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抗-tpo單克隆抗體的制作方法

文檔序號(hào):450037閱讀:334來源:國知局
專利名稱:抗-tpo單克隆抗體的制作方法
背景技術(shù)
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè),純化或定量TPO的抗-TPO單克隆抗體。相關(guān)領(lǐng)域的公開人TPO(血小板生成素)是一種作為細(xì)胞因子受體超家族成員之一的Mpl的配體被克隆的蛋白(de sauvage等人,自然(倫敦),第369期,533-565頁(1994);Bartley,T.D.等人,細(xì)胞,第77期,1117-1124頁(1994))。這些Mpl配體中的每一種均能在血小板減少動(dòng)物(人,小鼠,狗)的血清與血漿中檢測(cè)到,并且已經(jīng)證實(shí)它們涉及巨核細(xì)胞與血小板的生成。
為了開發(fā)一種用于治療血小板減少的治療劑,本發(fā)明人通過使用如所表明的一種活性已經(jīng)從血小板減少的大鼠的血漿中提純出大鼠TPO,其中該活性刺激了從大鼠骨髓中被高度純化的巨核細(xì)胞前體細(xì)胞中巨核細(xì)胞的生成,并且已經(jīng)成功地在其部分氨基酸序列的基礎(chǔ)上克隆大鼠TPO cDNA與人TPO cDNA并通過重組DNA技術(shù)大量地得到了均一的人TPO(H.Miyazaki等人,Exp.Hematol.,第22期,第838頁(1994))。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所得到的人TPO具有與上面所提到的作為人Mpl配體得到的因子同樣的氨基酸序列(參見下面顯示的序列表中的SEQ IDNO1)。
在本文中,需要檢測(cè)、純化或者定量TPO的高級(jí)方法以便于通過重組DNA技術(shù)大量生產(chǎn)均一的人TPO,測(cè)定所制備的TPO或者開發(fā)作為藥物的TPO。
發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)研究了制備用于檢測(cè)、純化或定量TPO的抗-TPO單克隆抗體,并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了雜交瘤生產(chǎn)出可以識(shí)別h6T(1-163)的單克隆抗體,該雜交瘤是通過把骨髓瘤細(xì)胞與從一種已經(jīng)用在大腸桿菌中表達(dá)的人TPO突變體(稱作“h6T(1-163)”)免疫接種的動(dòng)物中得到的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞進(jìn)行融合得到的,一種具有顯示在SEQ ID NO1中的氨基酸序列并且在CHO細(xì)胞(稱作“CHO(1-332)”)中進(jìn)行表達(dá)的人TPO蛋白,另一種具有顯示在SEQ ID NO1中位點(diǎn)1至163的氨基酸序列并且在CHO細(xì)胞(稱作“CHO(1-163)”)中進(jìn)行表達(dá)的人TPO蛋白等等,以及這些單克隆抗體可以用于純化和定量人TPO蛋白。
h6T(1-163)具有對(duì)應(yīng)于顯示在SEQ ID NO1中的氨基酸序列位點(diǎn)1至163的氨基酸序列(SEQ ID NO2),只是該氨基酸殘基Ser1與Ala3分別被Ala與Val所取代而且Met與Lys殘基被附加結(jié)合的N-末端上。在下面顯示的實(shí)施例1中將詳細(xì)地說明生產(chǎn)h6T(1-163)的方法。
因此,本發(fā)明提供了一種針對(duì)人TPO的單克隆抗體,它也提供了一種用于純化TPO的方法,該方法包括采用一種抗-人TPO單克隆抗體通過親和層析從含有TPO的物質(zhì)中分離TPO。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用于免疫化學(xué)定量或檢測(cè)TPO的方法,該方法包括使用一種抗-人TPO單克隆抗體。
附圖簡(jiǎn)要說明

圖1為一幅表明在450/570nm下吸光度隨CHO(1-163)或CHO(1-332)的劑量而變化的附圖。
圖2為一幅表明在450/570nm下吸光度隨CHO(1-163),CHO(1-332),MKT(L-163)或MKT(1-332)的含量(或濃度)而變化的附圖。
圖3為一幅表明本發(fā)明的單克隆抗體與CHO(1-332)以及重組的人促紅細(xì)胞生成素的反應(yīng)活性,它們是通過A450/A570的吸光度的比值進(jìn)行比較的。
發(fā)明詳述本發(fā)明在下面將進(jìn)行更為詳盡的描述。
本發(fā)明的單克隆抗體可以按下面的方式進(jìn)行生產(chǎn)。(1)制備免疫接種的動(dòng)物細(xì)胞采用人TPO對(duì)小鼠,大鼠或其類似物免疫接種,從中可以制備脾細(xì)胞。例如,人TPO可以通過采用重組DNA技術(shù)在大腸桿菌中生產(chǎn)(參見實(shí)施例1)。免疫接種通常是通過向小鼠,大鼠或兔子經(jīng)皮下、靜脈或腹膜內(nèi)給藥來實(shí)現(xiàn)的,給藥量為結(jié)合了一種合適輔劑的5至100微克的人TPO/動(dòng)物,或者按一種爪墊給藥的方式來實(shí)現(xiàn)。免疫接種可以每隔合適的時(shí)間,優(yōu)選每隔1至2周的時(shí)間(在爪墊給藥的情況下為2至3天)進(jìn)行一次或多次。
測(cè)定在免疫接種動(dòng)物的血清中抗體對(duì)抗原的滴度并且在此基礎(chǔ)上把顯示有足夠高的抗體滴度的動(dòng)物用作產(chǎn)生抗體細(xì)胞的來源。優(yōu)選為在最后的免疫接種后3-4天所得到的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。
許多已知的技術(shù),諸如放射免疫測(cè)定(RIA),酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)及其類似的測(cè)定可以用作測(cè)定一種抗體滴度的方法,并且在本發(fā)明中通常采用ELISA。(2)制備骨髓瘤細(xì)胞作為骨髓瘤細(xì)胞,通常希望使用從小鼠中得到的已建立的細(xì)胞,例如象P3-X63-Ag8-U1(P3-U1)[微生物學(xué)與免疫學(xué)中的流行課題,81,1-7(1978)],P3-NSI/I-Ag4.1(NS-1)[歐洲免疫學(xué)雜志,6,511-519(1976)],SP2/O-Ag14(SP-2)[自然,276,269-270(1978)],P3-X63-Ag8.653(653)[免疫學(xué)雜志,123,1548-1550(1979)],P3-X63-Ag8(X63)[自然,256,495-497(1975)]及其類似物的具有8-氮鳥嘌呤-抗性小鼠(BALB/c來源)的骨髓瘤細(xì)胞系。這些細(xì)胞系繼代培養(yǎng)在一種合適的培養(yǎng)基之內(nèi)或之上,這些培養(yǎng)基諸如8-氮鳥嘌呤培養(yǎng)基[8-氮鳥嘌呤加上常規(guī)培養(yǎng)基,即補(bǔ)充有谷氨酰胺(1.5mM),2-巰基乙醇(5×10-5M),慶大霉素(10微克/毫升)與胎牛血清(FCS;10%)的RPMI1640培養(yǎng)基];IMDM(Iscove改良的Dulbecco’s培養(yǎng)基);或Dulbecco’sMEN,并且在進(jìn)行細(xì)胞融合之前它們最后在常規(guī)培養(yǎng)基之內(nèi)或之上繼代培養(yǎng)3至4天以便于在融合時(shí)可以得到2×107或更多的融合細(xì)胞。(3)細(xì)胞融合在小鼠的情況下,例如將5至10微克的人TPO/動(dòng)物向已經(jīng)按步驟(1)的方式進(jìn)行免疫接種的小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)或皮下給藥,并且在3-4天后切去小鼠的脾臟以獲得脾細(xì)胞。象在步驟(2)中所制備的骨髓瘤細(xì)胞一樣,把如此得到的脾細(xì)胞也用培養(yǎng)基或PBS充分地洗滌,在將這兩種細(xì)胞以脾細(xì)胞比骨髓瘤細(xì)胞大約為5-10∶1的比例進(jìn)行混合后,然后使之離心。棄去所得到的上清液,而且充分地分散沉淀的細(xì)胞,并且當(dāng)向該懸浮液中加入溶于類似DMEM的培養(yǎng)基的聚乙二醇(PEG分子量為1,000至4,000)溶液的同時(shí)于37℃下攪拌該細(xì)胞1至2分鐘直至脾細(xì)胞的數(shù)量變?yōu)槊?.1-1.0毫升懸浮液有108個(gè)細(xì)胞為止,另外再持續(xù)攪拌1至2分鐘。在攪拌后,將1至3毫升的培養(yǎng)基加入到懸浮液中,與此同時(shí)攪拌1至3分鐘并且隨后緩慢地加入7至10毫升同樣的培養(yǎng)基。在37℃下保留該懸浮液5至10分鐘,然后離心。棄去所得到的上清液,并且將殘留的細(xì)胞再懸浮于FCS-補(bǔ)充培養(yǎng)基中并進(jìn)行離心。重復(fù)該步驟二或三次。將該細(xì)胞慢慢地懸浮在50至200毫升FCS-補(bǔ)充培養(yǎng)基中,并且以孔體積一半的量向一塊培養(yǎng)平板的孔中分配該懸浮液,采用一個(gè)3-7%的二氧化碳溫育箱在35至38℃下培養(yǎng)該懸浮液10至18小時(shí)。向該培養(yǎng)平板的孔中以孔體積一半的量分配HAT培養(yǎng)基(在常規(guī)培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤(10-6至10-3M),氨基蝶呤(10-8至10-7M)與胸苷(10-6至10-4M)),并且持續(xù)該培養(yǎng)10至30小時(shí)。此后,在1到4天的時(shí)間里每隔10至30小時(shí)除去一半體積的培養(yǎng)上清液的液體并且代之以同樣體積的新鮮HAT培養(yǎng)基,采用一個(gè)3-7%的二氧化碳溫育箱在35至38℃下培養(yǎng)該細(xì)胞10至14天。
當(dāng)在孔中觀察到呈一個(gè)集落形式生長(zhǎng)的雜交瘤時(shí),除去在孔中一半體積的上清液液體并且代之以同樣體積的HT培養(yǎng)基(不含氨基蝶呤的HAT培養(yǎng)基),并且隨后在1到3天的時(shí)間里每隔10至30小時(shí)進(jìn)行HT培養(yǎng)基對(duì)上清液液體的替換。在HT培養(yǎng)基中培養(yǎng)3至4天后,從該培養(yǎng)物中取出一部分培養(yǎng)上清液并且通過酶免疫測(cè)定方法來測(cè)定該上清液的抗-TPO抗體的滴度。
將由上面的抗體滴度測(cè)定來確定其特異抗體產(chǎn)率的雜交瘤轉(zhuǎn)移到另一塊平板上進(jìn)行克隆??梢酝ㄟ^一種經(jīng)有限稀釋來稀釋該雜交瘤從而在一個(gè)孔中含有一個(gè)單一的雜交瘤細(xì)胞的方法,一種從軟瓊脂培養(yǎng)基中分離集落的軟瓊脂方法,一種采用顯微操作器挑取單一的雜交瘤細(xì)胞的方法,或者一種采用細(xì)胞分選儀分離單一的雜交瘤細(xì)胞的“分選儀克隆”方法,并且優(yōu)選為簡(jiǎn)單或易于操作的有限稀釋方法來進(jìn)行這種克隆。對(duì)于確定抗體滴度所在的孔而言,例如通過有限稀釋方法重復(fù)該克隆2至4次,并且篩選表明具有一個(gè)穩(wěn)定的抗體滴度的克隆作為產(chǎn)生抗-TPO抗體的雜交瘤細(xì)胞系。(4)制備單克隆抗體以常規(guī)培養(yǎng)基代替HT培養(yǎng)基來培養(yǎng)在上面步驟(3)中得到的雜交瘤。采用旋動(dòng)或滾瓶實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)。例如通過把從大規(guī)模培養(yǎng)中得到的上清液液體進(jìn)行凝膠過濾以收集并純化IgG組分便可以得到抗-人TPO單克隆抗體。
在另一方面,當(dāng)免疫接種的動(dòng)物為小鼠時(shí),可以在屬于同品系(例如Balb/c或Nu/NU)的其它小鼠的腹腔內(nèi)培育該雜交瘤。在這種情況下,當(dāng)把在上面的步驟(3)中得到的產(chǎn)生抗-TPO單克隆抗體的雜交瘤通過腹膜內(nèi)注射以4×104-107細(xì)胞/動(dòng)物的劑量向經(jīng)降植烷-處理的雌性小鼠(4至8周齡)給藥時(shí),在給藥后2至3周該雜交瘤引起腹水腫瘤。當(dāng)從每只小鼠中收集該腹水液體并通過離心除去任意一種固體成分時(shí),它便可以用作檢測(cè)或定量和純化人TPO的一種單克隆抗體。如果需要進(jìn)一步的純化,可以使用DEAE-Sepharose柱,蛋白A-Sepharose柱或者類似柱從離心過的上清液中收集IgG組分。
通過Ouchterlony方法(免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)介紹,生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法15,由Gakkai Shuppan中心出版,東京,日本,第74頁,1981)或EIA進(jìn)行該抗體的同種型或亞類的鑒定。
通過Folin-Lowry方法并且通過在280nm下的吸光度[1.4(OD280)=免疫球蛋白1毫克/毫升]來計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。
制備本發(fā)明的單克隆抗體的方法將在下面的實(shí)施例中進(jìn)行描述,其中發(fā)現(xiàn)從雜交瘤細(xì)胞系L3-1與L4-1所得到的單克隆抗體(命名為L(zhǎng)3-1與L4-1)分別屬于IgG2a和IgG2b亞類。
在下面的實(shí)施例中描述了所得到的單克隆抗體L3-1與L4-1的抗原特異性。
本發(fā)明的單克隆抗體可以在親和色譜中用作分離和純化人TPO的配體。根據(jù)采用象CNBr-活化的Sepharose 4B(pharmacia精細(xì)化學(xué)品廠)的凝膠載體或膜載體的多種蛋白質(zhì)固定化技術(shù)可以制備在親和色譜中有用的固定化單克隆抗體。為了采用固定化的單克隆抗體純化人TPO,在一個(gè)柱中裝填該抗體并且將含有人TPO的溶液加入柱中。此后,未結(jié)合的物質(zhì)被洗出并且將結(jié)合到該柱上的TPO進(jìn)行洗脫,例如采用可以含有氯化鈉,丙酸,二氧雜環(huán)己烷,乙二醇,離液鹽,gluanidine的鹽酸化物,尿素或類似物的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液(pH2.5)洗脫。
本發(fā)明的單克隆抗體可以用于檢測(cè)人TPO,例如通過象固相夾心方法的酶免疫測(cè)定方法來測(cè)定。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案,本發(fā)明的檢測(cè)或定量方法包括將抗-TPO單克隆抗體與含有TPO的樣品接觸以檢測(cè)或定量所形成的免疫復(fù)合物。
固相夾心方法是通過下面的步驟進(jìn)行的。
固相夾心方法是一種非競(jìng)爭(zhēng)性固相酶免疫測(cè)定方法,其中一個(gè)抗原采用兩種不同的可以識(shí)別同一抗原不同表位的抗體來檢測(cè)或定量。即,在第一步把識(shí)別TPO的抗體固定化在固相上,之后在第二步通過形成一種TPO與固定化在固相上的抗體的免疫復(fù)合物而將TPO吸附在該固相上。在第三步,通過TPO與一個(gè)被標(biāo)記的抗體或抗體片段的反應(yīng)來檢測(cè)或定量TPO,其中該抗體或抗體片段可以識(shí)別一個(gè)TPO表位而不是識(shí)別由在第一步中采用的抗體可識(shí)別的表位。被標(biāo)記的抗體或其片段可以通過采用諸如辣根過氧化物酶的一種酶直接以馬來酰亞胺-鉸鏈(hinge)方法或類似方法,或者間接以親和素-生物素方法或類似方法標(biāo)記該抗體或其片段來制備。
實(shí)施例現(xiàn)給出下面的實(shí)施例以便于更為詳細(xì)地說明本發(fā)明。實(shí)施例1制備抗原蛋白h6T(1-163)將顯示在序列表(SEQ ID NO3)中編碼h6T(1-163)的DNA進(jìn)行化學(xué)合成并且克隆到已經(jīng)用XbaI和Hind III消化的pCFM536(ATCCNo.39934;JP-A-60-501988)中[采用事先以pMW1(ATCC No.39933)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109作為宿主]。把如此得到的克隆命名為pCFM536/h6T(1-163),并且采用含有這一表達(dá)載體的大腸桿菌菌株作為用于h6T(1-163)表達(dá)的轉(zhuǎn)化體。
表達(dá)質(zhì)粒pCFM536的表達(dá)受一個(gè)λPL啟動(dòng)子的控制,其中該啟動(dòng)子在一個(gè)cI857阻抑基因的控制之下。將上述轉(zhuǎn)化體于30℃下在60毫升補(bǔ)充有50微克/毫升α-氨基芐青霉素與12.5微克/毫升四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中搖振培養(yǎng)過夜,并且將25毫升該培養(yǎng)物加入到1,000毫升補(bǔ)充有50微克/毫升α-氨基芐青霉素的LB培養(yǎng)基中并在30℃下?lián)u振培養(yǎng)直至在A600下的OD達(dá)到1.0至1.2為止。接下來,加入大約330毫升預(yù)熱至65℃的LB培養(yǎng)基以便于最終的溫度變?yōu)?2℃,并且于42℃下持續(xù)該搖振培養(yǎng)3小時(shí)以誘導(dǎo)h6T(1-163)的表達(dá)。
將0.6克產(chǎn)生h6T(1-163)的轉(zhuǎn)化體的冷凍細(xì)胞懸浮在3毫升水中并且采用一臺(tái)高壓粉碎器粉碎該細(xì)胞。通過離心回收被沉淀的組分,借此除去大部分受污染的蛋白質(zhì),細(xì)胞組分及其類似物。將如此回收的含有h6T(1-163)的沉淀組分懸浮在2毫升水中,并與0.5毫升的1M Tris-HCl緩沖液(pH8.5)和10毫升的10M尿素混合,然后在室溫下攪拌5分鐘。向4毫升所得到的懸浮液中加入28毫升的20mM Tris-HCl緩沖液(pH8.5)與8毫升含有1M尿素的20mM Tris-HCl緩沖液(pH8.5),接下來在4℃下輕度攪拌過夜。通過離心回收被沉淀的組分,并且在室溫下通過加入200微升含有8M胍,5%乙氰和0.3%EDTA的0.5MTris-HCl緩沖液(pH8.5)使得如此回收的含有h6T(1-163)的沉淀組分進(jìn)行增溶溶解,然后在加入20毫克DTT之后使該組分在60℃下經(jīng)過1小時(shí)的還原處理。接下來采用一種洗脫溶劑A(0.1%TFA)和一種洗脫溶劑B(含有0.05%TFA的n-PrOH),將一份100微升的該組分加入到一個(gè)已用25%B平衡的Capcell Pak C1 300A(由Sheseido生產(chǎn),目錄(Ca.)號(hào).C1類型SG300A,φ4.6×150毫米)柱中,然后采用從25%B至40%B的50分鐘的線性梯度在0.4毫升/分鐘的流速下進(jìn)行展開以回收在從大約28%至大約30%n-PrOH的范圍內(nèi)洗脫的h6T(1-163)的峰組分。在向該組分加入100毫升50%的甘油后,通過離心-蒸發(fā)除去TFA和n-PrOH以制備用作抗原的h6T(1-163)。實(shí)施例2制備產(chǎn)生抗-人TPO單克隆抗體的雜交瘤(1)免疫接種小鼠將在實(shí)施例1中得到的500微克h6T(1-163)與1,000微升的RIVIADJUVANT(由免疫化學(xué)研究所生產(chǎn),目錄號(hào)52017700)充分混合以形成一種乳狀液。接下來,在用醚麻醉下向每只Balb/c雌性小鼠(4周齡)的爪墊注射5微克抗原/只小鼠。每隔3天按如上同樣的方式重復(fù)加強(qiáng)免疫共8次。在最后一次加強(qiáng)免疫時(shí),通過皮下注射以5微克/只小鼠的劑量注射人IL-6。在最后一次加強(qiáng)免疫3天后,采用血細(xì)胞比容毛細(xì)管從軌道中收集血液,并且從中分離出血清以便通過酶免疫測(cè)定方法來測(cè)定血液的抗體滴度及其與h6T(1-163)的反應(yīng)性。在接下來的細(xì)胞融合中采用表明具有1∶1000或者更高的抗體滴度以及TPO反應(yīng)性的小鼠的脾細(xì)胞。(2)制備骨髓瘤細(xì)胞系將骨髓瘤細(xì)胞(P3X63-Ag.8-653)解凍,懸浮在添加了10%FCS(由Hyclone生產(chǎn),目錄號(hào).A-1115-L)的DMEM培養(yǎng)基中,然后在300×g下離心5分鐘。棄去上清液,并且將殘留的細(xì)胞重新懸浮在10%FCS/DMEM中,并于37℃下在5%的二氧化碳溫育箱中進(jìn)行培養(yǎng)。(3)細(xì)胞融合按常規(guī)的方式進(jìn)行細(xì)胞融合。簡(jiǎn)而言之,無菌除去用h6T(1-163)免疫接種的小鼠的局部(即腹股溝,腸系膜)淋巴結(jié)和脾臟,并且將該淋巴結(jié)細(xì)胞和脾細(xì)胞分別懸浮在10%FCS/DMEM中以制備產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。接下來,將處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的1份骨髓瘤細(xì)胞與5份淋巴結(jié)細(xì)胞或脾細(xì)胞混合,用DMEM洗滌以除去血清,然后采用聚乙二醇(PEG1500,由Boehringer Mannheim生產(chǎn),目錄號(hào)783641)使之進(jìn)行細(xì)胞融合。在細(xì)胞融合完成后,用含有10%FCS和10納克/毫升的人IL-6的DMEM調(diào)節(jié)所得到的細(xì)胞至1×106細(xì)胞/毫升,并且將其以一份100微升分配至一塊96-孔微量滴定板(Nunc-Immuno P1ate MaxiSorpTM,由InterMed生產(chǎn),目錄號(hào)4-42404)的孔中。在18小時(shí)后,將含有2×HAT(由SIGMA生產(chǎn),目錄號(hào)H0262)的10%FCS/10納克/毫升-人IL-6/DMEM以100微升/孔的量加入孔中,并且于37℃下在一個(gè)5%的二氧化碳溫育箱中在大約10至大約14天的期間內(nèi)培養(yǎng)該細(xì)胞。(4)篩選生產(chǎn)抗-人TPO單克隆抗體的雜交瘤產(chǎn)生抗-人TPO單克隆抗體的雜交瘤是通過一種酶免疫測(cè)定方法進(jìn)行篩選的。用PBS調(diào)節(jié)h6T(1-163)或CHO(1-332)至20微克/毫升,并且將其以一份50微升分配至一塊96-孔微量滴定板(Nunc-ImmunoPlate MaxiSorpTM,由InterMed生產(chǎn),目錄號(hào)4-42404)的孔中。當(dāng)采用一個(gè)微量板混合器(微量板混合器MPM-1,由Iwaki Glass生產(chǎn))振蕩該平板時(shí),抗原在每個(gè)孔的底部充分分散。用平板密封(由SUMILON生產(chǎn),目錄號(hào)MS-30020)密封該平板,并用在37℃下保留該平板2小時(shí)或者在4℃下保留過夜以便吸附抗原至該平板上。接下來,在用20mM Tris-HCl/0.5M氯化鈉/0.1%Tween 20的洗滌緩沖液(pH7.5)洗滌后,向每個(gè)孔中加入300微升稀釋了4倍的Block Ace(由Dainippon制藥廠生產(chǎn),目錄號(hào)UK-B25),并且用平板密封密封該平板,并在37℃下保留該平板1小時(shí)或者在4℃下保留過夜。在用洗滌緩沖液洗滌4次之后,向每個(gè)孔中加入50微升雜交瘤克隆的培養(yǎng)上清液液體,并且采用一個(gè)微量板混合器振蕩該平板并用平板密封進(jìn)行密封,然后使該平板在37℃下反應(yīng)小時(shí)。在該反應(yīng)以及隨后用洗滌緩沖液洗滌4次完成后,向每個(gè)孔中加入50微升在稀釋了10倍的Block Ace中已按1∶500稀釋的堿性磷酸酶-標(biāo)記的蛋白A(PIERCE,目錄號(hào)32300),并且在一個(gè)微量板混合器上振蕩該平板,用平板密封進(jìn)行密封,然后使該平板在37℃下反應(yīng)1小時(shí),在反應(yīng)后,用洗滌緩沖液洗滌孔4次,向每個(gè)孔中加入100微升用于堿性磷酸酶的顏色展開試劑盒(Kirkegaard & Perry實(shí)驗(yàn)室,目錄號(hào)50-80-00)的顏色形成物,并且在一個(gè)微量板混合器上振蕩該平板,用平板密封進(jìn)行密封,然后使該平板在室溫下反應(yīng)。在大約30分鐘后,采用一個(gè)平板讀數(shù)器(Wellreader SK601,由SeikagakuKogyo生產(chǎn))測(cè)定在405nm處的吸光度,從孔中篩選對(duì)h6T(1-163)和CHO(1-332)均呈陽性的克隆。將如此篩選的克隆擴(kuò)增并冷凍直至使用。與此同時(shí),通過有限稀釋方法進(jìn)行克隆。采用含有1×HT(由SIGMA生產(chǎn),目錄號(hào)H0137)的10%FCS/10納克/毫升-人IL-6/DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行有限稀釋,第二次篩選是通過酶免疫測(cè)定方法按照與上面相同的方式來進(jìn)行的。當(dāng)該克隆被穩(wěn)定時(shí),在10%FCS/DMEM中繼代培養(yǎng)該克隆,擴(kuò)增該克隆,然后冷凍它們直至使用。(5)識(shí)別-人TPO單克隆抗體的位點(diǎn)通過以上的方法總共得到了63個(gè)抗-人TPO單克隆抗體的克隆。從這些克隆中篩選出了13個(gè)具有高反應(yīng)性的克隆,并且通過與在上面的步驟(4)中采用的同樣的酶免疫測(cè)定方法、采用在顯示于SEQ ID NO1中的人TPO氨基酸序列的基礎(chǔ)上所合成的多種抗原的肽(HT-1,2,3,4,5和6)(參見表1)測(cè)定了它們與TPO蛋白反應(yīng)的區(qū)域。結(jié)果得到了一個(gè)與HT-1反應(yīng)的抗體(抗體L3-1),一個(gè)與HT-2反應(yīng)的抗體(抗體L4-1),10個(gè)與HT-3反應(yīng)的抗體(抗體L1-10,S6-27,S3-13,S2-2,L3-15,L2-43,L3-4,L4-13,S4-12和S3-52)。
表1人TPO(氨基酸位點(diǎn)8至28)肽HT-1區(qū)域DLRVLSKLLRDSHVLHSRLSQ人TPO(氨基酸位點(diǎn)47至62)肽HT-2區(qū)域SLGEWKTQMEETKAQD人TPO(氨基酸位點(diǎn)108至126)肽HT-3區(qū)域LGTQLPPQGRTTAHKDPNA人TPO(氨基酸位點(diǎn)172至190)肽HT-4區(qū)域NELPNRTSGLLETNFTASA人TPO(氨基酸位點(diǎn)262至284)肽HT-5區(qū)域SLPPNLQPGYSPSPTHPPTGQYT人TPO(氨基酸位點(diǎn)306至332)肽HT-6區(qū)域PSAPTPTPTSPLLNTSYTHSQNLSQEG保藏機(jī)構(gòu)國家生物科學(xué)與人體技術(shù)研究院,工業(yè)科學(xué)與技術(shù)機(jī)構(gòu)地址1-3,Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,日本保藏機(jī)構(gòu)中國典型培養(yǎng)物保藏中心地址珞珈山,武漢430072,中國就此而論,雜交瘤L4-1的亞克隆(L4-1-31)與雜交瘤L3-1的亞克隆(L3-1-54)已于1994年12月27日保藏在日本國際貿(mào)易與工業(yè)部工業(yè)科學(xué)與技術(shù)機(jī)構(gòu)的國家生物科學(xué)與人體技術(shù)研究院,保藏號(hào)分別為FERM BP-4956與FERM BP-4955,這些亞克隆也被中國保藏機(jī)構(gòu)(CCTCC)所保藏,保藏號(hào)分別為CCTCC-C95003與CCTCC-C95002,該亞克隆分別命名為小鼠-小鼠雜交瘤L4-1-31和小鼠-小鼠雜交瘤L3-1-54。(6)抗-人TPO單克隆抗體的亞類通過EIA方法(INNOGENETICS)測(cè)定在上面步驟(5)中得到的抗-人TPO單克隆抗體L3-1,L4-1,L1-10,S6-27以及S3-13的亞類。將每種培養(yǎng)物的上清液與一種固定化的大鼠抗-小鼠(亞類特異的)單克隆抗體進(jìn)行反應(yīng),隨后使之與一種堿性磷酸酶-標(biāo)記的大鼠抗-小鼠(κ/輕鏈特異的)單克隆抗體進(jìn)行反應(yīng)。在反應(yīng)完成后,通過加入BCIP底物進(jìn)行顏色展開以測(cè)定亞類。結(jié)果,發(fā)現(xiàn)抗-人TPO單克隆抗體L3-1,L4-1,L1-10,S6-27以及S3-13的亞類分別為IgG2a,IgG2b,IgG3,IgG3和IgG3。(7)純化抗-人TPO單克隆抗體將產(chǎn)生抗-人TPO單克隆抗體的雜交瘤在1升補(bǔ)充有10毫克牛胰島素,10毫克人運(yùn)鐵蛋白,20mM單乙醇胺和5×10-5M亞硒酸鈉的不含血清的eRDF培養(yǎng)基中采用滾瓶(Falco,目錄號(hào)3000)大規(guī)模培養(yǎng)。當(dāng)雜交瘤的存活率達(dá)到90%或以下時(shí),進(jìn)行離心以回收培養(yǎng)上清液,隨后該上清液通過0.22微米的膜過濾器過濾。將所得到的培養(yǎng)上清液在100毫升/分鐘的流速下加到一個(gè)已用0.15M磷酸緩沖液(PBS)平衡的蛋白A柱(由Fuji過濾器工業(yè)K.K.生產(chǎn),日本)中。在培養(yǎng)上清液中的抗體吸附到蛋白A上之后,通過在100毫升/分鐘的流速下使PBS穿過該柱洗去未被吸附的物質(zhì)直至在280nm下的吸附值達(dá)到基線為止。在洗去未被吸附的物質(zhì)之后,采用0.1M的甘氨酸洗脫液(pH2.5)洗脫并回收該抗體。所回收的溶液用0.1M Tris進(jìn)行中和,通過超濾將其調(diào)節(jié)到一個(gè)合適的濃度,滅菌,然后在-20℃下儲(chǔ)存。實(shí)施例3采用抗-人TPO單克隆抗體的ELISA用50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.2)調(diào)節(jié)作為固相抗體識(shí)別HT-1區(qū)域的抗-人TPO單克隆抗體(L3-1的L3-1-54亞類)至20微克/毫升,并且將其以一份50微升分配至一塊96-孔微量滴定板(Nunc-ImmunoPlate MaxiSorpTM,由InterMed生產(chǎn),目錄號(hào)4-42404)的孔中。通過采用一個(gè)微量板混合器(微量板混合器MPM-1,由Iwaki Glass生產(chǎn))振蕩該平板,固相抗體在每個(gè)孔的底部充分分散。用平板密封(由SUMILON生產(chǎn),目錄號(hào)MS-30020)密封該平板,并且在37℃下保留該平板2小時(shí)或者在4℃下保留過夜以便吸附該固相抗體至該平板上。在用洗滌緩沖液(20mM Tris-HCl/0.5 M氯化鈉/0.1% Tween 20(pH7.5)洗滌后,向每個(gè)孔中加入300微升稀釋了4倍的Block Ace(由Dainippon制藥廠生產(chǎn),目錄號(hào)UK-B25),并且用平板密封密封該平板,并在37℃下保留該平板1小時(shí)或者在4℃下保留過夜。在用洗滌緩沖液洗滌4次之后,向每個(gè)孔中加入一個(gè)50微升待檢測(cè)的樣品或者在稀釋了10倍的Block Ace中作為標(biāo)準(zhǔn)稀釋的已知濃度的TPO,并且在微量板混合器上振蕩該平板,用平板密封進(jìn)行密封,然后在37℃下保留該平板2小時(shí)或者在4℃下保留過夜。在反應(yīng)后,用洗滌緩沖液洗滌孔4次,稀釋了10倍的Block Ace將識(shí)別HT-2區(qū)域的生物素-標(biāo)記的抗-人TPO單克隆抗體(L4-1的L4-1-31亞類;第一抗體)稀釋到500鈉克/毫升,并且將其以一份50微升分配至孔中,在一個(gè)微量板混合器上振蕩該平板,用平板密封進(jìn)行密封,然后在37℃下保留該平板2小時(shí)或者在4℃下保留過夜。在反應(yīng)后,用洗滌緩沖液洗滌孔4次,在稀釋了10倍的Block Ace中按1∶2,000稀釋過氧化物酶-標(biāo)記的親和素(UltraAvidinTM-辣根過氧化物酶,由Leinco Technologies生產(chǎn),目錄號(hào)A106),將其以一份50微升分配至孔中,并且在一個(gè)微量板混合器上振蕩該平板,用平板密封進(jìn)行密封,然后使該平板在37℃下反應(yīng)1小時(shí)。在該反應(yīng)完成并且隨后用洗滌緩沖液洗滌(×4)后,向每個(gè)孔中加入100微升的顏色形成物,其中該顏色形成物是通過將一種底物溶液以1/100的體積比加入到用于過氧化物酶的顏色展開試劑盒(SUMILON,目錄號(hào)ML-1120T)的TMBZ顏色形成物中制得的,并且在一個(gè)微量板混合器上振蕩該平板,用平板密封進(jìn)行密封,然后使該平板在室溫下反應(yīng)。在大約20分鐘后,向每個(gè)孔中加入100微升反應(yīng)終止溶液,在一個(gè)微量板混合器上振蕩該平板以終止染色反應(yīng)。采用一個(gè)ELISA平板讀數(shù)器(Wellreader SK601,由Seikagaku Kogyo生產(chǎn))測(cè)量在450nm/570nm波長(zhǎng)處的吸光度。在通過已知濃度的CHO(1-163)或CHO(1-332)得到的吸收值的基礎(chǔ)上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(參見圖1)。除了CHO(1-163)和CHO(1-332)以外,也繪制在大腸桿菌中生產(chǎn)的人TPO突變體(例如“MKT(1-332)”和“MKT(1-163)”)的另一標(biāo)準(zhǔn)曲線(參見圖2)。因此,可以定量測(cè)定不同種類的TPO分子。
MKT(1-332)具有一個(gè)向顯示在SEQ ID NO1中的人TPO氨基酸序列的N-末端加入一個(gè)Met殘基(在位點(diǎn)-2)與一個(gè)Lys殘基(在位點(diǎn)-1)的氨基酸序列。MKT(1-163)具有一個(gè)向顯示在SEQ ID NO1中的1-163氨基酸序列的N-末端加入一個(gè)Met殘基(在位點(diǎn)-2)與一個(gè)Lys殘基(在位點(diǎn)-1)的氨基酸序列此外,采用表明與在SEQ ID NO1中顯示的人TPO的N-末端氨基酸序列具有高同源性的人促紅細(xì)胞生成素(hEPO)檢測(cè)抗原的特異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這一系統(tǒng)能夠特異地檢測(cè)TPO(參見圖3)。
當(dāng)采用L3-1與S3-13,S3-13與L3-1,或者S3-13與L4-1的組合作為一種固相抗體與一種生物素-標(biāo)記的第一抗體的組合進(jìn)行夾心測(cè)定時(shí),也可以在類似于L3-1-54與L4-1-31組合的情況下進(jìn)行TPO的檢測(cè)與定量。
正如在上面具體的實(shí)施例中說明的,通過使用本發(fā)明的單克隆抗體可以檢測(cè)或定量不同種類的人TPO分子。
序列表SEQ ID NO1信息序列特征長(zhǎng)度332個(gè)氨基酸類型氨基酸最初來源人類序列描述SEQ ID NO1Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu15 10 15Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val20 25 30His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu35 40 45Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu50 55 60Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln65 70 75 80Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln85 90 95Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu100 105 110Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe115 120 125Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu130 135 140Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala145 150 155 160Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn165 170 175Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr180 185 190Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile195 200 205Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly210 2l5 220Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe225 230 235 240Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly245 250 255Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser260 265 270Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu275 280 285Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro290 295 300Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr305 310 315 320Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly325 330SEQ ID NO2信息序列特征長(zhǎng)度165個(gè)氨基酸類型氨基酸最初來源人類序列描述SEQ ID NO2Met Lys Ala Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys-2 -11 5 10Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro15 20 25 30Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe35 40 45Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp50 55 60Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg65 70 75Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser80 85 90Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr95 100 105 110Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala115 120 125Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu130 135 140Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr
145 150 155Thr Ala Val pro Ser160 163SEQ ID NO3信息序列特征長(zhǎng)度535個(gè)核苷酸類型核酸鏈 雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型合成DNA最初來源人類序列描述SEQ ID NO3CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATA 28ATG AAA GCA CCT GTA CCA CCT GCA TGT GAT TTA CGG GTC CTG TCT AAA 76Met Lys Ala Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys+1 5 10CTG CTG CGC GAC TCT CAC GTG CTG CAC TCT CGT CTG TCC CAG TGC CCG 124Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro15 20 25 30GAA GTT CAC CCG CTG CCG ACC CCG GTT CTG CTT CCG GCT GTC GAC TTC 172Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe35 40 45TCC CTG GGT GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAA GAG ACC AAA GCT CAG GAC 220Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp50 55 60ATC CTG GGT GCA GTA ACT CTG CTT CTG GAA GGC GTT ATG GCT GCA CGT 268Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg65 70 75GGC CAG CTT GGC CCG ACC TGC CTG TCT TCC CTG CTT GGC CAG CTG TCT 316Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser80 85 90GGC CAG GTT CGT CTG CTG CTC GGC GCT CTG CAG TCT CTG CTT GGC ACC 364Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr95 100 105 110CAG CTG CCG CCA CAG GGC CGT ACC ACT GCT CAC AAG GAT CCG AAC GCT 412Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala115 120 125ATC TTC CTG TCT TTC CAG CAC CTG CTG CGT GGC AAA GTT CGT TTC CTG 460Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu130 135 140ATG CTG GTT GGC GGT TCT ACC CTG TGC GTT CGT CGG GCG CCG CCA ACC 508Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr145 150 155ACT GCT GTT CCG TCT TAATGAAAGC TT535Thr Ala Val Pro Ser160
權(quán)利要求
1.一種針對(duì)人TPO的單克隆抗體。
2.一種純化TPO的方法,該方法包括采用一種針對(duì)人TPO的單克隆抗體通過親和層析從一種含有TPO的物質(zhì)中分離TPO。
3.一種用免疫化學(xué)方法定量或檢測(cè)TPO的方法,其特征在于使用了針對(duì)人TPO的單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法,該方法包括將該單克隆抗體與一種含有TPO的樣品接觸以定量或檢測(cè)所形成的免疫復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種針對(duì)人血小板生成素(TPO)的單克隆抗體,一種純化TPO的方法,該方法包括采用該抗體通過親和層析從一種含有TPO的物質(zhì)中分離TPO,以及采用該抗體用于免疫化學(xué)定量或檢測(cè)TPO的方法。通過采用抗-TPO的單克隆抗體可以純化,檢測(cè)或定量不同類型的人的TPO分子。
文檔編號(hào)C12P21/08GK1178537SQ96192592
公開日1998年4月8日 申請(qǐng)日期1996年1月16日 優(yōu)先權(quán)日1995年1月17日
發(fā)明者宮崎洋 申請(qǐng)人:麒麟麥酒株式會(huì)社
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