專利名稱：表達(dá)降低水平的金屬蛋白酶的宿主細(xì)胞和在蛋白質(zhì)產(chǎn)生中使用該宿主細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的宿主細(xì)胞和產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及對(duì)表達(dá)異源蛋白質(zhì)有用的宿主細(xì)胞，為了表達(dá)明顯降低水平的金屬蛋白酶，該宿主細(xì)胞已經(jīng)遺傳修飾過(guò)。此外本發(fā)明涉及產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法，該方法包括在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，接著回收所需蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
近年來(lái)在表達(dá)異源蛋白質(zhì)中重組宿主細(xì)胞的使用大大簡(jiǎn)化了商業(yè)上有價(jià)值的許多蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，這些蛋白質(zhì)原來(lái)僅僅可以通過(guò)從它們的天然源純化產(chǎn)生。當(dāng)前，有用來(lái)產(chǎn)生任何給定的蛋白質(zhì)的多種供選擇的表達(dá)系統(tǒng)，包括真細(xì)菌和真核宿主。對(duì)一個(gè)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)的選擇常常不僅取決于宿主細(xì)胞產(chǎn)生足夠量的活性狀態(tài)蛋白質(zhì)的能力，而且在很大程度上受制于蛋白質(zhì)的最終用途。
經(jīng)常遇到的一個(gè)問(wèn)題是給定的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的或在培養(yǎng)基中的高水平的蛋白酶。已有人提出人們可以提供喪失了產(chǎn)生特異性蛋白酶解化合物能力的宿主生物體。例如，國(guó)際專利申請(qǐng)WO 90/00192描述了不能分泌酶活性天冬氨酸蛋白酶的絲狀真菌宿主；EP 574 347描述了缺失枯草桿菌蛋白酶-型絲氨酸蛋白酶的曲霉屬宿主。
金屬蛋白酶已經(jīng)從許多真核源分離到。也已報(bào)道了從曲霉屬菌株分離的中性金屬蛋白酶，即，在中性pH時(shí)具有最佳活性的金屬蛋白酶。中性金屬蛋白酶被分成兩組NpI和NpII[Sekine，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，1972 36 207-216]。最近公開(kāi)了來(lái)源于米曲霉的中性金屬蛋白酶II cDNA的核苷酸序列[Tatsumi H，Murakami S，Tsuji RF，Ishida Y，Murakami K，Masaki A，Kawabe H，Arimura H，Nakano E和Motai H；Mol.Gen.Genet.1991 22897-103]。從未公開(kāi)過(guò)來(lái)源于米曲霉的中性金屬蛋白酶I cDNA的核苷酸序列。
雖然金屬蛋白酶已被報(bào)道，但從未描述過(guò)它們與降低從這些生物體所獲產(chǎn)物的穩(wěn)定性的關(guān)系。
發(fā)明概要按照本發(fā)明，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)金屬蛋白酶可以明顯地降低從細(xì)胞獲得的產(chǎn)物的穩(wěn)定性。
因此，本發(fā)明提供了對(duì)異源蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)有用的宿主細(xì)胞，為了表達(dá)明顯降低水平的金屬蛋白酶，該宿主細(xì)胞已經(jīng)遺傳修飾過(guò)。
另一方面，本發(fā)明提供了一種在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，該方法包括將編碼所說(shuō)蛋白質(zhì)的核酸序列引入到所說(shuō)的宿主細(xì)胞中，在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，并分離所說(shuō)的異源蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
通過(guò)本發(fā)明的方法，金屬蛋白酶產(chǎn)生的蛋白酶解作用被明顯減小，由此改善了由所述方法獲得的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。此外，用本發(fā)明的方法獲得的蛋白質(zhì)可以以下列形式獲得前體蛋白(即酶原)，雜合蛋白，作為原(pro)序列或原-前(pre-pro)序列或者以非成熟形式獲得的蛋白質(zhì)。
附圖簡(jiǎn)要描述參照附圖進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，在附圖中

圖1顯示質(zhì)粒pSO2的圖譜，參見(jiàn)實(shí)施例2；圖2顯示米曲霉菌株HowB101的構(gòu)建，參見(jiàn)實(shí)施例2；圖3顯示質(zhì)粒pJaL335的構(gòu)建，參見(jiàn)實(shí)施例2；圖4顯示質(zhì)粒pJaL399的構(gòu)建，參見(jiàn)實(shí)施例2；圖5顯示質(zhì)粒pJaL218的構(gòu)建，參見(jiàn)實(shí)施例4；和圖6顯示質(zhì)粒pToC56的圖譜，參見(jiàn)實(shí)施例5。
發(fā)明詳述宿主細(xì)胞本發(fā)明提供了對(duì)表達(dá)異源蛋白質(zhì)有用的宿主細(xì)胞，與親本細(xì)胞比較，為了表達(dá)明顯降低水平的金屬蛋白酶，該宿主細(xì)胞已經(jīng)遺傳修飾過(guò)。
所述親本細(xì)胞是所說(shuō)宿主細(xì)胞的來(lái)源。它可以是野生型細(xì)胞。此外，除在金屬蛋白酶水平上降低之外，它可以在另一方面被遺傳改變。
為了產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)，本發(fā)明的宿主細(xì)胞顯然必須擁有表達(dá)所需產(chǎn)物所必需的結(jié)構(gòu)基因區(qū)(即包含編碼核苷酸序列的區(qū))和調(diào)節(jié)基因區(qū)(即包含對(duì)例如轉(zhuǎn)錄、翻譯和終止所必需的核苷酸序列的區(qū))。這樣的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)區(qū)的性質(zhì)極大地取決于所述的產(chǎn)物和宿主細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞的遺傳設(shè)計(jì)可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員用轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)[參見(jiàn)例如Sambrook等，分子克隆，冷泉港，NY，1989]完成。
優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞通過(guò)用本領(lǐng)域已知的方法引入適當(dāng)?shù)目寺≥d體(即質(zhì)?；蜉d體)修飾，所述克隆載體包含編碼所需產(chǎn)物的DNA片段。該克隆載體可以作為自主復(fù)制質(zhì)粒引入到宿主細(xì)胞中，或者以整合進(jìn)染色體的方式引入到宿主細(xì)胞中。優(yōu)選的克隆載體包含一個(gè)或多個(gè)有效連接到一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)上的結(jié)構(gòu)區(qū)。
所述結(jié)構(gòu)區(qū)是擁有編碼所需產(chǎn)物的核苷酸序列的區(qū)。所述調(diào)節(jié)區(qū)包括包含轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列的啟動(dòng)子區(qū)，包含終止信號(hào)的終止子區(qū)和聚腺苷酸化區(qū)。啟動(dòng)子(即在選擇的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的核苷酸序列)可以是來(lái)自編碼胞外或胞內(nèi)蛋白質(zhì)的基因的一種，所述蛋白質(zhì)優(yōu)選的是酶，如淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、脂酶、纖維素酶、木聚糖酶、氧化還原酶、果膠酶、角質(zhì)酶或糖酵解酶。在真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適的啟動(dòng)子的例子是來(lái)源于編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(gluA)、黑曲霉乙酰胺酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸酶異構(gòu)酶、Rhizopus meihei天冬氨酸蛋白酶和Rhizopus meihei脂酶之基因的啟動(dòng)子。優(yōu)選的是米曲霉TAKA-淀粉酶和泡盛曲霉gluA啟動(dòng)子。
克隆載體也可以包括一個(gè)選擇性標(biāo)記，例如其產(chǎn)物補(bǔ)充宿主細(xì)胞的缺陷的一種基因，或賦予抗生素(如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素)抗性的一種基因。曲霉屬選擇性標(biāo)記的例子包括amdS、pyrG、argB、niaD和sC，產(chǎn)生潮霉素抗性的標(biāo)記。優(yōu)選的用于曲霉屬宿主細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG標(biāo)記。一個(gè)經(jīng)常使用的哺乳動(dòng)物標(biāo)記是二氫葉酸還原酶(DHFR)基因。此外，選擇可以由共-轉(zhuǎn)化完成。
分別連接本發(fā)明的DNA構(gòu)建體、啟動(dòng)子、終止子和其它元件，以及將它們插入到包含復(fù)制所需信息的合適的克隆載體中的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的[參見(jiàn)例如Sambrook等，分子克隆，冷泉港，NY，1989]。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是常規(guī)用于異源蛋白質(zhì)表達(dá)的的任何宿主細(xì)胞。
優(yōu)選地，本發(fā)明的宿主細(xì)胞是一種能夠產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的酵母或絲狀真菌。具體地說(shuō)，酵母細(xì)胞可以是酵母屬的菌株，優(yōu)選的是啤酒酵母。具體地說(shuō)，絲狀真菌可以是選自頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、假絲酵母屬(Candida)、Cocliobolus、內(nèi)座殼屬(Endothia)、鐮孢屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、鏈孢霉屬(Neurospora)、根毛霉屬(Rhizomucor)、根霉屬(Rhizopus)、Thermomyces、木霉屬(Trichoderma)、柄孢殼屬(Podospora)、Pyricularia或青霉屬(Penicillium)的菌株。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述絲狀真菌是選自米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、海棗曲霉(Aspergillus phoenicis)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、Aspergillus foetus、禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)、尖鐮孢(Fusarium oxysporum)、腐皮鐮孢(Fusariumsolani)、灰腐質(zhì)霉(Humicola griseea)、粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)、Rhizomucor meihei、Trichodermareesei和綠色木霉(Trichoderma viride)的菌株。產(chǎn)物所需最后產(chǎn)物(即由本發(fā)明的宿主細(xì)胞表達(dá)的異源蛋白質(zhì))可以是任何真細(xì)菌或真核蛋白質(zhì)。
如本文所限定的，″異源蛋白質(zhì)產(chǎn)物″是對(duì)宿主細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)，或已進(jìn)行修飾改變了天然序列的天然蛋白質(zhì)，或作為以下操作的結(jié)果其表達(dá)被定量改變的天然蛋白質(zhì)，所說(shuō)操作是表達(dá)天然蛋白質(zhì)所需調(diào)節(jié)序列(如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等)的操作或經(jīng)重組DNA技術(shù)對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行的其它操作。
由于缺乏金屬蛋白酶，由宿主細(xì)胞表達(dá)的異源蛋白質(zhì)也可以是前體蛋白質(zhì)(即酶原)、雜合蛋白、作為原序列或前原-序列或以非成熟形式獲得的蛋白質(zhì)。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述產(chǎn)物是酶。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述產(chǎn)物是真核酶，如胰島素、生長(zhǎng)激素、胰高血糖素、生長(zhǎng)激素釋放抑制因子、干擾素、PDGF、凝血因子VII、凝血因子VIII、尿激酶、EPO、凝乳酶、組織血纖維蛋白溶酶原激活劑或血清白蛋白。
在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述產(chǎn)物是真菌、酵母或細(xì)菌來(lái)源的酶。
優(yōu)選的酶是糖苷酶，例如淀粉酶，特別是α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)、纖維素酶(EC3.2.1.4)、內(nèi)-1，3(4)-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)、內(nèi)-1，4-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.8)、多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20)、β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)、木聚糖-內(nèi)-1，3-β-木糖苷酶(EC 3.2.1.32)、內(nèi)-1，3-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)、內(nèi)-1，3-α-葡聚糖酶(EC 3.2.1.59)、內(nèi)-1，2-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.71)，內(nèi)-1，6-β-萄聚糖酶(EC 3.2.1.75)、纖維素-1，4-β-纖維二糖苷酶(EC3.2.1.91，也稱作纖維二糖水解酶)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酶是脂解酶，特別是脂酶、酯酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。
在第三個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酶是肌醇六磷酸酶，特別是3-肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8)或6-肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.26)。
在第四個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酶是蛋白酶。
在第五個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酶是氧化還原酶(如過(guò)氧物酶或漆酶)、果膠酶或角質(zhì)酶。
優(yōu)選的雜合多肽是凝乳酶原和原胰蛋白酶類蛋白酶。金屬蛋白酶在本發(fā)明中，所述金屬蛋白酶是包含一個(gè)催化鋅金屬中心的蛋白酶，該中心參與肽骨架的水解?；钚凿\中心區(qū)別這些蛋白酶和需鈣蛋白酶(其活性依賴于鈣的存在)。蛋白酶作為金屬蛋白酶的證據(jù)是除去鋅中心伴隨著蛋白酶解活性的喪失。所述鋅中心可以用1，10-菲咯啉(1mM)除去。在用Zn2+(0.1-100μM)滴定后，蛋白水解活性恢復(fù)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明中所述的金屬蛋白酶是鐮孢屬金屬蛋白酶，優(yōu)選的是尖鐮孢金屬蛋白酶。在大多數(shù)優(yōu)選的實(shí)施方案中，金屬蛋白酶是具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列或其同源序列的尖鐮孢p45金屬蛋白酶。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的金屬蛋白酶是中性金屬蛋白酶，其是在中性pH區(qū)(即在pH6-8的范圍內(nèi)，優(yōu)選的在pH6.5-7.5(約7)的范圍內(nèi))具有最佳蛋白水解活性的金屬蛋白酶。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明所述的金屬蛋白酶是NpI或NpII組的中性曲霉屬金屬蛋白酶。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述金屬蛋白酶是米曲霉中性金屬蛋白酶I(NpI)，該蛋白酶由包含SEQ ID NO4所示的部分核苷酸序列或其同源序列之cDNA序列編碼。
同源性程度可以以表明第一序列與第二序列差別的兩種序列之間的相同性程度確定。用計(jì)算機(jī)程序通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法(例如，通過(guò)比較50bp的連續(xù)序列)可以合適地確定同源性。如本文所限定的，由同源cDNA序列編碼的蛋白質(zhì)顯示出與所述的序列至少70％的同源性，優(yōu)選的超過(guò)80％的同源性，更優(yōu)選的超過(guò)90％的同源性，最優(yōu)選的超過(guò)95％的同源性的同源性程度。
編碼金屬蛋白酶的基因可以按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)[參見(jiàn)例如Sambrook等，分子克隆，冷泉港，NY，1989]通過(guò)篩選鑒別，該鑒別經(jīng)利用合成寡核苷酸探針雜交編碼全部或部分金屬蛋白酶的核酸序列，所述探針可以基于cDNA序列(例如SEQ ID NO1和SEQ ID NO4所示的核苷酸序列)或基于金屬蛋白酶的氨基酸序列制備。遺傳修飾為了表達(dá)明顯降低水平的金屬蛋白酶，經(jīng)遺傳修飾的本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組DNA技術(shù)進(jìn)行修飾。在金屬蛋白酶的產(chǎn)生中起作用的基因序列可以被滅活或完全除去。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞是在編碼金屬蛋白酶的結(jié)構(gòu)或調(diào)節(jié)區(qū)經(jīng)遺傳修飾過(guò)的一種。已知的和有用的技術(shù)包括但不限于特異性或隨機(jī)誘變；PCR產(chǎn)生的誘變；定點(diǎn)DNA缺失、插入和/或取代；基因破裂或基因置換技術(shù)；反義技術(shù)或它們的組合。
誘變可以采用一種合適的物理或化學(xué)誘變劑進(jìn)行。適于本發(fā)明的目的的物理或化學(xué)誘變劑的例子包括紫外(UV)照射、羥胺、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、甲烷磺酸乙酯、亞硫酸氫鈉、蟻酸和核苷酸類似物。當(dāng)使用這些誘變劑時(shí)，誘變通常經(jīng)過(guò)在適于所述誘變的合適的條件下在選擇的誘變劑存在時(shí)培養(yǎng)待誘變的細(xì)胞進(jìn)行，然后選擇金屬蛋白酶產(chǎn)量明顯降低的突變細(xì)胞。
修飾也可以通過(guò)引入、取代或除去金屬蛋白酶編碼序列中或者其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)節(jié)元件中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸來(lái)完成?？梢岳绮迦牖虺ズ塑账?，以產(chǎn)生終止密碼子的引入、起始密碼子的除去或開(kāi)放讀框的改變?？梢园凑毡绢I(lǐng)域已知的方法通過(guò)定點(diǎn)誘變或PCR產(chǎn)生的誘變完成結(jié)構(gòu)序列或調(diào)節(jié)元件的修飾或滅活。盡管從原理上說(shuō)，可以在體內(nèi)(即直接在攜帶金屬蛋白酶基因的細(xì)胞上)完成修飾，但目前優(yōu)選在體外進(jìn)行。
一種方便的滅活或降低所選宿主細(xì)胞的金屬蛋白酶產(chǎn)生能力的方法基于基因中斷原理。這一方法包括使用相應(yīng)于需要消除的內(nèi)源基因或基因片段的DNA序列。將所說(shuō)DNA序列體外突變成缺陷基因，并轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞中。經(jīng)同源重組，缺陷基因取代所說(shuō)內(nèi)源基因或基因片段。最好是缺陷基因或基因片段編碼可用于選擇轉(zhuǎn)化子(其中編碼所說(shuō)金屬蛋白酶的基因已被修飾或消除)的標(biāo)記。
另外，可以經(jīng)使用已有的反義技術(shù)用互補(bǔ)于金屬蛋白酶編碼序列(例如SEQ ID NO1和SEQ ID NO4所示的核苷酸序列)的核苷酸序列進(jìn)行DNA序列的修飾或滅活。
由于遺傳修飾，本發(fā)明的宿主細(xì)胞表達(dá)明顯降低水平的金屬蛋白酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，由宿主細(xì)胞表達(dá)的金屬蛋白酶的水平降低約50％以上，優(yōu)選的約85％以上，更優(yōu)選的約90％以上，最優(yōu)選的約95％以上。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，由宿主細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)物基本上沒(méi)有任何金屬蛋白酶活性。產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生蛋白質(zhì)(即多肽和/或蛋白質(zhì))的方法，該方法包括在合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，接著回收所需產(chǎn)物。
通過(guò)本發(fā)明的方法，金屬蛋白酶的蛋白酶解作用被明顯減小，由此改善了所獲得的產(chǎn)物的穩(wěn)定性。此外，由于缺乏金屬蛋白酶，由宿主細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)可以以下列形式獲得前體蛋白(即酶原)，雜合蛋白，作為原序列或前原-序列或者以非成熟形式獲得的蛋白質(zhì)。
用于培養(yǎng)的培養(yǎng)液或培養(yǎng)基可以是任何適于培養(yǎng)所說(shuō)宿主細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)基，并且可以根據(jù)本領(lǐng)域的原理組成。培養(yǎng)基優(yōu)選地包含碳和氮源和其它無(wú)機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基(例如，基本或復(fù)合培養(yǎng)基)可從商業(yè)供給者獲得，或者可以按照出版的配方(例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心菌種目錄)制備。
在培養(yǎng)之后，用從培養(yǎng)液中分離和純化蛋白質(zhì)的常規(guī)方法回收蛋白質(zhì)。眾所周知的純化方法包括經(jīng)離心或過(guò)濾從培養(yǎng)物分離細(xì)胞，借助鹽(如硫酸銨)沉淀培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)組份以及色譜方法如離子交換色譜、凝膠過(guò)濾色譜和親和色譜法等等。
實(shí)施例參照以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，無(wú)意用所述實(shí)施例以任何方式限制所要求的本發(fā)明的范圍。材料和方法菌株米曲霉IFO 4177，可從大阪發(fā)酵研究所，17-25 Juso Hammachi 2-Chome Yodogawa-Ku，大阪，日本獲得。
尖鐮孢DSM 2672，根據(jù)國(guó)際承認(rèn)的用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約于1983年6月6日保藏在Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)，MascheFoder Weg 1b，DE-3300 Braunschweig，德國(guó)。
大腸桿菌DH5α，Hanahan D，分子生物學(xué)雜志，1983 166 557?；騈pI，該基因編碼中性金屬蛋白酶I。
NpII，該基因編碼中性金屬蛋白酶II。
pyrG該基因編碼乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶，該酶參與尿苷的生物合成。質(zhì)粒pUC118；Yanish-Perron等，1985基因33 103。
pJaL389；從粘粒3E8構(gòu)建該質(zhì)粒在實(shí)施例1中描述。
pSO2；該質(zhì)粒的構(gòu)建在實(shí)施例2中描述。
pJers4；pSO2的亞克隆。
pJaL335；從pSO2構(gòu)建該質(zhì)粒在實(shí)施例2中描述。
pSO5；從pSO2構(gòu)建該質(zhì)粒在實(shí)施例2中描述pJaL198；從pJaL198構(gòu)建該質(zhì)粒在實(shí)施例3中描述。
pJa1218；從pJa1218構(gòu)建該質(zhì)粒在實(shí)施例4中描述。
p3SR2；Kelly JM和Hynes MJ，EMBO雜志1985 4 475-479。
pToC90；p3SR2的亞克隆。
pToC56；該質(zhì)粒的構(gòu)建在EP 238,023 B中描述。
pToC65；該質(zhì)粒的構(gòu)建在EP 531 372 B中描述。
pCRTMII；可從Invitrogen公司(San Diego，CA，美國(guó))獲得。實(shí)施例1克隆米曲霉中性金屬蛋白酶I(NpI)構(gòu)建米曲霉粘粒文庫(kù)基本上按照″SuperCosl粘粒載體試劑盒″供給者(Stratagene)的說(shuō)明構(gòu)建所述文庫(kù)。
從用標(biāo)準(zhǔn)方法[參見(jiàn)例如Christensen等，生物技術(shù)1989 6 1419-1422]制備的原生質(zhì)體制備米曲霉IFO 4177基因組DNA。在分離原生質(zhì)體后，通過(guò)在LabofugeTMT(Heto)中2500rpm下離心5分鐘使其沉淀，如Supercos1粘粒載體試劑盒手冊(cè)中的描述，將該離心沉淀懸浮在DNA制劑其余部分10mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、100μg/ml蛋白酶TMK和0.5％SDS中。
采用Biorad的CHEF-凝膠裝置經(jīng)電泳分析基因組DNA的大小。用10-50秒脈沖在200伏特下在1％瓊脂糖凝膠上電泳20小時(shí)。凝膠由溴化乙錠染色并拍照。DNA的大小為50-100kb。DNA用Sau3A部分限制性消化。用相同的方法測(cè)定時(shí)，限制性消化的DNA的大小是20-50kb。
按照供給者的手冊(cè)制備CsCl梯度分離的SuperCosl載體，即進(jìn)行連接和包裝。在文庫(kù)滴定之后，將一種連接和包裝的所有包裝混合物轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞XL1-Blue MR中，并平板接種到50μg/ml氨芐青霉素LB平板上。獲得約3800個(gè)菌落。10個(gè)菌落的粘粒制劑顯示它們均具有所期待大小的插入物。收集單個(gè)菌落，在具有100μL LB(100μl/ml氨芐青霉素)的微滴板孔中培養(yǎng)，并于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將100μl 50％甘油添加到各孔中。將整個(gè)文庫(kù)在-80℃冷凍?？偣操A存3822個(gè)菌落。這代表米曲霉基因組約4.4倍?？寺〖忡犳遬45金屬蛋白酶基因純化在9000rpm下離心尖鐮孢DSM 2672培養(yǎng)液10分鐘，經(jīng)0.45μm濾器過(guò)濾上清液。在10ml Amlcon池(PM 10膜)和Centriprep-O(Amlcon)上將200ml濾液濃縮至10ml。把5ml濾液稀釋成100ml，用乙酸調(diào)節(jié)pH至5，并在下列緩沖溶液中通過(guò)1ml Mono-S柱0.1M硼酸鹽、10mMDMG、2mM氯化鈣，pH5.2，70分鐘內(nèi)從0M到0.5M氯化鈉的梯度。在上述鑒別緩沖液中以1ml/分鐘的流速洗滌10分鐘之后，收集1.5ml組份，并在Centricon-10(Amlcon)上濃縮。
在下列溶液中進(jìn)行使用Superose-12(HR 10/30，Pharmacia)的凝膠過(guò)濾0.1M硼酸鹽、10mM DMG、2mM CaCl2，pH6.5，流速0.4ml/分鐘。收集0.4ml組份，注射200μl樣品。蛋白酶測(cè)定在25℃于0.1M TRIS、2mM CaCl2，pH7(更低的pH時(shí)，使用100mM硼酸鹽、10mM DMG、2mM CaCl2)中預(yù)培養(yǎng)30-60分鐘后，測(cè)定從菌株尖鐮孢DSM 2672原-胰蛋白酶樣蛋白酶釋放胰蛋白酶活性的金屬蛋白酶活性。胰蛋白酶活性在微滴板中測(cè)量，將100μl樣品與底物100μl混合(貯存液87mg/ml在DMSO中的L-BAPNA(西格馬)，用緩沖液稀釋50倍)，從Molecular Devices上用Thermomax讀數(shù)器在405nm測(cè)量吸收值。SDS-PAGE和電印跡到PVDF上按照制造者的說(shuō)明進(jìn)行SDS-PAGE(10-27％，Novex)電泳。在添加樣品緩沖液之前將要電泳的樣品用PMSF預(yù)溫育。用Novex印跡模在3mMNa2CO3、10mM NaHCO3、20％MeOH，pH9.9中于30V下2小時(shí)電印跡到預(yù)-印跡膜(應(yīng)用生物系統(tǒng))上。按照應(yīng)用生物系統(tǒng)的描述染色預(yù)-印跡膜。IEF-涂蓋在Ampholine FAG-平板(Pharmacia)上，pH3.5至9.5下進(jìn)行等電聚焦(IEF)，按照制造者的說(shuō)明染色。將要涂蓋的凝膠首先在0.1M TRIS、2mM CaCl2，pH8.1中平衡15分鐘，然后添加有300μl L-BAPNA(西格馬)貯存液和500μl原-胰蛋白酶樣尖鐮孢DSM 2672蛋白酶(約0.25毫克/毫升)的10ml 1％瓊脂糖，0.1M TRIS、2mM CaCl2，pH8.1涂蓋。氨基酸分析和氨基酸測(cè)序利用MDS-2000水解站(CEM)進(jìn)行凍干樣品的微波促進(jìn)蒸發(fā)相水解。包含1％酚(清除劑)的6N HCl用于產(chǎn)生蒸發(fā)相。水解時(shí)間是在70psi(約148℃)下20分鐘。將水解樣品凍干并再溶解到20μl 500pmol/μl肌氨酸和正纈氨酸中作為內(nèi)標(biāo)。按照制造者的說(shuō)明用Hewlett-Packard的AminoQuant進(jìn)行分析。注射1μl樣品。按照制造者的說(shuō)明用應(yīng)用生物系統(tǒng)的476A蛋白質(zhì)測(cè)序儀進(jìn)行氨基酸測(cè)序。將預(yù)混緩沖液用于在線式HPLC。從尖鐮孢培養(yǎng)液純化p45
從濃縮的和過(guò)濾的發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)陽(yáng)離子-交換色譜(Mono-S)和接下來(lái)的在Superose 12上的凝膠過(guò)濾純化p45金屬蛋白酶。通過(guò)檢查從原胰蛋白酶樣尖鐮孢DSM 2672蛋白酶釋放胰蛋白酶樣活性的金屬蛋白酶活性選擇Mono-S組份。
用與Mono-S組份相同的試驗(yàn)方法鑒別來(lái)自于Superose-12柱的包含金屬蛋白酶的組份。純化的金屬蛋白酶在SDS-PAGE上顯示45kDa的單一帶。在IEF(pH3.5-9.5)中分別在pI8.4和8.7觀察到金屬蛋白酶的兩個(gè)異型。
氨基酸分析結(jié)果表明這一金屬蛋白酶(p45)具有SEQ ID NO3所示的N-末端氨基酸序列。克隆尖鐮孢p45金屬蛋白酶基因和確定重組p54的特征首先經(jīng)PCR克隆尖鐮孢p45金屬蛋白酶基因的一部分。利用N-末端蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO3)設(shè)計(jì)一引物，并且從金屬蛋白酶內(nèi)部肽序列(SEQ ID NO1的殘基483-515)設(shè)計(jì)一逆向引物。用這些DNA引物和從尖鐮孢分離的基因組DNA進(jìn)行PCR?；蚪MDNA的分離如下。
將約15g濕重尖鐮孢在MY50培養(yǎng)基(50g/l麥芽糖糊精、2g/l硫酸鎂、10g/l磷酸二氫鉀、2g/l檸檬酸、10g/l酵母抽提物、2g/l尿素、2g/l硫酸鉀、0.5ml微量金屬溶液，以5N NaOH調(diào)pH至6)中于30℃生長(zhǎng)。將菌絲體懸浮在16ml TE中(10mM TRIS、1mM EDTA，pH8.0)，分裝進(jìn)兩根試管中，將12g 0.45-0.52mm玻璃珠(Thomas Scientific)加到每根試管中。以30秒間隔將樣品交替渦旋和冰凍，直到出現(xiàn)明顯的粘性下降，將樣品另外額外地渦旋兩個(gè)30秒間隔。將2.5ml 20％SDS添加進(jìn)每種樣品中。把樣品倒置混合，在室溫溫育10分鐘，并再一次混合。于室溫在3.5K下離心樣品8分鐘。將上清液合并到50ml聚丙烯試管中。用以苯酚∶三氯甲烷∶異戊醇(25∶24∶1)(P/C/I提取的)平衡過(guò)的等體積的TE抽提樣品，然后于4℃在10,000rpm下離心10分鐘。在25℃用300μl 10毫克/毫升蛋白酶K處理上清液30分鐘。如以上所述經(jīng)P/C/I抽提DNA，乙醇沉淀，并且溶解在5ml TE中。將樣品用150μl 10mg/l RNA酶A在65℃處理15分鐘，25℃ 15分鐘。用蛋白酶K(100μl 10mg/ml 25℃下1.5小時(shí))再次處理該樣品，P/C/I抽提兩次，并用乙醇沉淀。將DNA收集到彎曲的巴氏移液管中，并轉(zhuǎn)移到5ml 80％的乙醇中。將樣品在10,000rpm離心3分鐘。簡(jiǎn)短干燥DNA沉淀，然后溶解在1ml TE中。
用PCR克隆尖鐮孢p45基因的一部分。使50-100ng尖鐮孢基因組DNA與在1×Taq緩沖液(Boehringer Mannheim)中的約100pmol的各合成PCR引物DNA以及濃度為100μM的dGTP、dATP、dTTP和dCTP在50μl體積中混合。添加Taq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)1-5單位，PCR溫育是在95℃5分鐘，然后是35個(gè)循環(huán)[95℃，30秒鐘，50℃1分鐘，72℃1分鐘]。
PCR反應(yīng)產(chǎn)生兩個(gè)長(zhǎng)度約1.0和1.3kb的DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離這些片段，純化，克隆進(jìn)大腸桿菌復(fù)制質(zhì)粒中，用分子生物學(xué)領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)序。將DNA翻譯產(chǎn)物與直接蛋白質(zhì)測(cè)序獲得的氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)1.0kb DNA片段包含尖鐮孢p45基因序列。因此，將這一1.0kb PCR產(chǎn)生的DNA片段用作探針從尖鐮孢基因組DNA文庫(kù)克隆整個(gè)金屬蛋白酶基因。
使用例如由Sambrook等[參見(jiàn)例如，Sambrook等，分子克隆，冷泉港，NY，1989]描述的方法從尖鐮孢基因組DNA制備λ噬菌體中的基因組文庫(kù)。總共50μg基因組DNA在25℃于200μl溶液中消化1分鐘，所述溶液包含10mM TRIS(pH7.5)，50mM NaCl，7mM MgCl2，7mM 2-巰基乙醇和4單位限制性內(nèi)切酶Sau3A。用凝膠電泳分離部分消化的分子大小為10-20kb的DNA，接著電洗脫進(jìn)透析膜，并用Elutip-D柱(Schleicher和Schuell)濃縮。將1μg EMBL4噬菌體λ臂(其已用限制性內(nèi)切酶BamH1切割，并用磷酸酶(Clonetech)處理)在標(biāo)準(zhǔn)條件下于25μl體積中與300-400μg Sau3A切割的基因組DNA連接[參見(jiàn)如，Sambrook等，分子克隆，冷泉港，NY，1989]。用市售的試劑盒(Gigapack Gold II Stratagene)按制造商的說(shuō)明從這一連接混合物制備λ噬菌體。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)[參見(jiàn)，Sambrook等，分子克隆，冷泉港，NY，1989]進(jìn)行約18,000個(gè)重組λ噬菌體的平板涂布和膜轉(zhuǎn)移(至N+濾膜上，Amersham)。按照制造者的說(shuō)明處理濾膜用Genious試劑盒(Boehringer Mannheim)雜交以檢測(cè)非放射性的核酸。用作p45探針的DNA是由如上所述獲得的1.0kb PCR片段。使用dioxigenin(DIG)標(biāo)記試劑盒和制造者提供的說(shuō)明經(jīng)PCR摻入DIG標(biāo)記該探針。將15ng 1.0kb p45片段在1×Taq緩沖液(Boehringer Mannheim)中與N-末端引物和內(nèi)部逆向引物各100pmol以及1-5單位Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)以80μl總體積混合。反應(yīng)條件是95℃3分鐘，然后是35個(gè)循環(huán)[95℃30秒；50℃1分鐘；和72℃1分鐘]，和72℃5分鐘。按照Genious試劑盒制造者提供的說(shuō)明，采用DIG標(biāo)記的探針和洗滌條件進(jìn)行濾膜雜交。
按照制造者(Boehringer Mannheim)的描述用堿性磷酸酶-結(jié)合的抗dioxigenin抗體(用Lumlphos 530可視化)檢測(cè)雜交噬菌體。用QiagenλMidi試劑盒從陽(yáng)性λ克隆(QIAGEN Inc.)制備DNA制劑。以限制酶EcoRI消化一種制劑的DNA，并將一6.3kb片段亞克隆進(jìn)質(zhì)粒pUC118中，對(duì)這一亞克隆部分DNA的序列分析鑒別了p45基因的整個(gè)編碼區(qū)，參見(jiàn)SEQID NO1?？寺45金屬蛋白酶cDNA按照作了以下修改的以前出版的方案[Chirgwin等，生物化學(xué)，198818 5294-5299；Aviv和Leder，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)，1972；69 1408-1412；Sambrook等，分子克隆，冷泉港，NY，1989]從尖鐮孢制備總RNA和poly-A RNA。
具體地說(shuō)，將菌絲體在液態(tài)氮中研制成細(xì)粉，然后在裂解緩沖液中于室溫下攪拌30分鐘再懸浮，所述裂解緩沖液包含4M硫氰酸胍、0.5％月桂基肌氨酸鈉、25mM檸檬酸鈉和0.1M 2-巰基乙醇(pH7.0)。低速(5000rpm 30分鐘)離心除去細(xì)胞碎片。典型地，用從Boehringer Mannheim獲得的oligo(dT)纖維素分離poly-A RNA組份。
利用發(fā)夾/RNA酶H方法[參見(jiàn)例如，Sambrook等，分子克隆，冷泉港，NY，1989]將poly-A RNA用來(lái)產(chǎn)生cDNA。具體地說(shuō)，在5μl水中的5μg poly-A RNA在70℃加熱，然后置于冰上。制備50μl總反應(yīng)混合物，其包含poly-A RNA、50mM TRIS(pH8.3)、75mM KCl，3mMMgCl2、10mM二硫蘇糖醇、dGTP，dATP，dTTP和dCTP各1mM、40單位RNasin、10μg寡(dT12-18)引物和1000單位SuperScriptII RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶(Bethesda研究室)。將混合物在45℃溫育一小時(shí)。然后添加30μl 10mM TRIS(pH7.5)、1mM EDTA、40g糖原載體(Boehringer Mannheim)、0.2體積10M乙酸銨和2.5體積乙醇以沉淀核酸。在離心之后，將沉淀再懸浮于20mM TRIS(pH7.4)、90mM KCl、4.6mM MgCl2、10mM硫酸銨、16μM βNAD+、dGTP，dATP，dTTP和dCTP各100μM、44單位大腸桿菌DNA聚合酶I、6.25單位RNA酶H和10.5單位DNA連接酶中。在這種溶液中于16℃下進(jìn)行第二鏈DNA合成3小時(shí)。由乙醇沉淀濃縮DNA，于30℃下將沉淀再懸浮于30μl 30mM醋酸鈉(pH4.6)、300mM NaCl、1mM ZnSO4、0.35mM二硫蘇糖醇、2％甘油和30單位Mung大豆核酸酶(Bethesda研究室)中30分鐘。用10mM TRIS(pH7.5)、1mM EDTA中和DNA溶液，酚提取，和乙醇沉淀。沉淀于25℃在50μl緩沖液(20mM TRIS-醋酸鹽(pH7.9)、10mM醋酸鎂、50mM醋酸鉀、1mM二硫蘇糖醇、dGTP，dATP，dTTP和dCTP各0.5mM)中用7.5單位T4聚合酶(Invitrogen)處理15分鐘。經(jīng)添加EDTA至20mM終止反應(yīng)，隨后酚抽取和乙醇沉淀。這一方法得到平端的雙鏈cDNA，它適于連接DNA接頭和克隆到任何載體中。
在瓊脂糖凝膠上大小分級(jí)分離具有EcoRI接頭的cDNA以獲得分子大小為0.7kb或更大的cDNA。經(jīng)電洗脫從凝膠上回收cDNA，并經(jīng)酚抽取和乙醇沉淀純化。將大小分級(jí)分離的cDNA用于構(gòu)建λcDNA文庫(kù)。把該cDNA克隆進(jìn)λZIPLOX臂(Gibco BRL)。以467 bp dioxigenin標(biāo)記的片段為探針(336-803bp基因組克隆)用以前描述的噬斑轉(zhuǎn)移和DNA雜交技術(shù)鑒別全長(zhǎng)cDNA克隆。如制造者(菌株和質(zhì)粒來(lái)源于Bibco BRL)的描述回收質(zhì)粒pZL1中的全長(zhǎng)cDNA。
將全長(zhǎng)cDNA測(cè)序，并且與基因組DNA序列比較?；蚪MDNA長(zhǎng)度為2052bp，包含三個(gè)內(nèi)含子。前原p45金屬蛋白酶的預(yù)測(cè)的編碼區(qū)由推定的18個(gè)氨基酸的信號(hào)序列、226個(gè)氨基酸的原區(qū)(pro-region)和388個(gè)氨基酸的成熟區(qū)組成，如SEQ ID NO1所示。制備尖鐮孢p45金屬蛋白酶探針選擇來(lái)源于上述cDNA文庫(kù)的一個(gè)克隆，稱為pDM115。質(zhì)粒pDM115包含尖鐮孢cDNA的1.76kb片段，其編碼部分p45基因。用SaII消化該質(zhì)粒，在1％瓊脂糖凝膠上分離形成的片段，切去1.5kb片段并洗脫DNA。經(jīng)隨機(jī)引物標(biāo)記法用32-P-dATP標(biāo)記這一片段，并用Southern或菌落轉(zhuǎn)移探測(cè)。用尖鐮孢p45探針篩選米曲霉文庫(kù)用適配于半微滴盤的具有6×8針的多針(multipin)裝置將分別冷凍的文庫(kù)菌落接種到LB-平板(100μg/ml氨芐青霉素)上，使平板包含文庫(kù)中的所有克隆的菌落。將平板在37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將切成培養(yǎng)皿大小的已滅菌的Whatman 540濾膜放置在菌落上，再于37℃培養(yǎng)兩小時(shí)。將濾膜轉(zhuǎn)移到含有200μg/ml氯霉素的LB平板上，在37℃培養(yǎng)平板過(guò)夜。第二天洗滌濾膜0.5M NaOH洗滌兩次，每次5分鐘；0.5M TRIS-HCl(pH7.4)洗滌兩次，每次5分鐘；2×SCC兩次，每次5分鐘。濾膜用乙醇潤(rùn)濕并風(fēng)干。
將所述濾膜與包含尖鐮孢蛋白酶基因的pDM115的1.5kb32P標(biāo)記的DNA片段雜交。雜交在65℃下在下列溶液中進(jìn)行16小時(shí)10×Denhart、5×SSC、0.02M EDTA、1％SDS、0.15毫克/毫升polyA和0.05毫克/毫升酵母tRNA。在雜交之后，于65℃將濾膜在2×SSC、0.1％SDS中洗滌兩次，并置于X光膠片上。三個(gè)菌落顯示出與探針雜交，即3E8、3C1和2A5，名稱指出它們?cè)谖膸?kù)中的位置。確定粘?？寺〉奶卣飨拗泼盖蟹治鲎C實(shí)三個(gè)粘粒克隆中的兩個(gè)(3E8和3C1)包含插入物，該插入物來(lái)源于米曲霉基因組的相同區(qū)。
用EcoRI消化3μg粘粒DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分級(jí)分離。將DNA轉(zhuǎn)移到Immobilan-N膜上，與pDM115的1.5kb放射性標(biāo)記的探針雜交。該探針雜交到兩個(gè)粘?？寺〉?kb EcoRI片段上。選擇4.0kb EcoRI片段供進(jìn)一步分析。將NpI克隆進(jìn)入質(zhì)粒pToC65并測(cè)序按照制造者的說(shuō)明用SacI消化質(zhì)粒pToC65，用細(xì)菌堿性磷酸酶處理以除去5’-磷酸基。然后用酚提取和沉淀。
用凝膠電泳分離包含米曲霉NpI基因的粘粒克隆3E8的5.5kb SacI片段，并純化。
將兩個(gè)片段混合在一起，并連接。在轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，通過(guò)少量質(zhì)粒制備物的限制性內(nèi)切酶消化鑒別攜帶正確質(zhì)粒的菌落。該質(zhì)粒稱為pJaL389。
將這一亞克隆的DNA序列分析結(jié)果與其它已知的NpI基因序列比較，以證實(shí)所述亞克隆包含米曲霉NpI基因的編碼區(qū)。實(shí)施例2米曲霉中性金屬蛋白酶NpI的基因組破裂為了產(chǎn)生特異性NpI生產(chǎn)缺陷的米曲霉菌株，使用了由Miller等，分子細(xì)胞生物學(xué)，1985 5 1714-1721所描述的基因置換策略。以下詳細(xì)描述這些實(shí)驗(yàn)。克隆米曲霉pyrG基因通過(guò)與黑曲霉pyrG基因[W.van Hartingsveldt等；Mol.Gen.Genet1987 206 71-75]的交叉雜交克隆米曲霉pyrG基因。在低嚴(yán)格度下用黑曲霉pyrG基因的1kb DNA片段探測(cè)SauIII A部分消化米曲霉IFO 4177DNA的λ文庫(kù)。將陽(yáng)性克隆的DNA亞克隆進(jìn)pUC118載體。通過(guò)黑曲霉pyrG-突變體的互補(bǔ)作用，顯示出形成的質(zhì)粒pSO2包含pyrG基因，參見(jiàn)圖1。構(gòu)建米曲霉pyrG陰性菌株從質(zhì)粒pSO2構(gòu)建在各末端包含約1kb pyrG側(cè)翼序列的質(zhì)粒pSO5，它是一種pyrG缺失。用這一構(gòu)建體轉(zhuǎn)化米曲霉菌株IFO 4177，通過(guò)5-氟-乳清酸抗性(pyrG突變體的表型特征)選擇轉(zhuǎn)化子。
通過(guò)Southern分析顯示一個(gè)轉(zhuǎn)化子HowB101在pyrG基因座具有所期待的缺失。由于pyrG突變體，HowB101的生長(zhǎng)需要尿苷。通過(guò)沒(méi)有尿苷時(shí)生長(zhǎng)能力的篩選，可用wt pyrG基因轉(zhuǎn)化HowB101。
構(gòu)建HowB101中涉及的步驟在圖2中說(shuō)明。構(gòu)建質(zhì)粒pJaL335
為了擴(kuò)增位于米曲霉pyrG基因5’端上游479個(gè)核苷酸上的431bp片段，制備以下兩個(gè)寡核苷酸；引物AGGAGGAAGATCTCTCTGGTACTCTTCGATCTC；SEQ IDNO5；和引物BGGAGGAGAATTCAAGCTTCTTCTACATCACAGTTTGAAAGC；SEQ ID NO6下劃線部分相應(yīng)于米曲霉pyrG基因序列。
引物5’末端用來(lái)促進(jìn)克隆(引物A包含BgIII限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)，引物B包含EcoRI和HindIII限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn))。
在PCR反應(yīng)中質(zhì)粒pSO2用作模板。擴(kuò)增在包含2.5單位Taq-聚合酶、100ng pSO2、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.0)、1.5mMMgCl2、250nM各dNTP和以上所述兩種引物各10pmol的100μl體積中進(jìn)行。
擴(kuò)增在Perkin-Elmer Cetus DNA Termal 480中進(jìn)行，包括94℃的3分鐘的一個(gè)循環(huán)，其后為94℃的1分鐘、55℃的30秒和72℃的1分鐘的25個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)產(chǎn)生長(zhǎng)度為430bp的一個(gè)DNA片段。用BgIII和EcoRI消化該片段，并經(jīng)凝膠電泳分離。將其純化并克隆進(jìn)質(zhì)粒pSO2的相應(yīng)位點(diǎn)中。形成的質(zhì)粒稱為pJaL335。pJaL335的構(gòu)建在圖3中說(shuō)明。構(gòu)建破裂質(zhì)粒pJaL399用BalI消化質(zhì)粒pJaL389，用Klenow聚合酶處理以獲得平端。凝膠電泳分離7.1kb片段，純化。按照制造者的說(shuō)明將這一DNA片段用細(xì)菌堿性磷酸酶處理以除去5’磷酸基，用酚提取并沉淀。
以HindIII消化質(zhì)粒pJaL335，用Klenow聚合酶處理以獲得平端。經(jīng)凝膠電泳分離編碼米曲霉pyrG基因的3.5kb片段，并純化。
將兩個(gè)片段混合在一起并連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，攜帶正確質(zhì)粒的菌落通過(guò)少量質(zhì)粒制備物的限制性內(nèi)切酶消化鑒別。pJaL399的構(gòu)建在圖4中說(shuō)明。
pJaL399具有pToC65載體，其包含攜帶有SacI位點(diǎn)在其側(cè)翼的NpI基因的片段，其中，中央1.1kb BalI片段已被編碼米曲霉pyrG基因的3.5kb DNA片段替代。轉(zhuǎn)化米曲霉15μg質(zhì)粒pJaL399由SacI完全消化。消化的完全程度通過(guò)取樣在凝膠上電泳檢查，其余DNA用酚提取，沉淀并再懸浮于108，25μl無(wú)菌水中。
米曲霉HowB1o1宿主菌株由原生質(zhì)體方法[Christensen等；1988生物技術(shù)1988 61419-1422]進(jìn)行轉(zhuǎn)化。典型地，使米曲霉菌絲體在富含營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)。過(guò)濾從培養(yǎng)液分離菌絲體。將NovozymeTM(可從丹麥NovoNordisk A/S獲得)添加到滲透穩(wěn)定的緩沖液(如用磷酸鈉緩沖到pH5.0的1.2M MgSO4)中的菌絲體中，于37℃在攪拌下將懸液溫育60分鐘。原生質(zhì)體通過(guò)mira-cloth過(guò)濾除去菌絲體碎片。收獲原生質(zhì)體，并用STC(1.2M山梨醇、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl(pH7.5))洗滌2次。最后，將原生質(zhì)體再懸浮在200-1000μl STC中。
為了轉(zhuǎn)化，將5μg DNA添加到100μl原生質(zhì)體懸液中。添加200μlPEG溶液(60％ PEG 4000、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl(pH7.5))，將混合物在室溫下溫育20分鐘，收獲原生質(zhì)體并用1.2M山梨醇洗滌兩次。最后將原生質(zhì)體再懸浮在200μl 1.2M山梨醇中，涂布在選擇平板(基本培養(yǎng)基+10g/l Bacto-瓊脂(Difco))上，于37℃培養(yǎng)。在37℃生長(zhǎng)3-4天后，穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子將出現(xiàn)旺盛的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢子菌落。鑒別基因破裂從穩(wěn)定的菌落將單個(gè)孢子在新鮮的基本平板上劃線培養(yǎng)，選擇單菌落并再劃線培養(yǎng)產(chǎn)生純培養(yǎng)物。將這些用于接種10ml液態(tài)YPM培養(yǎng)基(1％酵母提取物、1％蛋白胨、2％麥芽糖)。在30℃振蕩培養(yǎng)18小時(shí)后，將菌絲體收獲到濾紙上。然后將菌絲體轉(zhuǎn)移到2ml微量離心管中，并凍干。
在凍干之后，通過(guò)用研棒在管中將菌絲體研成細(xì)粉，從單獨(dú)的菌絲體制備DNA。經(jīng)渦旋將這一粉末再懸浮于0.5ml 50mM EDTA(pH8.0)、0.2％SDS、1μl DEP中。在65℃溫育20分鐘后，添加0.1ml 5MKAc(pH6.5)，混合溶液，在冰上放置5分鐘。在20,000rpm下離心5分鐘，從DNA溶液分離細(xì)胞碎片。0.4ml上清液用0.3ml異丙醇沉淀，在20,000rpm下離心10分鐘。將DNA沉淀再溶解到100μl包含0.1毫克/毫升RNA酶A的無(wú)菌TE緩沖液中。
用BalI消化3μg各DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分級(jí)分離，將其轉(zhuǎn)移到Immobilan-N膜上，使濾膜與5.5kb32P標(biāo)記的DNA SacI片段雜交，該片段來(lái)源于含NpI蛋白酶基因的pJaL389。包含攜帶有破裂NpI基因的菌株通過(guò)缺乏1.1kb BalI雜交片段以及其它兩個(gè)側(cè)翼片段的遷移改變來(lái)識(shí)別。實(shí)施例3克隆米曲霉中性金屬蛋白酶II(NpII)構(gòu)建pJaL198從已出版的cDNA核苷酸序列[Tatsuml等，Mol.Gen.Genet.1991228 97-103]設(shè)計(jì)兩個(gè)寡核苷酸，以便在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增NpII基因的編碼部分。
構(gòu)建A引物(CTAGGATCCAAGGCATTTATGCGTGTCACTACTCTC；SEQ ID NO7)以便核苷酸序列的3’末端相應(yīng)于NpII基因的N-末端部分(下劃線)，5’-末端促進(jìn)克隆(包含BamHI限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn))。
構(gòu)建B引物(CTACTCGAGTTAGCACTTGAGCTCGATAGC；SEQ ID NO8)以便核苷酸序列的3’末端相應(yīng)于NpII基因的C-末端部分(下劃線)，5’-末端促進(jìn)克隆(包含XhoI限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn))。
在PCR反應(yīng)中，將米曲霉IFO 4177基因組DNA用作模板。擴(kuò)增反應(yīng)在包含2.5單位Taq-聚合酶、100ng米曲霉基因組DNA、50mMKCl、10mM Tris-HCl(pH8.0)、1.5mM MgCl2、250nM各dNTP、以上所述的兩種引物各100pM的100μl體積中進(jìn)行。
擴(kuò)增在Perkin-Elmer Cetus DNA Termal 480中進(jìn)行，包括94℃的3分鐘的一個(gè)循環(huán)，其后為94℃的1分鐘、55℃的30秒和72℃的1分鐘的25個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)產(chǎn)生長(zhǎng)度為1.1kp的一個(gè)DNA片段。使用分子生物學(xué)領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法經(jīng)凝膠電泳分離這一片段，將其純化并克隆進(jìn)載體pCRTMII(Invitrogen公司)并測(cè)序。形成的質(zhì)粒稱為pJaL198。實(shí)施例4NpII的基因組破裂構(gòu)建JaL121為了產(chǎn)生特異性NpII生產(chǎn)缺陷的米曲霉菌株，使用了由Miller等，分子細(xì)胞生物學(xué)，1985 5 1714-1721所描述的基因置換策略。克隆米曲霉pyrG基因通過(guò)與黑曲霉pyrG基因[W.van Hartingsveldt等；Mol.Gen.Genet1987 206 71-75]的交叉雜交克隆米曲霉pyrG基因。在低嚴(yán)格度下用黑曲霉pyrG基因的1kb DNA片段探測(cè)SauIII A部分消化米曲霉IFO 4177DNA的λ文庫(kù)。將陽(yáng)性克隆的DNA亞克隆進(jìn)pUC118載體。通過(guò)黑曲霉pyrG-突變體的互補(bǔ)作用，顯示出形成的質(zhì)粒pSO2包含pyrG基因，參見(jiàn)圖1。構(gòu)建米曲霉pyrG陰性菌株從質(zhì)粒pSO2構(gòu)建在各末端包含約1kb pyrG側(cè)翼序列的質(zhì)粒pSO5，它是一種pyrG缺失質(zhì)粒。用這一構(gòu)建體轉(zhuǎn)化米曲霉菌株IFO 4177，通過(guò)5-氟-乳清酸抗性(pyrG突變體的表型特征)選擇轉(zhuǎn)化子。通過(guò)Southern分析顯示一個(gè)轉(zhuǎn)化子HowB101在pyrG基因座具有所期待的缺失。由于pyrG突變體，HowB101的生長(zhǎng)需要尿苷。通過(guò)沒(méi)有尿苷時(shí)生長(zhǎng)能力的篩選可用wt pyrG基因轉(zhuǎn)化HowB101。
構(gòu)建HowB101中涉及的步驟在圖2中說(shuō)明。構(gòu)建破裂質(zhì)粒pJaL218用BstEII消化質(zhì)粒pJaL198，用Klenow聚合酶處理以獲得平端。凝膠電泳分離4.9kb片段，純化。按照制造者的說(shuō)明將這一DNA片段用細(xì)菌堿性磷酸酶處理以除去5’磷酸基，用酚提取并沉淀。
以HindIII消化質(zhì)粒pJers4，用Klenow聚合酶處理以獲得平端。經(jīng)凝膠電泳分離編碼米曲霉pyrG基因的1.8kb片段，并純化。
將兩個(gè)片段混合在一起并連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，攜帶正確質(zhì)粒的菌落通過(guò)少量質(zhì)粒制備物的限制性內(nèi)切酶消化鑒別。pJaL218的構(gòu)建在圖5中說(shuō)明。
pJaL218具有pCRTMII載體，其包含攜帶有EcoRI位點(diǎn)在其側(cè)翼的NpII基因的片段，其中，中央BstEII片段已被編碼米曲霉pyrG基因的1.8kb DNA片段替代。轉(zhuǎn)化米曲霉15μg質(zhì)粒pJaL218由EcoRI完全消化。消化的完全程度通過(guò)取樣在凝膠上電泳檢查，其余DNA用酚提取，沉淀并再懸浮于10μl無(wú)菌水中。
米曲霉HowB101宿主菌株由原生質(zhì)體方法[Christensen等；1988生物技術(shù)1988 61419-1422]進(jìn)行轉(zhuǎn)化。典型地，使米曲霉菌絲體在富含營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)。通過(guò)過(guò)濾從培養(yǎng)液分離菌絲體。將NovozymeTM(可從丹麥Novo Nordisk A/S獲得)添加到滲透穩(wěn)定的緩沖液，1.2M MgSO4，磷酸鈉緩沖液(pH5.0)中的菌絲體中，于37℃在攪拌下將懸液溫育60分鐘。原生質(zhì)體通過(guò)miracloth過(guò)濾除去菌絲體碎片。收獲原生質(zhì)體，并用STC(1.2M山梨醇、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl(pH7.5))洗滌2次。最后，將原生質(zhì)體再懸浮在200-1000μl STC中。
為了轉(zhuǎn)化，將5μg DNA添加到100μ1原生質(zhì)體懸液中。添加200μlPEG溶液(60％ PEG 4000、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl(pH7.5))，將混合物在室溫下溫育20分鐘，收獲原生質(zhì)體并用1.2M山梨醇洗滌兩次。最后將原生質(zhì)體再懸浮在200μl 1.2M山梨醇中，涂布在選擇平板(基本培養(yǎng)基+10g/l Bacto-瓊脂(Difco))上，于37℃培養(yǎng)。
在37℃生長(zhǎng)3-4天后，穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子將出現(xiàn)旺盛的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢子菌落。鑒別基因破裂從穩(wěn)定的菌落將單個(gè)孢子在新鮮的基本平板上劃線培養(yǎng)，選擇單菌落并再劃線培養(yǎng)產(chǎn)生純培養(yǎng)物。
篩選33個(gè)轉(zhuǎn)化子，以了解轉(zhuǎn)化的DNA片段是否已經(jīng)由PCR經(jīng)雙交叉整合進(jìn)染色體的相應(yīng)基因中。PCR反應(yīng)和轉(zhuǎn)化子的基因組DNA的制備如上所述進(jìn)行。
所用的引物是CCCTTCTTTCCAAACCG(SEQ ID NO9)，其位于NpII基因編碼區(qū)的5’，和pyrG-5’(GGGTGAGCCACTGCCTC；SEQ IDNO10)，其對(duì)pyrG基因是特異性的。有一個(gè)轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生期望的1.1kb PCR產(chǎn)物。
從Southern印跡，包括轉(zhuǎn)化子和米曲霉基因組DNA以EcoRI消化，經(jīng)凝膠電泳分級(jí)分離，轉(zhuǎn)移到Immobilan-N膜上，用包含NpII基因的pJaL198的1.1kb EcoRI片段探測(cè)，發(fā)現(xiàn)野生型3.8kb帶在轉(zhuǎn)化子中轉(zhuǎn)移至10kb帶。這證明轉(zhuǎn)化的DNA以多拷貝整合進(jìn)NpII基因。該菌株稱為JaL121。實(shí)施例5用JaL121產(chǎn)生凝乳酶用質(zhì)粒pToC56(參見(jiàn)圖6)與pToC90共轉(zhuǎn)化米曲霉菌株JaL121，pToC56質(zhì)粒是哺乳動(dòng)物凝乳酶的真菌表達(dá)質(zhì)粒。質(zhì)粒pToC56的構(gòu)建在EP 98 993A中有描述。
在包含10mM乙酰胺的基本培養(yǎng)基生長(zhǎng)選擇轉(zhuǎn)化子，就產(chǎn)生凝乳酶的能力對(duì)pToC56的存在進(jìn)行篩選。于30℃在含有包含麥芽糖糊精、大豆粉和蛋白胨的培養(yǎng)基中使轉(zhuǎn)化子在搖瓶中生長(zhǎng)4天，使米曲霉IFO 4177中pToC56轉(zhuǎn)化子與JaL121轉(zhuǎn)化子同時(shí)生長(zhǎng)。
在每天收集發(fā)酵液樣品，用于SDS-Page和Western印跡法。然后將印跡膜與凝乳酶特異性兔抗體一起溫育，接著與連有過(guò)氧物酶的羊兔抗體一起溫育。
膜染色顯示，發(fā)酵的第一和第二天，米曲霉IFO 4177轉(zhuǎn)化子的上清液包含少量的凝乳酶，或其降解產(chǎn)物，此后，沒(méi)有檢測(cè)到胰凝乳蛋白酶。相反，JaL121轉(zhuǎn)化子含至少10倍的全長(zhǎng)凝乳酶。頭兩三天，上清液中的凝乳酶的量增加，然后保持恒定。
序列表SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2052個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體尖鐮孢(B)菌株DSM 2672(C)單個(gè)分離物p45(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞mat_肽(B)位置785..2049(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞sig_肽(B)位置55..784(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞內(nèi)含子(B)位置364..415(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞內(nèi)含子(B)位置802..854(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞內(nèi)含子(B)位置1821..1868(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGCGTTTCT CCGACTCTCT CCTCCTCATC GGCCTATCCA GCCTCGCTGG TGCTCATCCC 60AGCAGAAGGG CTCCTAATCC TTCACCGCTG AGCAAGCGTG GCCTCGACCT GGAAGCTTTT 120AAGCTTCCTC CCATGGCCGA GTACGTTCCT CAGGACGAGG TTCCTGATGA TGTCAGTGCC 180AAGGTCGTCA CCAAGCGCGC TGATTACACC GAGACTGCCA AGGACTTGGT TAAGTCGACT 240TTCCCCAAGG CTACTTTCCG TATGGTCACG GATCACTATG TTGGTAGCAA CGGAATTGCG 300CATGTAAACT TTAAGCAGAC TGTCAACGGT ATTGATATCG ACAATGCTGA TTTCAACGTC 360AACGTGGGTA TTCTCAAGAC TTTGGGGAGT TTGGAATGTG CTGACATGGA TACAGATTGG 420CGCTGACGGC GAGGTCTTCT CCTACGGAAA CAGCTTCTAC GAGGGCAAGA TTCCCGGTCC 480TCTTACCAAG CGTGACGAGA AAGACCCCGT CGACGCTCTC AAGGACACCG TTGATGTTCT 540TTCTCTCCCC GTTGAGGCTG ACAAGGCCAA GGCTGAGAAG AAGAGCAAGA ACCACTACAC 600CTTCACTGGT ACCAAGGGTA CCGTCAGCAA GCCCGAGGCT AAGCTCACCT ACCTTGTTGA 660TGAGAACAAG GAGCTCAAGC TCACATGGAG AGTTGAGACT GATATTGTTG ACAACTGGCT 720GTTGACTTAT GTCAATGCTG CCAAGACTGA TGAGGTTGTT GGTGTTGTTG ACTACGTCAA 780TGAGGCGACA TACAAGGTCT AGTACGTATT TCCATAAATT GACGATTGGG AAAGAATTGA 840CCGTTGTATT ATAGTCCTTG GGGTGTCAAT GATCCCTCCA AGGGATCTCG CTCCACTGTT 900GAGAACCCCT GGAATCTCGC GGCCTCCGAG TTCACCTGGC TCAGCGACGG CTCAAACAAC 960TACACCACAA CCCGCGGGAA CAATGGAATT GCACAGGTGA ATCCTTCAGG GGGCTCCACG1020TATCTGAACA ATTACCGTCC TGATAGCCCG TCGCTGAAGT TCGAGTATGA TTACTCCACC1080AGCACCACTA CACCCACCAC CTACCGCGAT GCTTCCATCG CTCAGCTTTT CTACACAGCC1140AACAAGTACC ACGACCTCCT CTACCTTCTT GGCTTTACCG AACAGGCTGG TAACTTCCAG1200ACCAACAACA ATGGCCAGGG TGGTGTAGGA AACGATATGG TTATCCTCAA CGCTCAGGAC1260GGAAGCGGCA CCAACAACGC CAACTTCGCT ACACCCGCTG ACGGTCAGCC CGGCCGCATG1320CGAATGTATC TCTGGACATA CAGCACACCC CAGCGTGACT GCAGTTTCGA CGCTGGCGTT1380GTTATCCACG AGTACACTCA CGGTCTCTCC AACCGTCTCA CAGGTGGCCC TGCCAACTCG1440GGTTGTCTTC CCGGTGGTGA ATCCGGTGGC ATGGGTGAGG GCTGGGGTGA CTTCATGGCT1500ACTGCCATTC ACATCCAATC CAAGGATACC CGCGCTAGCA ACAAGGTCAT GGGTGACTGG1560GTGTACAACA ACGCAGCTGG TATCCGAGCT TATCCTTACA GTACAAGCCT TACCACTAAC1620CCTTACACTT ACAAGAGTGT TAACAGTCTC AGTGGAGTCC ATGCTATTGG TACTTACTGG1680GCTACTGTTC TGTATGAGGT TATGTGGAAC CTCATCGACA AGCATGGGAA GAATGATGCG1740GATGAGCCCA AATTCAACAA CGGCGTTCCT ACAGATGGCA AATATCTTGC TATGAAGTTA1800GTAGTGGATG GCATGTCGCT_GTAAGTTGTC CCTTGGATTT GTAGGAGTTC TTATCTAACG1860TTTAATAGGC AACCTTGCAA CCCCAACATG GTCCAGGCCC GAGACGCCAT CATCGACGCC1920GACACCGCTC TTACCAAGGG AGCTAACAAG TGCGAGATCT GGAAGGGCTT TGCCAAGCGT1980GGTCTTGGAA CTGGTGCCAA GTATAGTGCT TCCAGCCGTA CTGAGAGCTT TGCTCTTCCT2040TCTGGATGTT AA2052SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度388個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體尖鐮孢(B)菌株DSM 2672(C)單個(gè)分離物p45(xi)序列描述SEQ ID NO2Ala Thr Tyr Lys Val Tyr Pro Trp Gly Val Asn Asp Pro Ser Lys Gly1 5 10 15Ser Arg Ser Thr Val Glu Asn Pro Trp Asn Leu Ala Ala Ser Glu Phe20 25 30Thr Trp Leu Ser Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Thr Thr Thr Arg Gly Asn35 40 45Asn Gly Ile Ala Gln Val Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Leu Asn50 55 60Asn Tyr Arg Pro Asp Ser Pro Ser Leu Lys Phe Glu Tyr Asp Tyr Ser65 70 75 80Thr Ser Thr Thr Thr Pro Thr Thr Tyr Arg Asp Ala Ser Ile Ala Gln85 90 95Leu Phe Tyr Thr Ala Asn Lys Tyr His Asp Leu Leu Tyr Leu Leu Gly100 105 110Phe Thr Glu Gln Ala Gly Asn Phe Gln Thr Asn Asn Asn Gly Gln Gly115 120 125Gly Val Gly Asn Asp Met Val Ile Leu Asn Ala Gln Asp Gly Ser Gly130 135 140Thr Asn Asn Ala Asn Phe Ala Thr Pro Ala Asp Gly Gln Pro Gly Arg145 150 155 160Met Arg Met Tyr Leu Trp Thr Tyr Ser Thr Pro Gln Arg Asp Cys Ser165 170 175Phe Asp Ala Gly Val Val Ile His Glu Tyr Thr His Gly Leu Ser Asn180 185 190Arg Leu Thr Gly Gly Pro Ala Asn Ser Gly Cys Leu Pro Gly Gly Glu195 200 205Ser Gly Gly Met Gly Glu Gly Trp Gly Asp Phe Met Ala Thr Ala Ile210 215 220His Ile Gln Ser Lys Asp Thr Arg Ala Ser Asn Lys Val Met Gly Asp225 230 235 240Trp Val Tyr Ash Asn Ala Ala Gly Ile Arg Ala Tyr Pro Tyr Ser Thr245 250 255Ser Leu Thr Thr Asn Pro Tyr Thr Tyr Lys Ser Val Asn Ser Leu Ser260 265 270Gly Val His Ala Ile Gly Thr Tyr Trp Ala Thr Val Leu Tyr Glu Val275 280 285Met Trp Asn Leu Ile Asp Lys His Gly Lys Asn Asp Ala Asp Glu Pro290 295 300Lys Phe Asn Asn Gly Val Pro Thr Asp Gly Lys Tyr Leu Ala Met Lys305 310 315 320Leu Val Val Asp Gly Met Ser Leu Gln Pro Cys Asn Pro Asn Met Val325 330 335Gln Ala Arg Asp Ala Ile Ile Asp Ala Asp Thr Ala Leu Thr Lys Gly340 345 350Ala Asn Lys Cys Glu Ile Trp Lys Gly Phe Ala Lys Arg Gly Leu Gly355 360 365Thr Gly Ala Lys Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Thr Glu Ser Phe Ala Leu370 375 380Pro Ser Gly Cys385SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(v)片段類型N-末端(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體尖鐮孢(B)菌株DSM 2672(C)單個(gè)分離物p45(xi)序列描述SEQ ID NO3Ala Thr Tyr Lys Val Tyr Pro Trp Gly Val Asn Asp Pro Ser15 10SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度747個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體米曲霉(B)菌株IFO 4177(C)單個(gè)分離物NpI(xi)序列描述SEQ ID NO4GCGTGGGGGA TGAATGACCC GACGGAGGGC CCTCGCACCG TCATCAGCGA TCCATGGGAT 60TCGTCCGCAT CTGCGTTCAC CTGGATCAGT GACGGAGAAA ACAACTATAC CACAACTCGC 120GGCAACAACG GTATCGCGCA GTCGAACCCT ACCGGTGGAT CGCAGTACTT GAAGAACTAC 180CGGCCTGATA GCCCCGATTT GAAATTCCAA TACCCCTATT CGTTCAACGC CACACCCCCA 240GAGTCCTATA TTGATGCGTC TATCACTCAG CTTTTCTACA CTGCCAACAC GTACCACGAT 300CTACTCTACA CTCTGGGCTT CAACGAGGAG GCCGGTAATT TCCAGTACGA TAACAATGGA 360AAAGGAGGTG CTGGAAACGA CTACGTGATC CTCAATGCTC AGGACGGTTC TGGCACCAAT 420AACGCCAACT TCGCTACGCC CCCGGATGGA CAGCCCGGCC GCATGCGCAT GTACATATGG 480ACCGAGTCCC AGCCTTACCG TGACGGCTCC TTCGAGGCTG GTATTGTGAT TCACGAGTAT 540ACTCACGGCC GTATGTATCC CTTATGAACC CCAAGTAAGG CAGTCTGAAC TAACACCACG 600GCACACAGTC TCTAACCGGC TCACTGGAGG ACCCGCTAAC TCTCGCTGTT TGAATGTCCT 660TGAATCCGGC GGAATGGGTG AAGGTTGGGG AGACTTCATG GCCACGGTAT TTCGGCTCAA 720GGTCGGCGAT TCTCACTTCG ATCCTTT 747SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5GGAGGAAGATCTCTCTGGTA CTCTTCGATCTCSEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO6GGAGGAGAATTCAAGCTTCTTCTACATCACAGTTTGAAAGCSEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO7CTAGGATCCA AGGCATTTAT GCGTGTCACT ACTCTC 36SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO8CTACTCGAGT TAGCACTTGA GCTCGATAGC 30SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO9CCCTTCTTTC CAAACCG 17SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO10GGGTGAGCCA CTGCCTC 1權(quán)利要求
1.一種對(duì)表達(dá)異源蛋白質(zhì)產(chǎn)物有用的宿主細(xì)胞，為了表達(dá)與親本細(xì)胞比較明顯降低水平的金屬蛋白酶，該宿主細(xì)胞已經(jīng)遺傳修飾過(guò)。
2.按照權(quán)利要求1的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
3.按照權(quán)利要求2的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞是酵母屬的菌株，優(yōu)選的是啤酒酵母。
4.按照權(quán)利要求1的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞是絲狀真菌。
5.按照權(quán)利要求4的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞是選自頂孢霉屬、曲霉屬、假絲酵母屬、Cocliobolus、內(nèi)座殼屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、鏈孢霉屬、根毛霉屬、根霉屬、Thermomyces、木霉屬、柄孢殼屬、Pyricularia和青霉屬的菌株。
6.按照權(quán)利要求5的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞是選自由米曲霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、泡盛曲霉、海棗曲霉、日本曲霉、Aspergillus foetus、禾谷鐮孢、尖鐮孢、腐皮鐮孢、灰腐質(zhì)霉、粗糙鏈孢霉、產(chǎn)黃青霉、Rhizomucormeihei、Trichoderma reesei和綠色木霉的菌株。
7.按照任何權(quán)利要求1-6任一之宿主細(xì)胞，其中所說(shuō)的金屬蛋白酶是鐮孢屬金屬蛋白酶。
8.按照權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞，其中所說(shuō)的金屬蛋白酶是尖鐮孢金屬蛋白酶。
9.按照權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞，其中所說(shuō)的金屬蛋白酶是具有SEQ IDNO2所示的氨基酸序列或其同源序列的尖鐮孢p45金屬蛋白酶。
10.按照權(quán)利要求1-6任一之宿主細(xì)胞，其中所說(shuō)的金屬蛋白酶是中性金屬蛋白酶，該蛋白酶具有在pH6-8范圍內(nèi)的最佳蛋白酶解活性。
11.按照權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞，其中所說(shuō)的金屬蛋白酶是NpI或NpII組的中性曲霉屬金屬蛋白酶。
12.按照權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，其中所說(shuō)的金屬蛋白酶是米曲霉中性金屬蛋白酶I(NpI)，該蛋白酶由包含SEQ ID NO4所示的部分核苷酸序列或其同源序列之cDNA序列編碼。
13.按照權(quán)利要求1-12任一之宿主細(xì)胞，該細(xì)胞的編碼金屬蛋白酶的結(jié)構(gòu)區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)已經(jīng)遺傳修飾過(guò)。
14.按照權(quán)利要求13的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞已由特異性或隨機(jī)誘變；PCR產(chǎn)生的誘變；定點(diǎn)DNA缺失、插入和/或取代；基因破裂或基因置換技術(shù)；反義技術(shù)或它們的組合遺傳修飾過(guò)。
15.按照權(quán)利要求1-14任一之宿主細(xì)胞，在該細(xì)胞中表達(dá)的金屬蛋白酶的水平降低約50％以上，優(yōu)選的約85％以上，更優(yōu)選的約90％以上，最優(yōu)選的約95％以上。
16.按照權(quán)利要求1-14任一之宿主細(xì)胞，該細(xì)胞基本上無(wú)任何金屬蛋白酶活性。
17.一種用權(quán)利要求1的宿主細(xì)胞產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，該方法包括(a)將編碼所說(shuō)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的核酸序列引入到所說(shuō)的宿主細(xì)胞中；(b)在合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(a)的宿主細(xì)胞；和(c)分離所說(shuō)的異源蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
18.按照權(quán)利要求17的方法，其中所說(shuō)的宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
19.按照權(quán)利要求18的方法，其中所說(shuō)的宿主細(xì)胞是酵母屬的菌株，優(yōu)選的是啤酒酵母。
20.按照權(quán)利要求17的方法，其中所說(shuō)的宿主細(xì)胞絲狀真菌。
21.按照權(quán)利要求20的方法，其中所說(shuō)的宿主細(xì)胞是選自由頂孢霉屬、曲霉屬、假絲酵母屬、Cocliobolus、內(nèi)座殼屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、鏈孢霉屬、根毛霉屬、根霉屬、Thermomyces、木霉屬、柄孢殼屬、Pyricularia、和青霉屬的菌株。
22.按照權(quán)利要求21的方法，其中所說(shuō)的宿主細(xì)胞是選自由米曲霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、泡盛曲霉、海棗曲霉、日本曲霉、Aspergillus foetus、禾谷鐮孢、尖鐮孢、腐皮鐮孢、灰腐質(zhì)霉、粗糙鏈孢霉、產(chǎn)黃青霉、Rhizomucor meihei、Trichoderma reesei和綠色木霉的菌株。
23.按照權(quán)利要求17-22的方法，其中所說(shuō)的金屬蛋白酶是鐮孢屬金屬蛋白酶。
24.按照權(quán)利要求23的方法，其中所說(shuō)的金屬蛋白酶是尖鐮孢金屬蛋白酶。
25.按照權(quán)利要求24的方法，其中所說(shuō)的金屬蛋白酶是具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列或其同源序列的尖鐮孢p45金屬蛋白酶。
26.按照權(quán)利要求17-22任一之方法，其中所說(shuō)的金屬蛋白酶是中性金屬蛋白酶，該蛋白酶具有在pH6-8范圍內(nèi)的最佳蛋白酶解活性。
27.按照權(quán)利要求26的方法，其中所說(shuō)的金屬蛋白酶是NpI或NpII組的中性曲霉屬金屬蛋白酶。
28.按照權(quán)利要求27的方法，其中所說(shuō)的金屬蛋白酶是米曲霉中性金屬蛋白酶I(NpI)，該蛋白酶由包含SEQ ID NO4所示的部分核苷酸序列或其同源序列之cDNA序列編碼。
29.按照權(quán)利要求17-28任一之方法，其中所說(shuō)的宿主細(xì)胞的編碼金屬蛋白酶的結(jié)構(gòu)區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)已經(jīng)遺傳修飾過(guò)。
30.按照權(quán)利要求29的方法，其中所說(shuō)的宿主細(xì)胞已經(jīng)特異性或隨機(jī)誘變；PCR產(chǎn)生的誘變；定點(diǎn)DNA缺失、插入和/或取代；基因破裂或基因置換技術(shù)；反義技術(shù)或它們的組合遺傳修飾過(guò)。
31.按照權(quán)利要求17-30任一之方法，其中由宿主細(xì)胞表達(dá)的金屬蛋白酶的水平降低約50％以上，優(yōu)選的約85％以上，更優(yōu)選的約90％以上，最優(yōu)選的約95％以上。
32.按照權(quán)利要求17-30任一之方法，其中由宿主細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)物基本上無(wú)任何金屬蛋白酶活性。
33.按照任何權(quán)利要求17-32任一之方法，其中所說(shuō)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是真核酶，如胰島素、生長(zhǎng)激素、胰高血糖素、生長(zhǎng)激素釋放抑制因子、干擾素、PDGF、凝血因子VII、凝血因子VIII、尿激酶、EPO、凝乳酶、組織血纖維蛋白溶酶原激活劑或血清白蛋白。
34.按照權(quán)利要求17-32任一之方法，其中所說(shuō)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是真菌來(lái)源的蛋白質(zhì)。
35.按照權(quán)利要求34的方法，其中所說(shuō)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是真菌酶，特別是淀粉分解酶如α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶，β-半乳糖苷酶，纖維素酶，脂解酶，木聚糖酶，蛋白酶，氧化還原酶如過(guò)氧物酶或漆酶，果膠酶或角質(zhì)酶。
36.按照權(quán)利要求17-32的方法，其中所說(shuō)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是細(xì)菌蛋白質(zhì)。
37.按照權(quán)利要求36的方法，其中所說(shuō)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是細(xì)菌酶，特別是淀粉分解酶如α-淀粉酶、β-淀粉酶、萄糖淀粉酶，β-半乳糖苷酶，纖維素酶，脂解酶，木聚糖酶，蛋白酶，氧化還原酶如過(guò)氧物酶或漆酶，果膠酶或角質(zhì)酶。
38.按照權(quán)利要求17-37任一之方法，其中所說(shuō)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是前體蛋白(即酶原)、雜合蛋白、作為原序列或前-原序列或者以非成熟形式獲得的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的宿主細(xì)胞和產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法。更具體地說(shuō),本發(fā)明涉及對(duì)表達(dá)異源蛋白質(zhì)有用的宿主細(xì)胞,為了表達(dá)明顯降低水平的金屬蛋白酶,該宿主細(xì)胞已經(jīng)遺傳修飾過(guò)。此外本發(fā)明涉及產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法,該方法包括在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞,接著回收所需蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N9/58GK1179178SQ96192700
公開(kāi)日1998年4月15日 申請(qǐng)日期1996年3月20日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月20日
發(fā)明者J·勒穆比克 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司