專利名稱：治療由皮質(zhì)甾類誘發(fā)的骨質(zhì)減少的方法
背景技術(shù)：
a)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及使用治療有效量的某種新的甲狀旁腺素和甲狀旁腺素相關(guān)肽的類似物來治療由皮質(zhì)甾類誘發(fā)的骨質(zhì)減少的方法。
b)相關(guān)技術(shù)的說明骨質(zhì)疏松是代謝性骨疾病的最常見形式，并且可以認為是骨流失(骨質(zhì)減少)的癥狀、骨折階段。雖然骨質(zhì)疏松可能因許多隱性疾病而發(fā)生，但90％是自發(fā)性的。絕經(jīng)后的婦女尤其易發(fā)自發(fā)性骨質(zhì)疏松(絕經(jīng)型或I型骨質(zhì)疏松)。自發(fā)性骨質(zhì)疏松的另一高發(fā)人群是高齡的男性和女性(老年型或II型骨質(zhì)疏松)。骨質(zhì)疏松還被發(fā)現(xiàn)與使用皮質(zhì)甾類、活動量少或過多的臥床休息、嗜酒、糖尿病、性激素中毒(gonadotoxic)、化療、催乳激素過多、神經(jīng)性厭食、原發(fā)性和繼發(fā)性閉經(jīng)，以及卵巢切除有關(guān)。
在各種形式的骨質(zhì)疏松中，經(jīng)常發(fā)生的是由于骨流失達到了機械衰竭點而引起的骨折。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松以腕骨骨折和脊柱骨折為特征，而股骨頸骨折似乎是老年型骨折的突出特征。
骨質(zhì)疏松中骨流失的機制被認為與骨骼自身更新過程中的不平衡有關(guān)。該過程被稱為骨的重塑(bone remodeling)。它發(fā)生在一系列分散的活性袋中。這些袋自發(fā)地形成于給定骨表面的骨基質(zhì)中，作為骨吸收位置。破骨細胞(骨溶解或吸收細胞)負責吸收通常為衡量的部分骨。在這種吸收過程之后出現(xiàn)了成骨細胞(骨形成細胞)，由它們用新的骨重新填補由破骨細胞留下的空穴。
在健康的成人體內(nèi)，破骨細胞和成骨細胞的形成速度在骨形成和骨吸收之間形成平衡。但是在骨質(zhì)疏松癥患者中，骨重塑過程中的失衡逐漸發(fā)展而導(dǎo)致骨流失的速度大于其形成的速度。雖然在大多數(shù)個體中，這種失衡在某種程度上是隨年齡的增長而發(fā)生的，但是在絕經(jīng)型骨質(zhì)疏松或在卵巢切除后的患者中其發(fā)病更嚴重而且更早。
Adachi等在《關(guān)節(jié)炎和風濕癥研討》(Seminars in Arthritis andRheumatism)226，375-84(1993，6)中報道，盡管許多有關(guān)皮質(zhì)甾類誘發(fā)的骨質(zhì)疏松的病理生理學(xué)數(shù)據(jù)不相一致，但普遍認同的是骨形成有所減少而骨吸收有所增加。皮質(zhì)甾類療法經(jīng)常引起骨流失及由其導(dǎo)致的骨折和骨壞死?？梢宰C明，在皮質(zhì)甾類療法的最初6至12個月內(nèi)，骨流失發(fā)生迅速；而且，在骨流失速度和皮質(zhì)甾類劑量之間似乎還存在著密切的關(guān)系。男性同樣地易受皮質(zhì)甾類的影響。骨折與骨壞死的估計發(fā)生率在30至50％之間。
已經(jīng)進行了多種嘗試以減慢骨的繼續(xù)流失或更好的是形成骨質(zhì)的凈增長來治療骨質(zhì)疏松。有些藥物，例如雌激素和二磷酸鹽似乎減慢了骨質(zhì)疏松癥患者中骨的繼續(xù)流失。減慢骨流失的藥物可能因骨吸收和骨形成的時間不同而表現(xiàn)為增加了骨質(zhì)(量級為3至7％)。但是這種表觀增長在時間上有限，不是漸進性的，而且是因“重塑空間”的減少而發(fā)生的，此外，由于吸收和形成之間的緊密聯(lián)系，抑制骨吸收的治療也會最終抑制骨形成。
已經(jīng)有人提出甲狀旁腺素(PTH)療法能同時提高骨轉(zhuǎn)化和形成正向鈣平衡。但是，人臨床實驗證明，小梁骨的任何增加都會被皮質(zhì)骨的減少而抵消，所以在總的骨上沒有凈增。
Hefti等在《臨床科學(xué)》(Clinicl Science)62389-396(1982)中報道，每日皮下給藥bPTH(1-84)或hPTH(1-34)在正常和骨質(zhì)疏松的成年雌性大鼠中提高了體鈣總含量和各種骨的灰分重量。
Liu等在(J.Bone Miner.Res.)610，1071-1080(1991)中提出，切除成年雌性大鼠的卵巢誘發(fā)了脛干骺端47％的小梁骨流失，并伴隨成骨細胞和小梁破骨細胞數(shù)量的顯著增加。每日皮下注射hPTH(1-34)完全逆轉(zhuǎn)了小梁骨流失，使得小梁骨量超過對照組。成骨細胞數(shù)量增加而破骨細胞減少。
Hock等在(J.Bone Min.Res.)71，65-71(1992)中報道，給健康的成年雄性大鼠每日皮下注射hPTH(1-34)12天，提高了小梁骨和皮質(zhì)骨中的鈣和干重?？偣琴|(zhì)量，小梁骨體積、小梁厚度和數(shù)量，以及成骨細胞表面增加。
哺乳動物的甲狀旁腺素，例如人的(hPTH)、牛的(bPTH)、豬的(pPTH)，是84氨基酸殘基的單條多肽鏈，其分子量約為9500。其生物活性與N末端部分有關(guān)，似乎最少需要殘基(1-34)。
人PTH的N末端片段與牛和豬激素的N末端片段分別僅相差3個和2個氨基酸殘基hPTH(1-34)Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu1 5 10 15Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp20 25 30Val His Asn Phe(SEQ ID NO1)；bPTH(1-34)Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Met His Asn Leu Gly Lys His Leu1 5 10 15Ser Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp20 25 30Val His Asn Phe (SEQ ID NO2)；pPTH(1-34)Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu1 5 10 15Ser Ser Leu Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp20 25 30Val His Asn Phe(SEQ ID NO3)；PTH的主要功能是引發(fā)維持胞外液體內(nèi)Ca2+恒定濃度的適應(yīng)性改變。PTH作用于腎以增加腎小管從尿液中對Ca2+的重吸收，并促進calcifediol向鈣三醇轉(zhuǎn)化，后者負責從腸中吸收Ca2+。突出的作用之一是促進骨中Ca2+的活化。PTH作用于骨以提高對Ca2+和磷酸鹽的吸收速度。PTH提高破骨細胞的骨吸收速度，提高間質(zhì)細胞向破骨細胞的分化速度，延長后者的半衰期。隨著PTH作用的延長，成骨細胞的數(shù)量也增加；這樣，骨轉(zhuǎn)化和重塑的速度被加快了。但是，個別的成骨細胞活性似乎低于一般成骨細胞。
Rosenblatt等在美國專利4,423,037、4,968,669和5,001,223中公開，通過缺失N末端氨基酸(1-6)和選擇性置換Phe7、Met8，18和Gly12獲得PTH拮抗劑。據(jù)報道Tyr34-NH2提高了這類化合物的活性和穩(wěn)定性。
甲狀旁腺素相關(guān)肽(PTHrp)，一種140+氨基酸蛋白質(zhì)，及其片段產(chǎn)生PTH的主要生物作用。許多人和動物腫瘤和其它組織產(chǎn)生PTHrp，它可能在惡性高鈣血癥中起一定的作用。hPTHrp(1-34)的序列為Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu20 25 30Ile His Thr Ala(SEQ ID NO4).
hPTH和hPTHrp之間的序列同源性主要局限于13個N末端氨基酸殘基，其中8個是相同的；hPTH受體結(jié)合區(qū)的10個氨基酸(25-34)中只有1個在hPTHrp中具有保守性。構(gòu)象的類似性可能構(gòu)成其共同的活性。Cohen等在《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)2663，1997-2004(1991)中提出，許多PTH(1-34)和PTHrp(1-34)序列，尤其是(5-18)和(21-34)區(qū)域具有α-螺旋構(gòu)型，同時提出對在生理條件下羧基末端是否主要為這種構(gòu)型還不確定。這種二級結(jié)構(gòu)對與脂類相互反應(yīng)，與受體相互作用，和/或結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定化可能是十分重要的。
本發(fā)明綜述本發(fā)明提供了一種治療由皮質(zhì)甾類誘發(fā)的骨質(zhì)減少的方法，該方法包括給需要治療的病人使用有效量的甲狀旁腺素(PTH)、甲狀旁腺素相關(guān)肽(PTHrp)、或PTH或PTHrp的生理活性截短形式同系物和類似物的合成多肽類似物，或其鹽，其中的氨基酸殘基(22-31)形成一個兩親α-螺旋，所述的殘基(22-31)選自按以下順序排列的親水性氨基酸(Haa)和親脂性氨基酸(Laa)Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa。
在實施方式之一中，氨基酸殘基(22-31)的序列選自(SEQ ID NOS85、86、26、27、28、29和30)。多肽的有效量約為0.002μg多肽/kg病人體重/天至約10μg多肽/kg病人體重/天。
本發(fā)明還提供了用于預(yù)防和治療皮質(zhì)甾類誘發(fā)的骨質(zhì)減少的藥物組合物，其中包含有效量的甲狀旁腺素(PTH)、甲狀旁腺素相關(guān)肽(PTHrp)、或PTH或PTHrp的生理活性截短形式同系物和類似物的合成多肽類似物，或其鹽，和藥學(xué)上認可的載體，其中的氨基酸殘基(22-31)形成一個兩親α-螺旋，所述的殘基(22-31)選自按以下順序排列的親水性氨基酸(Haa)和親脂性氨基酸(Laa)Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa。
在實施方式之一中，藥物組合物被制成用于治療皮質(zhì)甾類誘發(fā)的骨質(zhì)減少的單位劑型，其中包含約1μg至約1000μg甲狀旁腺素(PTH)、甲狀旁腺素相關(guān)肽(PTHrp)、或PTH或PTHrp的生理活性截短形式同系物和類似物的合成多肽類似物，或其鹽，和藥學(xué)上認可的載體，其中的氨基酸殘基(22-31)形成一個兩親α-螺旋，所述的殘基(22-31)選自按以下順序排列的親水性氨基酸(Haa)和親脂性氨基酸(Laa)Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa。
將該序列的具體的說明性實例插入PTH、PTHrp和PTH及PTHrp的生理活性截短形式同系物和類似物中時，形成的多肽是有效的骨重塑劑。
本

發(fā)明內(nèi)容
之一提供了一種用甲狀旁腺素(PTH)、甲狀旁腺素相關(guān)肽(PTHrp)、和PTH及PTHrp的生理活性截短形式同系物和類似物的合成多肽類似物，或其鹽來治療皮質(zhì)甾類誘發(fā)的骨質(zhì)減少的方法，其中的氨基酸殘基(22-31)形成一個兩親α-螺旋，所述的殘基(22-31)選自a)Xaa1Xaa2Leu Xaa4Xaa5Leu Xaa7Xaa8Xaa9Xaa101 5 10其中Xaa1和Xaa4各自是Glu、Glu(OCH3)，His或Phe；Xaa2是Leu或Phe；Xaa5是Lys或His；Xaa7和Xaa10各自是Leu或Ile；Xaa8是Ala、Arg或Glu；Xaa9是Lys或Glu(SEQ ID NO85)；較好的是Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu1 5 10其中的Xaa是Glu或Arg(SEQ ID NO26)；b)Xaa1Xaa2Leu Xaa4Arg Leu Leu Xaa8Arg Leu1 510其中Xaa1和Xaa4各自是Glu、Glu(OCH3)，His或Phe；Xaa2是Leu或Phe；Xaa8是Glu、Lys或Lys(COCH2PEGX)，PEGX是分子量為100至10,000的聚(乙二醇甲基醚)基團(SEQ ID NO86)；較好的是Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu1 5 10其中的Xaa是Glu，Lys或Lys(COCH2PEGX)，PEGX是分子量為100至10,000的聚(乙二醇甲基醚)基團(SEQ ID NO27)；c)Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu(SEQ ID NO28)；1 5 10d)Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu(SEQ ID NO29)；1 5 10
e)Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu(SEQ ID NO30)；1 5 10在另一方面的內(nèi)容中，本發(fā)明提供(PTH)、(PTHrp)、或PTH或PTHrp的生理活性截短形式同系物和類似物的合成多肽類似物或其鹽的藥物組合物，其中的氨基酸殘基(22-31)形成一個兩親α-螺旋，所述的殘基(22-31)選自a)Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu1 5 10其中的Xaa是Glu或Arg(SEQ ID NO26)；b)Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu1 5 10其中的Xaa是Glu，Lys或Lys(COCH2PEGX)，PEGX是分子量為100至10,000的聚(乙二醇甲基醚)基團(SEQ ID NO27)；c)Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu(SEQ ID NO28)；1 5 10d)Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu(SEQ ID NO29)；1 5 10e)Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu(SEQ ID NO30)；1 5 10本發(fā)明還提供了混合以上化合物和藥學(xué)上認可的載體來制備藥物組合物的方法。


圖1是編碼本發(fā)明的PTHrp(1-34)類似物的合成基因的DNA序列和限制性酶位點。
圖2是制備包含PTHrp(1-34)類似物基因的質(zhì)粒的簡圖。
圖3是制備包含二拷貝PTHrp(1-34)類似物基因的質(zhì)粒的簡圖。
圖4是制備包含四拷貝PTHrp(1-34)類似物基因的質(zhì)粒的簡圖。
本發(fā)明的詳細說明縮寫及定義各種一般核苷酸堿基和氨基酸的單字母和三字母縮寫根據(jù)的是《純應(yīng)用化學(xué)》(Pure Appl.Chem)31，639-645(1972)和40，277-290中以及IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會的建議。單字母和三字母縮寫如下所述
氨基酸的縮寫氨基酸 三字母標記單字母標記丙氨酸 Ala A精氨酸 Arg R天冬酰胺 Asn N天冬氨酸 Asp DAsn+AspAsx B半胱氨酸 Cys C谷胺酰胺 Gln Q谷氨酸 Glu EGln+GluGlx Z甘氨酸 Gly G組氨酸 His H異亮氨酸 Ile I亮氨酸 Leu L賴氨酸 Lys K甲硫氨酸 Met M苯丙氨酸 Phe F脯氨酸 Pro P絲氨酸 Ser S蘇氨酸 Thr T色氨酸 Trp W酪氨酸 Tyr Y纈氨酸 Val V其它氨基酸 Xaa X如果不另外加注D-或D，L-，以上縮寫代表L-氨基酸。有些天然和非天然氨基酸是非手性的，例如甘氨酸。所有肽序列都按N末端在左，C末端在右表示。
本文中使用的其它氨基酸和化合物的縮寫為
hSer 高絲氨酸hSerlac高絲氨酸內(nèi)酯Nle正亮氨酸PEG2 二甘醇甲基醚基，a.k.a.甲氧基二(乙氧基)，CH3O(CH2CH2O)2-，(分子量＝119)PEG5000聚乙二醇甲基醚基，a.k.a.甲氧基聚(乙氧基)，CH3O(CH2CH2O)110-，(平均分子量＝5000)PEGX 聚乙二醇甲基醚基，CH3O(CH2CH2O)n-，(平均分子量＝100至10,000)“親水性氨基酸”指除了形成肽鍵必需的官能團之外具有至少一個親水性官能團的氨基酸，例如精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸，谷氨酸、谷胺酰胺、組氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸及其同系物。
“親脂性氨基酸”指不帶電的脂肪族或芳香族氨基酸，例如異亮氨酸，亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸及其同系物。
出于本發(fā)明的目的，丙氨酸被歸類為“兩親”氨基酸，既具有親水性又具有親脂性。
“PTH或PTHrp的生理活性截短形式同系物或類似物”指這樣的多肽，其序列包含的氨基酸少于PTH或PTHrp的完整片段，但可引發(fā)相似的生理應(yīng)答。截短的PTH或PTHrp不需要與PTH或PTHrp完全同源才引發(fā)相似的生理應(yīng)答。其中代表性的是PTH(1-34)和PTHrp(1-34)，但不排除其它多肽。
“兩親α-螺旋”指某些多肽表現(xiàn)出的二級結(jié)構(gòu)，其中的氨基酸形成α-螺旋構(gòu)型，其相對的極性和非極性平面定向于沿螺旋的長軸。在某種程度上可以通過構(gòu)建一個具有正確螺距的“Schiffer-Edmundson輪”(M.Schiffer和A.B.Edmundson，《生物物理學(xué)雜志》(BioPhys.J.)7，121，(1967))和注意包圍螺旋的柱的相對兩平面上親水性和親脂性殘基的分離來探測感興趣的多肽中存在α-螺旋結(jié)構(gòu)的可能性。或者，經(jīng)驗性證據(jù)，例如園二色性或X光衍射數(shù)據(jù)可用于證明給定多肽中α-螺旋區(qū)域的存在。理想的α-螺旋每圈具有3.6個氨基酸殘基，相鄰側(cè)鏈分開100°弧度。Eisenberg等在《自然》(Nature)299371-374(1982)和《美國科學(xué)院院報》(Proc.Nat.Acad.Sci USA)81140-144(1984)中將疏水性等級和螺旋輪相結(jié)合來將兩親螺旋概念定量化。平均疏水性力矩定義為構(gòu)成螺旋的各氨基酸疏水性向量的總和。以下是Eisenberg(1984)報道的氨基酸疏水性的“一致”等級Ile 0.73； Phe 0.61； Val 0.54； Leu 0.53； Trp 0.37；Met 0.26； Ala 0.25； Gly 0.16； Cys 0.04； Tyr 0.02；Pro -0.07； Thr -0.18； Ser -0.26； His -0.40； Glu -0.62；Asn -0.64； Gln -0.69； Asp -0.72； Lys -1.10； Arg -1.76。
每圈3.6個殘基(或100°弧度(＝360°/3.6))的理想α-螺旋的疏水性力矩μH，可用以下公式計算μH＝[(∑HNsinδ(N-1))2+(∑HNcosδ(N-1))2]1/2其中HN是Nth氨基酸的疏水性值，總和由序列中周期率δ＝100°的N個氨基酸相加而得?？梢酝ㄟ^將μH除以N將疏水性力矩表示為單個殘基的平均疏水力矩<μH>。周期率為100°±20°的<μH>為約0.20或以上表明是兩親螺旋構(gòu)型。hPTHrp(22-31)和hPTH(22-31)周期率為100°時的<μH>分別為0.19和0.37。
Cornett等在《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)195659-685(1987)中進一步續(xù)展了對兩親α-螺旋的研究，即引入“兩親系數(shù)”作為兩親性的表征。他們推斷，所有已知α-螺旋中約有半數(shù)是兩親性的，頻率主要是97.5°而不是100°，每圈的殘基數(shù)更接近于3.7而不是3.6。雖然這種精確化在科學(xué)上很有意義，但是Eisenberg等的基本方法已足以區(qū)分一個給定的序列是否是兩親性的，尤其是在從頭設(shè)計一個形成兩親α-螺旋的序列時候。
在生理環(huán)境中，一個取代性兩親α-螺旋氨基酸序列可能與天然存在的肽中給定片段的序列不具有同源性，但卻可以形成相似的二級結(jié)構(gòu)，即具有相對的極性和非極性平面的α-螺旋。用替代性序列代替天然存在的氨基酸序列可能對被替換的親本多肽的生理活性、穩(wěn)定性或其它特性產(chǎn)生有益的影響。有關(guān)設(shè)計和選擇這樣的序列可參見J.L.Krstenansky等FEBS Letters 2422，409-413(1989)和J.P.Segrest等《蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和遺傳學(xué)》(ProteinsStructure，F(xiàn)unction，andGenetics)8103-117(1990)。
本發(fā)明10個氨基酸的兩親α-螺旋通式為Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa
其中的Haa選自親水性氨基酸，Laa選自親脂性氨基酸。假設(shè)是一個理想化的α-螺旋，殘基1、4、5、8和9沿螺旋的平面之一(A)分布，彼此間的周期率約為140°，殘基2、3、6、7和10在螺旋的另一平面(B)上占據(jù)相對的140°弧度。較好的是，同一面上的所有殘基極性相同，而另一面上的殘基都具有相反的極性，即如果平面A都是親水性的，平面B就都是親脂性的，或者相反。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，雖然本發(fā)明的螺旋被描述為Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa相反的描述Laa(Haa Haa Laa Laa)2Haa也符合殘基分布標準，是本發(fā)明螺旋的對等體。
因為丙氨酸在兩親螺旋的兩個表面都易于存在，所以可以被親水性氨基酸取代也可以被親脂性氨基酸取代，但是Ala10并不形成兩親α-螺旋。通常，不使用脯氨酸、半胱氨酸和酪氨酸；但是只要片段中的其余氨基酸完全符合親水性平面-親脂性平面的區(qū)分，他們的存在和序列中的其它偶然性誤差是容許的，例如親水性殘基存在于親脂性平面上。一種確定一段序列是否具有足夠的兩親性以作為本發(fā)明的序列的方法是如上所述計算平均疏水性力矩。如果周期率為100°+20°的單個氨基酸的峰值平均力矩超過約0.20，該序列將形成兩親螺旋，而且是本發(fā)明的序列。
例如，如下計算(SEQ ID NO26)周期率為100°時單個殘基的平均疏水性力矩，Xaa＝GluA.A.HNδ(N-1)Hsinδ(N-1)Hcosδ(N-1)E-0.62 0 0 -0.62L 0.53 1000.52 -0.17L 0.53 200 -0.18 -0.50E-0.62 3000.34 -0.3K-1.1 400 -0.70 -0.85L 0.53 5000.34 -0.41L 0.53 600 -0.46 -0.27
E-0.62700 21 -0.58K-1.1 800-1.08-0.19L 0.53900 0 -0.53∑＝0.81∑＝-4.43μH＝[(0.81)2+(-4.43)2]1/2＝4.50<μH>＝4.50/10＝0.45該序列的平均峰值疏水性力矩出現(xiàn)在周期率為92°時，其值為0.48。
將這一概念用于甲狀旁腺素和甲狀旁腺素相關(guān)肽，可以假設(shè)區(qū)域(7-16)和(22-31)其中之一或兩者可能表現(xiàn)出α-螺旋二級結(jié)構(gòu)，而且可以被具有相似的結(jié)構(gòu)傾向性的非同源序列所替代而不喪失其生物活性或誘發(fā)免疫反應(yīng)。
優(yōu)選實施方式本發(fā)明內(nèi)容之一提供了PTH、PTHrp，和PTH和PTHrp的生理活性截短形式類似物和同系物的類似物或其鹽，其中的氨基酸殘基(22-31)形成一個兩親α-螺旋，所述的殘基(22-31)選自a)Xaa1Xaa2Leu Xaa4Xaa5Leu Xaa7Xaa8Xaa9Xaa101 5 10其中Xaa1和Xaa4各自是Glu、Glu(OCH3)，His或Phe；Xaa2是Leu或Phe；Xaa5是Lys或His；Xaa7和Xaa10各自是Leu或Ile；Xaa8是Ala、Arg或Glu；Xaa9是Lys或Glu(SEQ ID NO85)；較好的是Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu1 5 10其中的Xaa是Glu或Arg(SEQ ID NO26)；b)Xaa1Xaa2Leu Xaa4Arg Leu Leu Xaa8Arg Leu1 510其中Xaa1和Xaa4各自是Glu、Glu(OCH3)、His或Phe；Xaa2是Leu或Phe；Xaa8是Glu、Lys或Lys(COCH2PEGX)，PEGX是分子量為100至10,000的聚(乙二醇甲基醚)基團(SEQ ID NO86)；較好的是Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu1 5 10
其中的Xaa是Glu、Lys或Lys(COCH2PEGX)，PEGX是分子量為100至10,000的聚(乙二醇甲基醚)基團(SEQ ID NO27)；c)Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu(SEQ ID NO28)；1 5 10d)Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu(SEQ ID NO29)；1 5 10e)Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu(SEQ ID NO30)；1 5 10在另一方面的內(nèi)容中，本發(fā)明提供(PTH)、(PTHrp)、或PTH或PTHrp的生理活性截短形式同系物和類似物的合成多肽類似物或其鹽的藥物組合物，它們具有以下通式Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Leu His Xaa10Xaa11Gly Xaa13Ser Ile GlnXaa17Leu Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22-31Xaa32Xaa33Xaa34Xaa35Xaa36Xaa37末端，其中Xaa1缺失或者是Ala；Xaa2缺失或者是Val；Xaa3缺失或者是Ser；Xaa4缺失或者是Glu或Glu(OCH3)；Xaa5缺失或者是His或Ala；Xaa6缺失或者是Gln；Xaa7缺失或者是Leu；Xaa10和Xaa17各自是Asp或Asp(OCH3)；Xaa11是Lys、Arg或Leu；Xaa13是Lys、Arg、Tyr、Cys、Leu、Cys(CH2CONH(CH2)2NH(生物素?；?)、Lys(7-二甲基氨基-2-氧-2H-1-苯氧基吡喃基-4-乙?；?或Lys(肉桂?；?；Xaa20是Arg或Leu；Xaa19和Xaa21各自是Lys、Ala或Arg；Xaa22-31選自(SEQ ID NO26、27、28、29或30)；Xaa32是His、Pro或Lys；
Xaa33缺失或者是Pro、Thr、Glu或Ala；Xaa34缺失或者是Pro、Arg、Met、Ala、hSer、hSer內(nèi)酯、Tyr、Leu或1，4-二氨基丁?；鶅?nèi)酰胺；Xaa35缺失或者是Pro、Glu、Ser、Ala或Gly；Xaa36缺失或者是Ala、Arg或Ile；Xaa37缺失或者是Arg、Trp或3-(-2-萘基)-L-丙氨酸；Xaa38缺失或者是Ala或hSer或Xaa38-42是Thr Arg Ser Ala Trp；末端是OR或NR2，其中的R都各自是H，(C1-C4)烷基或苯基(C1-C4)烷基；及其藥學(xué)上認可的鹽。
本發(fā)明在另一方面內(nèi)容中提供了生理活性截短形式同系物hPTH(1-34)的類似物，如結(jié)構(gòu)通式(I)所示Ala Val Ser Glu Xaa5Gln Leu Leu His Asp Xaa11Gly Xaa13Ser Ile Gln Asp LeuXaa19Arg Xaa21Xaa22-31Xaa32Xaa33Xaa34末端，其中Xaa5是His或Ala；Xaa11和Xaa13各自為Lys，Arg或Leu；Xaa19和Xaa21各自為Ala或Arg；Xaa22-31是選自a)Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu1 5 -10其中的Xaa是Glu或Arg(SEQ ID NO26)；b)Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu1 5 10其中的Xaa是Glu、Lys或Lys(COCH2PEGX)，PEGX是分子量為100至10,000的聚(乙二醇甲基醚)基團(SEQ ID NO27)；c)Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu(SEQ ID NO28)；1 5 10d)Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu(SEQ ID NO29)；1 5 10e)Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu(SEQ ID NO30)；1 5 10Xaa32是His或Lys；
Xaa33是Thr、G1u或Ala；Xaa34是Ala、hSer、Tyr或Leu；末端是Gly Arg Arg，內(nèi)酯，OH或NR2，其中的R都各自是H或(C1-C4)烷基；及其藥學(xué)上認可的鹽(結(jié)構(gòu)式I)。
本發(fā)明較為具體的內(nèi)容包括Xaa22-31為(SEQ ID NO26)的結(jié)構(gòu)式(I)多肽，它們100°周期時的<μH>超過0.45。本發(fā)明更為具體的內(nèi)容包括的結(jié)構(gòu)式(I)多肽其中的Xaa22-31為(SEQ ID NO26)，Xaa11和Xaa13都是Lys；Xaa19和Xaa21都是Arg。
代表性的多肽包括但不限于Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Arg Lys20 25 30Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO5)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO6)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO7)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr hSer NH2(SEQ ID NO8)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr hSerlac(SEQ ID NO9)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15
Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala Gly Arg Arg OH(SEQ ID NO10)；和35Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu Lys Glu Leu NH2(SEQ ID NO11).
本發(fā)明的另一項內(nèi)容包括結(jié)構(gòu)式(I)的那些多肽，其中的Xaa22-31為(SEQ IDNO26)，Xaa11和Xaa13都是Lys；Xaa19和Xaa21其中之一為Arg，另一個為Ala。該亞屬的代表性多肽包括但不限于Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Ala Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO12)和Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Ala Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO13)。
本發(fā)明的另一項內(nèi)容包括結(jié)構(gòu)式(I)的那些多肽，其中的Xaa22-31為(SEQ IDNO26)，Xaa11和Xaa13其中之一為Leu，另一個為Lys；Xaa19和Xaa21都是Arg。該亞屬的代表性多肽包括但不限于Ala Val Ser Glu Ala Gln Leu Leu His Asp Leu Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Ala Leu OH(SEQ ID NO14)。
本發(fā)明的另一項內(nèi)容包括Xaa22-31為(SEQ ID NO27)的結(jié)構(gòu)式(I)的那些多肽，它們100°周期時的<μH>超過0.50。本發(fā)明的另一項內(nèi)容包括結(jié)構(gòu)式(I)的那些多肽，其中的Xaa22-31為(SEQ ID NO27)，Xaa11和Xaa13都是Lys或Arg；Xaa19和Xaa21都是Arg。該亞屬的代表性多肽包括但不限于
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg20 25 30Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO15)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg20 25 30Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO16)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Lys Arg20 25 30Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO17)；Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu20 25Lys(COCH2PEG2)Arg Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO18)；和30Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu20 25Lys(COCH2PEG5000)Arg Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO19).
30本發(fā)明的另一項內(nèi)容包括Xaa22-31為(SEQ ID NO28)的結(jié)構(gòu)式(I)多肽，它們100°周期時的<μH>約為0.25。該亞屬的代表性多肽包括但不限于Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO20)。
本發(fā)明的另一項內(nèi)容包括Xaa22-31為(SEQ ID NO29)的結(jié)構(gòu)式(I)多肽，它們100°周期時的<μH>約為0.28。該亞屬的代表性多肽包括但不限于
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO21)。
本發(fā)明的另一項內(nèi)容包括Xaa22-31為(SEQ ID NO30)的結(jié)構(gòu)式(I)多肽，它們100°周期時的<μH>約為0.29。該亞屬的代表性多肽包括但不限于Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO22)。
本發(fā)明在另一方面內(nèi)容中提供了生理活性截短形式同系物bPTH(1-34)的類似物，如結(jié)構(gòu)通式(II)所示Xaa1Val Ser Glu Ile Gln Xaa7Xaa8His Asn Leu Gly Lys His Leu Xaa16SerXaa8Xaa19Arg Xaa21Xaa22-31His Asn Xaa34末端，其中Xaa1是Ser或Ala；Xaa7是Leu或Phe；Xaa8是Met或Nle；Xaa16是Asn或Ser；Xaa18是Leu，Met或Nle；Xaa19是Glu或Arg；Xaa21是Val或Arg；Xaa22-31選自(SEQ ID NO26、27、28、29和30)；Xaa34是Phe或Tyr；末端是OH或NR2，其中的R是H或(C1-C4)烷基；及其藥學(xué)上認可的鹽。結(jié)構(gòu)式(II)的代表性多肽包括但不限于Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His Leu1 5 10 15Ser Ser Nle Glu Arg Val Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Asn Tyr NH2(SEQ ID NO23)和
Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His Leu1 5 10 15Ser Ser Nle Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Asn Tyr NH2(SEQ ID NO24)。
在本發(fā)明的另一方面內(nèi)容中，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)少于34個氨基酸的PTH和PTHrp的同系物和類似物也是強效骨重塑劑。這類化合物的通式為Ala Val Ser Glu Xaa5Gln Leu Leu His Asp Xaa11Gly Xaa13Ser Ile Gln Asp LeuXaa19Arg Xaa21Xaa22-31Xaa32Xaa33Xaa34末端，代表性多肽包括但不限于化合物41AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHP-NH2(SEQ ID NO55)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Pro NH2(SEQ ID NO55).
物理數(shù)據(jù)m.p.142.8-166.1℃[a]D25-53.80(c0.38，H2O)FAB(C173H295N55O49)[M+H]+3929AAAAsx 2.0(2)Glx 5.7(6)Ser 1.8(2)His 3.0(3)Gly 1.1(1)Ala 0.9(1)Arg 2.8(3)Val 1.2(1)Ile 0.9(1)Leu 7.4(8)Lys 4.4(4)Pro 0.9(1)化合物42AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LP-NH2(SEQ ID NO56)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu Pro NH2(SEQ ID NO56)物理數(shù)據(jù)m.p.161.0-177.0℃ [a]D25-61.97(c0.19，H2O)FAB(C167H288N52O48)[M+H]+3792.0AAAAsx 2.2(2) Glx 5.9(6)Ser 1.9(2)His 2.1(2) Gly 1.1(1)Ala 1.0(1)Arg 3.0(3) Val 1.1(1)Ile 1.0(1)Leu 7.9(8) Lys 4.3(4)Pro 0.9(1)
本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得，只要在(22-31)的位置插入一段100°±20°周期時的單個殘基平均疏水力矩超過約0.20的氨基酸序列就可以合成這些多肽類似物的多種置換形式，它們都具有本文所要求的特性。
多肽的經(jīng)典合成法可以利用以下方法來合成本發(fā)明的多肽用于固相合成法的J.M.Stewart和J.D.Young，《(固相肽合成法》(Solid Phase Peptide Sythesis)第2版，PierceChemical Co.，Rockford，Illinois(1984)和J.Meinhofer，《激素類蛋白質(zhì)和肽》(Hormonal Protein and Peptide)，第2卷，Academic Press，New York(1973)，以及用于液相合成法的E.Schroder和K.Lubke，《肽》(The Peptides)第1卷，Academic Press，New York(1965)。
通常，以上方法涉及在一延伸肽鏈上依序添加被保護的氨基酸。一般而言，第一個氨基酸的氨基或羧基和任何反應(yīng)性側(cè)鏈基團被保護。然后，這一被保護的氨基酸或被連接到一惰性固體載體上或在溶液中使用，在適于酰胺鍵形成的條件下加上同樣經(jīng)適當保護的序列中的第二個氨基酸。全部氨基酸按正確順序連接之后，去除保護基和任何固體載體，形成粗制多肽。將多肽脫鹽并純化，以利用色譜法為佳，生成最終產(chǎn)品。
一種較好的制備少于約40個氨基酸的生理活性截短形式多肽的類似物的方法涉及固相的肽合成。在這種方法中用對酸或堿敏感的基團保護α-氨基官能團(Nα)和任意反應(yīng)性側(cè)鏈。保護基必需在肽鍵形成條件下保持穩(wěn)定，而且又能夠方便地被去除而不影響已形成的多肽鏈。合適的α-氨基保護基包括但不限于叔丁氧基羰基(Boc)、芐氧基羰基(Cbz)、鄰氯芐氧基羰基、二苯基異丙氧基羰基、叔戊氧基羰基(Amoc)、異冰片氧基羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基芐氧基-羰基、鄰硝基苯基亞氧硫基、2-氰基-叔丁氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)等，較好的是叔丁氧基羰基(Boc)。合適的側(cè)鏈保護基包括但不限于乙?；?、芐基(Bzl)、芐氧基甲基(Bom)、鄰溴芐氧基羰基、叔丁基、叔丁基二甲基甲硅烷基、2-氯芐基(Cl-z)、2，6-二氯芐基、環(huán)己基、環(huán)戊基、異丙基、新戊基、四氫吡喃-2-基、甲苯磺?；?Tos)、三甲基甲硅烷基和三苯甲游基。
在固相合成法中，C末端氨基酸首先與合適的樹脂載體連接。合適的樹脂對逐步縮合反應(yīng)和去保護反應(yīng)的反應(yīng)劑和反應(yīng)條件惰性，而且不溶于所用的介質(zhì)中。市售樹脂舉例包括用反應(yīng)性基團改性的苯乙烯/二乙烯基苯樹脂，例如氯甲基化的共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、羥基甲基化的共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)等。較好的是芐基化、羥基甲基化的苯基乙酰氨基甲基(PAM)樹脂。如果化合物的C末端是酰胺，較好的樹脂是對甲基二苯甲基-共聚(苯乙烯-二乙烯-基苯)樹脂。
可以通過Nα-保護的氨基酸與樹脂反應(yīng)來完成與PAM樹脂的連接，最好是Boc-氨基酸，以其銨、銫、三乙銨、1，5-二氮二環(huán)-[5.4.0]十一-5-烯、四甲基銨或類似的鹽形式在乙醇、乙腈、N，N-二甲酰胺(DMF)等中，最好是銫鹽在DMF中在較高的溫度例如40℃至60℃，最好約50℃與樹脂反應(yīng)12至72小時，最好約48小時。
Nα-Boc-氨基酸可以利用N，N’二異丙基碳化二亞胺(DIC)/1-羥基苯并三唑(HOBt)在例如二氯甲烷或二甲基甲酰胺之類溶劑，最好是二氯甲烷中，在約10℃至50℃，最好是25℃介導(dǎo)的偶合反應(yīng)約2至約24小時，最好約2小時，來與二苯甲基胺樹脂連接。
利用本領(lǐng)域眾所周知的方法可以成功地實現(xiàn)被保護氨基酸的偶合，尤其是在自動肽合成儀中。在用三乙胺或類似的堿中和后，被保護氨基酸最好以約1.5至2.5倍過量引入，并在惰性、非水性、極性溶劑例如二氯甲烷、DMF或它們的混合物中，最好于環(huán)境溫度下在二氯甲烷中進行偶合。代表性的偶合劑是N，N’-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)、N，N’-二異丙基-碳化二亞胺(DIC)或其它碳化二亞胺，它們或者單獨使用或者在1-羥基苯氧基三唑(HOBt)、O-烯丙基脲、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三(吡咯烷酮)鏻(PyBop)、N-羥基琥珀酰亞胺、其它的羥基亞胺或肟存在下使用?；蛘?，可以使用被保護氨基酸活性酯(例如對硝基苯酯、五氟苯酯等)或?qū)ΨQ酐。
在固相合成的最后，從樹脂上分離全保護肽。當與樹脂載體的連接是芐酯型時，可以在約-10℃至50℃，最好約25℃，對C末端為烷基酰胺的肽使用烷基胺或氟烷基胺或?qū)末端為非取代酰胺的肽使用氨/甲醇或氨/乙醇氨解約12至24小時，最好約18小時來進行分離。具有羥基C末端的肽可以利用HF或其它強酸性去保護法或利用皂化反應(yīng)來分離。或者，可以先利用例如用乙醇的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)然后利用氨解或皂化來從樹脂上分離肽。被保護的肽可以利用硅膠色譜純化。
從肽上去除側(cè)鏈保護基可以利用苯甲醚或其它正碳離子凈化劑存在下用無水液態(tài)氟化氫處理氨解產(chǎn)物，用氟化氫/吡啶氟化物處理，用三(三氟乙酰)硼或三氟乙酸處理，用氫和鈀碳或聚乙烯吡咯烷酮還原，或用液態(tài)氨鈉還原，較好的是用液態(tài)氟化氫在苯甲醚存在下在約-10℃至10℃，最好約0℃處理約15分鐘至2小時，最好約1.5小時。
對于二苯甲基胺樹脂上的肽，可以如上所述利用液態(tài)氟化氫和苯甲醚將與樹脂的分離和去保護步驟合并成一步。
可以將溶液脫鹽(例如用BioRad AG-3陰離子交換樹脂)，并利用一系列的以下類型之一或全部的色譜步驟來純化肽乙酸鹽型弱堿性樹脂上的離子交換；非衍生共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)上的疏水性吸附色譜，例如AmberliteXAD；硅膠吸附色譜；羧甲基纖維素上的離子交換色譜；分配色譜，例如SephadexG-25；逆流分配；或高效液相色譜(HPLC)，尤其是辛基或十八烷基甲硅烷基二氧化硅(ODS)結(jié)合相柱填料上的反相HPLC。
所以，本發(fā)明的另一方面內(nèi)容涉及制備多肽及其藥學(xué)上認可的鹽的方法，該方法包括在合適的樹脂載體上依序縮合被保護氨基酸，去除保護基和樹脂載體，并純化產(chǎn)物，生成PTH和PTHrp的生理活性截短形式同系物和類似物的類似物，較好的是PTH(1-34)和PTHrp(1-34)的類似物，其中(22-31)位的氨基酸形成一個兩親α-螺旋肽序列，正如前文所述。
多肽的重組合成法或者，可以通過克隆和表達一個編碼所需多肽的基因來制備本發(fā)明的多肽。在這種方法中，制備一個含有所需DNA序列的質(zhì)粒并將其插入合適的宿主微生物，通常是細菌例如大腸桿菌或釀酒酵母菌之類的酵母菌，并誘導(dǎo)宿主微生物產(chǎn)生多拷貝質(zhì)粒，從而產(chǎn)生編碼本發(fā)明多肽類似物的cDNA的多拷貝。
首先，設(shè)計一段編碼選定的PTH或PTHr類似物的合成基因，上面具有常規(guī)的限制性酶切位點以便以后的改變?？墒褂肕ullis在美國專利4,683,195和4,683,202中所述的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來擴增該序列。
分離出擴增后的合成基因并將它與合適的質(zhì)粒例如Trp LE質(zhì)粒連接，可以串聯(lián)地插入4份基因拷貝。美國專利4,738,921和歐洲專利公開No.0212532中記述了Trp LE質(zhì)粒的制備方法。Trp LE質(zhì)粒通常產(chǎn)生比Trp E質(zhì)粒多8至10倍的蛋白質(zhì)。然后可在合適的載體例如大腸桿菌或釀酒酵母中表達多拷貝基因。
具體使用的表達載體為Trp LE 18 Port(Ile3，Pro5)，它包含以下元件一段包含氨芐青霉素抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制起始點的pBR322片段(EcoRI-BamHI)；一段包含trp啟動子和trpE基因的EcoRI-SacII片段；一段HIV蛋白酶(Ile3，Pro5)基因片段(SacII-HindIII)；一段bGRF基因片段(HidnIII-BamHD；和大腸桿菌rpoc基因的轉(zhuǎn)錄終止子。HIV蛋白酶和bGRF基因片段不是必需的，可以根據(jù)需要以其它編碼序列取代。
表達的多聚體融合蛋白聚集在細胞內(nèi)穩(wěn)定的內(nèi)含體中，可以通過離心與其它細胞蛋白分離。分離的融合蛋白被轉(zhuǎn)變成單體PTH或PTHrp類似物，可以通過陽離子交換和/或反相HPLC純化。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉其它的克隆、擴增、表達和純化方法。代表性的方法公開于Maniafis等的《分子克隆，實驗室手冊》(Molacilar Cloning，a LaboratoryManuol)第二版(Cold spring Harbor Laboratory(1989))中。
使用與劑型本發(fā)明的多肽可用于預(yù)防和治療多種以骨流失為表征的哺乳動物疾病。具體地說，本發(fā)明的化合物適用于預(yù)防和治療人的骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)減少。
通常，本發(fā)明多肽或其鹽的用量約在每天0.002至10μg/kg體重之間，以每天約0.04μg/kg體重至約0.2μg/kg體重為佳。對于一個50kg的女性患者來說，活性成份的日用劑量在約0.1至約500μg，以約2.0至約100μg為佳。在其它哺乳動物和馬、狗和牛中，可能需用較高劑量。為了獲得最佳療效，該劑量可以以常規(guī)藥物組合物形式通過一次性使用、多次使用或控釋方式來施予，以每日一次或多次注射為佳。
對確切劑量和組成以及最合適的釋放型的選擇特別受到所選多肽的藥學(xué)特性、治療病癥的特點和嚴重程度以及病人的生理狀況和精神敏度的影響。
在對皮質(zhì)甾類誘發(fā)的骨質(zhì)減少的治療中，預(yù)計高劑量皮質(zhì)甾類所需的多肽劑量將較高。
代表性釋放型包括口服、腸外(包括皮下、肌內(nèi)和靜脈內(nèi))、直腸、口腔(包括舌下)、肺內(nèi)、透皮和鼻內(nèi)。
藥學(xué)上認可的鹽保留了所要求親本多肽的生物活性而沒有毒副作用。這類鹽的實例是(a)與無機酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成的鹽；和與有機酸例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、維生素C、苯甲酸、單寧酸、雙羥萘酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等形成的鹽；(b)與多價金屬陽離子例如鋅、鈣、鉬、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳、鎘等形成的堿加成鹽；或與N，N’-二芐基亞乙基胺或乙二胺形成的有機陽離子形成的鹽；或(c)(a)和(b)的組合，例如單寧酸鋅鹽等。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容涉及包含以本發(fā)明多肽或其藥學(xué)上認可的鹽為活性成份，混合以藥學(xué)上認可的無毒載體的藥物組合物。如上所述，這樣的組合物可以制備成腸外劑型(包括皮下、肌內(nèi)和靜脈內(nèi))，特別是液態(tài)的溶液或懸浮液形式；口服或口腔劑型，特別是片劑或栓劑；肺內(nèi)或鼻內(nèi)劑型，特別是粉劑、滴鼻液或噴霧劑；和直腸或透皮劑型。
組合物可以利用制藥業(yè)的常用方法，例如《Remington藥物科學(xué)》(Remigton’sPharmaceutical Sciences)第17版，Mack出版公司，Easton PA(1985)中所述的方法進行制備并方便地以單位劑型使用。腸外劑型的配方包含作為賦形劑的無菌水或生理鹽水、亞烷基二醇例如丙二醇、聚烷基二醇例如聚乙二醇、植物油、氫化萘等?？诜┬偷呐浞娇梢酝ㄟ^添加膽鹽或?；鈮A來強化。鼻內(nèi)劑型的配方可以是固體并包含賦形劑例如乳糖和葡聚糖，或者是以滴鼻液或定量噴劑形式使用的水溶液或油溶液。用于口腔劑型的典型賦形劑包括糖、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、預(yù)凝淀粉等。
在配制鼻內(nèi)劑型時，含量在約0.2至15重量百分比，以約0.5至4重量百分比，最好是約2重量百分比的表面活性酸例如甘氨膽酸、膽酸、牛黃膽酸、乙基膽酸、脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氫膽酸、脫氧甘膽酸、環(huán)糊精等可能強化通過鼻粘膜的吸收。
本發(fā)明化合物對患者例如一周至一年期的長期釋放可以通過一次性使用包含了對要求的釋放周期來說足量的活性成份的控釋劑型來進行。為此可以使用多種控釋系統(tǒng)，例如整片系統(tǒng)或貯庫系統(tǒng)微膠囊、緩釋植入體、滲透泵、囊泡、膠粒、脂質(zhì)體、透皮貼、離子滲透裝置和其它替代形式的可注射劑型。局限在需要活性成份釋放的部位是某些控釋劑型的又一特點，已證明這樣有利于治療某些疾病。
控釋劑型配方之一包含分散在或包含在某種緩慢降解、無毒、非抗原性聚合物例如共聚(乳酸/葡糖酸)中的多肽或其鹽，這類聚合物如Kent、Lewis、Sanders和Tice在美國專利4,675,189中的開創(chuàng)性研究工作所述。這些化合物，或其相關(guān)的不溶性鹽更好，還可以配制在甾醇或其它脂質(zhì)基質(zhì)的顆粒劑或硅塑料基質(zhì)植入體中。其它緩釋劑、緩釋植入體或可注射配方對熟練技術(shù)人員來說是顯而易見的。參見例如《維持和緩釋藥物傳遞系統(tǒng)》(Sustained and Controlled Release DrugDelivery System)，J.R.Robinson編輯，Marcel Dekker，Inc.，New York(1978)和R.W.Baker《生物活性藥物的緩釋》(Controlled Release of Biologically ActiveAgents)，John Wiley&Sons，New York(1987)。
以下具體實施例以說明本發(fā)明代表性化合物的合成和測試為目的，而不應(yīng)被理解成對權(quán)利要求范圍的限定。在實施例中，“m.p”表示熔點，“[α]D25”25℃時在所示溶劑中所示濃度下的光學(xué)活性，“FAB”快速原子轟擊質(zhì)譜，“AAA”是氨基酸分析，在測定值之后在括弧中給出估計值。在Hewlett-PackardAminoQuant Analyzer上按照制造商建議的程序進行氨基酸的分析。伯氨基酸用鄰苯二醛衍生；仲氨基酸用Fmoc衍生。用熒光檢測衍生后的氨基酸來定量。被保護的氨基酸由Applied Biosystems Inc.，提供。
實施例1使用自動的Applied Biosystems 430A型肽合成儀，在4-甲基二苯甲胺樹脂上，利用固相合成法制備0.5mmol化合物1(SEQ ID NO7)。用叔丁氧基羰基(Boc)保護α-氨基基團。側(cè)鏈保護基是用于Asp，Glu和Ser的芐基(Bzl)；用于Arg的甲苯磺酰基(Tos)；用于His的芐氧基甲基(Bom)；和用于Lys的2-氯芐基(Cl-z)。按照Stewart和Young(同上)所述用N，N’-二環(huán)己基碳化二亞胺/1-羥基苯并三唑(DIC/HOBt)依序偶合氨基酸。每一次氨基酸偶合之后，利用乙酸酐和二異丙基乙基胺在N-甲基吡咯烷酮中形成的混合物將肽乙?；?。在苯甲醚存在下用無水HF(25ml)從樹脂上分離完成后的肽，同時去保護側(cè)鏈保護基，在-10℃進行30分鐘，在0℃進行60分鐘。真空蒸發(fā)HF后，用無水乙醚洗滌殘留物，用10％乙酸萃取粗制肽。10％乙酸萃取液經(jīng)冷凍干燥得900mg粗制產(chǎn)物。利用中壓ODS反相柱色譜，使用CH3CN在0.1％TFA中形成的22至45％梯度純化肽。產(chǎn)物被洗脫在三份流份中，經(jīng)濃縮和冷凍干燥后得130mg白色固體，純度高于98％。
化合物1AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO7)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO7)物理數(shù)據(jù)m.p.150-159C [a]D25-34.88°(c0.16，H2O)FAB(C175H300N56O51)[M+H]+4005.5AAAAsp，1.9(2)；Glu，5.6(6)；Ser，1.6(2)；His，2.7(3)；Gly，1.0(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.9(2)；Arg，2.8(3)；Val，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.3(8)；Lys，4.0(4).
同樣，制備和鑒定化合物2、5-18、21-27、29-36、38-48、50-54、58、64和66-70，視合成羥基末端的多肽的需要替換PAM樹脂。
化合物2AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-OH(SEQ ID NO6)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO6)物理數(shù)據(jù)m.p.154-170℃ [a]D25-49.35°(c0.46，H2O)FAB(C175H301N57O50)[M+H]+4005.0AAAAsp，2.1(2)；Glu，5.9(6)；Ser，1.7(2)；His，2.9(3)；Gly 1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，1.9(2)；Arg，3.0(3)；Val，1.2(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.8(8)；Lys，4.2(4).
化合物5AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLERLLERLHTA-OH(SEQ ID NO15)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg20 25 30Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO15)物理數(shù)據(jù)m.p.147-165℃ [a]D25-49.17°(c0.66，H2O)FAB(C175H299N59O52)[M+H]+4061AAAAsp，2.1(2)；Gly，6.1(6)；Ser，1.8(2)；His，3.1(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，5.0(5)；Val，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.7(8)；Lys，1.9(2)化合物6AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLERLHTA-OH(SEQ ID NO16)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg20 25 30Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO16)物理數(shù)據(jù)m.p.150-170℃ [a]D25-48.65°(c0.54，H2O)FAB(C175H299N63O52)[M+H]+4118.0AAAAsp，2.1(2)；Glu，6.1(6)；Ser，1.8(2)；His，3.2(3)；Gly，1.2(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，6.9(7)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.8(8).
化合物7AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA-OH(SEQ ID NO17)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Lys Arg20 25 30Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO17)物理數(shù)據(jù)m.p.177-182℃ [a]D25-46.17°(c0.14，H2O)FAB(C176H304N64O50)[M+H]+4117AAAAsp，2.0(2)；Glu，4.8(5)；Ser，1.8(2)；His，3.2(3)；Gly，1.1(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.9(2)；Arg，6.7(7)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Lys，7.7(8)；Lys，0.9(1).
化合物8AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLRKLHTA-OH(SEQ ID NO5)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Arg Lys20 25 30Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO5)物理數(shù)據(jù)m.p.147-165℃ [a]D25-49.17°(c0.66，H2O)FAB(C176H305N59O49)[M+H]+4033.0AAAAsp，2.0(2)；Glu，4.8(5)；Ser，1.8(2)；His，2.7(3)；Gly，1 1(1)；Thr，0.9(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.9(4)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.9(8)；Lys，4.0(4).
化合物9AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTAGRR-OH(SEQ ID NO10)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala Gly Arg Arg OH(SEQ ID NO10)35物理數(shù)據(jù)m.p.158-160℃ [a]D25-44.76°(c0.1，H2O)FAB(C189H326N64O55)[M]+4375.0AAAAsp，2.0(2)；Glu，5.9(6)；Ser，1.7(2)；His，2.9(3)；Gly，2.3(2)；Thr，1.0(1)；Ala，1.9(2)；Arg，5.0(5)；Val，1.2(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.8(8)；Lys，4.3(4).
化合物10AVSEAQLLHDLGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHAL-OH(SEQ ID NO14)Ala Val Ser Glu Ala Gln Leu Leu His Asp Leu Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Ala Leu OH(SEQ ID NO14)物理數(shù)據(jù)m.p.170-175℃ [a]D25-31.59°(c0.54，H2O)FAB(C174H300N52O51)[M+H]+3936.0AAAAsp，2.0(2)；Glu，6.0(6)；Ser，1.8(2)；His，2.0(2)；Gly，1.2(1)；Ala，3.0(3)；Arg，2.8(3)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，9.9(10)；Lys，3.0(3).
化合物11AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLELLKEL-NH2(SEQ ID NO11)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu Lys Glu Leu NH2(SEQ ID NO11)物理數(shù)據(jù)m.p.172-174℃ [a]D25-43.29°(c0.2，H2O)FAB(C179H311N55O52)[M+H]+4065.8AAAAsp，2.2(2)；Glu，7.7(7)；Ser，1.7(2)；His，2.0(2)；Gly，1.0(1)；A la，1.0(1)；Arg，3.0(3)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，9.3(9)；Lys，5.1(5).
化合物12AVSEIQFXHNLGKHLSSXERVELLEKLLEKLHNY-NH2(X＝Nle，SEQ ID NO23)Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His Leu1 5 10 15Ser Ser Nle Glu Arg Val Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Asn Tyr NH2(SEQ ID NO23)物理數(shù)據(jù)m.p.178℃[a]D25-36.88°(c0.4，H2O)FAB(C182H295N50O51)[M+H]+4001.6AAAAsp，2.1(2)；Glu，6.5(6)；Ser，2 7(3)；His，3.1(3)；Gly，1.1(1)；Ala，1.0(1)；Arg，1.0(1)；Tyr，0.8(1)；Val，2.0(2)；Phe，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu+Nle，8.5(7+2)；Lys，3.1(3).
化合物13AVSEIQFXHNLGKHLSSXRRRELLEKLLEKLHNY-NH2(X＝Nle，SEQ ID NO24)Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His Leu1 5 10 15Ser Ser Nle Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Asn Tyr NH2(SEQ ID NO24)物理數(shù)據(jù)m.p.260℃ [a]D25-37.02°(c0.2，H2O)FAB(C184H304N56O49)[M+H]+4084AAAAsp，2.1(2)；Glu，5.5(5)；Ser，2.6(3)；His，3.1(3)；Ala，1.0(1)；Gly，1.1(1)；Arg，3.2(3)；Tyr，1.0(1)；Val，1.0(1)；Phe，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，9.0(9)；Lys，3.0(3).
化合物14AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRALAEALAEALHTA-NH2(SEQ ID NO20)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO20)物理數(shù)據(jù)m.p.190-225℃ [a]D25-56.58°(c0.36，H2O)FAB(C161H272N54O49)[M+H]+3747.0AAAAsp，2.1(2)；Glu，4.9(5)；Ser，1.7(2)；His，2.6(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，7.6(7)；Arg，2.8(3)；Val，1.2(1)；Ile，1.0(1)；Leu，6.6(6)；Lys，1.9(2).
化合物15AVSEHQLLHDKGKSIQDLARRELLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO12)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Ala Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO12)物理數(shù)據(jù)m.p.170-180℃ [a]D25-48.19°(c0.2，H2O)FAB(C172H293N53O51)[M+H]+3919.0AAAAsp，2.1(2)；Glu，6.1(6)；Ser，1.7(2)；His，3.1(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，3.0(3)；Arg，2.1(2)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.0(8)；Lys，4.4(4).
化合物16AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRAELLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO13)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Ala Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO13)物理數(shù)據(jù)m.p.190-195℃ [a]D25-50.50°(c0.4，H2O)FAB(C172H293N53O51)[M+H]+3919.0AAAAsp，2.1(2)；Glu，6.0(6)；Ser，1.8(2)；His，3.1(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，3.0(3)；Arg，2.1(2)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.5(8)；Lys，4.2(4).
化合物17AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRKSLLSSLLSSLHTA-NH2(SEQ ID NO21)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO21)物理數(shù)據(jù)m.p.195-204℃ [a]D25-67.11°(c0.3，H2O)FAB(C163H280N54O50)[M+H]+3796.0AAAAsp，2.1(2)；Glu，2.9(3)；Ser，6.8(7)；His，3.1(3)；Gly，1.2(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.0(3)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.2(8)；Lys，2.0(2).
化合物18AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRAFYDKVAEKLHTA-NH2(SEQ ID NO22)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO22)物理數(shù)據(jù)m.p.200-207℃ [a]D25-60.26°(c0.6，H2O)FAB(C174H284N56O50)[M+H]+3960.0AAAAsp，2.9(3)，Glu，3.5(4)；Ser，1.4(2)；His，2.6(3)；Gly，0.9(1)；Thr，1.0(1)；Ala，4.0(4)；Arg，3.0(3)；Tyr，0.9(1)；Val，1.9(2)；Phe，1.1(1)；Ile，0.9(1)；Leu，3.6(4)；Lys，4.1(4).
化合物21AVSEIQFLHN LGKHLSSLRRRELLEKLLEK LHNY-NH2(SEQ ID NO35)Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu1 5 10 15Ser Ser Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Asn Tyr NH2(SEQ ID NO35)物理數(shù)據(jù)m.p.148-155℃[a]D25-45.97(c0.26，H2O)FAB(C184H304N56O49)[M+H]+4084AAAAsx，2.1(2)；Glx，5.0(5)；Ser，2.7(3)；His，3.0(3)；Gly，1.0(1)；Ala，0.9(1)；Arg，3.1(3)；Tyr，0.9(1)；Val，1.0(1)；Phe，0.9(1)；Ile，0.9(1)；Leu 9.3(9)；Lys，3.2(3).
化合物24AVSEHQLLHD KGKSIQDLKL KELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO38)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Lys Leu Lys Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO38)物理數(shù)據(jù)m.p.175-182℃ [a]D25-49.99(c0.47，H2O)FAB(C175H299N49O51)[M+H]+3906.5AAAAsx，2.1(2)；Glx，6.5(6)；Ser，1.8(2)；His，3 1(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.1(2)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，9.1(9)；Lys，6.5(6).
化合物25AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTA-NH2(SEQ ID NO39)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg20 25 30Leu His Thr Ala-NH2(SEQ ID NO39)物理數(shù)據(jù)m.p.136.5-153.5℃ [a]D25-32.57(c0.13，H2O)FAB(C175H300N60O51)[M+H]+4060.8AAAAsx，2.2(2)；Glx，6.2(6)；Ser，1.8(2)；His，3.2(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.1(2)；Arg，5.2(5)；Val，1.1(1)；Ile，1.1(1)；Leu，8.4(8)；Lys，2.2(2).
化合物26AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAP-OH(SEQ ID NO40)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His AsP Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg20 25 30Leu His Thr Ala Pro OH(SEQ ID NO40)物理數(shù)據(jù)m.p.125.8-127.2℃[a]D25-54.62(c 0.23，H2O)FAB(C180H306N60O53)[M+H]+4158.0AAAAsx，2.1(2)；Glx，6.2(6)；Ser，1.8(2)；His，2.9(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，5.1(5)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.0(8)；Lys，2.1(2)；Pro，1.1(1).
化合物27AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRR-OH(SEQ ID NO41)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg20 25 30Leu His Thr Ala Gly Arg Arg OH(SEQ ID NO41)35物理數(shù)據(jù)m.p.106-137.3℃ [a]D25-39.55(c0.67，H2O)FAB(C189H326N68O55)[M+H]+4430.5AAAAsx，2.1(2)；Glx，5.9(6)；Ser，1.6(2)；His，2.7(3)；Gly，2.2(2)；Thr，1.0(1)；Ala，1.8(2)；Arg，7.3(7)；Val，0.8(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.1(8)；Lys，2.1(2).
化合物29AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTY-NH2(SEQ ID NO43)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Tyr NH2(SEQ ID NO43)物理數(shù)據(jù)m.p.160-172℃ [a]D25-49.85(c0.34，H2O)FAB(C181H304N56O52)[M+H]+4096.9AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.6(6)；Ser，1.7(2)；His，3.1(3)；Gly，1.1(1)；Thr，0.9(1)；Ala，0.9(1)；Arg，3.0(3)；Tyr，0.9(1)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.7(8)；Lys，4.4(4).
化合物30AVSEHQLLHD KGYSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO44)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Tyr Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO44)物理數(shù)據(jù)m.p.130-171℃ [a]D25-40.65(c0.34，H2O)FAB(C178H297N55O52)[M+H]+4039.4AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.5(6)；Ser，1.8(2)；His，3.4(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，2.9(3)；Tyr，0.8(1)；Val，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.9(8)；Lys，3.4(3).
化合物31AVSEHQLLHD KGCSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO45)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Cys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO45)物理數(shù)據(jù)m.p.140-160℃ [a]D25-44.48(c0.25，H2O)FAB(C172H293N55O51S1)[M+H]+3979AAAAsx+Cys，3.0(2+1)；Glx，5.6(6)；Ser，1.7(2)；His，3.0(3)；Gly，1.0(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.9(2)；Arg，2 5(3)；Val，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.5(8)；Lys，3.3(3).
化合物32AVSEHQLLHD KGXSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO46)(X＝Cys(CH2CONH(CH2)2NH(生物素)))Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Xaa Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2，(Xaa＝Cys(CH2CONH(CH2)2NH(生物素)))，(SEQ ID NO46)物理數(shù)據(jù)m.p.(not determined) [a]D25(not determined)FAB(C186H316N59O54S2)[M+H]+4306.6AAAAsx，2.2(2)；Glx，6.1(6)；Ser，1.8(2)；His，3.8(3)；Gly，1.0(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.1(3)；Val，1.1(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.3(3)；Lys，3.3(3).
化合物33AVSEHQLLHD KGXSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO47)(X＝Lys(7-二甲基氨基-2-氧-2H-1-苯氧基吡喃-4-乙?；?)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Xaa Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2，(Xaa＝Lys(7-二甲基氨基-2-氧-2H-1-苯氧基吡喃-4-乙?；?，(SEQ ID NO47)物理數(shù)據(jù)m.p 135-205℃ [a]D25-26.92(c0.104，50％aq.HOAc)FAB(C188H311N57O54)[M+H]+4233AAAAsx，1.9(2)；Glx，6.3(6)；Ser，1.7(2)；His，3.2(3)；Gly，1.0(1)；Thr，1.1(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.2(3)；Val，1.1(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.2(8)；Lys，4.5(4).
化合物34AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAG-OH(SEQ ID NO48)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala Gly OH(SEQ ID NO48)35物理數(shù)據(jù)m.p.92.1-146.6℃[a]D25-40.76(c0.34，H2O)FAB(C177H302N56O53)[M+H]+4062.0AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.7(6)；Ser，1.8(2)；His，3.0(3)；Gly，2.2(2)；Thr，0.9(1)；Ala，1.9(2)；Arg，2.8(3)；Val，1.2(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.5(8)；Lys，4.2(4).
化合物35AVSX1HQLLHX2KGKSIQX2LRR RX1LLX1KLLX1K LHA-OH(SEQ ID NO49)(X1＝Glu(OCH3)；X2＝Asp(OCH3))Ala Val Ser Xaa1 His Gln Leu Leu His Xaa2 Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Xaa2 Leu Arg Arg Arg Xaa1 Leu Leu Xaa1Lys Leu Leu Xaa1 Lys20 25 30Leu His Ala OH(Xaa1＝Glu(OCH3)；Xaa2＝Asp(OCH3))(SEQ ID NO49)物理數(shù)據(jù)m.p.(未測定) [a]D25-21.96(c0.132，H2O)FAB(C181H311N55O52)[M+H]+4089.0AAAAsx，2.1(2)；Glx，6.3(6)；Ser，1.8(2)；His，3.3(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.1(3)；Val，1.1(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.0(8)；Lys，4.2(4).
化合物36AVSX1HQLLHX2KGKSIQX2LRR RX1LLX1KLLX1K LHA-OCH3(SEQ ID NO50)(X1＝Glu(OCH3)；X2＝Asp(OCH3))Ala Val Ser Xaa1 His Gln Leu Leu His Xaa2 Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Xaa2 Leu Arg Arg Arg Xaa1 Leu Leu Xaa1 Lys Leu Leu Xaa1 Lys20 25 30Leu His Ala OCH3(Xaa1＝Glu(OCH3)；Xaa2＝Asp(OCH3))(SEQ ID NO50)物理數(shù)據(jù)m.p.(未測定) [a]D25-46.80(c0.07，H2O)FAB(C182H313N55O52)[M+H]+4103AAAAsx，2.1(2)；Glx，6.2(6)；Ser，1.4(2)；His，3.0(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.1(1)；Ala，1.7(2)；Arg，3.2(3)；Val，0.6(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.0(8)；Lys，4.1(4).
化合物38AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAP-OH(SEQ ID NO52)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala Pro OH(SEQ ID NO52)35物理數(shù)據(jù)m.p.152.1-186.5℃[a]D25-55.91(c0.33，H2O)FAB(C180H306N56O53)[M+H]+4102.6AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.6(6)；Ser，1.7(2)；His，2.9(3)；Gly，1.1(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.9(2)；Arg，2.9(3)；Val，1.2(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.7(8)；Lys，4.3(4).
化合物39AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTP-OH(SEQ ID NO53)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Pro OH(SEQ ID NO53)物理數(shù)據(jù)m.p.120-148.2℃ [a]D25-52.78(c0.47，H2O)FAB(C177H301N55O52)[M+H]+4031.0AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.5(6)；Ser，1.8(2)；His，2.9(3)；Gly，1.0(1)；Thr，1.0(1)；Ala，0.9(1)；Arg，2.9(3)；Val，1.2(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.5(8)；Lys，3.6(3)；Pro，0.9(1).
化合物40AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTP-NH2(SEQ ID NO54)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Pro NH2(SEQ ID NO54)物理數(shù)據(jù)m.p.133.9-155.1℃[a]D25-54.22(c0.37，H2O)FAB(C177H302N56O51)[M+H]+4030.7AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.6(6)；Ser，1.9(2)；His，2.9(3)；Gly，1.1(1)；Thr，0.9(1)；Ala，0.9(1)；Arg，2.8(3)；Val，1.2(1)；Ile，1.1(1)；Leu，7.8(8)；Lys，4.2(4)；Pro，0.9(1).
化合物41AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHP-NH2(SEQ ID NO55)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Pro NH2(SEQ ID NO55)物理數(shù)據(jù)m.p.142.8-166.1℃[a]D25-53.80(c0.38，H2O)FAB(C173H295N55O49)[M+H]+3929AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.7(6)；Ser，1.8(2)；His，3.0(3)；Gly，1.1(1)；Ala，0.9(1)；Arg，2.8(3)；Val，1.2(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.4(8)；Lys，4.4(4)；Pro，0.9(1).
化合物42AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LP-NH2(SEQ ID NO56)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu Pro NH2(SEQ ID NO56)物理數(shù)據(jù)m.p.161.0-1770℃[a]D25-61.97(c0.19，H2O)FAB(C167H288N52O48)[M+H]+3792.0AAAAsx，2.2(2)；Glx，5.9(6)；Ser，1.9(2)；His，2.1(2)；Gly，1.1(1)；Ala，1.0(1)；Arg，3.0(3)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.9(8)；Lys，4.3(4)；Pro，0.9(1).
化合物43AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAW-OH(SEQ ID NO57)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Arg Ser Ala Trp OH(SEQ ID NO57)35物理數(shù)據(jù)m.p.181-202℃ [a]D25-45.14(c0.19，H2O)FAB(C195H326N62O56)[M+H]+4435.2AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.8(6)；Ser，2.8(3)；His，2.8(3)；Gly，1.1(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.9(2)；Arg，3.7(4)；Ile，0.9(1)；Leu，7.5(8)；Lys，4.3(4)；Trp，0.9(1).
化合物44AVSEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-OH(SEQ ID NO58)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg20 25 30Leu His Thr Arg Gly Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp OH(SEQ ID NO58)35 40物理數(shù)據(jù)m.p.130-132.2℃[a]D25-46.66(c0.195，H2O)FAB(C216H365N81O62)[M+H]+5088.8AAAAsx，2.2(2)；Glx，6.0(6)；Ser，2.7(3)；His，3.0(3)；Gly，2.2(2)；Thr，2.1(2)；Ala，3.0(3)；Arg，l0.5(10)；Val，0.9(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.2(8)；Trp，1.0(1).
化合物45AVSEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-NH2(SEQ ID NO59)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg20 25 30Leu His Thr Arg Gly Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp NH2 (SEQ ID NO59)35 40物理數(shù)據(jù)m.p.158-174℃ [a]D25-43.57(c0.53，H2O)FAB(C216H366N82O61)[M+H]+5087.4AAAAsx，1.9(2)；Glx，5.6(6)；Ser，2.6(3)；His，3.3(3)；Gly，2.1(2)；Thr，2.0(2)；Ala，2.9(3)；Arg，10.1(10)；Val，0.9(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.3(8)；Trp 1.1(1).
化合物46AVSEHQLLHD RGXSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-OH(SEQ ID NO60)(X＝Lys(二羥基肉桂?；?)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Xaa Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg20 25 30Leu His Thr Arg Gly Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp OH35 40(Xaa＝Lys(二羥基肉桂酰基)，(SEQ ID NO60)物理數(shù)據(jù)m.p.165.4-175.2℃[a]D25-40.43(c0.20，H2O)FAB(C225H374N80O62)[M+H]+5191AAAAsx，2.1(2)，Glx，6.3(6)；Ser，2.8(3)；His，3.2(3)；Gly，2.1(2)，Thr，2.0(2)；Ala，3.2(3)；Arg，9.9(9)；Val，1.0(1)，Ile，0.9(1)；Leu，8.6(8)；Lys，1.1(1)；Trp，1.1(1).
化合物47AVSEIQFXHN LGKHLSSXTR SAWLRKKLQD VHNY-NH2(SEQ ID NO61)(X＝正亮氨酸)Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His Leu1 5 10 15Ser Ser Nle Thr Arg Ser Ala Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp20 25 30Val His Asn Tyr NH2(SEQ ID NO61)物理數(shù)據(jù)m.p.140-160℃ [a]D25-56.88(c0.16，H2O)FAB(C180H287N55O58)[M+H]+3989.8AAAAsx，3.0(3)；Glx，2.9(3)；Ser，3.7(4)；His，2.8(3)；Gly，1.1(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.9(2)；Arg，2.0(2)；Tyr，1.0(1)；Val，1.7(2)；Phe，0.9(1)；Ile，0.9(1)；Leu+Nle 5.8(2+4)；Lys，3.4(3)；Trp，1.1(1).
化合物48AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTMA-NH2(SEQ ID NO62)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Met Ala NH2(SEQ ID NO62)35物理數(shù)據(jù)m.p.140-210℃ [a]D25-47.75(c0.178，H2O)FAB(C180H309N57O52S1)[M+H]+41350AAAAsx，2.3(2)；Glx，6.6(6)；Ser，1.4(2)；His，3.2(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.1(3)；Val，0.9(1)；Met，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.8(8)；Lys，4.4(4).
化合物50AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RFFLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO64)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO64)35物理數(shù)據(jù)m.p.136.5-156.8℃[a]D25-49.89(c0.24，H2O)FAB(C182H300N56O49)[M+H]+4056.0AAAAsx，2.2(2)；Glx，5.0(5)；Ser，1.9(2)；His，3.3(3)；Gly，1.0(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.1(2)；Arg，3.1(3)；Val，1.0(1)；Phe，2.0(2)；Ile，0.9(1)；Leu，7.2(7)；Lys，3.5(4).
化合物51AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLHKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO65)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu His Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO65)物理數(shù)據(jù)m.p.80.7-141.0℃[a]D25-55.38(c0.23，H2O)FAB(C176H300N58O49)[M+H]+4012.8AAAAsx，2.2(2)；Glx，4.9(5)；Ser，1.8(2)；His，4.3(4)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.1(3)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.1(8)；Lys，3.9(4).
化合物52AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEHLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO66)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu His Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO66)物理數(shù)據(jù)m.p.134.3-157.9℃[a]D25-50.72(c0.45，H2O)FAB(C175H295N57O51)[M+H]+4012.8AAAAsx，2.1(2)；Glx，5.9(6)；Ser，1.8(2)；His，4.2(4)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.0(3)；Val，1.1(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.1(8)；Lys，3.1(3)
化合物53AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLIAK LHTA-NH2(SEQ ID NO67)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Ile Ala Lys20 25 30Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO67)物理數(shù)據(jù)m.p.142.7-159.8℃[a]D25-54.01(c0.21，H2O)FAB(C173H298N56O49)[M+H]+3946.0AAAAsx，2.2(2)；Glx，4.9(5)；Ser，1.8(2)；His，3.1(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，3.1(3)；Arg，3.1(3)；Val，1.0(1)；Ile，1.9(2)；Leu，7.0(7)；Lys，4.3(4).
化合物54AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEE IHTA-NH2(SEQ ID NO68)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Glu20 25 30Ile His Thr Ala NH2(SEQ ID NO68)物理數(shù)據(jù)m.p.138-185℃[a]D25-50.17(c0.14，H2O)FAB(C174H295N55O53)[M+H]+4005AAAAsx，2.2(2)；Glx，7.1(7)；Ser，1.7(2)；His，2.8(3)；Gly，1.0(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.1(2)；Arg，3.1(3)；Val，1.1(1)；Ile，1.7(2)；Leu，7.1(7)；Lys，2.7(3).
化合物58AV SEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAW-NH2(SEQ ID NO72)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Arg Ser Ala Trp NH2(SEQ ID NO72)35物理數(shù)據(jù)m.p.158-163℃ [a]D25-46.06(c0.17，H2O)FAB(C195H327N63O55)[M+H]+4434.8AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.5(6)；Ser，2.7(3)；His，3.1(3)；Gly，1.0(1)；Ala，1.8(2)；Arg，4.0(4)；Thr，0.9(1)；Val，0.9(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.5(8)；Lys，3.9(4)；Trp，1.0(1).
化合物59AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAX-OH(SEQ ID NO73)(X＝Nal(2)＝3-(2-萘基)-L-Ala)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Arg Ser Ala 3-(2-萘基)-L-ala-OH(SEQ ID NO73)35物理數(shù)據(jù)m.p.156-162℃ [a]D25-44.44(c0.189，H2O)FAB(C197H328N62O55)[M+H]+4445.6AAAAsx，2.1(2)；Glx，5.5(6)；Ser，2.8(3)；His，2.9(3)；Gly，1.0(1)；Ala，2.0(2)；Arg，4.0(4)；Thr，0.9(1)；Val，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.5(8)；Lys，4.2(4)；Nal，1.1(1).
化合物60AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTASAW-OH(SEQ ID NO74)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala Ser Ala Trp OH(SEQ ID NO74)35物理數(shù)據(jù)m.p.159-164℃ [a]D25-50.94(c0.29，H2O)FAB(C192H320N60O55)[M+H]+4349.0AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.6(6)；Ser，2.7(3)；His，3.2(3)；Gly，1.0(1)；Ala，3.1(3)；Arg，2.8(3)；Thr，1.0(1)；Val，1.1(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.6(8)；Lys，4.0(4)；Trp，1.0(1).
化合物61AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEIRA-OH(SEQ ID NO75)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala Glu Ile Arg Ala OH(SEQ ID NO75)35物理數(shù)據(jù)m.p.155-210℃[a]D25-46.15(c0.12，H2O)FAB(C195H334N62O58)[M+H]+4475.8AAAAsx，2.2(2)；Glx，6.9(7)；Ser，1.7(2)；His，3.2(3)；Gly，1.1(1)；Ala，3.1(3)；Arg，4.0(4)；Thr，0.9(1)；Val，1.1(1)；Ile，1.9(2)；Leu，8.1(8)；Lys，4.1(4).
化合物62AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEIR-OH(SEQ ID NO76)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala Glu Ile Arg OH(SEQ ID NO76)35物理數(shù)據(jù)m.p.186-218℃ [a]D25-52.73(c0.265，H2O)FAB(C192H329N61O57)[M+H]+4404.4AAAAsx，2.0(2)；Glx，6.6(7)；Ser，1.9(2)；His，3.4(3)；Gly，1.1(1)；Ala，2.0(2)；Arg，3.8(4)；Thr，1.0(1)；Val，1.1(1)；Ile，1.7(2)；Leu，7.9(8)；Lys，4.0(4).
化合物63AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEI-OH(SEQ ID NO77)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala Glu Ile OH(SEQ ID NO77)35物理數(shù)據(jù)m.p. 169-205℃ [a]D25-50.78(c0.51，H2O)FAB(C186H317N57O56)[M+H]+4248.0AAAAsx，2.2(2)；Glx，6.8(7)；Ser，1.8(2)；His，3.3(3)；Gly，1.0(1)；Ala，2.O(2)；Arg，3.0(3)；Thr，1.0(1)；Val，1.0(1)；Ile，1.8(2)；Leu，7.8(8)；Lys，3.6(4).
化合物64AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAE-OH(SEQ ID NO78)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr Ala Glu OH(SEQ ID NO78)35物理數(shù)據(jù)m.p.199-205℃ [a]D25-52.47(c0.41，H2O)FAB(C180H306N56O55)[M+H]+4135.0AAAAsx，2.0(2)；Glx，6.6(7)；Ser，1.9(2)；His，3.3(3)；Gly，1.1(1)；Ala，2.0(2)；Arg，2.9(3)；Thr，1.0(1)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.2(8)；Lys，3.8(4).
化合物66SEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO80)Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln Asp1 5 10 15Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His20 25 30Thr Ala NH2(SEQ ID NO80)物理數(shù)據(jù)m.p.134.2℃[a]D25-48.12(c0.36，H2O)FAB(C167H286N54O49)[M+H]+3834.4AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.7(6)；Ser，1.7(2)；His，2.9(3)；Gly，1.0(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.0(1)；Arg，2.8(3)；Ile，0.9(1)；Leu，7.4(8)；Lys，4.3(4).
化合物67LLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO81)Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln Asp Leu Arg Arg Arg1 5 10 15Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO81)20 25物理數(shù)據(jù)m.p.128.5-184.5℃[a]D25-6.53(c0.69，MeOH)FAB(C148H259N47O41)[M+H]+3353AAAAsx，2.0(2)；Glx，4.1(4)；Ser，0.9(1)；His，2.1(2)；Gly，1.0(1)；Thr，0.9(1)；Ala，1.0(1)；Arg，3.0(3)；Ile，1.0(1)；Leu，8.1(8)；Lys，4.2(4).
化合物68LHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO82)Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu1 5 10 15Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His Thr Ala NH2(SEQ ID NO82)20 25物理數(shù)據(jù)m.p.165-210℃ [a]D25-36.05(c0.12，H2O)FAB(C142H248N46O40)[M+H]+3239.0AAAAsx，2.0(2)；Glx，3 9(4)；Ser，0.9(1)；His，1.9(2)；Gly，1.0(1)；Thr，1.0(1)；Ala，1.0(1)；Arg，2.9(3)；Ile，0.9(1)；Leu，6.8(7)；Lys，4.2(4).
化合物69SEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHAGRRTRSAW-OH(SEQ ID NO83)Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gln Asp1 5 10 15Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg Leu His20 25 30Leu His Arg Gly Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp OH (SEQ ID NO83)35 40次重結(jié)晶，得到產(chǎn)物游離堿2.47g(54％)。將濾液濃縮，對殘余物進行重結(jié)晶。在從乙腈中濃縮母液后留下的殘余物進行重結(jié)晶，得到另外一部分游離堿產(chǎn)物1.12g(26％)。將一部分游離堿產(chǎn)物(1g)溶解于熱甲醇中，用鹽酸甲醇進行處理。通過過濾收集沉淀物，得到分析純產(chǎn)物0.67g，mp＞300℃。分析計算值(C12H9ClFN3O) 54.25％C 3.41％H15.82％N實驗值54.07％C 3.64％H15.80％N實施例26

7-氟-3-[4-(吡啶基)氨基]-1，2-苯并異噁唑?qū)?，3-二氟-N-4-吡啶基苯甲酰胺(10g)和亞硫酰氯(45mL)的混合物在回流下加熱4hr.。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫并真空濃縮。加入二氯乙烷和乙醚，收集沉淀的酰亞氨基氯(10.0g)。
將O-三甲基甲硅烷基羥胺(10.3g)快速加至上面形成的酰亞氨基氯的THF(210mL)懸浮液中，將混合物在室溫下攪拌18hr.。加入10％的鹽酸(50mL)，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1hr.。溶液用飽和碳酸氫鈉溶液堿化，用乙酸乙酯萃取。將兩層分開，水層用乙酸乙酯萃取。將合并后的有機萃取層用水和飽和氯化鈉溶液洗滌，用無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮濾液。殘余物用乙酸乙酯研磨得到5.9g的偕胺肟；其不經(jīng)純化可用于下一步驟。
將叔丁醇鉀(1.1g)加至懸浮于THF(45mL)中的部分偕胺肟(2.25g)中，將混合物在回流下加熱4hr.。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，用水和乙酸乙酯稀釋。將兩層分開，水層用乙酸乙酯萃取。合并后的有機層用水和飽和氯化鈉溶液洗滌，用無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮濾液。殘余物用乙腈重結(jié)晶，產(chǎn)物1.25g(61％)，mp 234-236℃。分析計算值(C12H9FN3O)62.88％C 3.52％H18.33％N<p>實施例II按照實施例I的過程制備和純化[Met34，Ala35]化合物1，AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEK-LLEKLHTMA-NH2，(SEQ ID NO25)。如下所述將此肽轉(zhuǎn)化為高絲氨酸內(nèi)酯。將純化后的肽(160mg)溶解在44％甲酸(4ml)中。在0℃，將該溶液與溴化氰(700mg)和苯酚(1.6mg)在44％甲酸(4ml)預(yù)先混合而成的溶液合并。溶液在0℃攪拌2小時，再在室溫下攪拌2小時。用HPLC(VydacC-18，300，4.6×250mm，流速1.2ml/min，乙腈在0.1％TFA中形成的25-45％梯度，洗脫10分鐘)監(jiān)測產(chǎn)物的生成。反應(yīng)在4小時內(nèi)進行完全。取一半樣品濃縮并用制備RP-HPLC(VydacC-18，乙腈在0.1％TFA中形成的25-45％梯度)純化。匯集高絲氨酸內(nèi)酯肽流份，冷凍干燥后得28mg白色固體，純度高于95％，即化合物4。
化合物4AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTX(X＝hSerlac，SEQ ID NO9)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr hSerlac(SEQ ID NO9)物理數(shù)據(jù)m.p.138-142℃ [a]D25-50.66°(c0.1，H2O)FAB(G176H299N55O52)[M+H]+4017.61AAAAsp，2.1(2)；Glu，6.1(6)；Ser，1.8(2)；His，3.0(3)；Thi，1.1(1)；Ala，1.1(1)；Arg，2.7(3)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.2(8)；Lys，3.8(4)；Gly 1.09(1)；hSer，1.09(1)。
同樣，按照以上過程制備65化合物。
化合物65AVSEIQFX1HN KGKHLSSX1ER VEWLRKKLQD VHNX2(SEQ ID NO79)(X1＝L-正亮氨酸；X2＝高絲氨酸內(nèi)酯)Ala Val Ser Glu Ile Gin Phe Nle His Asn Lys Gly Lys His Leu1 5 10 15Ser Ser Nle Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp20 25 30Val His Asn hSerlac(SEQ ID NO79)物理數(shù)據(jù)m.p.166-176℃ [a]D25-52.22(c0.25，H2O)FAB(C180H288N54O50)[M+H]+4008.6AAAAsx，3.1(3)；Glx，4.8(5)；Ser，2 9(3)；His，2.9(3)；Gly，1.1(1)；Ala，1.1(1)；Arg，2.0(2)；Val，2.7(3)；Phe，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu+Nle 5.9(4+2)；Lys，2.8(3).
實施例III為了制備高絲氨酸酰胺，將粗制高絲氨酸內(nèi)酯類似物，化合物4濃縮并用25ml的NH3甲醇飽和溶液處理。該溶液在0℃攪拌2小時，再在室溫下攪拌16小時。用HPLC(VydacC-18，300A，4.6×250mm，流速1.2ml/min，乙腈在0.1％TFA中形成的25-45％梯度，洗脫10分鐘)監(jiān)測反應(yīng)。反應(yīng)在18小時內(nèi)進行完全。濃縮溶液并用制備RP-HPLC(VydacC-18，乙腈在0.1％TFA中形成的25-45％梯度)純化。匯集高絲氨酸酰胺流份，冷凍干燥后得30mg白色固體，純度高于98％，即化合物3。
化合物3AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTX-NH2(X＝hSer，SEQ ID NO8)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr hSer NH2(SEQ ID NO8)物理數(shù)據(jù)m.p.138-142℃[a]D25-45.97°(c0.25，H2O)FAB(C176H302N56O52)[M+H]+4033.9AAAAsp，2.1(2)；Glu，6.1(6)；Ser，1.6(2)；His，2.8(3)；Gly，0.97(1)；hSer，0.97(1)；Thi，1.0(1)；Ala，1.0(1)；Arg，2.9(3)；Val，1.0(1)；Ile，1.0(1)；Leu，7.6(8)；Lys，3.9(4)。
同樣，按照以上過程制備化合物22，23和28。
化合物22AVSEIQFLHN LGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNX-NH2(SEQ ID NO36)(X＝高絲氨酸)Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu1 5 10 15Ser Ser Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Asn hSer NH2(SEQ ID NO36)物理數(shù)據(jù)m.p.69.4-128℃ [a]D25-43.93(c0.1 5，H2O)FAB(C179H302N56O49)[M+H]+4022.9AAAAsx，2.0(2)；Glx，4.9(5)；Ser，2.6(3)；His，2.8(3)；Gly，1.0(1)；Ala，1.0(1)；Arg，3.0(3)；Val 1.0(1)；Phe，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.8(9)；Lys，3.4(3)；
化合物23AVSEIQFLHN KGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNX-NH2(SEQ ID NO37)(X＝高絲氨酸)Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Leu His Asn Lys Gly Lys His Leu1 5 10 15Ser Ser Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Asn hSer NH2(SEQ ID NO37)物理數(shù)據(jù)m.p.87.1-142.1℃[a]D25-52.14(c0.41，H2O)FAB(C179H303N57O49)[M+H]+4038AAAAsx，2.1(2)；Glx，4.9(5)；Ser，2.7(3)；His，2.8(3)；Gly，1.0(1)；hSer，1.0(1)；Ala，1.0(1)；Arg，3.0(3)；Val，1.1(1)；Phe，0.9(1)；Ile，0.9(1)；Leu，7.9(8)；Lys，3.7(4).
Compound 28AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRX-NH2(SEQ ID NO42)(X＝高絲氨酸)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg20 25 30Leu His Thr Ala Gly Arg Arg hSer NH2(SEQ ID NO42)35物理數(shù)據(jù)m.p.80℃ [a]D25-48.64(c0.09，H2O)FAB(C193H334N70O56)[M+H]+4530.0AAAAsx，2.2(2)；Glx，6.1(6)；Ser，1.7(2)；His，3.0(3)；Gly，1.9(2)；hSer，1.0(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.1(2)；Arg，7.2(7)；Val，0.8(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.4(8)；Lys，2.1(2).
按照相似于制備高絲氨酸內(nèi)酯的方法，將其溶解在含有過量烷基胺的DMF中，由此制備高絲氨酸烷基酰胺。在室溫下攪拌數(shù)天(用分析HPLC監(jiān)測反應(yīng))，將混合物蒸發(fā)干燥，用制備HPLC純化肽。代表性高絲氨酸內(nèi)酯是化合物55和56。
化合物55AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-NHCH2CH3(SEQ ID NO69)(X＝高絲氨酸)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr hSer NHCH2CH(SEQ ID NO69)物理數(shù)據(jù)m.p.(未測定) [a]D25(未測定)FAB(C178H306N56O52)[M+H]+4063.0AAAAsx，2.1(2)；Glx，5.8(6)；Ser，1 7(2)；His，3.1(3)；Gly，0.9(1)；Thr，1.0(1)；Ala，0.9(1)；Arg，3.0(3)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.4(8)；Lys，3.7(4)；hSer，0.9(1).
化合物56AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-NHCH2CH2C6H5(SEQ ID NO70)(X＝高絲氨酸)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr hSer NHCH2CH2C6H5(SEQ ID NO70)物理數(shù)據(jù)m.p.(未測定) [a]D25(未測定)FAB(C184H310N56O52)[M+H]+4138.8AAAAsx，2.0(2)；Glx，5.9(6)；Ser，1.7(2)；His，2.9(3)；Gly，0.9(1)；Thr，1.0(1)；Ala，0.9(1)；Arg，3.0(3)；Val，1.0(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.0(8)；Lys，4.1(4)；hSer，0.9(1).
實施例IV將Nα-Boc-Nγ-Fmoc-L-2，4-二氨基丁酸與Merrifild樹脂連接(DMF，50℃，48小時)，將其代替實施例1中的Boc-Ala樹脂用于固相合成中。合成完畢后，肽用20％吡啶DMF溶液在室溫下處理30分鐘以去除側(cè)鏈的Fmoc保護基。被保護的肽自動環(huán)化成內(nèi)酰胺從而與樹脂分離。從樹脂中過濾出溶液并在真空中蒸發(fā)成油狀。殘留物如實施例I中所述用液態(tài)HF處理，生成粗制去保護肽。如實施例I所述處理和純化這些肽。
化合物49AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX(SEQ ID NO63)(X＝L-2，4-二氨基丁內(nèi)酰胺)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr L-2，4-二氨基丁內(nèi)酰胺(SEQ ID NO63)物理數(shù)據(jù)m.p.161-181℃[a]D25-48.38(c0.25，H2O)FAB(C176H300N56O51)[M+H]+4016.8AAAAsx，2.1(2)；Glx，6.3(6)；Ser，1.7(2)；His，3.3(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.0(1)；Ala，2.1(2)；Arg，2.9(3)；Val，0.9(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.0(8)；Lys，3.8(4).
實施例V實施例II制備的高絲氨酸內(nèi)酯類似物水溶液用豬肝酯酶(Sigma ChemicalCompany，St.Louis，MO)處理。用HPLC監(jiān)測內(nèi)酯水解成C末端高絲氨酸的反應(yīng)。判斷水解完全后，如實施例I所述用制備HPLC純化產(chǎn)物。
化合物37AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-OH(SEQ ID NO51)(X＝高絲氨酸)Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30Leu His Thr hSer OH(SEQ ID NO51)物理數(shù)據(jù)m.p.(未測定) [a]D25(未測定)FAB(C176H301N55O53)[M+H]+4035.1AAAAsx，2.1(2)；Glx，5.9(6)；Ser，2.0(2)；His，3 1(3)；Gly，0.8(1)；hSer，0.8(1)；Thr，1.0(1)；Ala，1.0(1)；Arg，3.0(3)；Val，1.3(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.1(8)；Lys，3.8(4).
實施例VI按照實施例I合成0.35mmol被保護肽-樹脂BocAVS(Bzl)E(oBz)H(Bom)QLLHD(oBzl)R(Ts)GR(Ts)S(Bzl)IQD(OBz)-LR(Ts)R(Ts)E(OBz)LLE(OBzl)R(Ts)LLK(Fmoc)R(Ts)LH(Bom)T(Bzl)A-O-PAM。所有的Nα基團都用叔丁氧基羰基(Boc)保護；且表明了側(cè)鏈保護基。在完成全合成后，用20％吡啶的二甲酰胺(DMF)溶液50ml在室溫下處理肽樹脂30分鐘以去除賴氨酸上的芴基甲氧基羰基(Fmoc)保護基。依次用DMF、MeOH、CH2Cl2洗滌樹脂并干燥后得1.6g部分保護的肽。取0.8g(0.175mmol)部分保護的肽，用0.44g(0.3mmol)甲氧基二(亞乙氧基)乙酸(PEG(2)CH2COOH)在0.16g(0.3mmol)六氟磷酸苯并三唑氧-三(吡咯烷基)磷鎓(PyBop)和0.067g(0.525mmol)二異丙基乙基胺(DIEA)存在下，在20ml DFM中，于室溫下乙?；嚢彼?小時。5小時后，過濾出樹脂并依次用DMF、MeOH、CH2Cl2洗滌。乙?；襟E重復(fù)兩次，直至樹脂的茚三酮測試結(jié)果為陰性。如實施例I所述，將最終的肽與樹脂分離同時去除側(cè)鏈保護基，并純化；由此獲得100mg化合物19。
化合物19AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA-OH(SEQ ID NO18)CH3O(CH2CH2O)2CH2C＝OAla Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu20 25Lys(COCH2PEG2)Arg Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO18)30物理數(shù)據(jù)m.p.145-195C [a]D25-44.60°(c0.2，H2O)FAB(C183H316N64O54)[M+H]+4276.2AAAAsp，2.1(2)；Glu，5.0(5)；Ser，1.6(2)；His，2.9(3)；Gly，0.9(1)；Thr，1.9(2)；Arg，7.1(7)；Val，1.1(1)；Ile，1.0(1)；Leu，8.0(8)；Lys，0.9(1).
實施例VII按照實施例IV，合成、分離和純化肽，所不同的是用2-甲氧基聚(亞乙基氧)乙酸(PEG(5000)CH2CO2H)作為乙?；瘎?.8g(0.175mmol)部分被保護的肽生成300mg純化合物20。
化合物20AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA-OH(SEQ ID NO19)CH3O(CH2CH2O)110CH2C＝OAla Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu20 25Lys(COCH2PEG5000)Arg Leu His Thr Ala OH(SEQ ID NO19).
30物理數(shù)據(jù)m.p.105℃ [a]D25-22.95°(c0.11，50％aq.HOAc)AAAAsp，2.0(2)；Glu，4.8(5)；Ser，1.6(2)；His，2.6(3)；Gly，1.1(1)；Thr，1.1(1)；Arg，7.3(7)；Val，0.8(1)；Ile，0.9(1)；Leu，8.3(8)；Lys，1.1(1)；Ala，1.8(2).
實施例VIIIhPTHrp(1-34)類似物基因的合成設(shè)計一段編碼hPTHrp(1-34)類似物即化合物4(SEQ ID NO9)的合成基因，其序列和限制性酶切位點如圖1所示。用DNA合成儀(Milligen/Biosearch)，用Sinha等在《(核酸研究》(Nucleic Acid Research)21，4539-4557(1984)上所述的方法合成要求的寡脫氧核苷酸，去保護后，利用15％制備聚丙烯酰胺凝膠上的凝膠電泳來純化粗制寡核苷酸。利用紫外光(UV)定位寡核苷酸，將其從凝膠中切出，在WatersC18 Sep-pak柱上脫鹽，然后冷凍干燥。
在Perkin-Elmer Cetus熱循環(huán)儀上進行25輪聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增94℃1分鐘，50℃2分鐘，72℃3分鐘，使用“GeneAmp”擴增試劑盒(Perkin-ElmerCetus)的試劑包括Taq聚合酶。
制備兩段重迭寡核苷酸作為hPTH(1-34)類似物基因的模板DNA序列，分別為一段88聚體(2μg)的PTH3，(SEQ ID NO31)CCTCTAGATC TCCGCGGCGC TAGC ATG GCT GTT TCT GAA CAT CAG 45Met Ala Val Ser Glu His Gln1 5CTG CTT CAT GAC AAA GGT AAA TCG ATT CAA GAT CTG AGA CGT C 88Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln Asp Leu Arg Arg10 15 20和一段反義鏈，90聚體(2μg)的PTH4，(SEQ ID NO32)
CCTCGAAGCT TATGCATCAT TATCTAGA CAT AGT ATG CAG CTT TTC 46Met Thr His Leu Lys Glu30AAG CAG TTT CTC CAG CAG CTC GCG ACG TCT CAG ATC TTG AAT 88Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Arg Arg Arg Leu Asp Gln Ile25 20 15CG 90使用以下兩段側(cè)翼引物，PYHPCR1CCTCTAGATC TCCGCGGCGC TAG(SEQ ID NO33)和PYHPCR2CCTCGAAGCT TATGCATCAT TATC(SEQ IDNO34)，用PCR擴增完整的基因。在4％NuSieve瓊脂糖凝膠上利用凝膠電泳純化擴增后的DNA產(chǎn)物。從凝膠上切取包含長約150堿基對的合成hPTHrp(1-34)類似物基因的條帶，由Elu-Quik玻璃凝膠DNA萃取(Schleicher&amp;Schuell，Keene，NH)分離得到約200ng DNA。
實施例IXhPTHrp(1-34)類似物基因的分子克隆為了亞克隆實施例VI的hPTHrp(1-34)類似物基因，分離200ng擴增的DNA并用限制性酶HindIII和SacII切割。如圖2所示，將DNA與2μg事先用HindIII和SacII切割的TrpLE 18 Prot(Ile3，Pro5)質(zhì)粒連接。
形成的質(zhì)粒TrpLE 18 hPTHrp(1-34)1包含一份拷貝的hPTHrp(1-34)類似物基因，然后將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的大腸桿菌HB101細胞(CLONTECH，Palo Alto，CA)中。用PCR證實轉(zhuǎn)化子中的插入。選取轉(zhuǎn)化細胞的菌落，在200μl水中煮沸5分鐘；取2μl用插入片段兩側(cè)的引物進行PCR。在1％瓊脂糖凝膠上檢測PCR產(chǎn)物，證實存在一份拷貝的hPTHrp(1-34)類似物基因插入片段。在自動DNA測序儀(Applied Biosystems 373型，F(xiàn)oster City，CA)上，使用供應(yīng)商的染料脫氧終止劑試劑盒進行DNA測序來檢驗TrpLE 18 hPTHrp(1-34)1構(gòu)建物。
實施例X包含hPTHrp(1-34)類似物基因多拷貝的Trp LE 18載體的構(gòu)建單一的Nhe I和Xba I限制性位點靠近hPTHrp(1-34)類似物基因的起點和終點。識別不同序列但產(chǎn)生相同單鏈粘端的這兩個位點允許在Trp LE 18載體內(nèi)構(gòu)建hPTHrp(1-34)類似物基因的多份拷貝。
圖3中表示了構(gòu)建串聯(lián)形式的重復(fù)hPTHrp(1-34)序列的方法。在分離反應(yīng)中，用Bam HI+Nhe I和Xba I+Bam HI切割包含單拷貝基因的TrpLE 18hPTHrp(1-34)1構(gòu)建物。從兩份消化產(chǎn)物中各可分離約300ng包含hPTHrp(1-34)類似物基因的片段。將兩種片段混合并連接，形成TrpLE 18 hPTHrp(1-34)2質(zhì)粒。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌HB101細胞。在1％瓊脂糖凝膠上測定轉(zhuǎn)化后PCR產(chǎn)物的大小，用以確定存在2二拷貝的hPTHrp(1-34)基因插入片段。然后由DNA測序檢驗含有兩份基因拷貝的TrpLE 18 hPTHrp(1-34)2。兩份hPTHrp(1-34)基因的正確融合消除了連接處的Nhe I和Xba I位點。由此使得留下的Nhe I和Xba I位點僅位于串聯(lián)基因的兩側(cè)。
如圖4所示，重復(fù)以上步驟，構(gòu)建出包含hPTHrp(1-34)基因4份拷貝的TrpLE18 hPTHrp(1-34)4。DNA測序證實TrpLE 18 hPTHrp(1-34)4的序列正確。
實施例XITrpLE 18 hPTHrp(1-34)4的表達和純化TrpLE 18 hPTHrp(1-34)4的引入將包含TrpLE 18 hPTHrp(1-34)4質(zhì)粒的大腸桿菌細胞接種在50ml包含50μg/ml氨芐青霉素和100μg/ml色氨酸的LB培養(yǎng)基中(J.H.Miller，“分子遺傳學(xué)實驗”(“Experiments in Molecular Genetics”)p431(1972)，在此參考)，并在37℃通宵劇烈振蕩培養(yǎng)，達到A550約6。用20ml起始培養(yǎng)物接種入37℃預(yù)熱的2升LB培養(yǎng)基中，生長至A550約0.06。然后，加入10mg/ml吲哚丙烯酸(IAA)溶液2ml，將培養(yǎng)物劇烈振蕩培養(yǎng)至A550約0.6至0.8。在良好的通氣條件下繼續(xù)培養(yǎng)約16小時，直至最終A550約6(通常在4至10之間)。離心濃縮細胞后重懸在500ml 50mM的Tris-HCl，pH7.5，0.1mM EDTA緩沖溶液(Tris緩沖液)中。
在Heat Systems-Ultrasoniac，Inc.220F型超聲發(fā)生儀(配有3/4”天線)上超聲處理懸浮液，以全功率的50％操作以免過熱。
為了確定引入的程度，利用SDS-PAGE檢測完整的細胞。由TrpLE 18hPTHrp(1-34)4構(gòu)建物產(chǎn)生的基因產(chǎn)物呈約17,000預(yù)計分子量的主要條帶。該產(chǎn)物占全部細胞蛋白質(zhì)的10％。融合蛋白的分離細胞裂解液以約3600×g離心15分鐘以沉淀TrpLE 18 hPTHrp(1-34)4融合蛋白；棄去上清液。將沉淀重懸在200ml Tris緩沖液中。(通常為40至80A550/ml)。
實施例XIII融合蛋白的加工和高絲氨酸內(nèi)酯hPTHrp(1-34)肽的純化用CNBr切除hPTHrp(1-34)多聚體融合蛋白側(cè)面的甲硫氨酸殘基，釋放出要求的高絲氨酸hPTHrp(1-34)多肽，然后如下進行純化。
融合蛋白的CNBr處理溫和攪拌，將洗滌后的TrpLE 18 hPTHrp(1-34)4融合蛋白重懸于60ml 70％甲酸(約20mg/ml總蛋白；通常將1000 A550單位細胞的產(chǎn)物溶于3ml中)。加入數(shù)滴辛醇，在溶液中通20分鐘氮氣，然后加入5.5g CNBr。該反應(yīng)在25℃進行6小時，然后將等體積的50∶50 MeOH∶H2O與樣品混合，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將其去除。該過程重復(fù)2至4次，基本去除甲酸和CNBr。然后將樣品蒸發(fā)至于，重新溶解在20ml水中，冷凍干燥保存。
高絲氨酸內(nèi)酯hPTHrp(1-34)的純化用50mM的KH2PO4pH6.5透析CNBr切割后的上清液，期間多次更換透析液。在透析過程中，將pH維持在6.5。透析后，高速離心去除沉淀。用Gelman 0.45μ過濾裝置(Acrodisc 4184)澄清上清液。
陽離子交換色譜利用Bio-Gel TSK-SP-5PW HPLC柱(21.5×150mm)上的陽離子交換色譜進行最初的純化。8ml/min流速，產(chǎn)量約12mg高度純化的高絲氨酸內(nèi)酯hPTHrp(1-34)肽的色譜條件為1.在50mM KH2PO4，pH6.5中進行柱平衡2.上樣10ml澄清的上清液(約1.5L培養(yǎng)液或2.4g內(nèi)含物)。
3.用含有50mM NaCl的50mM KH2PO4，pH6.5洗柱，直至基線穩(wěn)定。
4.用含有90mM NaCl的50mM KH2PO4，pH6.5洗脫，收集流份約45分鐘，5.用C18 HPLC檢測90mM NaCl流份的高絲氨酸內(nèi)酯hPTHrp(1-34)濃度，然后匯集流份并保存。
反相HPLC色譜將反相Poros R/H 4.6×100mm柱(Perseptive Biosystems，Cambridge，MA)用于最終的純化步驟。色譜條件如下移動相A0.1％三氟乙酸(TFA)/水B0.1％三氟乙酸(TFA)/CH3CN時間 流速 ％B0min 4ml/min 155.0min 4ml/min 405.2min 4ml/min 1006.8min 4ml/min 1007.0min 4ml/min 15高絲氨酸內(nèi)酯hPTHrp(1-34)即化合物4的滯留時間約2.943分鐘。經(jīng)質(zhì)譜測定，純化后的肽純度約98％。
實施例XIII通常根據(jù)Gunness-Hey和Hock在(Metab.Bone Dis)5177-181(1984)中所示的方法，在切除了卵巢的大鼠中評價本發(fā)明化合物對骨質(zhì)量的作用。
使成年Sprague-Dawley雌性大鼠適應(yīng)環(huán)境，按重量分組(n＝9、10或12)，進行雙側(cè)卵巢切除或?qū)φ帐中g(shù)。手術(shù)后起始給藥17天并繼續(xù)20天。試驗化合物以2％大鼠血清/鹽水載體每天一次皮下施用。
給藥20天后，處死大鼠并切斷右側(cè)股骨，將股骨切去一半，再通過鉆取小梁將遠端半段股骨(DHF)分離成小梁骨(TB)和皮質(zhì)骨(CB)。抽提鈣，并用Calcette鈣分析儀測定，表示為平均骨鈣，單位為mg/DHF/100g體重。
用雙樣品t試驗來比較OVX和對照組。用單邊ANOVA(one-way ANOVA)比較OVX組，然后用Fisher LSD多重比較來比較各處理組和載體組。
卵巢切除造成嚴重的總體骨流失，主要是小梁骨流失。總骨鈣比對照組低47至54％。
每日80μg/kg的bPTH(1-34)和hPTH(1-34)在統(tǒng)計學(xué)上顯著提高治療的OVX大鼠總骨鈣，分別為53至95％和18至40％；然而在皮質(zhì)骨鈣中無顯著增加。
每日80μg/kg給藥本發(fā)明的化合物，提高總骨鈣66至138％，小梁骨鈣87至128％。與非治療OVX對照相比，皮質(zhì)骨鈣、小梁厚度和骨體積也明顯增加。
在該試驗中，對以下化合物進行了測試
化合物編號n 小梁骨鈣 總骨鈣(測試次數(shù)) (相對OVX的提高％) (相對OVX的提高％)化合物1(SEQ ID NO7)6 101-128％ 88-138％化合物2(SEQ ID NO6)3 87-102％ 66-114％化合物4(SEQ ID NO9)3 - 88-114％在類似的研究中，切除了卵巢的大鼠以每日40μg/kg的劑量用藥5、10和20天，結(jié)果如下
化合物編號n 總骨鈣(測試次數(shù))用藥天數(shù)(d)(相對OVX的提高％)化合物1(SEQ ID NO7)3 2073-109％化合物4(SEQ ID NO9)5 2079-105％化合物4(SEQ ID NO9)1 1079％化合物49(SEQ ID NO63) 1 1093％化合物4(SEQ ID NO9)1 5 55％化合物42(SEQ ID NO56) 1 5 60％實施例XIV成熟新西蘭雌性白兔(Hazelton Rearch Products，Inc.，3.6kg，n＝9-11/處理組)在13個月內(nèi)，每日注射載體或0.15mg/kg潑尼松。用雙能X光吸收比色法(HologicQDR-11500W型，Hologic，Inc.，Waltham，MA)測定骨礦物質(zhì)密度(BMD)，然后進行骨代謝的生物化學(xué)標記。9個月后，亞組在接受每日0.05，0.15或0.5ug/kg的化合物1(SEQ ID NO7)皮下注射。2個月后，將劑量提高至每日0.5，3和10ug/kg。潑尼松處理導(dǎo)致迅速的早期骨流失(2-4個月)，BMD然后在以后的研究中保持穩(wěn)定。腰椎A(chǔ)/P檢查、外側(cè)檢查和遠端股骨中觀察到離基線12.4+1.3％、18.1±1.9％和11.8±2.5％的最終骨流失。在股骨骨干中觀察到了較小的減少(7.8±2.2％)。較低的早期劑量并不改變以上情況。在持續(xù)使用潑尼松的動物中，10ug/kg化合物1使用30至60天后，使得各位置的BMD值恢復(fù)到與只用載體處理12個月的對照兔基本相同。潑尼松處理的兔其血清骨鈣質(zhì)(serum osteocalcin)比50±8ng/ml的基線值下降6.4倍，但在聯(lián)用10ug/kg化合物1后恢復(fù)正常。
權(quán)利要求
1.一種治療由皮質(zhì)甾類誘發(fā)的骨質(zhì)減少的方法，該方法包括給需要治療的病人使用有效量的甲狀旁腺素PTH、甲狀旁腺素相關(guān)肽PTHrp、和PTH和PTHrp的具有生理活性的截短形式同系物和類似物的合成多肽類似物或其鹽，其中所述合成多肽類似物的氨基酸殘基(22-31)形成兩親α-螺旋，所述的殘基(22-31)選自按以下順序排列的親水性氨基酸(Haa)和親脂性氨基酸(Laa)Haa(Laa Laa HaaHaa)2Laa。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中氨基酸殘基(22-31)的序列選擇(SEQ IDNO85、86、26、27、28、29和30)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中多肽的有效量是約0.002μg多肽/kg病人體重/天至約10μg多肽/kg病人體重/天。
4.用于預(yù)防或治療由皮質(zhì)甾類誘發(fā)的骨質(zhì)減少的藥物組合物，其中包含有效量的甲狀旁腺素PTH、甲狀旁腺素相關(guān)肽PTHrp、和PTH和PTHrp的具有生理活性的截短形式同系物和類似物的合成多肽類似物或其鹽和藥學(xué)上認可的載體，其中所述合成多肽類似物的氨基酸殘基(22-31)形成兩親α-螺旋，所述的殘基(22-31)選自按以下順序排列的親水性氨基酸(Haa)和親脂性氨基酸(Laa)Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中氨基酸殘基(22-31)的序列選擇(SEQ IDNO85、86、26、27、28、29和30)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中多肽的有效量是約0.002μg多肽/kg病人體重/天至約10μg多肽/kg病人體重/天。
7.用于預(yù)防或治療由皮質(zhì)甾類誘發(fā)的骨質(zhì)減少的單位劑型的藥物組合物，其中包含約1μg至約1000μg甲狀旁腺素PTH、甲狀旁腺素相關(guān)肽PTHrp、和PTH和PTHrp的具有生理活性的截短形式同系物和類似物的合成多肽類似物或其鹽和藥學(xué)上認可的載體，其中所述合成多肽類似物的氨基酸殘基(22-31)形成兩親α-螺旋，所述的殘基(22-31)選自按以下順序排列的親水性氨基酸(Haa)和親脂性氨基酸(Laa)Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中氨基酸殘基(22-31)的序列選擇(SEQID NO85、86、26、27、28、29和30)。
全文摘要
甲狀旁腺素PTH、甲狀旁腺素相關(guān)肽PTHrp、和PTH和PTHrp的具有生理活性的截短形式同系物和類似物的合成多肽類似物和它們藥學(xué)上認可的鹽可用于預(yù)防和治療哺乳動物由皮質(zhì)甾類誘發(fā)的骨質(zhì)減少,其中所述合成多肽類似物的氨基酸殘基(22—31)形成兩親α－螺旋,所述的殘基選自按以下順序排列的親水性氨基酸(Haa)和親脂性氨基酸(Laa):Haa(Laa Laa Haa Haa)
文檔編號C12N1/21GK1187203SQ96194551
公開日1998年7月8日 申請日期1996年6月3日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者B·H·維克里 申請人:森德克斯(美國)股份有限公司