專利名稱：：抗應(yīng)激性微生物及發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本項(xiàng)發(fā)明系關(guān)于發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法，具體說(shuō)就是通過(guò)微生物發(fā)酵，制取氨基酸等有益物質(zhì)的方法，以及對(duì)抑制微生物的生長(zhǎng)和/或發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生的應(yīng)激壓力具有抗性的微生物。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞一旦處于高溫、高滲透壓、代謝阻滯、重金屬存在、病毒感染等應(yīng)激狀態(tài)，在很短時(shí)間內(nèi)就可以誘導(dǎo)合成一種稱為熱應(yīng)激蛋白的蛋白質(zhì)(以下簡(jiǎn)稱[HSP])，以防御應(yīng)激反應(yīng)。這種HSP，從原核細(xì)胞到真核細(xì)胞具有廣泛的同源性，可分成這幾個(gè)大組(HSP60組、HSP70組、HSP90組、TRiC組、其它組)(Hendrick，J.P.andHartlF-V生物化學(xué)年評(píng)，62,349-384(1993))。HSP之所以具有抗應(yīng)激性，是因?yàn)镠SP具有形成蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的功能(蛋白質(zhì)的折疊)。即蛋白質(zhì)因應(yīng)激反應(yīng)而變性、不能形成正常高級(jí)結(jié)構(gòu)，HSP與其相結(jié)合，該蛋白質(zhì)重新形成正確的高級(jí)結(jié)構(gòu)(再折疊)使其恢復(fù)正常功能。在蛋白質(zhì)形成高級(jí)結(jié)構(gòu)的過(guò)程中，HSP不僅對(duì)已變性蛋白質(zhì)發(fā)揮作用，即使是正常狀態(tài)的細(xì)胞，HSP也作為伴侶分子參與到蛋白質(zhì)的折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程中，現(xiàn)在人們已經(jīng)意識(shí)到它的重要性，給予很大關(guān)注(Ellis，R.J.等科學(xué)250，954-959(1990)。所謂伴侶分子就是輔助的意思，因HSP可與各種蛋白質(zhì)相結(jié)合發(fā)揮作用而被命名的。HSP是在細(xì)胞處于上述應(yīng)激狀態(tài)的誘導(dǎo)之下發(fā)現(xiàn)的。通常情況下，這種誘導(dǎo)是暫時(shí)的，不久就會(huì)減退，重新達(dá)到一個(gè)新的穩(wěn)定狀態(tài)。這種誘導(dǎo)HSP的方法，是在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行的(CowingD.C.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，80，2679-2683(1985)，Zhou，Y.N.等，細(xì)菌學(xué)雜志，170，3640-3649(1988))。HSP基因中有一稱為熱應(yīng)激啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)，其中存在對(duì)該熱應(yīng)激啟動(dòng)子特異起作用的σ因子中的一種σ32。σ32是由rpoH基因編碼半衰期很短(約1分鐘)的一種蛋白質(zhì)，它與短時(shí)誘導(dǎo)HSP密切相關(guān)(Straus，D.B.等，自然，329，348-351(1987))。σ32的自身調(diào)節(jié)是靠轉(zhuǎn)錄及翻譯進(jìn)行的，但主要依靠翻譯調(diào)節(jié)。由熱應(yīng)激方式誘導(dǎo)HSP的方法，主要取決于σ32合成量的增加和穩(wěn)定性的增加二方面的機(jī)制。其中將σ32的結(jié)構(gòu)進(jìn)行熱處理，促進(jìn)其翻譯功能，可增加它的合成量(Yura.T.等，微生物學(xué)年評(píng)，47，321-351(1993))；關(guān)于σ32穩(wěn)定性問(wèn)題，現(xiàn)在認(rèn)為σ32的降解過(guò)程與HSP(Dnak等)有關(guān)，通過(guò)HSP反饋抑制其活動(dòng)，達(dá)到一定狀態(tài)(Tilly，K等，細(xì)胞，34，641-646(1983)，Liberek，K，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)8935116-3520(1994)。我們已經(jīng)了解大腸桿菌(E.coli)在應(yīng)激狀態(tài)下HSP與細(xì)胞生長(zhǎng)之間的關(guān)系(Meury，J.等，歐洲微生物學(xué)聯(lián)合會(huì)微生物學(xué)快報(bào)，11393-100(1993))、dnaK對(duì)人成長(zhǎng)過(guò)程中激素產(chǎn)生的影響及groE對(duì)膠原酶原分泌的影響(Hockney，R.C.，生物工程動(dòng)態(tài)12，456(1994))，但還不清楚氨基酸核酸等發(fā)酵產(chǎn)物與HSP之間的關(guān)系。而且還尚不清楚棒桿狀細(xì)菌中HSP與生長(zhǎng)的關(guān)系和HSP與發(fā)酵產(chǎn)物之間的關(guān)。發(fā)明公開(kāi)本發(fā)明以明確HSP與微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵的關(guān)系為課題，在氨基酸等有益物質(zhì)的發(fā)酵過(guò)程中，減少應(yīng)激壓力對(duì)微生物的生長(zhǎng)/或發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)生的影響，從而改善生產(chǎn)及收獲率低下。本發(fā)明人，為解決上述課題進(jìn)行了專門的研究，將編碼HSP的基因或編碼HSP中有特殊功能的σ因子的基因?qū)胛⑸镏?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這樣可使HSP活性增強(qiáng)，從而使微生物的生產(chǎn)性及生長(zhǎng)等得到改善，及至最終完成本發(fā)明。本發(fā)明也即包括如下特征的方法在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，使發(fā)酵產(chǎn)物在培養(yǎng)基中生成和積聚，然后提取該發(fā)酵產(chǎn)物，再利用微生物制備發(fā)酵產(chǎn)物的方法，將前面提到的微生物中編碼HSP的基因或編碼HSP中有特殊功能的σ因子的基因，至少一個(gè)導(dǎo)入該發(fā)酵產(chǎn)物的細(xì)胞中，使HSP活性增強(qiáng)，減少應(yīng)激反應(yīng)對(duì)微生物的生長(zhǎng)/或發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)生的抑制。另一方面，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物用的微生物，其中該微生物由于導(dǎo)入至少一種編碼HSP的基因和在細(xì)胞中特異性增強(qiáng)HSP表達(dá)量的σ因子的基因而被修飾，從而該微生物對(duì)應(yīng)激壓力的抗性增強(qiáng)，否則的話應(yīng)激壓力將抑制微生物的生長(zhǎng)和/或發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法和微生物涉及各種發(fā)酵產(chǎn)物包括，例如，L-蘇氨酸，L-賴氨酸，L-谷氨酸，L-亮氨酸，L-異亮氨酸，L-纈氨酸，L-苯丙氨酸；核酸或核苷如鳥(niǎo)苷酸，肌苷，和肌苷酸；以及其它物質(zhì)如維生素和抗生素。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，應(yīng)激壓力包括溫度，培養(yǎng)基的滲透壓，和對(duì)微生物的生長(zhǎng)不利的高濃度的發(fā)酵產(chǎn)物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼熱應(yīng)激蛋白的基因具體包括groE而編碼σ因子的基因具體包括rpoH。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明使用的微生物包括屬于大腸桿菌屬的細(xì)菌和棒桿狀細(xì)菌。下面將詳細(xì)描述本發(fā)明。本發(fā)明所使用的發(fā)酵產(chǎn)物沒(méi)有具體限制，只要它是可用微生物發(fā)酵產(chǎn)生的產(chǎn)物即可。發(fā)酵產(chǎn)物這些由微生物產(chǎn)生的如，各種L-氨基酸如L-蘇氧酸，L-賴氨酸，L-谷氨酸，L-亮氨酸，L-異亮氨酸，L-纈氨酸，L-苯丙氨酸；核酸或核苷如鳥(niǎo)苷酸，肌苷，和肌苷酸；以及其它物質(zhì)如維生素和抗生素。甚至一些目前不是用微生物產(chǎn)生的物質(zhì)，本發(fā)明可用于這些物質(zhì)使它們可用微生物產(chǎn)生，例如作為基因重組的后續(xù)結(jié)果。在上述的物質(zhì)中，本發(fā)明的方法優(yōu)選用于那些被分泌到培養(yǎng)基中的物質(zhì)，尤其是氨基酸，以便增加培養(yǎng)基的滲透壓。對(duì)因?qū)胫辽僖环N編碼HSP的基因和編碼σ因子的基因而被修飾的微生物沒(méi)有特別限制，只要該微生物能通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物即可，其中編碼σ因子的基因可特異性的作用于HSP基因以增加其在細(xì)胞中的表達(dá)量，從而增加了對(duì)抑制微生物的生長(zhǎng)和/或發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生的應(yīng)激壓力的抗性。該微生物包括那些以被用于產(chǎn)生物質(zhì)的，例如屬于大腸桿菌屬的細(xì)菌，棒桿狀細(xì)菌，屬于枯草桿菌屬的細(xì)菌，以及屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌。優(yōu)選的微生物是其中以獲得了一個(gè)含質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)的DNA片段，HSP基因或?qū)SP基因特異的基因的操縱子，而且這些基因的拷貝數(shù)在微生物中增加。上述的棒桿狀細(xì)菌是一組如伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)，第8版，599頁(yè)(1974)中所定義的微生物，它們是好氧和抗酸的不具孢子形成能力的革蘭氏陽(yáng)性桿狀菌，屬于棒桿菌屬的細(xì)菌，屬于短桿菌屬的目前已被劃分到短桿菌屬但現(xiàn)在仍與屬于棒桿菌屬的細(xì)菌一致的細(xì)菌，和屬于與棒桿菌屬密切相關(guān)的短桿菌屬的細(xì)菌。具體地說(shuō)，每種發(fā)酵產(chǎn)物的代表性微生物如下。適于L-蘇氨酸包括大腸桿菌VKPMB3996(RIA)(參見(jiàn)美國(guó)專利5,175,107)，和噬乙酰乙酸棒桿菌AJ12318(FERMBP-1172)(參見(jiàn)美國(guó)專利5,188,949)。適用于L-賴氨酸的包括，例如大腸桿菌AJ11442(NRRLB-12185，F(xiàn)ERMBP-1543)(參見(jiàn)美國(guó)專利4,346,170)，大腸桿菌W3110(tyrA)(該菌株可通過(guò)從大腸桿菌W3110(tyrA)/pHATerm(FERMBP-3635)中去除質(zhì)粒pHATerm而得到，參見(jiàn)WO95/16042國(guó)際專利公報(bào))，乳發(fā)酵短桿菌AJ12435(FERMBP-2294)(參見(jiàn)美國(guó)專利5,304,476)，和乳發(fā)酵短桿菌AJ3990(ATCC31269)(參見(jiàn)美國(guó)專利4,066,501)。適于L-谷氨酸的包括，例如大腸桿菌AJ12624(FERMBP-3835)(參見(jiàn)法國(guó)專利公開(kāi)2,680,178)，乳發(fā)酵短桿菌AJ12821(FERMBP-4172)(參見(jiàn)日本專利公開(kāi)5-26811，法國(guó)專利公開(kāi)2,701,489)，乳發(fā)酵短桿菌AJ12475(FERMBP-2922)(參見(jiàn)美國(guó)專利5,272,067)，和乳發(fā)酵短桿菌AJ13029(FERMBP-5189)(參見(jiàn)JP95/01586國(guó)際專利公報(bào))。適于L-亮氨酸的包括，例如，大腸桿菌AJ11478(FERMP-5274)(參見(jiàn)日本專利公報(bào)62-34397)，以及乳發(fā)酵短桿菌AJ3718(FERMP-2516)(參見(jiàn)美國(guó)專利3,970,519)。適于L-異亮氨酸包括，例如，大腸桿菌KXI41(VKPMB-4781)(參見(jiàn)歐洲專利公報(bào)519,113)，黃色短桿菌AJ12149(FERMBP-759)(參見(jiàn)美國(guó)專利4,656,135)。適于L-纈氨酸的包括，例如，大腸桿菌VL1970(VKPMB-4411)(參見(jiàn)歐洲專利公報(bào)519,113)，乳發(fā)酵短桿菌AJ12341(FERMBP-1763)(參見(jiàn)美國(guó)專利5,188,948)。適于L-苯丙氨酸的包括，例如，大腸桿菌AJ12604(FERMBP-3579)(參見(jiàn)日本專利公開(kāi)5-236947和歐洲專利公報(bào)488,424)，乳發(fā)酵短桿菌AJ12637(FERMBP-4160)(參見(jiàn)法國(guó)專利公報(bào)2,686,898)。用于本發(fā)明方法的微生物包括上述的微生物，在所定義的由導(dǎo)入了至少一種編碼HSP的基因和特異性作用于HSP以增強(qiáng)HSP在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量的σ因子的基因而被修飾的微生物的范圍以內(nèi)，從而使該微生物增加了對(duì)抑制微生物生長(zhǎng)和/或發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生的應(yīng)激壓力的抗性。將被導(dǎo)入進(jìn)微生物中的基因可以是編碼HSP的基因和編碼特異性作用于HSP基因的σ因子的基因中的任一個(gè)或二者。術(shù)語(yǔ)“增加HSP的表達(dá)量”指增加原先產(chǎn)HSP的微生物的HSP的產(chǎn)物量，還意謂著使在原先的狀態(tài)不表達(dá)HSP的微生物變德表達(dá)HSP。具體地說(shuō)，HSP表達(dá)量的增加可這樣實(shí)現(xiàn)，例如，通過(guò)將外來(lái)或外源HSP基因?qū)胛⑸锏募?xì)胞中并使其在細(xì)胞中表而實(shí)現(xiàn)。在這樣的方法中，可用能在微生物細(xì)胞中自主復(fù)制的載體，特別是多拷貝類型的質(zhì)粒作為載體使細(xì)胞中的HSP基因的拷貝數(shù)增加?？商娲兀琀SP的表達(dá)可用具有高表達(dá)效率的啟動(dòng)子增加每單位HSP基因的表達(dá)量而被有效的增強(qiáng)?？商娲?，HSP還可通過(guò)向微生物細(xì)胞中導(dǎo)入一個(gè)特異性用作HSP基因的內(nèi)在啟動(dòng)子的σ因子的基因而被增強(qiáng)。編碼HSP的基因包括，例如，groE(GroELS的基因)，dnaK(DnaK的基因)，以及dnaJ(DnaJ的基因)。其中，優(yōu)選groE。特異性作用于這些基因的σ因子以編碼σ32的rpoH為代表。作為這些基因來(lái)源低得微生物沒(méi)有特別限制，只要每種基因能夠在大腸桿菌屬的或棒桿狀細(xì)菌的微生物細(xì)胞中起作用，且具體的以屬于大腸桿菌屬和棒桿狀細(xì)菌的微生物為代表。已經(jīng)報(bào)道了大腸桿菌的rpoH基因和groE基因的核苷酸序列(rpoH細(xì)菌學(xué)雜志，170，3479-3484(1988)；groE自然，333，330-334(1988))。這些基因可用在這些序列的基礎(chǔ)上合成的寡核苷酸引物通過(guò)PCR方法(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))從大腸桿菌染色體中得到。擴(kuò)增rpoH基因的引物的核苷酸序列代表性地如SEQIDNOS1和2所示。擴(kuò)增groE基因的引物的核苷酸序列代表性地如SEQIDNOS3和4所示。據(jù)報(bào)道已用PCR方法分離了黃色短桿菌的dnaK和groE基因，所用的引物是在來(lái)源于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的dnaK和groE基因中保守的氨基酸序列的基礎(chǔ)上制備的，且這些基因與來(lái)源于其它微生物的dnaK和groE基因高度同源(1994年日本分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)會(huì)議報(bào)告摘要，395頁(yè))。根據(jù)以上事實(shí)，預(yù)測(cè)編碼其它HSP基因(dnaJ和rpoE基因等)也與其它來(lái)源于大腸桿菌的每一種基因高度同源。因此，認(rèn)為可以很容易地使用來(lái)源于大腸桿菌的編碼HSP的基因通過(guò)雜交方法，或者利用這些基因的部分序列通過(guò)PCR方法從棒桿狀細(xì)菌中分離這些基因。為了將如上所述得到的基因?qū)氪竽c桿菌屬的細(xì)菌中，例如，將含有該基因的DNA片段與可在大腸桿菌屬的細(xì)菌細(xì)胞中自主復(fù)制的載體連接，并可用得到的大腸桿菌屬的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌的細(xì)菌。為了將上述的基因大腸桿菌屬細(xì)菌以外的其它微生物中，將含有該基因的DNA片段與可在微生物細(xì)胞中自主復(fù)制的載體連接，并可用得到的大腸桿菌屬的重組載體轉(zhuǎn)化該微生物。質(zhì)粒載體DNA是本發(fā)明中可使用的優(yōu)選的載體DNA。這些適于以大腸桿菌屬細(xì)菌作為導(dǎo)入用微生物的質(zhì)粒包括，例如，pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG399，heRSF1010?？商娲兀部墒褂檬删wDNA。為了有效地促進(jìn)HSP的表達(dá)，可用在微生物中起操縱作用的啟動(dòng)子如lac，trp，和PL代替HSP的內(nèi)在啟動(dòng)子。為了將HSP基因或特異性地對(duì)HSP基因起作用的σ因子導(dǎo)入微生物中，可用轉(zhuǎn)座子的方法(Berg，D.E.和Berg，C.M.，生物和工程學(xué)，1，417(1983))，μ噬菌體(日本專利公開(kāi)2-109985)，或同源重組(分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1972)將含有該基因的DNA整合到微生物的染色體中。當(dāng)導(dǎo)入該基因用的微生物是棒桿狀細(xì)菌時(shí)，可用于本發(fā)明的載體DNA包括能在棒桿狀細(xì)菌自主復(fù)制的質(zhì)粒載體，如pAM330(參見(jiàn)日本專利公報(bào)1-11280)，和pHM1519(參見(jiàn)日本專利公開(kāi)58-77859)。轉(zhuǎn)化方法與制備微生物轉(zhuǎn)化子的普通方法沒(méi)有特別不同。例如，對(duì)屬于大腸桿菌屬的細(xì)菌，可根據(jù)D.M.Morrison的方法(酶學(xué)方法，68，326(1979))，用氯化鈣處理受體細(xì)胞以增加對(duì)DNA的通透性的方法(Mandel，M和Higa，A，分子生物學(xué)雜志，53，159(1970))。棒桿狀細(xì)菌根據(jù)Mandel等的方法轉(zhuǎn)化，或者如在枯草芽孢桿菌中所述的在增殖期導(dǎo)入的方法(以提供所謂的感受態(tài)細(xì)胞(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Young，F(xiàn).E.，基因，1，153(1977))?？商娲兀亟MDNA可在將DNA受體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樵|(zhì)體或原生質(zhì)球后被導(dǎo)入，如在枯草芽孢桿菌，放線菌和酵母中已知的那樣可以容易地整合重組DNA(Chang，S和Choen，S.N.，分子和普通遺傳學(xué)，168，111(179)，Bibb，M.J.，Ward，J.M.，和Hopwood，O.A，自然，274，(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.Fink，G.R.，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，75，1929(1978))?？商娲兀部捎秒娒}沖方法將重組DNA導(dǎo)入屬于短桿菌屬或棒桿菌屬的細(xì)菌中(杉木等，日本專利公開(kāi)2-207791)。普通微生物在受到培養(yǎng)溫度增加，由發(fā)酵產(chǎn)物或高濃度的培養(yǎng)基成分引起的高滲透壓，或與目標(biāo)發(fā)酵產(chǎn)物相關(guān)的代謝異常等應(yīng)激壓力的影響時(shí)，其生長(zhǎng)受抑制，發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量和產(chǎn)率下降。相反地，可能通過(guò)增強(qiáng)HSP的表達(dá)增加對(duì)此類應(yīng)激壓力的抗性。結(jié)果，可以在受上述應(yīng)激壓力影響的環(huán)境下增加發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。對(duì)應(yīng)激壓力的抗性不是指完全的抗性，因此還包括減少由應(yīng)激壓力引起的影響的特征。根據(jù)將被導(dǎo)入基因的類型和宿主微生物的類型，不是生長(zhǎng)的抑制和發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量和產(chǎn)率的下降都必須脫敏。有時(shí)盡管生長(zhǎng)受到抑制，但發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率確有提高。根據(jù)本發(fā)明的方法可以增加對(duì)其抗性的應(yīng)激壓力包括，如溫度，培養(yǎng)基的滲透壓和培養(yǎng)基中對(duì)微生物的生長(zhǎng)非優(yōu)選的高濃度的氨基酸。根據(jù)所用的微生物，用于本發(fā)明方法的發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基可以是已知的培養(yǎng)基。即，是含碳源，氮源，無(wú)機(jī)離子和任選的其它有機(jī)成分的普通培養(yǎng)基。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明不需要特殊的培養(yǎng)基。這些可用作碳源的包括，例如，糖類如葡萄糖，乳糖，半乳糖，果糖和淀粉水解產(chǎn)物；醇類如甘油和山梨糖醇；有機(jī)酸如富馬酸，檸檬酸，和琥玻酸?？捎米鞯吹陌?，例如，無(wú)機(jī)氨鹽如硫酸銨，氯化銨，和磷酸銨；有機(jī)氮如大豆水解產(chǎn)物，氨氣，和氨水。還希望含有合適量的作為有機(jī)微量營(yíng)養(yǎng)源的所需物質(zhì)如維生素B1，L-高絲氨酸，和L-酪氨酸；酵母提取物等。處此之外，如果需要還要加入小量的磷酸鉀，硫酸鎂，鐵離子，錳離子等。根據(jù)所用的微生物，可在已知的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)選培養(yǎng)在通氣條件下進(jìn)行16-120小時(shí)。在培養(yǎng)中溫度控制在25℃-45℃，pH控制在5-8。調(diào)節(jié)pH可以使用無(wú)機(jī)或有機(jī)的，酸性或堿性的物質(zhì)，氨氣等。在本發(fā)明中，在發(fā)酵完成之后從培養(yǎng)基液體中收集發(fā)酵產(chǎn)物，不需要任何特殊方法。即，本發(fā)明可綜合使用離子交換樹(shù)脂，沉淀和其它已知的方法進(jìn)行。實(shí)施本發(fā)明的最佳方式下面將參照實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地描述。實(shí)施例1制備導(dǎo)入rpoH基因和groE基因用的質(zhì)粒<1>rpoH基因和groE基因的克隆根據(jù)PCR方法(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))對(duì)大腸桿菌的rpoH基因和groE基因進(jìn)行了克隆。PCR方法中所用的引物是在已報(bào)道的大腸桿菌的rpoH基因(細(xì)菌學(xué)雜志.，170，3479-3484(1988))和groE基因(自然，333，330-334(1988))序列的基礎(chǔ)上合成的。合成了具有如SEQIDNO1(5’端)和SEQIDNO2(3’端)所示的核苷酸序列的寡核苷酸作為擴(kuò)增rpoH基因的引物。合成了具有如SEQIDNO3(5’端)和SEQIDNO4(3’端)所示的核苷酸序列的寡核苷酸作為擴(kuò)增groE基因的引物。(擴(kuò)增rpoH基因的引物)5′端-CGGAACGAAGTTTGATATCA-3′(SEQIDNO1)3′端5′-ATCCAGGGTTCTCTGCTTAA-3′(SEQIDNO2)(擴(kuò)增groE基因的引物)5′端5′-GACGTCGATAGCAGGCCAAT-3′(SEQIDNO3)3′端5′-GACGCACTCGCGTCGTCCGT-3′(SEQIDNO4)采用齊藤法(SaitoH.andMiura，K，生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào)，72，619(1963))從大腸桿菌K-12菌株中提取染色體DNA，以此為模板，使用上述的寡核苷酸作為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)即熱變性(94℃下1分鐘)、退火(37℃下2分鐘)、聚合反應(yīng)(72℃下3分鐘)如此反復(fù)25次。用市場(chǎng)上銷售的DNA未端平齊化試劑盒(寶酒造社制Bluntingkit)，將獲取的擴(kuò)增產(chǎn)物的兩末端平齊化處理，之后，將產(chǎn)物分別在載體質(zhì)粒pSTV28的HincII位點(diǎn)導(dǎo)入，即得到了質(zhì)粒pSTV28-rpoH和pSTV28-groE<2>在含有rpoH基因和groE基因的質(zhì)粒中導(dǎo)入棒桿狀菌的復(fù)制起點(diǎn)為了使pSTV28-rpoH能在棒桿狀細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制，一個(gè)來(lái)源于已得到的可在棒桿狀細(xì)菌內(nèi)自主復(fù)制的pHM1519質(zhì)粒(Miwa，K等，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，48(1984)2901-2903)的復(fù)制起點(diǎn)(日本專利公開(kāi)5-007491)導(dǎo)入pSTV28-rpoH中。具體地，用限制酶BamHI和KpnI消化pHM1519以得到含復(fù)制起點(diǎn)的DNA片段。用DNA末端平齊化試劑盒(寶酒造社制)將得到的片段末端平齊化，然后將KpnI接頭(寶酒造社制)與該末端連接。該片段被插入了pSTV28-rpoH質(zhì)粒的KpnI位點(diǎn)以得到pRPH。另一方面。用不含rpoH基因的質(zhì)粒pHSG399作為對(duì)照。還用SalI接頭(寶酒造社制)將來(lái)源于pHM1519的復(fù)制起點(diǎn)對(duì)照質(zhì)粒的SalI位點(diǎn)已得到pSAC4。實(shí)施例2用導(dǎo)入了rpoH基因的產(chǎn)谷氨酸細(xì)菌生產(chǎn)谷氨酸如上所述得到的pRPH和pSAC4被導(dǎo)入了具有產(chǎn)L-谷氨酸能力的乳發(fā)酵短桿菌AJ12821(FERMBP-4172)中。對(duì)含各個(gè)導(dǎo)入質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子的谷氨酸產(chǎn)量進(jìn)行評(píng)估。用電脈沖方法將質(zhì)粒導(dǎo)入乳發(fā)酵短桿菌的細(xì)胞中(日本專利公開(kāi)2-207791)。將含導(dǎo)入的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在含4μg/ml氯霉素的CM2G的平板培養(yǎng)基(1L純水中含10克蛋白胨(polypeptone)，10克酵母提取物，5克葡萄糖，5克NaCl，15克瓊脂，pH7.2)上篩選。對(duì)得到的轉(zhuǎn)化子的谷氨酸的產(chǎn)力進(jìn)行了如下評(píng)價(jià)。在CM2G平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)各轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行細(xì)胞更新，在1L純水中含葡萄糖80g、KH2PO41g、MgSO4.7H2O0.4g、(NH4)2SO430g、FeSO4.7H2O0.01g、MnSO4·7H2O0.01g、大豆水解液15ml、鹽酸硫胺200μg、生物素300μg、氯霉素4mg及CaCO350g這樣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)更新的各轉(zhuǎn)化子(用KOH調(diào)節(jié)PH在8.0)。優(yōu)選31-32℃培養(yǎng)20小時(shí)。培養(yǎng)后，測(cè)定菌體濃度和積聚在培養(yǎng)基中的L-谷氨酸的濃度。用Asahi化學(xué)公司的BiotecAnalyzerAs-210定量測(cè)定L-谷氨酸。把培養(yǎng)液用0.2N鹽酸稀釋51倍，通過(guò)它在660nm時(shí)的吸光度(OD660)菌體濃度。結(jié)果如表-1所示。表1這一結(jié)果表明導(dǎo)入了rpoH基因的乳發(fā)酵短桿菌谷氨酸生產(chǎn)菌，它的生長(zhǎng)被抑制，而谷氨酸的產(chǎn)生量卻增加了。實(shí)施例3導(dǎo)入了rpoH基因的賴氨酸生產(chǎn)菌賴氨酸的產(chǎn)生上述制備的pRPH和pSAC4被導(dǎo)入了從乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869突變而來(lái)的抗S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸并能產(chǎn)生L-賴氨酸的乳發(fā)酵短桿菌AJ12435(FERMBP-2294)中。測(cè)定了攜帶有各導(dǎo)入質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子的L-賴氨酸的產(chǎn)力。用電脈沖的方法(日長(zhǎng)專利公開(kāi)2-207791)將質(zhì)粒導(dǎo)入了乳發(fā)酵短桿菌的細(xì)胞中。將含導(dǎo)入的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在含4μg/ml氯霉素的CM2G的平板培養(yǎng)基(1L純水中含10克蛋白胨(polypeptone)，10克酵母提取物，5克葡萄糖，5克NaCl，15免瓊脂，pH7.2)上篩選。對(duì)得到的轉(zhuǎn)化子的L-賴氨酸的產(chǎn)力進(jìn)行了如下評(píng)價(jià)。在CM2G平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)各轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行細(xì)胞更新，在1L純水中含葡萄糖80g、KH2PO41g、MgSO4.7H2O0.4g、(NH4)2SO430g、FeSO4.7H2O0.01g、MnSO4·7H2O0.01g、大豆水解液15ml、鹽酸硫胺200μg、生物素300μg、氯霉素4mg及CaCO350g這樣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)更新的各轉(zhuǎn)化子(用KOH調(diào)節(jié)PH在8.0)。培養(yǎng)后，測(cè)定菌體濃度和積聚在培養(yǎng)基中的L-谷氨酸的濃度。用Asahi化學(xué)公司的BiotecAnalyzerAs-210定量測(cè)定L-賴氨酸。把培養(yǎng)液用0.2N鹽酸稀釋51倍，通過(guò)它在660nm時(shí)的吸光度(OD660)菌體濃度。結(jié)果如表-2所示。表2</tables>如表2所示，導(dǎo)入了rpoH基因的乳發(fā)酵短桿菌的細(xì)菌生長(zhǎng)良好，L-賴氨酸的產(chǎn)量也有增加。猜想該結(jié)果收由于L-賴氨酸的積聚而來(lái)的滲透壓的增加波動(dòng)的影響。實(shí)施例4導(dǎo)入了groE基因的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌苯丙氨酸的產(chǎn)生將按上述方法制備的pSTV28-groE或pSTV28導(dǎo)入培養(yǎng)自大腸桿菌K12株的苯丙氨酸生產(chǎn)菌AJ12604菌株(FERMBP-3579)中。對(duì)導(dǎo)入質(zhì)粒的各轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生苯基丙氨酸的情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)電子脈沖法(日本專利公開(kāi)2-207791)導(dǎo)入質(zhì)粒。將含導(dǎo)入的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在含40μg/ml氯霉素的CM2G的平板培養(yǎng)基(1L純水中含10克蛋白胨(polypeptone)，10克酵母提取物，5克葡萄糖，5克NaCl，15克瓊脂，pH7.2)上篩選。對(duì)得到的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生苯基丙氨酸的性能進(jìn)行了如下評(píng)價(jià)。在含40mg/L氯霉素的L平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)各轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行細(xì)胞更新。在1L純水中含葡萄糖20g、Na2HPO429.4g、KH2PO46g，NaCl1g，NH4Cl2g，10g檸檬酸鈉，0.4g谷氨酸鈉，MgSO4.7H2O3g、0.23gKcl，2mg鹽酸硫胺，75mgL-酪氨酸和40mg氯霉素，這樣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)更新的各轉(zhuǎn)化子(用KOH調(diào)節(jié)PH在7.0)。培養(yǎng)后，測(cè)定菌體濃度和積聚在培養(yǎng)基中的L-苯丙氨酸的濃度。用Asahi化學(xué)公司的BiotecAnalyzerAs-210定量測(cè)定L-賴氨酸。把培養(yǎng)液用純水稀釋51倍，通過(guò)它在660nm時(shí)的吸光度(OD660)菌體濃度。結(jié)果如表-3所示。表3這一結(jié)果表明導(dǎo)入groE基因的大腸桿菌的L-苯丙氨酸的產(chǎn)生量增加了。實(shí)施例5導(dǎo)入了rpoH基因的具有了產(chǎn)生L-賴氨酸能力的大腸桿菌L-賴氨酸的產(chǎn)生使用大腸桿菌W3110(tyrA)株作為生產(chǎn)賴氨酸的宿主。在歐洲專利公開(kāi)92年488424號(hào)公報(bào)中詳細(xì)記載W3110(tyrA)株，以下就簡(jiǎn)要地介紹其制備方法。從國(guó)立遺傳學(xué)研究所(靜岡縣三島)獲得大腸桿菌W3110。將該菌株涂布在含有鏈霉素的LB平板上，從形成的菌落中可取得耐鏈霉素株。把選擇出的耐鏈霉素株和大腸桿菌ME8424株混和，在完全培養(yǎng)基(L-肉湯1％細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCI)37℃的條件下，15分鐘靜置培養(yǎng)，誘導(dǎo)融合。大腸桿菌K-12ME8424株有(hfrP045，thi，relA1，tryATn10，ung-1，nadB)的遺傳特征，能夠從國(guó)立遺傳學(xué)研究所取得。然后，把培養(yǎng)物放入含有鏈霉素、四環(huán)素以及L-酪氨酸的完全培養(yǎng)基(L-肉湯1％細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物，0.5％NaCl)中，選擇形成菌落的菌株，將此株命名為大腸桿菌(tyrA)株。在歐洲專利公報(bào)488424(1992)中描述了許多把質(zhì)粒導(dǎo)入而形成的菌株。例如，將導(dǎo)入了質(zhì)粒pHATerm的菌株命名為大腸桿菌W3110(tyrA)/pHATerm，根據(jù)布達(dá)佩斯條約于1991年11月16以登記號(hào)FERMBP-3635保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工業(yè)技術(shù)研究所(郵編305日本茨城縣筑波市東1區(qū)1條3號(hào))?？捎贸Ｒ?guī)方法將質(zhì)粒pHATerm從該菌株去除而得到大腸桿菌W3110(tyrA)。根據(jù)實(shí)施例4的方法，把攜帶有賴氨酸合成基因的質(zhì)粒RSFD80導(dǎo)入了大腸桿菌W3110(tyrA)菌株。RSFD80在WO95/16042國(guó)際專利公報(bào)中有描述，它含有對(duì)L-賴氨酸反饋抑制脫敏的編碼二氫葉酸還原酶的DNA，和對(duì)L-賴氨酸反饋抑制脫敏的編碼天冬氨酸激酶的DNA。攜帶RSFD80質(zhì)粒的大腸桿菌JM109菌株被命名為AJ12396，并于1993年10月28號(hào)以登記號(hào)FERMP-13936保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工業(yè)技術(shù)研究所(郵編305日本茨城縣筑波市東1區(qū)1條3號(hào))，并根據(jù)1994年11月1日布達(dá)佩斯條約轉(zhuǎn)移為國(guó)際保藏，保藏號(hào)FERMBP-4859。導(dǎo)入了RSFD80的W3110(tyrA)的轉(zhuǎn)化子在含50μg/ml的鏈霉素的平板培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。另一方面，為導(dǎo)入rpoH基因用的質(zhì)粒構(gòu)建如下。根據(jù)實(shí)施例1<1>中的PCR方法擴(kuò)增rpoH基因。用商業(yè)購(gòu)德的DNA末端平齊化試劑盒使得到的擴(kuò)增產(chǎn)物兩端平齊化(寶酒社造制)，然后將其克隆進(jìn)質(zhì)粒載體pMW119(和光純藥社制)的HincII位點(diǎn)。根據(jù)上述方法將該質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌W3110(tyrA)/RSFD80菌株中。在含50μg/ml的鏈霉素和50μg/ml的氨芐青霉素的L平板培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。對(duì)上述得到的大腸桿菌W3110(tyrA)/RSFD80菌株和大腸桿菌W3110(tyrA)/RSFD80+pMWrpoH菌株的L-賴氨酸產(chǎn)力進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)得到的轉(zhuǎn)化子的L-賴氨酸的產(chǎn)力評(píng)價(jià)如下。將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)在L平板培養(yǎng)基上使細(xì)胞更新。每個(gè)更新的轉(zhuǎn)化子在37℃在如下培養(yǎng)基中培養(yǎng)30小時(shí)，其中培養(yǎng)基在1L純水中含有40g葡萄糖，1gKH2PO4，0.01gMnSO4.7H2O，0.01gFeSO4.7H2O，2g酵母提取物，0.1gL-酪氨酸，1gMgSO4，和25gCaCO3(用KOH調(diào)pH值為7.0)。除了在最初加入40g/L鹽酸L-賴氨酸外，在本該轉(zhuǎn)化子也被培養(yǎng)在相同的培養(yǎng)基中。用旭化成(株)制造的Biotec分析儀AS210對(duì)L-賴氨酸進(jìn)行定量測(cè)定。表4示以鹽酸L-賴氨酸表示的L-賴氨酸量的增加(在培養(yǎng)后從培養(yǎng)基中L-賴氨酸的量中去除初始加入的L-賴氨酸的量)。表4</tables>根據(jù)以上結(jié)果，與不含導(dǎo)入的rpoH基因的菌株相比，即使在高濃度的L-賴氨酸的存在下，大腸桿菌的L-賴氨酸的產(chǎn)率也有提高。用于產(chǎn)業(yè)中的可能性通過(guò)本發(fā)明，明確了HSP與微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)酵之間的關(guān)系，能夠在氨基酸等有益物質(zhì)的發(fā)酵過(guò)程中，減少應(yīng)激反應(yīng)的影響，改善生產(chǎn)和收獲率低下。序列表(1)一般信息申請(qǐng)人味素株氏會(huì)社發(fā)明名稱抗應(yīng)激性微生物及發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法序列數(shù)4聯(lián)絡(luò)方法A會(huì)社名稱味素株氏會(huì)社B會(huì)社地址京橋1丁目15-1C市中央?yún)^(qū)D州東京都E國(guó)日本F郵區(qū)104計(jì)算機(jī)可讀形式A媒體B計(jì)算機(jī)C操作系統(tǒng)D軟件當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)A申請(qǐng)?zhí)朆申請(qǐng)日C分類代理人/事物所信息A名字B登記號(hào)C整理號(hào)通信方法A電話號(hào)碼B傳真號(hào)碼(2)有關(guān)SEQIDNO1的信息(i)序列特征A長(zhǎng)度20B種類核酸C鏈型單鏈D拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸合成寡核苷酸(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO1CGGAACGAAGTTTGATATCA20(2)有關(guān)SEQIDNO2的信息(i)序列特征A長(zhǎng)度20B種類核酸C鏈型單鏈D拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸合成寡核苷酸(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO2號(hào)序列ATCCAGGGTTCTCTGCTTAA20(2)有關(guān)SEQIDNO3的信息(i)序列特征A長(zhǎng)度20B種類核酸C鏈型單鏈D拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸合成寡核苷酸(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO3GACGTCGATAGCAGGCCAAT20(2)有關(guān)SEQIDNO4的信息(i)序列特征A長(zhǎng)度20B種類核酸C鏈型單鏈D拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸合成寡核苷酸(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO4GACGCACTCGCGTCGTCCGT20權(quán)利要求1.一種用微生物制備發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其特征在于包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物使其在培養(yǎng)基中長(zhǎng)生和積累發(fā)酵產(chǎn)物以及收集發(fā)酵產(chǎn)物的步驟，其中所說(shuō)的微生物由于導(dǎo)入至少一種編碼熱應(yīng)激蛋白和編碼特異性作用于熱應(yīng)激蛋白，增加其在細(xì)胞中的表達(dá)量的σ因子的基因而被修飾，從而所述微生物可增加對(duì)應(yīng)激壓力的抗性，否則的話該應(yīng)激壓力會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)和/或發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生。2.權(quán)利要求1的方法，其中發(fā)酵產(chǎn)物是氨基酸。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述應(yīng)激壓力是溫度，培養(yǎng)基的滲透壓，或?qū)ξ⑸锏纳L(zhǎng)不利的目標(biāo)發(fā)酵產(chǎn)物。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼熱應(yīng)激蛋白的基因是groE。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼σ因子的基因是rpoH基因。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物是屬于大腸桿菌屬的細(xì)菌，或者是棒桿狀細(xì)菌。7.一種用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的微生物，其中所說(shuō)的微生物由于導(dǎo)入至少一種編碼熱應(yīng)激蛋白和編碼特異性作用于熱應(yīng)激蛋白，增加其在細(xì)胞中的表達(dá)量的σ因子的基因而被修飾，從而所述微生物可增加對(duì)應(yīng)激壓力的抗性，否則的話該應(yīng)激壓力會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)和/或發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生。全文摘要通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物使其在培養(yǎng)基中長(zhǎng)生和積累發(fā)酵產(chǎn)物以及收集發(fā)酵產(chǎn)物而利用一種微生物發(fā)酵產(chǎn)生有用的如氨基酸等物質(zhì)等方法,其中所說(shuō)的微生物由于導(dǎo)入至少一種編碼熱應(yīng)激蛋白和編碼特異性作用于熱應(yīng)激蛋白,增加其在細(xì)胞中的表達(dá)量的σ因子的基因而被修飾,從而所述微生物可增加對(duì)應(yīng)激壓力的抗性,阻止了應(yīng)激壓力對(duì)微生物的生長(zhǎng)和/或發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生的抑制,否則的話該應(yīng)激壓力會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)和/或發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生。文檔編號(hào)C12P13/08GK1181785SQ9619333公開(kāi)日1998年5月13日申請(qǐng)日期1996年2月9日優(yōu)先權(quán)日1995年2月20日發(fā)明者木村英一郎,河原義雄,后藤慎也,中松亙,菊池慶實(shí),倉(cāng)橋修申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社被以下專利引用(2),