專利名稱：編碼堿性液化α－淀粉酶的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼堿性液化α-淀粉酶的基因和其片段，還涉及重組DNA和帶有該基因或該基因的片段的轉(zhuǎn)化子。
長(zhǎng)久以來(lái)α-淀粉酶一直被用于多個(gè)領(lǐng)域。例如，在發(fā)酵業(yè)中它一直被用于谷物和馬鈴薯的糖化，在紡織業(yè)中用作淀粉糊去除劑，在制藥業(yè)中用作助消化藥，而在食品業(yè)中用于制造粘稠的麥芽糖漿。α-淀粉酶是一種作用于淀粉相關(guān)多糖如直鏈淀粉和支鏈淀粉，單一地水解多糖分子中α-1，4-糖苷鍵的酶。自從1833年當(dāng)時(shí)Payen和Persoz首次發(fā)現(xiàn)這種酶開(kāi)始，已經(jīng)從包括細(xì)菌、真菌、植物種子和動(dòng)物消化腺等許多不同的來(lái)源中獲得了α-淀粉酶的晶體樣品或電泳上均質(zhì)的樣品。
本發(fā)明的發(fā)明者們最近發(fā)現(xiàn)當(dāng)將α-淀粉酶和支鏈淀粉酶都摻入洗碗劑和衣物洗滌劑中時(shí)，洗碗劑和衣物洗滌劑的效能可被大大提高，特別是對(duì)淀粉污漬(日本專利申請(qǐng)公開(kāi)(kokai)2-132192號(hào))。然而，以前在自然界中發(fā)現(xiàn)的大部分α-淀粉酶在中性到酸性pH范圍內(nèi)表現(xiàn)出最大且穩(wěn)定的酶切活性，但在pH9-10的堿性溶液中卻很少發(fā)揮作用。已知只有少數(shù)的淀粉酶在堿性的pH范圍內(nèi)表現(xiàn)最大的活性(所謂的堿性α-淀粉酶和耐堿α-淀粉酶)。這些堿性α-淀粉酶和耐堿α-淀粉酶包括由芽孢桿菌屬sp.A-40-2產(chǎn)生的一種酶〔Horikoshi，K.等，《農(nóng)業(yè)與生物化學(xué)》(Agric.Biol.Chem.)，35，1783(1971)〕，由芽孢桿菌屬sp.NRRL B-3881產(chǎn)生的一種酶〔Boyer，E.等，《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)，110，992(1972)〕，由鏈霉菌屬sp.KSM-9產(chǎn)生的一種酶(日本專利申請(qǐng)公開(kāi)(kokai)61-209528號(hào))，由芽孢桿菌屬sp.H-167產(chǎn)生的一種酶(日本專利申請(qǐng)公開(kāi)(kokai)62-208278號(hào))，由嗜熱堿性芽孢桿菌sp.A3-8產(chǎn)生的一種酶(日本專利申請(qǐng)公開(kāi)(kokai)2-49584號(hào))以及由嗜鹽堿球菌屬sp.AH-36產(chǎn)生的一種酶(日本專利申請(qǐng)公開(kāi)(kokai)4-211369號(hào))。
這里所用的，術(shù)語(yǔ)“堿性α-淀粉酶”指最適pH落在堿性pH范圍中的α-淀粉酶，而術(shù)語(yǔ)“耐堿α-淀粉酶”指最適pH在中性至酸性范圍內(nèi)但其在堿性范圍內(nèi)的活性與在最適pH時(shí)的活性類似且在堿性范圍內(nèi)保持其穩(wěn)定性的淀粉酶。術(shù)語(yǔ)“中性范圍”意指低于8且不小于6的pH范圍，而“堿性”表示高于“中性范圍”的pH。
這些堿性α-淀粉酶和耐堿α-淀粉酶的大部分是將淀粉或淀粉相關(guān)多糖分解為葡萄糖、麥芽糖或麥芽三糖的所謂的糖化α-淀粉酶。據(jù)此，雖然它們被有效地用于制糖業(yè)中，但如果將它們用作洗滌劑的酶卻會(huì)產(chǎn)生問(wèn)題。因此，仍然需要對(duì)用于洗滌劑中的表面活化劑具有抗性并以一種高度隨機(jī)的方式分解淀粉或淀粉相關(guān)多糖的所謂的堿性液化α-淀粉酶。本發(fā)明者們持續(xù)深入地尋找產(chǎn)生適于作為洗滌劑成分的堿性α-淀粉酶的微生物，并發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)最適pH在堿性范圍內(nèi)的嗜堿芽孢桿菌sp.KSM-AP1378菌株產(chǎn)生一種表現(xiàn)堿性液化α-淀粉酶活性的酶。他們證明這種酶作為用于洗碗和廚房用具的洗滌劑組合物以及用于洗衣的洗滌劑組合物中的一種添加劑是有效的(WO94/26881)。
通過(guò)改善用于產(chǎn)堿性α-淀粉酶微生物芽孢桿菌sp.KSM-AP1378的培養(yǎng)方法或通過(guò)利用突變可以有效增加所產(chǎn)生的酶的量。然而，為了以一種工業(yè)化的規(guī)模有利地生產(chǎn)這種酶，必需采取其它方法。
利用一種基因工程的方法可以提高所生產(chǎn)的酶的量，另外，利用一種基因工程方法通過(guò)改變編碼酶的基因提高酶的催化活性。然而，仍未獲得編碼一種堿性液化α-淀粉酶的基因。
相應(yīng)地，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供編碼堿性液化α-淀粉酶的基因和其片段、一種含有包括該基因的重組DNA的轉(zhuǎn)化子和一種用于利用該轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)堿性液化α-淀粉酶的方法。
編碼堿性液化α-淀粉酶基因的DNA進(jìn)一步可被用來(lái)制備用于從其它微生物中分離其它的同源堿性液化α-淀粉酶基因的探針。因此，本發(fā)明的另一目的是提供一種篩選和分離其它堿性液化α-淀粉酶的方法。
本發(fā)明者們?cè)噲D從一種嗜堿芽孢桿菌菌株的染色體DNA中分離一種含有編碼堿性液化α-淀粉酶基因的DNA片段，結(jié)果，他們成功分離了一個(gè)大約1.8kb的編碼一種堿性液化α-淀粉酶的DNA片段。當(dāng)他們利用被連至一合適載體的該DNA片段轉(zhuǎn)化一種宿主微生物時(shí)，證實(shí)了所獲的重組微生物產(chǎn)生一種堿性液化α-淀粉酶。此外，發(fā)現(xiàn)所編碼的堿性液化α-淀粉酶的氨基酸序列與以前已知的淀粉酶不同?；谶@個(gè)發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供編碼一種堿性液化α-淀粉酶的DNA片段。
本發(fā)明還提供一種含有上述的編碼堿性液化α-淀粉酶的DNA片段的重組DNA。
本發(fā)明還提供一種包含上述的含有編碼堿性液化α-淀粉酶的DNA片段的重組DNA的轉(zhuǎn)化的微生物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于通過(guò)培養(yǎng)上述的轉(zhuǎn)化的微生物產(chǎn)生一種堿性液化α-淀粉酶并收集酶的方法。


圖1表現(xiàn)編碼一種堿性液化淀粉酶的基因片段的限制性酶圖譜。
圖2是一個(gè)描述利用編碼一種堿性液化淀粉酶的基因片段構(gòu)建pAML100的圖。
圖3表現(xiàn)所用引物的核苷酸序列。
圖4是一個(gè)由芽孢桿菌sp.KSM-AP1378產(chǎn)生的一種堿性液化α-淀粉酶的pH曲線。
在本發(fā)明中，用作一種堿性液化α-淀粉酶基因供體的一個(gè)有效的微生物例如可以是芽孢桿菌sp.KSM-AP1378(FERM BP-3048，1989年7月24日寄存于發(fā)酵研究所(Fermentation Research Institute)，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)代理處(Agency of Industrial Science and Technology)1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，305日本)，它是一種嗜堿芽孢桿菌菌株。這種菌株是由本發(fā)明者在日本Tochigi縣的Tochigi城附近從土壤中分離到并鑒定為一種產(chǎn)生顯著量的堿性液化α-淀粉酶的菌株。該菌株在1990年8月8日以FERM BP-3048(最初于1989年7月24日保存為P-10886)保存在發(fā)酵研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)代理處(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305，日本)。
為了從供體微生物中獲得染色體DNA，可利用由Marmur，J.(《分子生物學(xué)雜志》(J.MoL.Biol.)，3，208(1961))建議的方法或由Saito，H.和Miura，K.(《生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(bào)》(Biochcm.Biophys.Acta)，72，619(1963))建議的方法。也可使用其它類似的方法。
通過(guò)利用限制性酶切割所獲的染色體DNA制備含有堿性液化α-淀粉酶基因的DNA片段。對(duì)于可使用的限制性酶只要不切割該基因則并無(wú)特殊限制。也可通過(guò)PCR獲得堿性液化α-淀粉酶的基因(Mullis，K.B.和Faloona，F(xiàn).A.，《酶學(xué)方法》(Methods Enzymol.)，155，355(1987)；Saiki，R.K.等，《科學(xué)》(Science)，239，487(1988))。例如，根據(jù)在序列號(hào)2中描述的核苷酸序列通過(guò)合成具有與那些在核心區(qū)域的5’-末端的上游和3’-末端的下游序列相應(yīng)的序列的引物，隨后通過(guò)將產(chǎn)一種堿性液化α-淀粉酶的微生物的染色體DNA用作模板進(jìn)行PCR可以獲得基因。另外，可通過(guò)利用任何方法從產(chǎn)一種堿性液化α-淀粉酶的微生物中首先獲得堿性液化α-淀粉酶基因的一個(gè)片段，隨后通過(guò)PCR擴(kuò)增該片段基因的上游和下游區(qū)。
然后將所制備的基因片段進(jìn)行克隆。只要宿主細(xì)菌表達(dá)本發(fā)明的堿性液化α-淀粉酶基因，重組DNA分子在宿主菌中可被復(fù)制并且整合的基因可被穩(wěn)定地保留，則對(duì)可利用的宿主/載體系統(tǒng)并無(wú)特殊限制。例如，宿主是大腸桿菌K-12的EK系統(tǒng)的成員和宿主為Marburg枯草芽孢桿菌的BS系統(tǒng)的成員都可以使用。利用包含許多種載體并且遺傳學(xué)上被深入地研究過(guò)的EK系統(tǒng)可獲得良好的結(jié)果，因而是優(yōu)選的。宿主細(xì)菌的特定的例子包括EK系統(tǒng)的HB101、C600和JM109，以及BS系統(tǒng)的BD170、MI112和ISW1214。載體的特定的例子包括用于EK系統(tǒng)pBR322和pUC18，以及用于BS系統(tǒng)的pUB110和pHY300PLK。
通過(guò)用一限制性酶切割一種載體隨后與上述的染色體或PCR擴(kuò)增的DNA片段連接產(chǎn)生一種重組質(zhì)粒DNA分子。例如通過(guò)利用一種DNA連接酶可以實(shí)現(xiàn)連接。
對(duì)利用一重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)菌的方法并無(wú)特殊的限制。例如，在EK系統(tǒng)宿主的情況下可用氯化鈣法(Mandel，M.和Higa，A.，《分子生物學(xué)雜志》，53，159(1970))，而在BS系統(tǒng)宿主的情況下可用原生質(zhì)體法(Chang，C.和Cohen，S.N.，《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》(Mol.Gen.Genet.)，168，111(1978))。按照下面的方法進(jìn)行重組子微生物的篩選。首先，利用一種未由外源染色體DNA片段的插入而失活的特性作為一種指標(biāo)如載體DNA上編碼的對(duì)抗生素的抗性，來(lái)篩選用含有載體衍生的DNA片段轉(zhuǎn)化的微生物。例如，在一利用EK系統(tǒng)的pBR322作為載體并將染色體DNA的一個(gè)HindIII片段插入pBR322的HindIII切割位點(diǎn)中的特定例子中，四環(huán)素抗性基因失活，所以可以通過(guò)在氨芐青霉素基因中不帶有HindIII切割位點(diǎn)而賦予氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)進(jìn)行初次篩選。隨后，將所選的轉(zhuǎn)化子利用如影印方法轉(zhuǎn)移至含有淀粉的瓊脂平板上，然后進(jìn)行培養(yǎng)以便形成菌落。因?yàn)榘兄亟M子微生物在集落周圍分解淀粉，所以通過(guò)利用一種含碘溶液對(duì)在含有淀粉的瓊脂平板中所含的淀粉染色可以對(duì)其進(jìn)行篩選。
利用制備質(zhì)?；蚴删wDNA的標(biāo)準(zhǔn)程序可以提取由所獲的重組微生物包含的重組DNA分子(Maniatis，T.等，《分子克隆》(MolecularCloning)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約(1982))。在利用電泳分析通過(guò)利用各種限制性酶所獲得的切割模式時(shí)，證實(shí)重組DNA分子是載體DNA分子和一個(gè)含有堿性液化α-淀粉酶的DNA片段的連接產(chǎn)物。
在圖1的限制性酶切圖譜中所表現(xiàn)的一個(gè)大約2.1kb的DNA片段內(nèi)含有編碼一種堿性液化α-淀粉酶的基因，并存在于由白色帶表示的大約1.6kb的片段中。該基因具有一個(gè)顯示在序列號(hào)2中的核苷酸序列。在此序列中，5’末端和3’末端分別對(duì)應(yīng)于顯示在序列2中的大約2.1kb片段的左手側(cè)和右手側(cè)。在此序列中觀察到一個(gè)在第145個(gè)核苷酸ATG處開(kāi)始并編碼一個(gè)由序列號(hào)1中所描述的516個(gè)氨基酸殘基組成的序列的開(kāi)放閱讀框架(ORF)。ORF上游13個(gè)堿基(13b)處存在一個(gè)與枯草芽孢桿菌16S核糖體RNA的3’末端序列高度互補(bǔ)的AAGGAG序列(McLaughlin，J.R.等，《生物學(xué)和化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)，256，11283(1981))。在核苷酸由9延伸至36的更加上游的區(qū)域中，存在一個(gè)與一種σA-型啟動(dòng)子的共有序列具有高度同源性的TTGAAA……16b……TATGGT序列(Gitt，M.A.等，《生物學(xué)與化學(xué)雜志》，260，7178(1985))。類似地，在從95到125的核苷酸中發(fā)現(xiàn)另一個(gè)σA-型啟動(dòng)子序列。從芽孢桿菌sp.KSM-AP1378培養(yǎng)物純化的堿性液化α-淀粉酶中氨基末端側(cè)的10個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列與由該DNA片段的核苷酸序列所推導(dǎo)的第37個(gè)氨基酸延伸的序列(序列號(hào)2中的37-46號(hào)氨基酸)一致。
當(dāng)將本發(fā)明中基因的核苷酸序列和所推導(dǎo)的氨基酸序列與那些目前已知的α-淀粉酶相比較時(shí)，證實(shí)該基因包括一種新型核苷酸序列，所推導(dǎo)的由該基因編碼的氨基酸序列與那些其它α-淀粉酶如由解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的一種液化α-淀粉酶(Takkinen，K.等，《生物學(xué)與化學(xué)雜志》，258，1007(1983))、由嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)生的一種液化α-淀粉酶(Nakajima，R.等，《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)，163，401(1985))、由地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的一種液化α-淀粉酶(Yuuki，T.等，《生物化學(xué)雜志》(J.Biochem.)，98，1147(1985))或由芽孢桿菌sp.707產(chǎn)生的一種液化α-淀粉酶(Tsukamoto，A.等，《生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，151，25(1988))不同。
含有堿性液化α-淀粉酶基因完整區(qū)域的一個(gè)優(yōu)選的重組DNA分子的例子是質(zhì)粒pAML100(圖2)。這個(gè)重組質(zhì)粒大小為4.4kb并形成一個(gè)含有包括堿性液化α-淀粉酶基因和pUC19的一個(gè)1.8kb片段的片段。包含該重組DNA分子的一個(gè)優(yōu)選的重組微生物是一種大腸桿菌HB101(pAML100)菌株。通過(guò)用重組質(zhì)粒pAML100以一種標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101獲得該菌株。當(dāng)用一種常規(guī)用來(lái)培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基培養(yǎng)該菌株時(shí)，它產(chǎn)生一種堿性液化α-淀粉酶。所產(chǎn)生的酶的最適反應(yīng)pH為pH8-9。這與對(duì)由該基因的供體細(xì)菌菌株芽孢桿菌sp.KSM-AP1378產(chǎn)生的堿性液化α-淀粉酶所確定的活性-pH關(guān)系曲線(圖4)非常一致。
本發(fā)明的DNA片段，只要它們編碼一種表現(xiàn)所需酶切活性的的蛋白質(zhì)，則不一定僅限于那些編碼在下述的序列表中所列氨基酸序列的DNA，這包括編碼一種其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、增加、缺失、倒位或插入的氨基酸序列的DNA片段。這種DNA的一個(gè)例子是一個(gè)編碼一種等價(jià)于在序列號(hào)1中所描述的氨基酸序列而N-末端有多至32個(gè)氨基酸已缺失的氨基酸序列的DNA。
為了利用本發(fā)明中被轉(zhuǎn)化的微生物生產(chǎn)一種堿性液化α-淀粉酶，將一種被轉(zhuǎn)化的含有本發(fā)明中前面提到的DNA片段的微生物進(jìn)行培養(yǎng)。另外，可將該DNA片段整合入許多表達(dá)載體來(lái)獲得具有提高了表達(dá)能力的被轉(zhuǎn)化的微生物，隨后培養(yǎng)所獲的轉(zhuǎn)化子。此外，根據(jù)微生物的特性可在不同的條件下培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的微生物。因此，可以使用適于宿主的培養(yǎng)條件。為了從所獲的培養(yǎng)物中收集一種堿性液化α-淀粉酶，可使用一種常規(guī)的方法(如在WO94/26881中所描述的方法)。
可以進(jìn)一步將本發(fā)明中的DNA片段用作探針用于從其它生物中分離同源的堿性液化α-淀粉酶基因。
實(shí)施例下面將要通過(guò)實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)被認(rèn)為是將本發(fā)明限定于此。在實(shí)施例中的濃度都是以重量的％為基礎(chǔ)。實(shí)施例1將產(chǎn)生一種堿性液化α-淀粉酶的芽孢桿菌sp.KSM-AP1378接種在5ml培養(yǎng)基A(表1)中并在30℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。將1ml培養(yǎng)物接種于100ml同樣的培養(yǎng)基中，然后在30℃再次振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。隨后，通過(guò)離心收集細(xì)胞并按照由Saito和Miura推薦的方法(Saito，H.和Miura，K.，《生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(bào)》(Biochem.Biophys.Acta)，72，619(1963))獲得大約1mg的染色體DNA。
表1培養(yǎng)基A的組成可溶性淀粉1.0％多聚蛋白胨1.0％酵母提取物0.5％KH2PO40.1％Na2HPO4·12H2O0.25％MgSO4·7H2O0.02％CaCl2·2H2O0.02％FeSO4·7H2O0.001％MnCl2·4H2O0.0001％Na2CO31.0％(單獨(dú)滅菌)實(shí)施例2已知淀粉酶家族的許多成員具有氨基酸序列高度保守的I-IV區(qū)(Nakajima，R.等，《應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)》(Appl.Microbiol.Biotechnol.)，23，355(1986))。因而，根據(jù)在已知的堿性液化α-淀粉酶的I到IV區(qū)中非常保守的II區(qū)和IV區(qū)的氨基酸序列合成與II區(qū)和IV區(qū)相應(yīng)的引物1和2(圖1和3)。利用所合成的引物和KSM-AP1378的染色體DNA(用作模板)進(jìn)行PCR(1個(gè)循環(huán)＝94℃×1min+42℃×1min+60℃×2min，30個(gè)循環(huán))。獲得了在圖1中所示的一個(gè)大約0.3kb的基因片段(片段A)，并測(cè)定了該片段的核苷酸序列。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該片段編碼一種表現(xiàn)出與已知液化淀粉酶的從II區(qū)延伸到IV區(qū)的氨基酸序列具有一種不可忽視水平同源性的氨基酸序列。實(shí)施例3利用片段A作為一個(gè)探針，對(duì)經(jīng)XbaI消化的KSM-AP1378的染色體DNA進(jìn)行Southern雜交。結(jié)果，證實(shí)在大約1.0kb位置處雜交有一條帶。利用從片段A的末端序列合成的引物(在II區(qū)側(cè)引物3；在IV區(qū)側(cè)引物4)和通過(guò)分子內(nèi)連接X(jué)baI消化的KSM-AP1378的染色體DNA(圖1)而獲得的DNA作為模板，通過(guò)一種反向PCR方法(Triglia，T.等，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)，16，81(1988))獲得一個(gè)大約0.7kb的擴(kuò)增片段(片段B)。對(duì)片段B測(cè)定其核苷酸序列，其序列揭示該片段含有一段IV區(qū)下游的大約0.6kb區(qū)域的序列。該片段含有一個(gè)ORF的終止密碼子，推測(cè)其歸因于堿性液化α-淀粉酶。實(shí)施例4基于來(lái)自KSM-AP1378菌株的堿性液化α-淀粉酶的N-末端氨基酸序列(7個(gè)氨基酸)(圖3)設(shè)計(jì)并合成一個(gè)引物。利用所得的引物(引物5)聯(lián)合前面所述的引物3(圖3)并以KSM-AP1378的染色體DNA作為模板，進(jìn)行PCR獲得一個(gè)大約0.7kb的片段(片段C，圖1)，然后測(cè)定其核苷酸序列。實(shí)施例5合成一個(gè)含有21個(gè)堿基、在編碼所純化的酶N-末端氨基酸序列的核苷酸序列的下游直接延伸的引物(引物6)。利用引物6和7(圖1和3)并以通過(guò)分子內(nèi)連接HindIII消化的KSM-AP1378染色體DNA所獲的DNA(圖1)為模板，進(jìn)行反向PCR，獲得一個(gè)其中在HindIII位點(diǎn)將一個(gè)上游的0.8kb片段(片段D)和一個(gè)下游的PstI-HindIII 0.4kb片段連接起來(lái)的1.2kb片段。對(duì)片段D區(qū)的核苷酸序列進(jìn)行測(cè)定，揭示了一個(gè)由31個(gè)氨基酸組成的信號(hào)序列MKLHNRIISVLLTLLLAVAVLFPYMTEPAQA(從序列號(hào)2的第1到第31位)、一個(gè)推導(dǎo)的由AAGGAG組成的SD序列(核苷酸127-132；McLaughlin，J.R.等，《生物學(xué)與化學(xué)雜志》，260，7178(1985))和兩種推導(dǎo)的啟動(dòng)子序列(-35序列，TTGAAA；-10序列，TATGGT和-35序列，TTGACT；-10序列，TAAATT)的存在。實(shí)施例6
利用定位于啟動(dòng)子序列上游大約0.1kb處的引物A、定位于中止密碼子下游79b處的引物B并以KSM-AP1378的染色體DNA作為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增在引物間的大約1.8kb的片段。將所獲的擴(kuò)增片段插入pUC19的SmaI位點(diǎn)，然后引入大腸桿菌HB101。轉(zhuǎn)化子可以在含有0.4％的淀粉天青和15ug/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。分離在周圍形成透明暈環(huán)的集落作為產(chǎn)生液化α-淀粉酶的大腸桿菌菌株。從該轉(zhuǎn)化子中制備重組質(zhì)粒，并制備質(zhì)粒的限制性酶切圖譜。在圖譜中，證實(shí)含有一個(gè)在圖1中所示的大約1.8kb的DNA片段(片段E)。這個(gè)重組質(zhì)粒被定名為質(zhì)粒pAML100(圖2)。實(shí)施例7將在實(shí)施例6中獲得的重組大腸桿菌于5ml含有50ug/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。將1ml培養(yǎng)物接種于100ml LB培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素)中，然后在37℃振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。將通過(guò)離心分離收集的細(xì)胞懸于Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，并通過(guò)超聲處理破壞細(xì)胞。細(xì)胞被超聲處理后，通過(guò)離心分離清除細(xì)胞碎片，并將所獲的上清用作一種無(wú)細(xì)胞提取物。作為對(duì)照，以一種相似的方式分別制備HB101(pUC19)菌株的無(wú)細(xì)胞提取物。首先通過(guò)在一含有50mM甘氨酸-NaCl-NaOH緩沖液(pH10)和可溶性淀粉的反應(yīng)混合物中于50℃反應(yīng)15分鐘，然后通過(guò)利用3，5-二硝基水楊酸方法定量測(cè)定所產(chǎn)生的還原糖來(lái)檢測(cè)這些提取物中的α-淀粉酶活性(WO94/26881)。將1個(gè)單位的酶活性定義為每分鐘產(chǎn)生還原糖的量等價(jià)于1μmol葡萄糖的蛋白質(zhì)的量。因而，在菌株HB101(pAML100)的無(wú)細(xì)胞提取物中檢測(cè)α-淀粉酶的活性。發(fā)現(xiàn)α-淀粉酶的最適工作pH落在8到9之間pH范圍中。這個(gè)結(jié)果與由芽孢桿菌sp.KSM-AP1378產(chǎn)生的液化α-淀粉酶的最適pH非常一致(圖4)。對(duì)于酶活性的測(cè)定，利用下面表2中所示的緩沖液(各為40mM)。
表2pH3.5-5.5 醋酸鹽緩沖液pH5.5-8.5 Tris-馬來(lái)酸緩沖液pH8.5-10.5 甘氨酸-NaCl-NaOH緩沖液pH10.5-11.0Na2CO3-NaHCO3緩沖液根據(jù)本發(fā)明，獲得一個(gè)編碼在堿性pH范圍內(nèi)表現(xiàn)最大活性的堿性液化α-淀粉酶的基因和含有這種基因的微生物是可能的。利用它們便于堿性液化α-淀粉酶的大量生產(chǎn)。序列表序列號(hào)1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度516個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列號(hào)1Met Lys Leu His Asn Arg Ile Ile Ser Val Leu Leu Thr Leu Leu Leu1 5 10 15Ala Val Ala Val Leu Phe Pro Tyr Met Thr Glu Pro Ala Gln Ala His20 25 30His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His Leu35 40 45Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala Asn50 55 60Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro AIa Trp Lys65 70 75 80Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp85 90 95Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr100 105 110Arg Ser Gln Leu Gln Gly Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly Ile115 120 125Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Gly130 135 140Thr Glu Met Val Asn Ala Val Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn Gln145 150 155 160Glu Ile Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe165 170 175Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His180 185 190Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys Ile195 200 205Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Ile210 215 220Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp225 230 235 240His Pro Glu Val Ile Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr245 250 255Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile260 265 270Lys Tyr Ser Tyr Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr Thr275 280 285Gly Lys Pro Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Ala290 295 300Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val Phe305 310 315 320Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly Gly325 330 335Tyr Phe Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys His340 345 350Pro lle His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Gly355 360 365Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Ser Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr370 375 380Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly385 390 395 400Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ser MeL Lys Ser Lys405 410 415Ile Asp Pro Leu Leu Gln Ala Arg Gln Thr Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln420 425 430His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly435 440 445Asp Ser Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly450 455 460Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys His Lys Ala Gly Gln465 470 475 480Val Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile Asn485 490 495Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Thr Val Asn Gly Gly Ala Val Ser Val500 505 510Trp Val Lys Gln516序列號(hào)2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1776個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)成鏈類型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物體芽孢桿菌屬(B)菌株KSM-AP1378(xi)序列描述序列號(hào)2ATATAAATTT GAAATGAACA CCTATGAAAA TATGGTAGCG ATTGCGCGAC GAGAAAAAAC 60TTGGGAGTTA GGAAGTGATA TTAAAGGATT TTTTTTGACT TGTTGTGAAA ACGCTTGCAT 120AAATTGAAGG AGAGGGTGCT TTTT ATG AAA CTT CAT AAC CGT ATA ATT AGC GTA174Met Lys Leu His Asn Arg Ile Ile Ser Val1 5 10CTA TTA ACA-CTA TTG TTA GCT GTA GCT GTT TTG TTT CCA TAT ATG ACG 222Leu Leu Thr Leu Leu Leu Ala Val Ala Val Leu Phe Pro Tyr Met Thr15 20 25GAA CCA GCA CAA GCC CAT CAT AAT GGG ACG AAT GGG ACC ATG ATG CAG 270Glu Pro Ala Gln Ala His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln30 35 40TAT TTT GAA TGG CAT TTG CCA AAT GAC GGG AAC CAC TGG AAC AGG TTA 318Tyr Phe Glu Trp His Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu45 50 55CGA GAT GAC GCA GCT AAC TTA AAG AGT AAA GGG ATT ACC GCT GTT TGG 366Arg Asp Asp Ala Ala Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp60 65 70ATT CCT CCT GCA TGG AAG GGG ACT TCG CAA AAT GAT GTT GGG TAT GGT 414Ile Pro Pro Ala Trp Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly75 80 85 90GCC TAT GAT TTG TAC GAT CTT GGT GAG TTT AAC CAA AAG GGA ACC GTC 462Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val95 100 105CGT ACA AAA TAT GGC ACA AGG AGT CAG TTG CAA GGT GCC GTG ACA TCT 510Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Arg Ser Gln Leu Gln Gly Ala Val Thr Ser110 115 120TTG AAA AAT AAC GGG ATT CAA GTT TAT GGG GAT GTC GTG ATG AAT CAT 558Leu Lys Asn Asn Gly Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His125 130 135AAA GGT GGA GCA GAC GGG ACA GAG ATG GTA AAT GCG GTG GAA GTG AAC 606Lys Gly Gly Ala Asp Gly Thr Glu Met Val Asn Ala Val Glu Val Asn140 145 150CGA AGC AAC CGA AAC CAA GAA ATA TCA GGT GAA TAC ACC ATT GAA GCA 654Arg Ser Asn Arg Asn Gln Glu Ile Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala155 160 165 170TGG ACG AAA TTT GAT TTC CCT GGA AGA GGA AAT ACC CAT TCC AAC TTT 702Trp Thr Lys Phe Asp Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe175 180 185AAA TGG CGC TGG TAT CAT TTT GAT GGG ACA GAT TGG GAT CAG TCA CGT 750Lys Trp Arg Trp Tyr His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg190 195 200CAG CTT CAG AAC AAA ATA TAT AAA TTC AGA GGT ACC GGA AAG GCA TGG 798Gln Leu Gln Asn Lys Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp205 210 215GAC TGG GAA GTA GAT ATA GAG AAC GGC AAC TAT GAT TAC CTT ATG TAT 846Asp Trp Glu Val Asp Ile Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr220 225 230GCA GAC ATT GAT ATG GAT CAT CCA GAA GTA ATC AAT GAA CTT AGA AAT 894Ala Asp Ile Asp Met Asp His Pro Glu Val Ile Asn Glu Leu Arg Asn235 240 245 250TGG GGA GTT TGG TAT ACA AAT ACA CTT AAT CTA GAT GGA TTT AGA ATC 942Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile255 260 265GAT GCT GTG AAA CAT ATT AAA TAC AGC TAT ACG AGA GAT TGG CTA ACA 990Asp Ala Val Lys His Ile Lys Tyr Ser Tyr Thr Arg Asp Trp Leu Thr270 275 280CAT GTG CGT AAC ACC ACA GGT AAA CCA ATG TTT GCA GTT GCA GAA TTT 1038His Val Arg Asn Thr Thr Gly Lys Pro Met Phe Ala Val Ala Glu Phe285 290 295TGG AAA AAT GAC CTT GCT GCA ATC GAA AAC TAT TTA AAT AAA ACA AGT 1086Trp Lys Asn Asp Leu Ala Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser300 305 310TGG AAT CAC TCC GTG TTC GAT GTT CCT CTT CAT TAT AAT TTG TAC AAT 1134Trp Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn315 320 325 330GCA TCT AAT AGT GGT GGC TAT TTT GAT ATG AGA AAT ATT TTA AAT GGT 1182Ala Ser Asn Ser Gly Gly Tyr Phe Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly335 340 345TCT GTC GTA CAA AAA CAC CCT ATA CAT GCA GTC ACA TTT GTT GAT AAC 1230Ser Val Val Gln Lys His Pro Ile His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn350 355 360CAT GAC TCT CAG CCA GGA GAA GCA TTG GAA TCC TTT GTT CAA TCG TGG 1278His Asp Ser Gln Pro Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Ser Trp365 370 375TTC AAA CCA CTG GCA TAT GCA TTG ATT CTG ACA AGG GAG CAA GGT TAC 1326Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr380 385 390CCT TCC GTA TTT TAC GGT GAT TAC TAC GGT ATA CCA ACT CAT GGT GTT 1374Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val395 400 405 410CCT TCG ATG AAA TCT AAA ATT GAT CCA CTT CTG CAG GCA CGT CAA ACG 1422Pro Ser Met Lys Ser Lys Ile Asp Pro Leu Leu Gln Ala Arg Gln Thr
415 420 425TAT GCC TAC GGA ACC CAA CAT GAT TAT TTT GAT CAT CAT GAT ATT ATC 1470Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Ile430 435 440GGC TGG ACG AGA GAA GGG GAC AGC TCC CAC CCA AAT TCA GGA CTT GCA 1518Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala445 450 455ACT ATT ATG TCC GAT GGG CCA GGG GGT AAT AAA TGG ATG TAT GTC GGG 1566Thr Ile Met Ser Asp Gly Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly460 465 470AAA CAT AAA GCT GGC CAA GTA TGG AGA GAT ATC ACC GGA AAT AGG TCT 1614Lys His Lys Ala Gly Gln Val Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser475 480 485 490GGT ACC GTC ACC ATT AAT GCA GAT GGT TGG GGG AAT TTC ACT GTA AAC 1662Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Thr Val Asn495 500 505GGA GGG GCA GTT TCG GTT TGG GTG AAG CAA TAAATAAGGA ACAAGAGGCG 1712Gly Gly Ala Val Ser Val Trp Val Lys Gln510 515AAAATTACTT TCCTACATGC AGAGCTTTCC GATCACTCAT ACACCCAATA TAAATTGGAA 1772GCTT177權(quán)利要求
1.一種編碼堿性液化α-淀粉酶活性的DNA分子。
2.一種在權(quán)利要求1中所定義的DNA分子，它編碼在序列號(hào)1中所描述的氨基酸序列或其功能片段。
3.一種DNA分子，它編碼一種表現(xiàn)堿性液化α-淀粉酶活性的蛋白質(zhì)并具有一個(gè)在序列號(hào)1中所描述的其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、增加、缺失、倒位或插入的氨基酸序列。
4.一種在權(quán)利要求1到3中的任何一項(xiàng)中所定義的DNA分子，進(jìn)一步包括一個(gè)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的核苷酸序列。
5.一種重組DNA，它含有權(quán)利要求1到4中任何一項(xiàng)的DNA分子。
6.一種含有權(quán)利要求5的重組DNA的轉(zhuǎn)化的微生物。
7.一種用于生產(chǎn)堿性液化α-淀粉酶的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)化的微生物和分離由該微生物產(chǎn)生的堿性液化α-淀粉酶。
8.一種DNA分子，它與同序列號(hào)2的核酸序列互補(bǔ)的一種DNA序列雜交。
9.一種由權(quán)利要求9的DNA分子編碼的蛋白質(zhì)。
10.一種DNA分子，它與同序列號(hào)2中的核酸序列互補(bǔ)的一種DNA序列雜交，其中所說(shuō)的DNA分子編碼一種具有堿性液化α-淀粉酶活性的蛋白質(zhì)。
11.一種由權(quán)利要求11的DNA分子編碼的蛋白質(zhì)。
12.重組DNA質(zhì)粒pAML100。
13.重組大腸桿菌菌株HB101(pAML100)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種編碼堿性液化α－淀粉酶的DNA片段、包括該DNA片段的重組DNA、含有該重組DNA的轉(zhuǎn)化的微生物和一種利用轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)堿性液化α－淀粉酶的方法。本發(fā)明的方法能夠大規(guī)模生產(chǎn)作為一種洗滌劑的成分有用的堿性液化α－淀粉酶。
文檔編號(hào)C12N15/56GK1187853SQ96194754
公開(kāi)日1998年7月15日 申請(qǐng)日期1996年6月14日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月14日
發(fā)明者秦田勇二, 尾崎克也, 荒勝俊, 川合修次, 伊藤進(jìn) 申請(qǐng)人:花王株式會(huì)社