菌等細菌)以及經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)基因的植物細胞與植物或其DNA中。這些載體，微生物，植物細胞和植物及其DNA成為本發(fā)明的一部分。與重組的原核生物與真核生物的DNA一樣，通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員采用本發(fā)明所描述的知識，特別是SEQ ID NO1與SEQ ID NO2，通過通常已知和/或常規(guī)的步驟與方法可以得到它們。
可以作為特別優(yōu)選所提到的載體為載體質(zhì)粒pET3a-GST III c與pSS-GST III c。這兩種載體都含有根據(jù)本發(fā)明顯示在SEQ ID NO1中的GST III c DNA。
質(zhì)粒pET3a-GST III c在NdeI/BamHI片段上含有GST III c DNA。為了構(gòu)建這一質(zhì)粒，將顯示在SEQ ID NO1中的GST III c DNA克隆(Studier F.W.，Moffatt B.A.，J.Mol.Biol. 189113-130；Studier F.W.，J.Mol.Biol.，21937-44(1991))到載體pET-3a的NdeI與BamHI的切割位點上(Novagen/Madison)。在

圖1中描繪了這一質(zhì)粒(5306bps)。箭頭的方向表示啟動子與基因，以及具有起始密碼子ATG的GST III c DNA的方向?！癆mp”代表α-氨基芐青霉素的抗性基因。
為了構(gòu)建質(zhì)粒pSS-GST III c，從載體pET3a-GST III c中純化GSTIII c DNA作為XbaI/BamHI片段并且將之克隆到質(zhì)粒Bluescript-SKII(XbaI/BamHI-線性化；Stratagene)中。隨后從以這種方式衍生的質(zhì)粒Bluescript SKII-GST III c中，通過SstI/SmaI限制性切割分離出GST III cDNA，并且將其連接至載體pRT101(SstI/SmaI-線性化；Topfer等人，1987)上。然后從以這種方式衍生的載體pRT101-GSTIII c中純化GST III c DNA作為EcoRI/SmaI片段并且將之克隆到二元載體pSS(EcoRI/SmaI-線性化；Voβ等人，1994)。在結(jié)果衍生的載體pSS-GST III c中，編碼GST III c DNA是在從CaMV中的一個經(jīng)復制的35S RNA啟動子的控制下進行的。質(zhì)粒pSS-GST III c(10000pbs)如圖2所描繪。
如果有需要的話，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過一般常規(guī)的步驟與方法從所說的質(zhì)粒中分離出根據(jù)本發(fā)明的GST III c DNA。
根據(jù)本發(fā)明，可以稱作特別優(yōu)選的經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)基因的微生物為大腸桿菌菌株DS pET3a-GST III c與DS pSS-GST III c及其突變體。菌株DS pET3a-GST III c含有質(zhì)粒pET3a-GST III c并且菌株DS pSS-GSTIII c含有質(zhì)粒pSS-GST III c。根據(jù)本發(fā)明的突變體為仍然含有可以進行本發(fā)明的本質(zhì)特征的那些微生物，也即特別仍然含有質(zhì)粒pET3a-GST III c和/或pSS-GST III c或由此衍生的DNA序列。這些菌株可以通過一般常規(guī)的方法生長。同樣，質(zhì)粒pET3a-GST III c與pSS-GSTIII c能夠通過一般常規(guī)的方法從這些微生物中分離出來。
遵照關(guān)于用于專利程序目的的微生物保藏的國際認可的布達佩斯條約的條款，大腸桿菌菌株pET3a-GST III c保藏在Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen(DSM)，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，德意志聯(lián)邦民主共和國(保藏日1995年1月1 7日)。該菌株所給的保藏號為DSM 9677。
正如上面已經(jīng)解釋的，本發(fā)明也包括轉(zhuǎn)基因植物與植物細胞(包括原生質(zhì)體)以及來自于這些轉(zhuǎn)基因植物中的植物體的一部分(諸如愈傷組織，葉，莖，花，花的一部分，根，塊莖，種子及其它的繁殖材料)，這些植物在其基因組中包含GST III c DNA或由此衍生的DNA序列和/或根據(jù)本發(fā)明作為“外源”或“添加”DNA的重組的原核生物或真核生物的DNA。
根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物也包括根據(jù)本發(fā)明可以衍生的轉(zhuǎn)基因植物的子代以及與其它的植物及其子代交配的產(chǎn)物，而只要這些轉(zhuǎn)基因植物含有GST III c DNA或由此衍生的作為“外源”或“添加”DNA的DNA序列。
優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物為那些在其基因組中含有如在SEQ ID NO1中顯示的作為“外源”或“添加”DNA的GST III c DNA的植物。
特別優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物為那些在其基因組中含有CaMV 35S雙啟動子和顯示在SEQ ID NO1中作為“外源”或“添加”DNA的GSTIII cDNA的構(gòu)建物的植物。
非常特別優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物為那些在其基因組中含有在SEQ IDNO1中顯示的GST III c DNA和/或CaMV 35S雙啟動子與顯示在SEQ ID NO1中作為“外源”或“添加”DNA的GST III c DNA的構(gòu)建物的植物。除了玉米變種Mutin以外，迄今尚未公開在其基因組中含有相對應于GST III c DNA的DNA的植物。
鑒于本發(fā)明，“外源”DNA試圖意味著一種并非天然存在于具體的原核生物或真核生物(包括植物)的基因組中而是僅僅通過人類的干預(轉(zhuǎn)化)在這一基因組中所插入的DNA。“添加”DNA為一種盡管已經(jīng)存在于特殊的原核生物或真核生物的基因組中，但卻通過人工干預(轉(zhuǎn)化)在這一基因組中以添加量插入的DNA?！巴庠础被颉疤砑印盌NA可以有賴于需要以及特殊情況的性質(zhì)插入一個或多個拷貝。
正如已經(jīng)解釋的，本發(fā)明的主要目的為生產(chǎn)出具有對除草劑，優(yōu)選雜芳氧基乙酰胺除草劑的抗性提高的新的植物。
因此，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的新的轉(zhuǎn)基因植物為與相應的非轉(zhuǎn)基因植物相比，除了具有上述性質(zhì)以外(“外源”或“添加”GST III c DNA的內(nèi)含物)，還對除草劑，特別是對雜芳氧基乙酰胺除草劑的抗性提高的那些植物。因此，可以用除草劑處理這些轉(zhuǎn)基因植物的作物，以便在不損傷作物植物的情況下控制不想要的植物。
對于農(nóng)業(yè)與林業(yè)，對于觀賞植物的培養(yǎng)，藥用植物的培養(yǎng)以及植物繁殖而言，根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細胞與植物對除草劑抗性的提高是重要的。
因此，本發(fā)明也涉及一種用于生產(chǎn)具有對除草劑抗性提高的轉(zhuǎn)基因植物細胞(包括原生質(zhì)體)與植物(包括植物的一部分以及種子)的方法，其特征在于(a)把GST III c DNA和/或根據(jù)本發(fā)明的含有編碼蛋白GST IIIc的GST III c DNA的重組DNA的一個或多個拷貝插入到植物細胞(包括原生質(zhì)體)中，并且在合適的時候，(b)從轉(zhuǎn)化的植物細胞(包括原生質(zhì)體)中再生出完整的轉(zhuǎn)化植物，并且在合適的時候?qū)⑵湓鲋?，并且在合適的時候，(c)從以這種方式衍生的親代或由此衍生的下一代的轉(zhuǎn)基因植物中獲得所需要的植物的部分(包括原生質(zhì)體)。
方法步驟(a)，(b)與(c)能夠以常規(guī)的方式通過已知的步驟與方法進行。
含有一倍或多倍的作為“外源”或“添加”DNA的GST III c DNA的轉(zhuǎn)基因植物(包括原生質(zhì)體)與植物(包括植物的一部分與種子)以及那些通過上面的方法可以衍生的轉(zhuǎn)基因植物細胞與植物同樣也形成本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明的一部分也為(a)GST III c DNA和/或根據(jù)本發(fā)明的重組DNA和/或根據(jù)本發(fā)明的重組載體和/或根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化微生物在轉(zhuǎn)化植物細胞(包括原生質(zhì)體)與植物(包括植物的一部分與種子)中的應用，(b)根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細胞(包括原生質(zhì)體)與植物(包括植物的一部分與種子)來生產(chǎn)繁殖材料并且生產(chǎn)出新的植物及其繁殖材料中的應用，(c)包含在質(zhì)粒pET3a-GST III c中的cDNA或其部分的cDNA以及對應于顯示在序列表SEQ ID NO1中的序列信息的DNA序列在確定植物體中以及(通常)轉(zhuǎn)基因植物細胞(包括原生質(zhì)體)與植物(包括植物的一部分與種子)的生產(chǎn)中編碼GST III c蛋白或GST III c酶的DNA的應用，以及由pET3a-GST IIIc的GST III c DNA編碼的蛋白質(zhì)序列及顯示在SEQ ID NO2中的蛋白質(zhì)在分離和檢測GST III c DNA(例如通過常規(guī)的抗體技術(shù))中的應用。
有許多不同的方法可用于將GST III c DNA作為“外源”或“添加”DNA插入到植物或植物細胞的基因物質(zhì)中，其中該GST III c DNA適合于作為與CaMV 35S雙啟動子的構(gòu)建物。通過一般常規(guī)已知的方法，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠在每一種情況下毫不費力地制定出合適的方法進行該基因轉(zhuǎn)化。
根瘤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)?？梢杂米鬏d體，該載體特別合適并且能夠廣泛用于轉(zhuǎn)化“外源”或“添加”DNA至雙子葉與單子葉植物的基因組中。編碼蛋白GST III c的基因物質(zhì)在合適的時候與調(diào)控DNA序列一起插入到合適的Ti質(zhì)粒的T DNA中(例如Zambryski等人，1983)，并且通過感染植物，感染植物或植物組織的一部分(諸如，例如葉盤(leaf discs)，莖，下胚軸，子葉，分生組織及其由此衍生的組織，所衍生的組織諸如例如次級胚胎與愈傷組織)或通過采用根瘤農(nóng)桿菌的原生質(zhì)體的共培養(yǎng)物來轉(zhuǎn)化該基因物質(zhì)。
一種替代的方法為在聚陽離子或鈣鹽與聚乙二醇存在的條件下，將在植物原生質(zhì)體中含有所需要的基因或所需要的DNA的純化DNA進行溫育(例如Hain等人，1985；Krens等人，1982；Paszkowski等人，1984)。
此外，DNA的攝入也可以得到電場(電穿孔法)的支持(例如Fromm等人，1986)。
DNA也可以由植物花粉，通過“轟擊”花粉或具有攜帶DNA的物理加速粒子的植物的其它部分，按照已知的方式引入(參見EP-A 0270356) 。
按照已知的方式，在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基的協(xié)助下進行植物的再生(例如Nagy與Maliga1976)。
在根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選的實施方案中，把來自于質(zhì)粒pET3a-GST III c的GST III c DNA克隆到一個二元(binary)表達載體上(例如Voβ等人(1994))。然后，將嵌合基因的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到根瘤農(nóng)桿菌中(Koncz與Schell，1986)。
采用另外一種方法，以常規(guī)的方式通過直接的基因轉(zhuǎn)化將位于載體pSS-GST III c上的嵌合基因的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到植物的原生質(zhì)體上(例如Hain等人，1985)。在這種情況下，該質(zhì)?？赡艹虱h(huán)狀的形式，但是優(yōu)選其呈線性形式。
當采用這種具有報道基因的質(zhì)粒時，隨后檢驗卡那霉素-抗性原生質(zhì)體對GST III c的表達。
通過已知的方法，例如通過葉盤轉(zhuǎn)化(例如Horsch等人，1985)，通過再生植物的原生質(zhì)體或細胞培養(yǎng)物與根瘤農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)(例如Marton等人1979，Hain等人1985)或通過直接的DNA轉(zhuǎn)染生產(chǎn)轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)基因)的植物或植物細胞。所衍生的轉(zhuǎn)基因植物或者通過對報道基因表達的篩選，例如借助體外卡那霉素硫酸鹽的磷酸化作用(Reiss等人，1984；Schreier等人，1985)，或者通過胭脂氨酸合酶的表達(Aerts等人的方法，1983)或通過Northern印跡分析法與Western印跡分析法的GST III c的表達進行檢測。也可以使用特異的抗體以已知的方式通過Western印跡分析法在轉(zhuǎn)基因植物中檢測蛋白GST III c。
通過一般常規(guī)的方法使用適合于每種情況的營養(yǎng)培養(yǎng)基可以進行轉(zhuǎn)化植物細胞的培養(yǎng)及其再生為完整的植株。
含有根據(jù)本發(fā)明的GST III c DNA并且形成本發(fā)明的一部分的轉(zhuǎn)化植物細胞與轉(zhuǎn)化植物，兩者均顯示出對除草劑，特別是對雜芳氧基除草劑抗性的提高非常之大。
鑒于本發(fā)明，術(shù)語“植物”表示完整的植株與植株的一部分，諸如葉，種子，塊莖，插枝等等。“植物細胞”包括原生質(zhì)體，細胞系，植物愈傷組織等等。“繁殖材料”表示用于繁殖該轉(zhuǎn)化植物與植物細胞的植物與植物細胞，并且因此同樣也成為本發(fā)明的一部分。
通過根據(jù)本發(fā)明的GST III c DNA的插入(轉(zhuǎn)化)能夠使得對除草劑抗性提高的植物實質(zhì)上包括所有的植物。當然存在特殊的需要在下面的植物中產(chǎn)生這種抗性，諸如林業(yè)植物，例如云杉，冷杉，花旗松，松樹，落葉松，山毛櫸與橡樹的作物植物，以及提供糧食和原材料的植物，例如谷物(特別是小麥，黑麥，大麥，燕麥，小米，水稻與玉米)，土豆，豆科(諸如莢科植物與特別地如苜蓿，大豆)，蔬菜(尤其是蕓苔屬植物與番茄)，水果(特別是蘋果，梨，櫻桃，葡萄，柑橘水果，菠蘿與香蕉)，油棕櫚，茶葉，可可與咖啡作物，煙草，劍麻與棉花，以及藥用植物，諸如蘿芙藤與毛地黃。可以特別優(yōu)選所提到的那些為土豆，甜菜，甘蔗，諸如小麥，大麥與高粱的谷物，以及水稻。根據(jù)本發(fā)明的GST III c DNA優(yōu)選作為“外源”DNA插入到這些植物的基因組中。
抵抗根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的提高的除草劑抗性的除草劑優(yōu)選屬于雜芳氧基乙酰胺的類群。在這一方面，特別優(yōu)選的是具有通式(I)的雜芳氧基乙酰胺Het-O-CH2-CO-NR1R2(I)其中Het代表一種可選擇性地用優(yōu)選的五元環(huán)取代的雜芳香基，該五元環(huán)中優(yōu)選含有至少一個氮原子與一個硫原子或氧原子，可以提到的一個特別優(yōu)選的基團為5-三氟甲基-1，3，4-噻二唑-2-基基團；R 代表選擇性地取代的烷基或烷氧基(在每一種情況1下，優(yōu)選以1-4個碳原子取代)；并且R 代表選擇性地取代的芳香基(優(yōu)選為苯基，而該基團2優(yōu)選以鹵素取代)目前已經(jīng)公開了這種類型的除草劑(參見例如EP-A-18497及與之相對應的美國專利No.4645525，EP-A-94541及與之相對應的美國專利No.4585471，以及EP-A-348737及與之相對應的美國專利No.4968342)。在這些專利申請與專利中所提到的除草劑是在本發(fā)明中特別優(yōu)選的。
根據(jù)本發(fā)明，對在EP-A-348737及與之相對應的美國專利No.4968342中所提到的，化學名稱為(5-三氟甲基-1，3，4-噻二唑-2-基氧)乙酸N-異丙基-N-(4-氟苯基)酰胺(推薦的通用名thiafluamide)除草劑的抗性是非常特別優(yōu)選的。這一抗性允許在作物中使用所說的除草劑，即使該作物呈無抗性的形式，且以一種不可接受的方式將受到該除草劑的損傷。
借助下面典型的實施方案將具體地解釋本發(fā)明I.從玉米中分離GST III c DNA采用分子生物學已知的步驟和方法分離GST III c DNA，例如采用下面的手冊中所描述的方法Maniatis T.，F(xiàn)ritsch E.F.，Sambrook J.分子克隆，一本實驗室手冊；Cold Spring Habor實驗室，第二版，1989。
為了分離出GST III c DNA，首先從經(jīng)黃化(etiolated)的玉米幼苗(Zea mais)，Mutin變種中純化該蛋白質(zhì)(1)，并且通過蛋白質(zhì)序列分析法完全測定其氨基酸序列(2)。同樣從玉米的幼苗中分離出mRNA(3)，并且通過逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA酶促轉(zhuǎn)錄為cDNA(4)。以這種方法衍生的cDNA在聚合酶鏈式反應中用作模板(Mullis K.B.，F(xiàn)alloona F.A.，(1987)Method Enzymol.155335-350)以分離GSTIII c DNA。
1. 從玉米，Mutin變種中分離GST III c蛋白質(zhì)為了純化GST III c蛋白質(zhì)，將玉米幼苗破碎并與0.2M tris/HClpH7.8，1mM EDTA(2毫升/克鮮重)混合。離心該懸浮液，并通過具有30％和70％飽和度的硫酸銨分級沉淀得到上清液中的蛋白質(zhì)部分。通過色譜在下面的柱中采用所指出的緩沖液的條件分離GST III c蛋白質(zhì)A)Sephadex G-100(基于葡聚糖分離介質(zhì))，v＝500毫升(Pharmacia)緩沖液A50mM磷酸鉀pH7.3B)DEAE-Sepharose(具有以共價鍵結(jié)合的二乙氨乙基基團的交聯(lián)瓊脂糖基質(zhì))，v＝50毫升(Pharmacia)緩沖液A10mM磷酸鉀pH7.3緩沖液B1.0M磷酸鉀pH7.3梯度0-100％B，500分鐘C)谷胱甘肽-磺基溴代酞-瓊脂糖，v＝20毫升(Sigma)緩沖液A50mM磷酸鉀pH7.3緩沖液B50mM磷酸鉀pH8.0，5mM谷胱甘肽D)單Q HR 5/5(基于具有帶電的-CH2N(CH3)3+基團的交聯(lián)瓊脂糖的陰離子交換物質(zhì)，粒子尺寸為10±5微米)，v＝1毫升(Pharmacia)緩沖液A20mM tris/HCl pH7.5緩沖液B20mM tris/HCl pH8.0，1.0M NaCl梯度0-25％B，20分鐘2.GST III c蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)序列分析將從玉米(Mutin變種)中分離出的GST III c蛋白進行還原，羧甲基化且用0.2M碳酸氫銨透析(Glazer A.N.，Delange R.J.，SigmanD.S.，(1975)蛋白質(zhì)的化學修飾，Elsevier生物醫(yī)學出版社，阿姆斯特丹)。隨后在23℃下，以蛋白質(zhì)/蛋白酶的比例為1∶100的條件下用內(nèi)切蛋白酶Asp-N(測序級別，Boehringer Mannheim)或胰蛋白酶(TPCK-處理的，Worthington)切割該蛋白質(zhì)16小時。通過加入0.1％的三氟乙酸停止切割反應。通過離心除去不溶的肽，并且在下面的條件下通過反向HPLC彼此分離出可溶性的肽柱 Vydac C18(具有脂肪鏈(C18)的二氧化硅骨架分離凝膠)，0.46厘米×25厘米洗脫液0.1％三氟乙酸A洗脫液0.1％三氟乙酸，90％乙氰B梯度0-60％B， 40分鐘流速0.25毫升/分鐘使用實用生物系統(tǒng)470A與473A蛋白測序儀測定所分離的氨基酸序列。在SEQ ID NO2中描繪了GST III c蛋白的完整的蛋白質(zhì)序列。
3. 從玉米(Mutin變種)中分離poly(A)+mRNAGST III c DNA，mRNA及與之相對應的cDNA含有能夠從彼此衍生的核苷酸序列。為了分離GST III c DNA，首先從黃化的玉米幼苗中制備聚腺苷酸化的mRNA。按照生產(chǎn)者的方案(Dynal，奧斯陸/挪威；Jakobsen K.S.，Breivold E.，(1990)Nucleic Acids Res.183669)使用Dynabeads Oligo(dT)25進行分離。用于純化poly(A)+RNA的方法是基于在位于mRNA的3’末端上的poly(A)+殘基與oligo(dT)殘基間的堿基對的結(jié)合，它們以共價鍵結(jié)合在磁性金屬珠(Dynabeads)的表面上。每一毫克的Dynabeads使用0.2克的植物材料。可以把通過這種方法分離出的mRNA不進行進一步的純化步驟而用于cDNA的酶促合成。
4. cDNA的酶促合成在cDNA第一鏈合成試劑盒的協(xié)助下制備cDNA(Pharmacia P-LBiochemicals Inc.)。該方法基于根據(jù)一個RNA模板合成DNA的病毒DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄)的酶活性(Maniatis T.，F(xiàn)ritsch E.F.，SambrookJ.，(1982)分子克隆實驗室手冊，Cold Spring Harbor實驗室)。
按照生產(chǎn)者的說明，反應以下面的方式進行來自于玉米，Mutin變種的5μm的poly(A)+mRNA與1μm的0.5M dithioeritrit，1μm的d(T)16-18引物相混合11μm的反應混合物(總體反應的混合)包括鼠逆轉(zhuǎn)錄酶，135mM tris/HCl，pH8.3，204mM KCl，27mMMgCl2，0.24毫克/毫升BSA，5.4mM dATP，dCTP，dGTP，dTTP。
在37℃下反應1小時后，通過加堿水解除去mRNA。沉淀所合成的cDNA并以之作為聚合酶鏈式反應的模板。
5. GST III c DNA的擴增，克隆與測序為了分離出GST III c DNA，首先用聚合酶鏈式反應擴增編碼GSTIII c的核苷酸序列(Mullis K.B.，F(xiàn)aloona F.A.，(1987)MethodEnzymol.155335-350)。用于反應的模板為從玉米mRNA中制備的cDNA。為了特異地富集GST III c DNA，使用顯示在SEQ ID NO3中的引物1(正向)以及顯示在SEQ ID NO4中的引物2(逆向)。
制備含有下面組合物的反應混合物5μm的cDNA(200納克/微升)1μm的50μM引物11μm的50μM引物24μl的250μM dATP，dCTP，dGTP，dTTP5μl的200mM tris/HCl，pH8.8，100mM KCl，60mM(NH4)2SO4，15mM MgCl2，1％Triton X-10034μlH2O在一個GeneAmp PCR系統(tǒng)9600熱循環(huán)儀(Perkin Elmer)中進行聚合酶鏈式反應。加入1微升作為熱穩(wěn)定聚合酶的Pfu Dna聚合酶(Stratagene，2500U/毫升)。采用下面的溫度與反應時間總共進行35個反應循環(huán)在94℃下45秒，在58℃下45秒，在72℃下45秒。通過瓊脂糖凝膠電泳純化擴增的含有編碼核苷酸序列的DNA片段，并且將其克隆到如已描述的載體pET 3a上。使用測序酶DNA測序試劑盒(美國Biochemical/Cleveland)測定GST III c DNA(SEQ ID NO1)的完整的DNA序列(Sanger F.，Coulson R.，(1975) J.Mol. Biol.94441-448)。
II.水稻的轉(zhuǎn)化按照在下面的參考文獻中所描述的方法可以轉(zhuǎn)化水稻(Oryzasativa)Zhang H.M.，Yang H.，Rech E.L.，Golds T.J.，Davis A.S.，MulliganB.J.，(1988)通過電穿孔-介導的質(zhì)粒攝入原生質(zhì)體生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因水稻植株P(guān)lant Cell Rep.7379-384Zhang W.，Wu R.，(1988)從水稻的原生質(zhì)體中有效地再生轉(zhuǎn)基因植物以及在植物體中外源基因正確地調(diào)控表達Theor. Appl. Gen.76835-840Shimamoto K.，Terada R.，Izawa T.，F(xiàn)ujimoto H.，(1989)從轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體中再生的可育的轉(zhuǎn)基因水稻植株天然338274-276Datta S.K.，Peterhans A.，Datta K.，Potrykus I.，(1990)從原生質(zhì)體中再生的基因工程化的可育indica-水稻Biotechnol. 6736-740Hayashimoto A.，Li Z.，Murai N.，(1990)用于生產(chǎn)可育的轉(zhuǎn)基因水稻植株的一個聚乙二醇介導的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，Plant Physiol.93857-863使用Hayashimoto等人的方法(1990)可以將載體pSS-GST III c轉(zhuǎn)化到水稻上，而不需修飾。
在Northern印跡實驗中，使用卡那霉素-抗性轉(zhuǎn)化體檢驗GST III的表達。通過特異的抗體檢測GST III c蛋白的形成。通過檢測除草劑(5-三氟甲基-1，3，4-噻二唑-2-基氧)乙酸N-異丙基-N-(4-氟苯基)酰胺，可能可以顯示出從轉(zhuǎn)化水稻植株的粗提取物中的蛋白質(zhì)的酶的活性。
與未轉(zhuǎn)化的對照物相比，轉(zhuǎn)基因的水稻植株顯示出對所說的除草劑的抗性。
III.煙草的轉(zhuǎn)化a)煙草嫩枝的培養(yǎng)與煙草原生質(zhì)體的分離在不含激素的LS培養(yǎng)基(Linsmaier與Skoog 1965)上以無菌嫩枝培養(yǎng)增殖煙草(Petit Havanna SR1)。將其嫩枝部分以6-8周的間隔轉(zhuǎn)移到新鮮的LS培養(yǎng)基上。在24-26℃下，采用12小時光照(1000-3000lux)于生長室中保留其嫩枝培養(yǎng)物。為了分離葉子的原生質(zhì)體，使用一個清潔的剃刀刀片將大約2克的葉子(大約3-5厘米長)切割成小片(0.5厘米×1厘米)。在室溫下，于由K3培養(yǎng)基(Nagy與Maliga 1976)，0.4M蔗糖，pH5.6，2％纖維素R10(Serva)，0.5％Macerozym R10(Serva)所組成的20毫升酶溶液中溫育該葉子材料14-16小時。然后通過0.30毫米與0.1毫米的噴射濾網(wǎng)(screen)過濾，從細胞殘余物中分離出原生質(zhì)體。在100×g下離心該濾液10分鐘。在這一離心過程中進行完整的原生質(zhì)體的浮選，它在酶溶液上邊的條帶中進行收集。通過玻璃毛細管吸走細胞殘余物的小片與酶溶液。把經(jīng)預純化的原生質(zhì)體與新鮮的K3培養(yǎng)基(以0.4M蔗糖作為滲透劑)混合成10毫升并且重復進行浮選。吸走該洗滌培養(yǎng)基并且將原生質(zhì)體稀釋為用于培養(yǎng)或隨后以農(nóng)桿菌感染(共培養(yǎng))的1-2×105/毫升。在一個計數(shù)室內(nèi)測定原生質(zhì)體的濃度。
b)載體pSS-GST III c的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化到根瘤農(nóng)桿菌中從載體pET3a-GST III c中切割出GST III c DNA與Shine-Delgarno序列作為XbaI/BamHI片段，將其純化并且克隆到質(zhì)粒Bluescript II Sk+/-(Stratagene，La Jolla，加利弗尼亞)中，下文稱作pBS-SK II。使用XbaI與BamHI切割位點。隨后通過Sst1與Sma1切割位點從載體pBS-SK II-GST III c中切割出GST III c DNA，將其分離并且結(jié)合在載體pRT101(Sst1/Sma1-線性化)上(Topfer R.，Matzeit V.，Gronenborn B.，Schell J.，Steinbiβ H.H.，(1987)Nucleic Acids Res.145890)。
然后從載體pRT101-GST III c中純化出GST III c DNA作為EcoR1/Sma1片段并且將之克隆到表達載體pSS上(EcoR1/Sam1-線性化，(Voβ等人，Molec.Breeding 115-26(1995)))。
可能使用任何其它的具有合適切割位點的表達載體與穿梭載體來代替所說的載體，而本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在上面陳述的基礎上能夠容易地作出合適的選擇。結(jié)果，將含有GST III c DNA的穿梭載體pSS-GSTIII c轉(zhuǎn)化到含有一個功能性vir區(qū)域的根瘤農(nóng)桿菌中(Koncz與Schell1986，van Haute等人1983)。
c)通過與根瘤農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化正在再生的煙草原生質(zhì)體下文采用通過輕微改進的Marton等人(1979)的方法。如所述，分離原生質(zhì)體并且在K3培養(yǎng)基(0.4M蔗糖，0.1毫克/毫升NAA，0.2毫克細胞分裂素)中，26℃下以1-2×105/毫升的密度進行溫育，在黑暗中溫育2天，在弱光(500lux)下溫育1至2天。
原生質(zhì)體一開始發(fā)生分裂，就將含于基本A(Am)培養(yǎng)基中從b)中衍生的30微升農(nóng)桿菌的懸浮液(密度大約為109農(nóng)桿菌/毫升)加入到3毫升正在再生的原生質(zhì)體中。在20℃下于黑暗中進行共培養(yǎng)3-4天。然后把煙草細胞裝入12毫升離心試管中，用海水(600mOsm/千克)稀釋到10毫升并且在60×g下將其制片10分鐘。重復洗滌步驟1-2×多次以除去大多數(shù)的農(nóng)桿菌。在含有1毫克/升NAA(萘基-1-乙酸)，0.2毫克/升細胞分裂素與500毫克/升頭孢菌素抗生素cefotaxime的K3培養(yǎng)基(0.3m蔗糖)中以5×104/毫升的密度培養(yǎng)細胞懸浮物。每周用新鮮的K3培養(yǎng)基稀釋細胞懸浮物，并且每周以0.05M的蔗糖(大約60mOsm/千克)連續(xù)地還原培養(yǎng)基的滲透值。在瓊脂糖玻珠培養(yǎng)(Shillito等人1983)中共培養(yǎng)后的2-3周開始以卡那霉素進行篩選(100毫克/升卡那霉素硫酸鹽(Sigma)，660毫克/克活性Km)。從篩選開始后的3-4周，可以從存留菌落的背景中分辨出卡那霉素-抗性菌落。
d)用DNA直接轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體硝酸鈣/PEG轉(zhuǎn)化將含于180微升K3培養(yǎng)基中的大約106的原生質(zhì)體小心地與20微升含水的DNA溶液混合，該溶液在培養(yǎng)皿中含有20微克的質(zhì)粒pSS-GST III c。質(zhì)粒pSS-GST III c可以通過已知的方法從質(zhì)粒pET3a-GSTIII c，pRT101，pBS-SK II與pSS中得到。隨后小心地加入200微升的融合溶液(0.1M硝酸鈣，0.45M甘露糖醇，25％聚乙二醇(PEG6000)，pH9)。15分鐘后，加入5毫升的洗液(0.275M硝酸鈣，pH6)，并且再過5分鐘后將原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移到一個離心試管中且在60×g下制片。在少量的K3培養(yǎng)基中吸取小片并且以如下部分的描述將其培養(yǎng)。另外，也可以如Hain等人(1985)所描述的轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體。
e)用DNA溫育的原生質(zhì)體的培養(yǎng)以及卡那霉素-抗性愈傷組織的篩選把一種改性的玻珠類型培養(yǎng)技術(shù)(Shillito等人1983)用于下文所述的卡那霉素-抗性菌落的培養(yǎng)與篩選。用DNA處理原生質(zhì)體1周后(參照d)，在5厘米培養(yǎng)皿中將3毫升的細胞懸浮物與3毫升的K3培養(yǎng)基混合(0.3M蔗糖+激素；1.2％(Seaplaque)LMT瓊脂糖(低熔點瓊脂糖，Marine Colloids))。為了這一目的，干法高壓滅菌瓊脂糖，并且在加入K3培養(yǎng)基后在微波爐中使之簡單地沸騰。瓊脂糖固化后，將含有用于進一步培養(yǎng)與篩選的被包埋的煙草微愈傷組織的瓊脂糖圓片(玻珠)轉(zhuǎn)移到10厘米的培養(yǎng)皿中，并且向每個培養(yǎng)皿中加入10毫升的K3培養(yǎng)基(0.3M蔗糖，1毫克/升NAA，0.2毫克/升細胞分裂素)與100毫克/升的卡那霉素硫酸鹽(Sigma)。每周更換一次液體培養(yǎng)基。與此同時，逐步地還原培養(yǎng)基的滲透值。
每周通過0.05M的蔗糖(大約60mOsm)還原取代培養(yǎng)基(K3+Km)。
在DNA轉(zhuǎn)化后，篩選具有卡那霉素-抗性的煙草菌落的線路圖為0.4M 0.3M 0.25M 0.20M 0.15M 0.10M溶于液體培養(yǎng)基中的蔗糖A ESK123 456 DNA攝入后的周數(shù)(K3培養(yǎng)基1毫克/升NAA，0.2毫克/升細胞分裂素)A＝DNA攝入E＝在瓊脂糖中包埋S＝以卡那霉素(100毫克/升卡那霉素硫酸鹽)篩選K＝從背景中可以清晰地分辨出的卡那霉素-抗性菌落f)卡那霉素抗性植株的再生卡那霉素-抗性菌落的直徑一達到大約0.5厘米，便將其中的一半菌落放置在再生培養(yǎng)基(LS培養(yǎng)基，2％蔗糖，0.5毫克/升芐基氨基嘌呤BAP)上并且于24℃下以12小時的光照(3000-5000lux)將其保留在生長室中。另一半則作為愈傷組織培養(yǎng)物在含有1毫克/升NAA，0.2毫克/升細胞分裂素，0.1毫克/升BAP與100毫克/升卡那霉素硫酸鹽的LS培養(yǎng)基上進行增殖。當再生的嫩枝尺寸大約為1厘米時，將其剪下并且放置在不含生長調(diào)節(jié)劑的1/2 LS培養(yǎng)基(1％蔗糖，0.8％瓊脂)中用于生根。在含有100毫克/升卡那霉素硫酸鹽的1/2 MS培養(yǎng)基中使嫩枝生根并且隨后把它轉(zhuǎn)移至土壤中。
g)通過根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化葉盤為了轉(zhuǎn)化葉盤(Horsch等人1985)，將從無菌的嫩枝培養(yǎng)物中衍生的大約2-3厘米長的葉子切割成直徑為1厘米的圓片，并且用含于Am培養(yǎng)基(參見下文)中的合適的農(nóng)桿菌的懸浮物(大約109/毫升)(參見c)溫育大約5分鐘。在大約24℃下，在不合激素的MS培養(yǎng)基(參見下文)上保留葉子被感染的片段3-4天。在這段時間內(nèi)，農(nóng)桿菌生長越過葉子的片段。隨后在MS培養(yǎng)基(0.5毫克/毫升，0.1毫克/毫升)中洗滌葉子的片段并且把它放置在含有500微克/毫升cefotaxime與100微克/毫升卡那霉素硫酸鹽的同樣的培養(yǎng)基(0.8％瓊脂)上。兩周后，應當更換培養(yǎng)基。進而再過2-3周后，轉(zhuǎn)化的卡那霉素-抗性嫩枝便可以看到了。
生物化學轉(zhuǎn)化檢測方法新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT II)的酶分析正如Reiβ等人(1984)所述的以及Schreier等人(1985)所改進的，如下述通過卡那霉素的就地磷酸化來檢測植物組織中NPT II的活性。于冰上，在添加有玻璃粉末的50微升抽提緩沖液(10％甘油，5％2-巰基乙醇，0.1％SDS，0.025％溴酚藍，62.5mM tris pH6.8)中將50毫克的植物組織進行勻漿，并且于4℃下在一個Eppendorf離心機中離心10分鐘。把50微升的上清液裝填到一個未改性的聚丙烯酰胺凝膠(145×110×1.2毫米；分離膠10％丙烯酰胺，0.33％丙烯酰胺，0.375M tris pH8.8，堆積膠5％丙烯酰胺，0.165％雙丙烯酰胺，0.125M tris pH6.8)中并且在4℃與60V下電泳過夜。溴酚藍標記物一跑出凝膠，即用蒸餾水洗滌凝膠兩次、洗10分鐘，并且用反應緩沖液(67mM tris順丁烯二酸，pH7.1，42mM氯化鎂，400mM氯化銨)洗滌一次、洗30分鐘。將凝膠放置在同樣尺寸的玻璃板上并且以40毫升含于反應緩沖液中的1％的強度(strength)凝膠進行覆蓋，其中的反應緩沖液含有底物卡那霉素硫酸鹽(20微克/毫升)與20-200μCi的32PATP(Amersham)。在室溫下溫育該夾心凝膠30分鐘，然后把一張P81磷酸纖維素紙(Whatman)放置在瓊脂糖上。在其頂部堆積了四層3MM濾紙(Whatman)以及一些紙巾。在3-4小時后，停止就地磷酸化的放射性卡那霉素磷酸鹽向P81紙的轉(zhuǎn)移。在蛋白酶K與1％十二烷基硫酸鈉(SDS)的溶液中，于60℃下溫育P81紙30分鐘，然后于80℃下，在250毫升10mM磷酸緩沖液(pH7.5)中洗滌3-4次，干燥該紙且在-70℃下放射自顯影(XAR5膠卷柯達)1-12小時。
除非另作聲明以外，在上面的實施例中以及下文的那些實施例中所有的百分比的數(shù)據(jù)均為重量百分數(shù)。
通過Southern印跡分析法證實了在上面以及實施例中衍生的植物細胞以及植物中GST III c DNA的存在。通過Northern印跡分析法以及Western印跡，使用特異的抗體檢測GST III c DNA的表達。
在植物與植物細胞的轉(zhuǎn)化中使用的一些培養(yǎng)基如下所述Am培養(yǎng)基3.5克K2HPO41.5克KH2PO40.5克Na3檸檬酸鹽0.1克MgSO4×7H2O1克 (NH4)2SO42克 葡萄糖ad11用于無菌煙草嫩枝培養(yǎng)的培養(yǎng)基MS鹽的大量元素的1/2濃度MS鹽的微量元素的1/2濃度Fe EDTA Murashige與skoog(MS)肌醇 100毫克/升蔗糖 10毫克/升瓊脂 8毫克/升維生素 Ca泛酸 1毫克/升生物素10毫克/升煙酸 1毫克/升吡哆醇 1毫克/升硫胺素 1毫克/升在高壓滅菌前pH7.5K3培養(yǎng)基用于培養(yǎng)煙草小Havana SR1，煙草Wisconsin 38與Nicotianaplumaginifolia原生質(zhì)體(Nagy與Maliga，1976)大量元素 NH4NO3250毫克/升KNO32500毫克/升CaCl2·2H2O 900毫克/升MgSO4·7H2O 250毫克/升NaH2PO4·1H2O 150毫克/升(NH4)2SO4134毫克/升CaHPO4·1H2O 50毫克/升微量元素 H3BO33毫克/升MnSO4·1H2O 10毫克/升ZnSO4·4H2O2毫克/升KI0.75毫克/升Na2MoO4·2H2O 0.25毫克/升CuSO4·5H2O0.025毫克/升CoCl2·6H2O0.025毫克/升Fe EDTA Na2EDTA 37.2毫克/升FeSO4·7H2O 27.8毫克/升肌醇100毫克/升蔗糖 137克/升(＝0.4M)
木糖250毫克/升維生素煙酸1毫克/升吡哆醇1毫克/升硫胺素 10毫克/升激素 NAA 1.0毫克/升細胞分裂素 0.2毫克/升pH5.6將過濾器滅菌Linsmaier與Skoog培養(yǎng)基(Linsmaier與Skoog 1965)用于培養(yǎng)正在再生的原生質(zhì)體并且用于煙草腫瘤與愈傷組織的組織培養(yǎng)。Linsmaier與Skoog(LS)培養(yǎng)基為采用了下述改進的Murashige與Skoog培養(yǎng)基(Murashige與Skoog，1962)-硫胺素以較高的濃度0.4毫克/升稱重，代替0.1毫克/升；-缺乏甘氨酸，吡哆醇與煙酸。
大量元素NH4NO31650毫克/升KNO31900毫克/升CaCl2·2H2O 440毫克/升MgSO4·7H2O 370毫克/升KH2PO4170毫克/升微量元素H3BO36.2毫克/升MnSO4·1H2O 22.3毫克/升ZnSO4·4H2O 8.6毫克/升KI0.83毫克/升Na2MoO4·2H2O 0.25毫克/升CuSO4·5H2O0.025毫克/升CoCl2·6H2O0.025毫克/升Fe EDTA Na2EDTA 37.2毫克/升FeSO4·7H2O 27.8毫克/升肌醇 100毫克/升蔗糖 30克/升瓊脂 8毫克/升維生素Thiamine 0.4毫克/升激素 NAA 1毫克/升細胞分裂素 0.2毫克/升pH5.7可以在植物與植物細胞的轉(zhuǎn)化中引用下面的文獻Fraley R.T.，Rogers S.G.，Horsch R.B.，Sanders P.R.，F(xiàn)lick J.S.，Adams S.P.，Bitther M.L.，F(xiàn)inker C.L.，F(xiàn)ry J.S.，F(xiàn)allupi G.R.，GoldbergS.B.，Hoffmann N.L.，Woo S.C.(1983).細菌基因在植物細胞中的表達Proc.Natl.Acad.Sci.USA 804803-4807.
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Van den Elzen P.J.M.，Townsend J.，Lee K.Y.，Bedbrook J.R.(1985)在植物細胞中作為一個可選擇的標記物的嵌合抗性基因Plant Mol.Biol. 5299-302Velten J.，Velten L.，Hain R.，Schell J.，(1984)從根瘤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒中分離一個雙植物啟動子片段EMSO J.122723-2730
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轉(zhuǎn)基因植物提高的證實與對照植物相比，測定對根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物的損傷以檢驗對具有除草劑活性的雜氧乙酰胺的抗性的提高。所使用的檢驗除草劑為化合物(5-三氟甲基-1，3，4-噻二唑-2-基氧)乙酸N-異丙基-N-(4-氟苯基)酰胺。
在溫室中，將轉(zhuǎn)化植物的F1代的種子播種在位于容器(d＝11厘米)中的含有3％腐殖土內(nèi)含物的天然土壤中。在溫度為23℃且相對濕度為70-80％下栽培該植物。在種子播撒后24小時，以相應于施加量為2000-4000活性化合物/ha的濃度，用上面提及的除草劑化合物，其表示為70WP(可潤濕的粉末)進行處理。
在用除草劑處理20天后進行評估。與經(jīng)過同樣濃度的活性化合物處理的相應的對照植物比較，評價其對轉(zhuǎn)基因植物總體損傷的百分數(shù)。
與未轉(zhuǎn)化的相應的對照植物相比，經(jīng)插入根據(jù)本發(fā)明的GST III cDNA的轉(zhuǎn)化煙草植物顯示出對除草劑的高的施加量(2000-4000克/ha)抗性的顯著提高。序列一覽表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名拜爾AG(B)街道拜爾沃克(C)城市勒沃庫森(E)國家德國(F)郵政編碼D-51368(G)電話0214/30 66400(H)傳真0214/30 3482(I)電報85101-265通過d(ii)發(fā)明名稱脫氧核苷酸及其用途(iii)序列數(shù)4(iv)計算機可讀形式(A)存儲媒體類型軟磁盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件帕特汀瑞利斯#1.0，版本#1.30(EPA)(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度666個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓撲構(gòu)建物線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定無(iv)反義無(ix)特征(A)名稱/要點CDS(B)位置1.663(xi)序列描述SEQ ID NO1ATG GCG CCT CTG AAG CTG TAC GGG ATG CCG CTG TCC CCC AAC GTG GTG 48Met Ala Pro Leu Lys Leu Tyr Gly Met Pro Leu Ser Pro Asn Val Val1 5 10 15CGC GTG GCC ACC GTG CTC AAC GAG AAG GGC CTC GAC TTC GAG ATC GTC 96Arg Val Ala Thr Val Leu Asn Glu Lys Gly Leu Asp Phe Glu Ile Val20 25 30CCC GTC GAC CTC ACC ACC GGC GCC CAC AAG CAG CCC GAC TTC CTC GCC 144Pro Val Asp Leu Thr Thr Gly Ala His Lys Gln Pro Asp Phe Leu Ala35 40 45CTC AAC CCT TTC GGC CAG ATC CCG GCT CTC GTC GAC GGA GAC GAA GTC 192Leu Asn Pro Phe Gly Gln Ile Pro Ala Leu Val Asp Gly Asp Glu Val50 55 60CTC TTC GAG TCC CGT GCG ATC AAC CGG TAC ATC GCC AGC AAG TAC GCG 240Leu Phe Glu Ser Arg Ala Ile Asn Arg Tyr Ile Ala Ser Lys Tyr Ala65 70 75 80TCG GAG GGC ACG GAC CTG CTC CCC GCG ACG GCG TCG GCG GCG AAG CTG 285Ser Glu Gly Thr Asp Leu Leu Pro Ala Thr Ala Ser Ala Ala Lys Leu85 90 95GAG GTG TGG CTG GAG GTG GAG TCG CAC CAC TTC CAC CCG AAC GCG TCG 336Glu Val Trp Leu Glu Val Glu Ser His His Phe His Pro Asn Ala Ser100 105 110CCG CTG GTG TTC CAG CTG CTC GTG AGG CCG CTC CTG GGC GGC GCC CCC 384Pro Leu Val Phe Gln Leu Leu Val Arg Pro Leu Leu Gly Gly Ala Pro115 120 125GAC GCG GCG GTG GTG GAG AAG CAC GCG GAG CAG CTC GCC AAG GTG CTC 432Asp Ala Ala Val Val Glu Lys His Ala Glu Gln Leu Ala Lys Val Leu130 135 140GAC GTG TAC GAG GCG CAC CTG GCC CGC AAC AAG TAC CTC GCC GGG GAC 480Asp Val Tyr Glu Ala His Leu Ala Arg Asn Lys Tyr Leu Ala Gly Asp145 150 155 160GAG TTC ACG CTC GCC GAC GCC AAC CAC GCG TCC TAC CTG CTC TAC CTC 528Glu Phe Thr Leu Ala Asp Ala Asn His Ala Ser Tyr Leu Leu Tyr Leu165 170 175AGC AAG ACC CCC AAG GCC GGG CTC GTC GCC GCC CGC CCC CAC GTC AAG576Ser Lys Thr Pro Lys Ala Gly Leu Val Ala Ala Arg Pro His Val Lys180 185 190GCC TGG TGG GAG GCC ATC GCC GCC CGC CCC GCG TTC CAG AAG ACC GTC 624Ala Trp Trp Glu Ala Ile Ala Ala Arg Pro Ala Phe Gln Lys Thr Val195 200 205GCC GCC ATC CCC TTG CCC CCG CCG CCC TCC TCC TCG GCT TGA 666Ala Ala Ile Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Ser Ser Ala210 215220(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長度221個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構(gòu)建物線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Pro Leu Lys Leu Tyr Gly Met Pro Leu Ser Pro Asn Val Val1 5 10 15Arg Val Ala Thr Val Leu Asn Glu Lys Gly Leu Asp Phe Glu Ile Val20 25 30Pro Val Asp Leu Thr Thr Gly Ala His Lys Gln Pro Asp Phe Leu Ala35 40 45Leu Asn Pro Phe Gly Gln Ile Pro Ala Leu Val Asp Gly Asp Glu Val50 55 60Leu Phe Glu Ser Arg Ala Ile Asn Arg Tyr Ile Ala Ser Lys Tyr Ala65 70 75 80Ser Glu Gly Thr Asp Leu Leu Pro Ala Thr Ala Ser Ala Ala Lys Leu85 90 95Glu Val Trp Leu Glu Val Glu Ser His His Phe His Pro Asn Ala Ser100 105 110Pro Leu Val Phe Gln Leu Leu Val Arg Pro Leu Leu Gly Gly Ala Pro115 120 125Asp Ala Ala Val Val Glu Lys His Ala Glu Gln Leu Ala Lys Val Leu130 135 140Asp Val Tyr Glu Ala His Leu Ala Arg Asn Lys Tyr Leu Ala Gly Asp145 150 155 160Glu Phe Thr Leu Ala Asp Ala Asn His Ala Ser Tyr Leu Leu Tyr Leu165 170 175Ser Lys Thr Pro Lys Ala Gly Leu Val Ala Ala Arg Pro His Val Lys180 185 190Ala Trp Trp Glu Ala Ile Ala Ala Arg Pro Ala Phe Gln Lys Thr Val195 200 205Ala Ala Ile Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Ser Ser Ala210 215 220(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓撲構(gòu)建物線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO3AGCGCATATG GCGGCTCTGA AGCTGTACGG GAT(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓撲構(gòu)建物線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO4GACGGATCCT CAAGCCGAGG AGGAGGGCGG
權(quán)利要求
1.編碼SEQ ID NO2中顯示的蛋白質(zhì)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶III c(GST III c)或由此衍生的蛋白質(zhì)序列的DNA(脫氧核糖核酸)(GSTIII c DNA)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，它具有顯示在SEQ ID NO1中的序列或由此衍生的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，它具有存在于載體質(zhì)粒pET3a-GSTIII c上的GST III c DNA的序列或由此衍生的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的DNA，它呈DNA雙鏈的形式，該雙鏈含有根據(jù)權(quán)利要求1至3的DNA以及與之互補的一個DNA鏈。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4的DNA，其中在其編碼序列的5’末端的上游插入一個在植物體中有效的啟動子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的DNA，其中將CaMV 35S啟動子或由CaMV35S增強子與CaMV 35S啟動子組成的CaMV 35S雙啟動子作為啟動子。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的DNA，它呈現(xiàn)為處于載體質(zhì)粒pSS-GST III c上的GST III c DNA與CaMV 35S雙啟動子的構(gòu)建物。
8.重組的原核生物或真核生物的DNA，它含有根據(jù)權(quán)利要求1至7的DNA。
9.重組DNA，它存在于植物或植物細胞中并且含有根據(jù)權(quán)利要求1至7的DNA。
10.載體，它含有根據(jù)權(quán)利要求1至7的DNA或根據(jù)權(quán)利要求8和9的重組DNA。
11.載體質(zhì)粒pET3a-GST III c與pSS-GST III c。
12.轉(zhuǎn)化的微生物，它含有根據(jù)權(quán)利要求1至7的DNA或根據(jù)權(quán)利要求8和9的重組DNA。
13.大腸桿菌菌株DS pET3a-GST III c(根據(jù)DSM 9677)及其突變體，它仍然具有完成本發(fā)明的本質(zhì)特征。
14.轉(zhuǎn)基因植物(包括這些植物的一部分及其繁殖材料，諸如原生質(zhì)體，植物細胞，愈傷組織，種子，塊莖或插枝等)，在其基因組中除了含有相對應的非轉(zhuǎn)基因植物的DNA外，還含有根據(jù)權(quán)利要求1至7的DNA。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因植物，它在其基因組中含有根據(jù)權(quán)利要求6的DNA。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因植物，它在其基因組中含有根據(jù)權(quán)利要求7的DNA。
17.根據(jù)權(quán)利要求14至16的轉(zhuǎn)基因植物，它具有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶III c(GST III c)的含量，必要時，呈二聚物的形式。
18.根據(jù)權(quán)利要求14至17的轉(zhuǎn)基因植物，它與相對應的非轉(zhuǎn)基因植物相比具有對除草劑，特別對雜氧乙酰胺除草劑的提高的抗性。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至7的DNA和/或根據(jù)權(quán)利要求8和9的重組DNA和/或根據(jù)權(quán)利要求10和11的載體和/或根據(jù)權(quán)利要求12和13的轉(zhuǎn)化微生物在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物細胞(包括原生質(zhì)體)和植物(包括植物的一部分和種子)中的應用。
20.生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于(a)將根據(jù)權(quán)利要求1的DNA和/或根據(jù)權(quán)利要求8的重組DNA插入到植物細胞(包括原生質(zhì)體)的基因組中并且，必要時，(b)從轉(zhuǎn)基因植物細胞(包括原生質(zhì)體)中再生出完整的轉(zhuǎn)化植物并且必要時將其增殖，并且必要時，(c)從以這種方式衍生的親代或由此衍生的下一代的轉(zhuǎn)基因植物中得到所需要的植物的部分(包括繁殖材料)。
21.根據(jù)權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因植物的用途，該植物用于生產(chǎn)繁殖材料以及用于生產(chǎn)含有根據(jù)權(quán)利要求1的DNA或根據(jù)權(quán)利要求8的重組DNA的新的植物及其繁殖材料。
22.對應于完全或部分存在于質(zhì)粒pET3a-GST III c上的GST III cDNA，或?qū)谕耆虿糠諷EQ ID NO2的DNA的用作探針的用途，它用于檢測GST III c DNA的含量或待研究其含量的DNA的組成。
23.編碼如顯示在SEQ ID NO2中的蛋白GST III c的DNA的用途，它用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，該植物與相對應的非轉(zhuǎn)基因植物相比具有對除草劑，特別是雜氧乙酰胺除草劑的提高的抗性。
24.具有顯示在SEQ ID NO2中的氨基酸序列或由此衍生的序列的蛋白質(zhì)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的蛋白質(zhì)，它呈二聚物的形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的脫氧核糖核酸及其在載體、縮體、生物體和植物轉(zhuǎn)化及高除草劑抗性植物育種中的應用。
文檔編號C12N15/09GK1169160SQ96191572
公開日1997年12月31日 申請日期1996年1月10日 優(yōu)先權(quán)日1995年1月23日
發(fā)明者B·比謝勒, P·里蘭默, R·海恩, K·曼, H·-J·里弗, J·E·托姆齊克 申請人:拜爾公司