專利名稱：轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具體涉及基于VP22的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、VP22的同源物或其片段，還涉及包括轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分子和組合物，并涉及高效遞送這類蛋白質(zhì)和任何結(jié)合的分子至靶細(xì)胞群的方法。
1型單純皰疹病毒(HSV-1)UL49基因的產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)蛋白VP22(4)，是HSV殼的主要成分，處于病毒殼體外和包膜內(nèi)的毒粒的區(qū)室，由至少10個(gè)或更多個(gè)病毒多肽構(gòu)成(參見綜述(6))。VP22的分子量為32k，具有較強(qiáng)的堿性，并通過感染細(xì)胞內(nèi)的磷酸化和核苷酸化(1、4、8、9、11)而被修飾。
盡管和已被完全鑒定的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白VP16一起是毒粒內(nèi)主要?dú)さ鞍字唬珜?duì)于VP22在病毒復(fù)制循環(huán)中的作用知道得很少。尚不知它是否是必需的病毒蛋白，但在類似于VP16的方式中，VP22有可能在感染期間起兩個(gè)作用一首先在病毒基因表達(dá)中作為功能蛋白，其次在病毒裝配中作為毒粒的結(jié)構(gòu)成分。至于前者，一些跡象表明VP22能與HSV-1 DNA專一性地結(jié)合(2、8、10)。
我們最近闡述了VP16和VP22之間存在穩(wěn)定的和專一性的相互作用，它與裝配和轉(zhuǎn)錄激活中VP16的作用機(jī)制有聯(lián)系。在那些研究中，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)VP22自身在細(xì)胞中時(shí)，它具有獨(dú)特的行為模式。在本文所述的工作中，我們擴(kuò)展了這些研究以詳細(xì)探討細(xì)胞的定位作用，業(yè)已發(fā)現(xiàn)VP22表現(xiàn)出極為獨(dú)特的性能，因?yàn)樗鼜淖畛醣磉_(dá)它、而且它在其中表現(xiàn)胞質(zhì)定位作用的細(xì)胞有效地轉(zhuǎn)運(yùn)至單細(xì)胞層內(nèi)的毗鄰細(xì)胞，它在毗鄰細(xì)胞中被攝取入細(xì)胞核。我們?cè)囼?yàn)過的一些蛋白質(zhì)中的其它任何蛋白質(zhì)例如VP16均未觀測(cè)到這種行為模式；而且據(jù)我們所知，這些性能和活性是前所未有的。
當(dāng)將VP22或VP16引入單細(xì)胞層大約30小時(shí)之后觀測(cè)到VP22的這種意外的性能，雖然平均而言可在約2-5％的細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到VP16(是這種試驗(yàn)中常見的)，但VP22幾乎可在單細(xì)胞層的每個(gè)細(xì)胞中被檢測(cè)到。我們還發(fā)現(xiàn)VP22胞間轉(zhuǎn)運(yùn)的專一性，并業(yè)已證實(shí)了在該蛋白質(zhì)的C端含有決定子。這是由于，缺失C端34個(gè)氨基酸的變體雖然在初始表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的胞質(zhì)定位中被表達(dá)，但未被轉(zhuǎn)運(yùn)至毗鄰的細(xì)胞。
蛋白質(zhì)分泌或外排通常是通過專一途徑發(fā)生的，要求已被完全鑒定的信號(hào)序列，分選入輸出途徑中包括的區(qū)室和小泡，可參見綜述(12)。VP22沒有慣常的任意信號(hào)序列，而且它的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑和機(jī)制相當(dāng)獨(dú)特，從未被鑒定過。對(duì)于VP22中需要的決定子和細(xì)胞內(nèi)生理需要的進(jìn)一步研究應(yīng)有助于闡明所涉及的途徑。因此，VP22或者更具體地指VP22轉(zhuǎn)運(yùn)中涉及的決定子，可被轉(zhuǎn)移到其它蛋白質(zhì)，以能在靶細(xì)胞群內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和有效表達(dá)或攝取。可容易地設(shè)想該性質(zhì)的廣泛效用和應(yīng)用。
因此，本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)，即有可能將編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸引入靶細(xì)胞群的第一部分，和任選地用編碼與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)(例如融合配偶體)的核酸，來表達(dá)核酸，任選地從組織專一性啟動(dòng)子產(chǎn)生蛋白質(zhì)；然后該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白連同相關(guān)任意蛋白質(zhì)從細(xì)胞中輸出，而被不直接產(chǎn)生蛋白質(zhì)的靶細(xì)胞群的第二部分?jǐn)z取。通常發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)被靶細(xì)胞群的第二部分高效地?cái)z取，并傾向于定位在靶細(xì)胞群的第二部分的核內(nèi)。于是，將初始引入作用和后續(xù)的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合可使轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和任何相關(guān)蛋白質(zhì)被高效遞送至靶細(xì)胞群。
因此，本發(fā)明的一方面在于提供這種蛋白質(zhì)它可從表達(dá)它的細(xì)胞內(nèi)輸出，并能被其它細(xì)胞例如不直接產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的細(xì)胞攝取。該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白優(yōu)選與需要遞送至靶細(xì)胞群的一種或多種其它蛋白質(zhì)結(jié)合。
進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)VP22作為提取物被加入胞外介質(zhì)時(shí)它就被輸入細(xì)胞。這說明，要發(fā)生觀測(cè)到的胞間轉(zhuǎn)運(yùn)，無需在至少部分細(xì)胞群中表達(dá)VP22。
在另一方面，VP22轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白例如可通過共價(jià)鍵與相關(guān)分子偶聯(lián)，或與相關(guān)分子結(jié)合，并以該形式應(yīng)用；這與應(yīng)用表達(dá)載體產(chǎn)生蛋白質(zhì)和/或相關(guān)分子恰好相反。具體地說，這可使非肽基分子如核酸、藥物或標(biāo)志物(蛋白質(zhì)除外或作為蛋白質(zhì)的替代物)與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合并被細(xì)胞群攝取，而無需在至少部分細(xì)胞群內(nèi)表達(dá)VP22及相關(guān)分子，其中需要將VP22和/或相關(guān)分子遞送至這些細(xì)胞群。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供如下轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ⅰ)VP22或其活性部分；(ⅱ)VP22的片段或同源物，包括提供轉(zhuǎn)運(yùn)性能的一種或多種決定子；或者，(ⅲ)得自VP22的C端34個(gè)氨基酸的片段；該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白任選與需要轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞群的一個(gè)或多個(gè)其它分子結(jié)合。
在本發(fā)明中，“活性部分”表示比全長(zhǎng)VP22短的肽，但它保留被產(chǎn)生它的細(xì)胞分泌和被其它分子攝取的性能。
本發(fā)明的進(jìn)一步方面是提供包括一種或多種上述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的組合物，該蛋白質(zhì)任選與需要遞送至細(xì)胞群的一個(gè)或多個(gè)分子結(jié)合。
本發(fā)明的又一方面在于提供將所需分子轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞群的方法，是通過將細(xì)胞暴露于所需分子和上述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而實(shí)施的。
因此在該方面，本發(fā)明提供的方法避免初始需要用編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和任選所需分子的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞群。這樣，也可以轉(zhuǎn)運(yùn)非肽基、不能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的分子，因?yàn)榭蓪⑺璺肿雍娃D(zhuǎn)運(yùn)蛋白加入細(xì)胞周圍的介質(zhì)中。
在一些實(shí)施方案中，可使所需分子與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白共價(jià)偶聯(lián)，并將這些實(shí)體暴露于靶細(xì)胞群。也可將所需分子與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白非共價(jià)鍵結(jié)合，例如利用脂質(zhì)基載體摻合如核酸的所需分子和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
因此在另一方面，本發(fā)明提供制備含有待轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞群的所需分子的組合物的方法，該方法包括共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵地結(jié)合所需分子與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
本發(fā)明的進(jìn)一步方面在于，提供編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和(任選)相關(guān)分子的核酸。例如，在其中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為融合構(gòu)建物表達(dá)的實(shí)施方案中，提供的核酸編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其融合配偶體。
本發(fā)明的進(jìn)一步方面在于提供這種表達(dá)載體它結(jié)合編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其活性部分或其片段的核酸，和任選的編碼相關(guān)分子的核酸。
本發(fā)明的進(jìn)一步方面在于提供用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的進(jìn)一步方面在于提供轉(zhuǎn)運(yùn)所需蛋白質(zhì)或肽至靶細(xì)胞群的方法，該方法包括(ⅰ)用編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸并任選地用編碼與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)染、感染或其它方式引入靶細(xì)胞群的第一部分；(ⅱ)表達(dá)該核酸而產(chǎn)生蛋白質(zhì)，隨后從細(xì)胞輸出該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，連同與之結(jié)合的其它任何蛋白質(zhì)，由不直接產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的靶細(xì)胞群的第二部分?jǐn)z取。
應(yīng)懂得，可通過用重組病毒感染而實(shí)現(xiàn)靶細(xì)胞群第一部分的轉(zhuǎn)染。
本發(fā)明的進(jìn)一步方面在于提供將所需分子轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞群的方法，該方法包括(ⅰ)將所需分子與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白偶聯(lián)形成復(fù)合體；和(ⅱ)使細(xì)胞暴露于復(fù)合體中使細(xì)胞攝取該復(fù)合體。
在該方法中，將可以是非肽基的所需分子例如通過共價(jià)作用或摻合作用與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合。
本發(fā)明的進(jìn)一步方面在于提供上述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和載體以用于轉(zhuǎn)運(yùn)分子的方法中。其中的方法指研究方法和治療方法。本發(fā)明特別適用于引導(dǎo)試劑至需要高效導(dǎo)向的細(xì)胞群的方法中，例如在基因治療方法中；癌的治療，例如可通過遞送腫瘤抑制劑至細(xì)胞。對(duì)圖的簡(jiǎn)要描述

圖1示出表達(dá)VP22的COS-1細(xì)胞的免疫熒光。用VP22表達(dá)載體轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)于蓋玻片上的COS-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染40小時(shí)后，細(xì)胞于室溫下100％甲醇中被固定15分鐘，并與抗VP22單克隆抗體P43培養(yǎng)，接著與FITC-綴合次級(jí)抗體培養(yǎng)。然后用共焦顯微鏡檢術(shù)(confocal microscopy)分析這些細(xì)胞。(a)VP22表達(dá)細(xì)胞顯示的典型核定位。(b)存在于約5-10％表達(dá)細(xì)胞中VP22表達(dá)的胞質(zhì)模式。(c)當(dāng)表達(dá)量增加時(shí)觀測(cè)到的VP22定位模式。(d)VP22表達(dá)導(dǎo)致蛋白質(zhì)被定位于單細(xì)胞層內(nèi)每個(gè)細(xì)胞中。
圖2示出VP22在Vero細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)。按對(duì)圖1那樣進(jìn)行轉(zhuǎn)染和檢測(cè)，只是該實(shí)驗(yàn)是在Vero細(xì)胞中進(jìn)行的。該畫面示出處于中心細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)VP22的焦點(diǎn)和在周圍細(xì)胞中(它被定位于細(xì)胞核內(nèi))呈密度梯度。
圖3示出VP22表達(dá)的轉(zhuǎn)染時(shí)間過程，表明VP22在細(xì)胞之間被轉(zhuǎn)運(yùn)。COS-1細(xì)胞被轉(zhuǎn)染并在轉(zhuǎn)染后14、20、26和38小時(shí)被固定。示出的共焦圖像表示在20hr時(shí)間點(diǎn)時(shí)放大20倍(a欄)和38hr時(shí)放大100倍(b欄)。
圖4示出VP22的蛋白質(zhì)編碼序列，它是HSV-1 UL49基因的產(chǎn)物，該顯示△267突變體的截?cái)帱c(diǎn)；圖5(a)和(b)示出當(dāng)含全長(zhǎng)VP22和△267 VP22的提取物被加入胞外介質(zhì)后進(jìn)行的免疫熒光分析結(jié)果；和圖5(c)示出全長(zhǎng)VP22和△267 VP22細(xì)胞提取物的蛋白質(zhì)印跡；圖6示出應(yīng)用于介質(zhì)時(shí)VP22或其修飾物的輸入。
圖7a示出用β-gal的抗體染色后一個(gè)顯微注射細(xì)胞的視野的典型圖。
圖7b示出細(xì)胞的相同視野，其中VP22不但可見于顯微注射的細(xì)胞中，而且可見于周圍許多細(xì)胞中。
圖8a示出由T-抗原陽性COS細(xì)胞標(biāo)記的混合細(xì)胞的典型視野。T-抗原抗體未檢測(cè)到周圍的BHK細(xì)胞；圖8b示出VP22陽性細(xì)胞，即見到中央COS細(xì)胞加上周圍的非轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞；圖9a示出將表達(dá)全長(zhǎng)VP22的COS-1細(xì)胞對(duì)于VP22和DNA進(jìn)行染色，并分析有絲分裂不同階段的細(xì)胞。為染色DNA，將碘化丙錠(propidium iodide)加到甘油固定物上，最終濃度為3μg/ml。示出代表前期、前中期和后期的細(xì)胞。
圖9b示出與末端標(biāo)記的40bp寡核苷酸(T24)一起培養(yǎng)的增加量的GST和GST-VP22融合蛋白；采用凝膠移位分析法分析所得復(fù)合體。將VP22專一性復(fù)合體標(biāo)記為1～3；和圖10示出用HSV-1[gH-ve]感染的Vero細(xì)胞。a表示對(duì)β-半乳糖苷酶染色而感染24小時(shí)后的視野。b示出對(duì)VP22染色后的相同視野。c示出對(duì)β-半乳糖苷酶染色而感染66小時(shí)后的視野。d示出對(duì)VP22染色后的相同視野。
原料和方法細(xì)胞和病毒。
HeLa(人上皮癌細(xì)胞)，COS-1細(xì)胞(由SV40 T-抗原轉(zhuǎn)化的猴腎成纖維細(xì)胞)，Vero細(xì)胞(猴腎成纖維細(xì)胞)和BHK(幼倉鼠細(xì)胞)均生長(zhǎng)于含10％新生小牛血清的Dulbecco改進(jìn)的極限必需介質(zhì)中。
質(zhì)粒。
受hCMV IE啟動(dòng)子控制的真核表達(dá)載體pGE 109含VP22開放讀框，以前曾被描述過(4)。簡(jiǎn)言之，該表達(dá)構(gòu)建物是這樣制備的利用聚合酶鏈反應(yīng)，以含BgⅢ或BamHⅠ限制酶切位點(diǎn)的接頭擴(kuò)增VP22開放讀框，以便于后續(xù)在hCMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)控制下引入載體。
抗體。
這些實(shí)驗(yàn)用到抗VP16單克隆抗體LP1和抗VP22單克隆抗體p43。p43抗體是通過單純皰疹病毒的毒粒蛋白制劑對(duì)小鼠免疫接種而產(chǎn)生的。對(duì)VP22有反應(yīng)活性的多克隆抗體(AGV30)是通過用由與VP22開放讀框連接的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶構(gòu)成的融合蛋白對(duì)兔子免疫接種而產(chǎn)生的。該融合蛋白是這樣生成的通過得自pGE109的BglⅡ-BamHⅠ片段符合讀框插入可商購的(Pharmacia)細(xì)菌表達(dá)載體pGEX2T的BamHⅠ位點(diǎn)而產(chǎn)生載體pGST-VP22。往對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物中加入IPTG(0.1mM)而引入含pGST-VP22的大腸桿菌(E.coli)株HB101，再過3小時(shí)后收集細(xì)胞。沉淀后，使細(xì)胞重懸浮于含0.5％NP-40的磷酸鹽緩沖鹽水，用Branson Ultra-sonic細(xì)胞勻漿器進(jìn)行超聲處理，接著于4℃下在12000rpm時(shí)離心凈化20分鐘。然后通過在谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠(Pharmacia)上親和層析，在PBS 0.5％NP40中洗滌未結(jié)合的蛋白質(zhì)，再用含5mM谷胱甘肽的10mM Tris-Hcl緩沖液(pH8.0)洗脫來純化GST-VP22融合蛋白。對(duì)3只兔子中的每只每隔4周注射一次(每次約50μg)該融合蛋白的佐劑溶液，并于總計(jì)17周后采集血清。
SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡。
通過用雙丙烯酰胺交聯(lián)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。干燥含放射性標(biāo)記的樣品的凝膠并暴露于X光片。用于蛋白質(zhì)印跡分析的凝膠被轉(zhuǎn)至硝酸纖維素濾器與合適的抗體反應(yīng)。應(yīng)用辣根過氧化物酶連接的次級(jí)偶聯(lián)物，以3,3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸二水合物(DAB)或以增強(qiáng)的化學(xué)熒光顯影可見到活性帶。
轉(zhuǎn)染和免疫熒光。
轉(zhuǎn)染前那天將細(xì)胞置于6孔盤(6×35mm)，每孔配有一個(gè)蓋玻片，密度為每孔2×105個(gè)細(xì)胞。用pUC19 DNA將500ng表達(dá)質(zhì)粒配成2μg而進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)染，利用磷酸鈣沉淀法，其中以BES[N,N-二(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸]緩中鹽水代替以前描述的HEPES緩沖鹽水作出修改(3,5)。轉(zhuǎn)染40小時(shí)后于室溫下在100％甲醇中固定細(xì)胞達(dá)15分鐘，然后用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌。轉(zhuǎn)染時(shí)，將蓋玻片上的細(xì)胞在室溫下與PBS/10％小牛血清培養(yǎng)15分鐘而封阻細(xì)胞。往此同一溶液(p43在1∶100的稀釋度下)中加入初級(jí)抗體并于室溫下培養(yǎng)20分鐘。用PBS充分洗滌后，將次級(jí)抗體(FITC偶聯(lián)的抗小鼠IgM和/或Texas Red(德克薩斯紅)偶聯(lián)的抗兔IgG)加入PBS/10％小牛血清并培養(yǎng)10分鐘。再用PBS充分洗滌，然后使蓋玻片在甘油中固定，應(yīng)用Biorad MRC600共焦顯微鏡在雙通道中檢驗(yàn)。利用普通光學(xué)顯微鏡拍下相差照片。
結(jié)果VP22定位于兩個(gè)不同的模式中。
是這樣研究VP22的細(xì)胞定位的先應(yīng)用抗VP22單克隆P43進(jìn)行VP22表達(dá)細(xì)胞的免疫熒光分析，接著通過共焦顯微鏡檢術(shù)分析。依上述方法轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，然后使細(xì)胞在甲醇中固定30～40小時(shí)并加工處理以檢測(cè)VP22。初始結(jié)果表明，在大部分含VP22的細(xì)胞中，蛋白質(zhì)存在于獨(dú)特的核模式中，往往表現(xiàn)出在核邊緣富集。圖1a表示VP22的核模式的典型實(shí)例。但在一些細(xì)胞中，VP22呈完全不同的胞質(zhì)的纖維狀模式(圖1b)。此時(shí)，檢測(cè)到的蛋白質(zhì)在胞質(zhì)內(nèi)呈網(wǎng)絡(luò)狀或籠形模式并被排除在細(xì)胞核外。這種分布不均一性雖然其自身并非異常，但對(duì)于本研究的其它HSV殼蛋白(VP16)未觀察到該不均一性，它呈現(xiàn)的模式因細(xì)胞不同而略有不同，主要包括擴(kuò)散胞質(zhì)模式，少量存在于細(xì)胞核內(nèi)。
進(jìn)一步研究表明，VP22的胞質(zhì)分布與核分布相互間不是無規(guī)的，即含胞質(zhì)VP22的中心細(xì)胞周圍被含核VP22的細(xì)胞暈圈環(huán)繞，后者細(xì)胞區(qū)中明顯地富含該蛋白質(zhì)，這些細(xì)胞毗鄰含胞質(zhì)VP22的中心細(xì)胞(圖1c)。最后，單細(xì)胞層區(qū)(其中每個(gè)細(xì)胞中可檢測(cè)到VP22)也呈現(xiàn)這種分布，在少量細(xì)胞中觀察到胞質(zhì)模式，在周圍細(xì)胞中觀察到核模式(圖1d)。
最初是在COS細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)的，它依靠SV40T-抗原復(fù)制本文所用的VP22表達(dá)質(zhì)粒。盡管我們對(duì)于相同載體表達(dá)的其它蛋白質(zhì)(例如前述VP16)未檢測(cè)到這種分布，但我們希望排除這種可能性即VP22分布模式與COS細(xì)胞的應(yīng)用有關(guān)。于是用Vero細(xì)胞和HeLa細(xì)胞進(jìn)行了同樣實(shí)驗(yàn)，并得出完全相同的結(jié)果。圖2示出VP22在Vero細(xì)胞中的表達(dá)呈上述模式，其中含胞質(zhì)VP22的中心細(xì)胞周圍被含核VP22的細(xì)胞環(huán)繞。此時(shí)，可見VP22呈遞降的密度梯度，從中心細(xì)胞至毗鄰細(xì)胞具有稠密的核VP22，而相距更遠(yuǎn)的細(xì)胞核VP22密度更小。
這些意外結(jié)果指出，VP22從最初在其中合成并呈胞質(zhì)形式的細(xì)胞中被轉(zhuǎn)運(yùn)至毗鄰細(xì)胞，也被轉(zhuǎn)運(yùn)至再一次轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，其中它定位于細(xì)胞核。為了闡述VP22在細(xì)胞間的移動(dòng)，研究了轉(zhuǎn)染的時(shí)間過程。轉(zhuǎn)染14小時(shí)后，可以在各個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)到VP22表達(dá)。在20小時(shí)，可見到含VP22的細(xì)胞灶，其中含稠密的VP22的中心細(xì)胞周圍環(huán)繞數(shù)個(gè)含更低密度的VP22的細(xì)胞(圖3a，較低的放大倍數(shù)以利于看清點(diǎn)的分布)，而38小時(shí)后實(shí)際上每個(gè)細(xì)胞中都含該蛋白質(zhì)(圖3b)。
作為VP22在細(xì)胞間被轉(zhuǎn)運(yùn)的另一個(gè)證據(jù)，用VP22表達(dá)載體，和pRG50(一種VP16表達(dá)載體)轉(zhuǎn)染獨(dú)立的兩皿COS-1細(xì)胞。24小時(shí)后，每皿細(xì)胞用胰蛋白酶消化，再將兩組細(xì)胞群混合后固定于蓋玻片上。24小時(shí)后，可能檢測(cè)VP16表達(dá)細(xì)胞，其細(xì)胞核內(nèi)也含有VP22，這表明從未暴露于VP22表達(dá)載體的細(xì)胞已攝取VP22蛋白。
胞間轉(zhuǎn)運(yùn)需要VP22內(nèi)的C端決定子。
為開始鑒定VP22內(nèi)的需要，我們測(cè)試了含短鏈(3-4個(gè)氨基酸)的符合讀框的插入物的一組變體和缺殘基267至該蛋白末端(殘基301)的缺失突變體。插入突變體在位置60、159、192和267上含插入物。在插入突變體Ins60、Ins159或Ins267中，任何一個(gè)都不影響VP22定位的模式或者其進(jìn)行胞間轉(zhuǎn)運(yùn)的能力(數(shù)據(jù)未顯示，均與野生型相同)。然而在位置192上的插入具有顯著影響。該突變體表現(xiàn)的分布模式類似于從野生型見到的胞質(zhì)分布；于是，未觀測(cè)到毗鄰細(xì)胞中的核染色，總體觀測(cè)到更少的陽性細(xì)胞，而且在VP22陽性細(xì)胞中模式全是胞質(zhì)的(圖3c)。
對(duì)于缺乏C端34個(gè)殘基267-301的缺失突變體觀測(cè)到完全相同的表型(圖3d)。應(yīng)注意在位置267上的插入突變體是正常的。分布模式顯示全為胞質(zhì)VP22和267-301缺失突變體和插入突變體192沒有轉(zhuǎn)運(yùn)至周圍細(xì)胞，這并非由于無效合成。當(dāng)用蛋白質(zhì)印跡比較總的合成時(shí)，觀測(cè)到相似量的w/t和突變型蛋白質(zhì)。
為開始提出這種可能性，即胞間轉(zhuǎn)運(yùn)性能可用于轉(zhuǎn)運(yùn)其它肽或蛋白質(zhì)，我們測(cè)試了VP22的一種變體(VP22ep)是否也能被轉(zhuǎn)運(yùn)，該變體在其C端末端含12個(gè)殘基延伸(它含有單克隆抗體識(shí)別位點(diǎn))。結(jié)果表明，該延伸蛋白被有效地轉(zhuǎn)運(yùn)。事實(shí)上，闡述Vero細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)的圖3b用到該C端延伸變體。如上所述，含中心胞質(zhì)VP22ep的細(xì)胞灶周圍環(huán)繞含核VP22ep的細(xì)胞，而且，至于w/t蛋白質(zhì)，其實(shí)可在單細(xì)胞層的每個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)到VP22的表達(dá)。此外，被檢測(cè)到的蛋白質(zhì)就是融合蛋白，而不是某些偶然的缺失產(chǎn)物，因?yàn)樗捎每筕P22抗體p43或C端肽延伸的抗體檢測(cè)。這一重要結(jié)果表明，確實(shí)可以通過將肽或蛋白質(zhì)與合適的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如VP22連接而促使它們遞送至細(xì)胞。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以慣常地應(yīng)用這些或者其它定點(diǎn)誘變方法來定位或精修對(duì)于轉(zhuǎn)運(yùn)性能至關(guān)重要和/或重要的VP22中決定子，因而能夠應(yīng)用VP22片段而不是全長(zhǎng)蛋白質(zhì)。
從介質(zhì)攝取VP22。
雖然在細(xì)胞表面易于檢測(cè)VP22，但我們還不能檢測(cè)已轉(zhuǎn)染細(xì)胞的介質(zhì)中的VP22。然而為檢驗(yàn)VP22被從胞外介質(zhì)輸入的能力，將從VP22表達(dá)細(xì)胞制備的可溶性提取物加入未轉(zhuǎn)染細(xì)胞介質(zhì)。VP22被高效和迅速地輸入并定位于細(xì)胞核(見圖5(a))，加入介質(zhì)后5分鐘內(nèi)被攝取(可解釋我們未能在介質(zhì)中檢測(cè)它)。攝取機(jī)理不受4℃下培養(yǎng)作用的影響，說明不是通過正常的胞吞作用內(nèi)在化。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于所試驗(yàn)的其它任何蛋白質(zhì)均未觀測(cè)到從介質(zhì)攝取。
將含全長(zhǎng)(WT)或者截短(△267)VP22的可溶性提取物加入覆蓋蓋玻片上生長(zhǎng)的COS-1細(xì)胞的介質(zhì)，1小時(shí)后固定細(xì)胞。還通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡法分析等量的提取物。
為制備可溶性提取物，用全長(zhǎng)或△267 VP22表達(dá)載體轉(zhuǎn)染一百萬個(gè)COS-1細(xì)胞，16小時(shí)后收集細(xì)胞，將提取物調(diào)和于10mMHEPES(pH7.9)、400mM NaCl、0.1mM EDTA、0.5mM DTT和5％甘油中。然后將一半提取物加入覆蓋生長(zhǎng)于蓋玻片上5×105個(gè)COS-1細(xì)胞的介質(zhì)，1小時(shí)后固定細(xì)胞，利用多克隆抗VP22抗體進(jìn)行免疫熒光分析(見圖5(a)和5(b))。分析1/10的所述提取物是在10％丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，接著用單克隆抗體P43進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析(見圖5(c))。
此外，雖然在可溶性提取物中存在與全長(zhǎng)VP22等量的VP22缺失突變體△267(見圖5(c)，△267)，但在細(xì)胞間未檢測(cè)出，表明該過程需要C端34個(gè)殘基(圖5(b))。
為了進(jìn)一步研究，我們制備了相應(yīng)于該C端34個(gè)殘基的肽并續(xù)上一個(gè)12個(gè)殘基的標(biāo)記以便于免疫檢測(cè)。將此肽應(yīng)用于細(xì)胞介質(zhì)后，它可進(jìn)入細(xì)胞并被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核(圖6b)。這些實(shí)驗(yàn)表明，這些C端34個(gè)殘基是a)所需的和b)足以引起轉(zhuǎn)運(yùn)。
轉(zhuǎn)運(yùn)融合蛋白雖然如上所述，我們已闡明可將肽融合至VP22而轉(zhuǎn)運(yùn)，但尚不知道多大的蛋白質(zhì)可與VP22融合以便利轉(zhuǎn)運(yùn)。
用質(zhì)粒pGE109、△267或VP22-GFP轉(zhuǎn)染6mm皿中的COS-1細(xì)胞，VP22-GFP的構(gòu)建是將UL49開放讀框插入質(zhì)粒pGFP-N1(Clontech)的BamH1位點(diǎn)，得到VP22與綠熒光蛋白(GFP)的N端的融合體。轉(zhuǎn)染40小時(shí)后收集細(xì)胞，制備高含鹽量提取物。這些提取物的蛋白質(zhì)印跡表明，雖然提取物中存在等量的全長(zhǎng)VP22和VP22的△267變體，但22-GFP蛋白質(zhì)的含量約小5倍。將等量的各提取物加入覆蓋蓋玻片上COS-1細(xì)胞的介質(zhì)，放置1小時(shí)，然后在100％甲醇中固定。用AGV30進(jìn)行免疫熒光分析。結(jié)果示出(圖6a)，可在受體細(xì)胞中檢測(cè)到VP22-GFP融合蛋白，而且它已積累于細(xì)胞核內(nèi)。
總之，我們已證實(shí)能獲得表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞提取物，其中連接的蛋白質(zhì)是32Kda，而且將該提取物應(yīng)用于細(xì)胞介質(zhì)后，可檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)的融合蛋白。
顯微注射VP22雖然通過轉(zhuǎn)染而轉(zhuǎn)運(yùn)適用于組織培養(yǎng)應(yīng)用中，但在組織或病人中遞送可能不是真正有效的途徑。
顯微注射(還有脂質(zhì)體遞送)被用于活體內(nèi)且它還適用于闡述通過活體內(nèi)實(shí)用的遞送途徑的VP22轉(zhuǎn)運(yùn)。
用100ng/μl pGE109和100ng/μl pBAG混合物作為注射細(xì)胞用的標(biāo)記物(PNAS 84:156-160)顯微注射鋪板于蓋玻片上的COS-1細(xì)胞，應(yīng)用Carl Zeiss半自動(dòng)手工操作型顯微注射器。將細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，于100％甲醇中固定，應(yīng)用多克隆抗VP22抗體AGV30(1∶500)和單克隆抗β-半乳糖苷酶(1∶50)(Promega)進(jìn)行雙免疫熒光分析。圖7a示出用β-gal的抗體染色的一個(gè)顯微注射細(xì)胞視野的代表圖。在這些細(xì)胞的相同視野內(nèi)，不但在顯微注射細(xì)胞內(nèi)而且在很多非注射細(xì)胞內(nèi)可見到VP22(圖7b)。因此，該遞送途徑可用于活體內(nèi)通過顯微注入例如腫瘤中心以遞送VP22或其變體。當(dāng)然，其它遞送途徑也同樣可行，這里只是闡述一種直接途徑。目前，應(yīng)用兩種主要途徑遞送基因，即脂質(zhì)體介導(dǎo)的感染和病毒感染。因此，可以把VP22或各種修飾物(包括融合蛋白)的基因摻入脂質(zhì)體載體供活體內(nèi)遞送。同樣，脂質(zhì)體遞送也可用于組織培養(yǎng)系統(tǒng)。也可將VP22或其變體的基因插入例如腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組以傳遞感染。在兩種情況下，將在初始轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞群中表達(dá)，但VP22將被遞送至周圍細(xì)胞內(nèi)。這特別適用于通過設(shè)計(jì)成不復(fù)制的缺損病毒載體(disabled virus vectors)的遞送。該場(chǎng)合的遞送將會(huì)增強(qiáng)。直接顯微注射基因或者直接應(yīng)用裸DNA也是本領(lǐng)域中正在研究的方法。
轉(zhuǎn)運(yùn)VP22至不同種細(xì)胞我們已進(jìn)一步證實(shí)了VP22可從初始表達(dá)它的細(xì)胞被轉(zhuǎn)運(yùn)至不同種細(xì)胞。
用被PUC19 DNA從1μg配成4μg的pGE109轉(zhuǎn)染60mm板中的COS-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后用胰蛋白酶消化除去細(xì)胞，再與先被胰蛋白酶消化的BHK-21細(xì)胞(倉鼠)以1∶20的比率混合。將該細(xì)胞混合物鋪板于6孔板中的蓋玻片上，再進(jìn)一步培養(yǎng)20小時(shí)，然后在100％甲醇中固定。應(yīng)用AGV30(1∶500)和單克隆抗T抗原pAB419(純凈的)進(jìn)行雙免疫熒光分析以鑒定COS-1細(xì)胞(J.Vi-rol.39:861-869)。
圖8示出混合細(xì)胞的典型視野，其中可見T抗原陽性COS細(xì)胞(圖6a，左邊欄)，周圍的BHK細(xì)胞當(dāng)然未被T抗原抗體檢測(cè)到)，而在圖8b右邊欄中是VP22陽性細(xì)胞，即中心COS細(xì)胞和周圍的未轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞均可見。
VP22的DNA結(jié)合性能我們已證實(shí)，在VP22在核內(nèi)的細(xì)胞中，它在有絲分裂期間與濃縮染色體結(jié)合。這表明有絲分裂期間與染色體的強(qiáng)烈結(jié)合，且說明一旦VP22或其變體被攝入細(xì)胞，它們也在分裂后被傳給子細(xì)胞。這性能使VP22更適用于遞送。此外我們已證實(shí)，在體外，VP22具有非專一性DNA結(jié)合性能，這可能(至少部分地)解釋活體內(nèi)染色質(zhì)結(jié)合。綜合這兩種現(xiàn)象得知VP22有可能結(jié)合DNA和遞送DNA/基因至細(xì)胞核。
分析期間我們發(fā)現(xiàn)，一部分核內(nèi)含VP22的細(xì)胞中該蛋白質(zhì)的模式類似于有絲分裂染色質(zhì)的模式。對(duì)VP22和DNA的細(xì)胞雙染色表明，對(duì)于有絲分裂各階段的細(xì)胞均可檢測(cè)出VP22定位于濃縮染色體周圍(圖9a)。為測(cè)定VP22是否能與DNA直接作用，我們通過凝膠阻滯分析測(cè)試了GST-VP22融合蛋白結(jié)合40bp寡核苷酸探針的能力。對(duì)于GST-VP22觀測(cè)到3種復(fù)合體的出現(xiàn)隨劑量增大而增強(qiáng)(圖9b)，在GST對(duì)照組中未存在該現(xiàn)象。尺寸更大的復(fù)合體可能表示該蛋白質(zhì)的多聚化，因?yàn)樗纬傻淖畲笠粋€(gè)對(duì)于更短的探針結(jié)合效果差(未顯示)。此外，VP22能結(jié)合一系列DNA探針，說明該蛋白質(zhì)與DNA以非專一性方式作用。
VP22在病毒感染的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)基因治療中遞送基因的主要途徑之一是應(yīng)用病毒來進(jìn)行。這類病毒一般在某些方面無功效以至它們低效復(fù)制或完全不能復(fù)制。希望限制復(fù)制以防止病理方面的并發(fā)癥。病毒載體的安全性是基因治療中的主要問題，研究人員作出很大努力試圖開發(fā)嚴(yán)格缺損的病毒。但應(yīng)用缺損病毒的缺點(diǎn)在于目的基因只能被遞送至初始感染的細(xì)胞。
我們意在直接證實(shí)VP22可從病毒感染的細(xì)胞被轉(zhuǎn)運(yùn)至未感染的細(xì)胞。為此，我們用缺損的單純皰疹病毒突變體HSV-1[gH-ve]感染細(xì)胞。該病毒缺乏病毒糖蛋白gH必需的基因，且必需在含gH的特化互補(bǔ)細(xì)胞系上繁殖。但當(dāng)該病毒感染非互補(bǔ)細(xì)胞(即不含病毒gH的任何細(xì)胞類型)時(shí)，該病毒能滲入初始細(xì)胞群、合成病毒蛋白(gH除外)和裝配病毒粒子，但這些都是非感染性的。未發(fā)生第二輪感染。我們想證實(shí)VP22可從初始用HSV-1[gH-ve]病毒突變體感染的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)(Desai,P.J.等，J Gen Virol 69(pt 6):1147-56(1988)；Forrester,A.等，J Virol 66:341-8(1992)U.Gompels & A.Minson Virology 153:230-47(1986))。在大約0.2pfu/細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)下用HSV-1[gH-ve]感染Vero細(xì)胞。因而大約5個(gè)細(xì)胞中有一個(gè)開始時(shí)將被感染。感染24或66小時(shí)后使細(xì)胞在甲醇中固定，再估測(cè)VP22或β-半乳糖苷酶的存在。應(yīng)注意，該病毒含β-半乳糖苷酶的基因，而且存在的β-半乳糖苷酶用作初級(jí)感染細(xì)胞的標(biāo)記物。結(jié)果示于圖10。
圖10a示出對(duì)β-半乳糖苷酶染色、感染24小時(shí)后的視野。
圖10b示出對(duì)VP22染色的相同視野。
圖10c示出對(duì)β-半乳糖苷酶染色、感染66小時(shí)后的視野。
圖10d示出對(duì)VP22染色的相同視野。
圖10a中用箭頭標(biāo)出了表達(dá)β-半乳糖苷酶的兩個(gè)細(xì)胞。注意周圍的細(xì)胞缺乏β-半乳糖苷酶。在對(duì)VP22染色的相同視野(圖10)中，這兩個(gè)細(xì)胞也是VP22陽性的(大箭頭)，但還檢測(cè)到幾個(gè)周圍細(xì)胞含VP22(小箭頭)，它們是β-半乳糖苷酶陰性的。
在圖10c(感染66小時(shí)后)中示出的3個(gè)細(xì)胞也是β-半乳糖苷酶陽性的(大箭頭)。在對(duì)VP22染色的相同視野(圖10d)中，這3個(gè)細(xì)胞是陽性的，但周圍其它細(xì)胞是β-半乳糖苷酶陰性的因而未感染，不過含有VP22，它已積聚于細(xì)胞核內(nèi)(小箭頭)。注意盡管在3個(gè)中心陽性細(xì)胞中濃染色，最后的這些細(xì)胞完全缺乏可檢測(cè)的β-半乳糖苷酶。
結(jié)果表明，VP22可從病毒感染細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。這不只是瘡疹病毒感染的性質(zhì)，因?yàn)閂P22可從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或顯微注射的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，轉(zhuǎn)運(yùn)不需其它任何瘡疹病毒編碼的蛋白質(zhì)，于是應(yīng)用任何病毒載體如腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒都幾乎肯定會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)。
這樣我們直接證實(shí)了VP22從病毒感染細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的原理依據(jù)。很容易預(yù)測(cè)，含目的基因的融合蛋白可通過與VP22的基因或其活性部分連接而被構(gòu)建，并在基本上有效的或組織專一性的啟動(dòng)子控制下被插入病毒載體。隨后該融合蛋白可被遞送至比初始感染的細(xì)胞群要大得多的細(xì)胞群。
討論上還結(jié)果表明，VP22表現(xiàn)出相當(dāng)獨(dú)特的性能，因?yàn)樗挥行У貜某跏急磉_(dá)它、而且它在其中表現(xiàn)為胞質(zhì)定位的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞單層中毗鄰細(xì)胞，在那里它被細(xì)胞核攝取。在我們?cè)囼?yàn)過的一系列蛋白質(zhì)中，對(duì)于其它任何蛋白質(zhì)均未觀測(cè)到這種行為模式，而且以前從未闡述過這種活性。于是，例如VP16也是在細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)的，但它的表達(dá)模式在表達(dá)細(xì)胞群中是完全均勻的，而且它未被轉(zhuǎn)運(yùn)至毗鄰細(xì)胞。這種差異和VP22的這種意外的性能從如下結(jié)果得以證實(shí)即，當(dāng)VP22或VP16被引入細(xì)胞單層大約30小時(shí)后，雖然VP16能在平均約2-5％的細(xì)胞中被檢測(cè)到，但VP22能在單層的每個(gè)細(xì)胞中被檢測(cè)到。
本工作還證明了VP22胞間轉(zhuǎn)運(yùn)的專一性，并證明了該蛋白質(zhì)C端包含一個(gè)決定子，因?yàn)槿狈端34個(gè)氨基酸的變體雖然在初始表達(dá)細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)定位中被表達(dá)，但未被轉(zhuǎn)運(yùn)至毗鄰細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)表明，VP22的胞間轉(zhuǎn)運(yùn)可在一些不同種細(xì)胞包括COS-1細(xì)胞、Vero細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中進(jìn)行，即該現(xiàn)象對(duì)其中最初觀察到該現(xiàn)象的COS細(xì)胞不具有專一性。
蛋白質(zhì)分泌或外排通常經(jīng)過特定途徑發(fā)生，要求完全鑒定的信號(hào)序列以分選入外排途徑中包括的區(qū)室和載體。在蛋白質(zhì)分泌的主要機(jī)制之一中，信號(hào)序列通常殘留于蛋白質(zhì)的N端末端，被7S RNA和至少6個(gè)多肽的復(fù)合體識(shí)別，其中復(fù)合體的組分一起包括信號(hào)識(shí)別顆粒(SRP)。由SRP識(shí)別后接著在內(nèi)質(zhì)膜中?？亢蛯⑿盘?hào)肽傳遞給受體。然后該出現(xiàn)的多肽通過ER膜排出，接著通過在Golgi網(wǎng)絡(luò)中相互作用和小泡裝配的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行處理。VP22不具備任何慣常的信號(hào)序列，而且它在胞質(zhì)內(nèi)的分布模式與ER分布或Golgi分布不相似。
已有少量有關(guān)哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)通過非經(jīng)典途徑分泌的現(xiàn)有實(shí)例，例如包括細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1α和1β，以及堿性和酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(7)。輸出這類成分的一種可能性是通過ABC-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)。這些蛋白質(zhì)包括依賴于ATP的蛋白質(zhì)和膜結(jié)合蛋白質(zhì)，它們含跨膜螺旋。它們包括于蛋白質(zhì)專一性結(jié)合中和轉(zhuǎn)運(yùn)穿過膜并在細(xì)菌系統(tǒng)中已被最完全鑒定。然而，迄今尚無有關(guān)任意哺乳動(dòng)物ABC-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在蛋白質(zhì)分泌中的作用的直接證據(jù)。
還有，雖然某些蛋白質(zhì)是通過非經(jīng)典途徑被分泌的，但VP22分泌的模式極為獨(dú)特。由于不想受任何具體理論的束縛，對(duì)于我們的結(jié)果的最簡(jiǎn)單解釋是這樣的VP22被分泌后就被靶細(xì)胞的核攝取并在其中濃縮。又一次地，雖然該蛋白質(zhì)的預(yù)計(jì)分子量為32k，但VP22中沒有明顯的核定位信號(hào)，所以它無需專門的信號(hào)就能進(jìn)入細(xì)胞核。對(duì)于VP22內(nèi)所需決定子和細(xì)胞內(nèi)生理需求的進(jìn)一步研究將會(huì)有助于闡明所包括的途徑，而對(duì)于VP22如何被分泌的理解將有助于理解其它蛋白質(zhì)在非經(jīng)典輸出途徑中是如何被轉(zhuǎn)運(yùn)的。
這些結(jié)果揭示了有可能應(yīng)用VP22轉(zhuǎn)運(yùn)中涉及的決定子來使其它蛋白質(zhì)或與VP22決定子相關(guān)的其他分子在靶細(xì)胞群中被轉(zhuǎn)運(yùn)、有效表達(dá)或攝取。我們業(yè)已證實(shí)，短肽(12個(gè)殘基)可與VP22連接且該融合蛋白仍能被轉(zhuǎn)運(yùn)至單層的每個(gè)細(xì)胞中。該結(jié)果表明，確實(shí)易于通過將肽與VP22連接而促使肽的傳遞。
此外，我們已證實(shí)大型蛋白質(zhì)(32Kd)與VP22連接后可從細(xì)胞介質(zhì)被輸入細(xì)胞，并看到它在細(xì)胞核內(nèi)積聚。
容易預(yù)測(cè)這種能力的廣泛應(yīng)用。例如有可能將DNA結(jié)合蛋白質(zhì)與VP22決定子連接，使得當(dāng)遞送至靶細(xì)胞群后，它們將在大得多的細(xì)胞群中被有效地表達(dá)。
其它應(yīng)用包括宿主加強(qiáng)免疫響應(yīng)需要共同刺激分子和細(xì)胞因子疫苗開發(fā)領(lǐng)域的近期資料著重于對(duì)共同刺激分子和細(xì)胞因子的需求，以使疫苗有效地作用以加強(qiáng)細(xì)胞水平的宿主免疫響應(yīng)。腫瘤細(xì)胞不在其細(xì)胞表面表達(dá)共同刺激分子，這就是為什么在宿主中沒有CTL(細(xì)胞毒性T細(xì)胞)的克隆擴(kuò)充的原因，導(dǎo)致病人沒有藥物介入就不能使腫瘤收縮。
直接刺激宿主中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞響應(yīng)遞送具有抗癌性能的外源蛋白至細(xì)胞核。外源蛋白可能是已知能引起對(duì)腫瘤的免疫(T細(xì)胞)響應(yīng)的腫瘤特異抗原。
該外源蛋白可與VP22分子一起直接遞送至細(xì)胞核(這也會(huì)模擬病毒感染-見注釋)。然后該外源蛋白在細(xì)胞的蛋白體中會(huì)斷裂成肽。如果接著進(jìn)行經(jīng)典的T細(xì)胞引入途徑，則肽被導(dǎo)向通過細(xì)胞的ER和高爾基體并與MHC-Ⅰ型分子結(jié)合呈現(xiàn)于細(xì)胞表面。加強(qiáng)病人中CTL響應(yīng)對(duì)于非癌治療，尤其是由病毒感染引起的疾病有顯著作用。認(rèn)為在宿主中引起強(qiáng)烈的CTL響應(yīng)可導(dǎo)致體內(nèi)病毒的消除，近期已獲得科學(xué)證據(jù)。
用待導(dǎo)向的蛋白質(zhì)/抗原加強(qiáng)遞送MHC分子的免疫響應(yīng)有可能通過導(dǎo)向抗原加HLA分子來解決細(xì)胞群中MHC限制性并加強(qiáng)細(xì)胞的響應(yīng)的問題。該應(yīng)用也會(huì)具有非癌用途。
信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)很多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是通過如下方法進(jìn)行的轉(zhuǎn)移環(huán)境信號(hào)、激素、將配體與膜結(jié)合、脅迫(DNA損傷、熱滲透的等等)細(xì)胞核以引起基因表達(dá)變化?？梢酝ㄟ^將蛋白質(zhì)或肽與信號(hào)分子偶合而應(yīng)用VP22介導(dǎo)這種信號(hào)。遞送融合蛋白或相應(yīng)基因?qū)?huì)增強(qiáng)信號(hào)，因?yàn)槿诤象w也是輸出至相鄰細(xì)胞。例如，將VP22與質(zhì)膜相關(guān)性信號(hào)效應(yīng)子的顯性突變體(例如小GTP酶及其效應(yīng)子或編程性細(xì)胞死亡(apoptotic)調(diào)節(jié)分子)融合可能實(shí)現(xiàn)所需途徑，不但可在存在該基因的受體細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)，還能在沒有該基因的周圍細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)?？稍O(shè)想調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的多種變化形式。
VP22在體外與DNA結(jié)合的能力和VP22在有絲分裂期間與濃縮染色體結(jié)合的能力可應(yīng)用于基因/DNA治療。該應(yīng)用有如下幾種形式
a)病毒感染，其中VP22或其突變體的基因被插入腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組以傳遞感染。同樣，也可插入所需蛋白質(zhì)的基因從而可表達(dá)包括VP22和目的蛋白質(zhì)的融合蛋白。然后VP22就能遞送目的蛋白質(zhì)至周圍細(xì)胞群。這樣，可使這類病毒的量減少因而降低病毒感染的危害。
b)將編碼VP22(或其變體)的核酸和目的蛋白質(zhì)直接顯微注入細(xì)胞，于是一旦表達(dá)，VP22就能將目的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)入周圍細(xì)胞群。
c)脂質(zhì)體介導(dǎo)的感染，其中VP22的基因或包括融合蛋白的各種修飾物被摻入脂質(zhì)體載體以供活體內(nèi)遞送。
對(duì)技術(shù)人員而言，將DNA引入細(xì)胞的其它方法是顯而易見的，例如，直接劃痕(direct scarification)，其中DNA直接被組織攝??；受體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化；磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染；和彈道式遞送(ballistic de-livery)。
有效遞送功能分子是基因/蛋白質(zhì)治療中所期望的。該機(jī)制的另外優(yōu)點(diǎn)在于，表達(dá)VP22的基因?qū)⒅淮嬖谟谛∪杭?xì)胞中，而蛋白質(zhì)存在于大得多的細(xì)胞群內(nèi)。當(dāng)需要考慮遞送基因的可能有害效果時(shí)，這將是有用的因素。低基因遞送量同時(shí)保持較大功能性蛋白遞送量是所期望的。實(shí)際上可預(yù)測(cè)，需要或者希望有效表達(dá)試驗(yàn)蛋白質(zhì)的任何應(yīng)用都可運(yùn)用VP22遞送機(jī)制。遞送腫瘤抑制蛋白、酶等等。我們還已證實(shí)有可能將核酸與VP22結(jié)合，因此，除了DNA之外也可以遞送反義RNA核酸等等。參考文獻(xiàn)1．Blaho,J.A.,C.Mitchell，和B.Roizman.1994.由單純瘡疹病毒1α調(diào)節(jié)蛋白0、4、22和27共享的氨基酸序列預(yù)示UL21、UL31、UL47和UL49基因產(chǎn)物的核苷?；?nucleotidylylation)。J.Biol Chem269:17401-10。2．Blair,E.D.，和R.W.Honess.1983.由herpes virus saimiri專一化的DNA結(jié)合蛋白。J.Gen.Virol.64:2697-2715。3．Chen,C.，和H.Okayama.1987.用質(zhì)粒DNA高效轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞。Mol.Cell Biol.7:2745-2752。4．Elliott,G.D.，和D.M.Meredith.1992。由基因UL49編碼單純瘡疹病毒-1型殼蛋白VP22。J.Gen．Virol.73:723-6。5．Greaves,R.F.，和P.OHare.1990。對(duì)于同細(xì)胞八聚體結(jié)合蛋白序列和靶TAATGARAT序列作用的單純瘡疹病毒-1型反式激活蛋白Vmw65的結(jié)構(gòu)要求。J.Virol.64:2716-2724。6．Haarr,L.，和S.Skulstad.1994。單純瘡疹病毒-1型粒子結(jié)構(gòu)和分子功能。論文綜述。Apmis 102:321-46。7．Klucher,K.1993.蛋白質(zhì)分泌的獨(dú)特途徑簡(jiǎn)易分泌方式。Trendsin Cell Biol.3:421-426。8．Knopf,K.W.，和H.C.Kaerner.1980.與單純瘡疹病毒-1型(HSV-1)粒子結(jié)合的病毒特異性堿性磷蛋白和HSV-1感染的細(xì)胞的染色質(zhì)。J.Gen.Virol.46:405-414。9．Meredith,D.M.,J.A.Lindsay,I.W.Halliburton，和G.R.Whit-taker。1991.通過糖基化作用和磷酸化作用對(duì)單純瘡疹病毒-1型的殼蛋白(VP13和VP14)的翻譯后修飾。J.Gen.Virol.72:2771-5。10．Pinard,M.F.,R.Simard，和V.Bibor-Hardy.1987.單純瘡疹病毒-1型感染的BHK細(xì)胞核基質(zhì)的DNA結(jié)合蛋白。J.Gen.Virol.68:727-35。11．Preston,C.M.，和E.L.Notarianni.1983.單純瘡疹病毒立即早期多肽的聚(ADP-核糖基)化作用。Virol.131:492-501。12．Rothman,J.E.1994。胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制。Nature.372:55-63。
權(quán)利要求
1．VP22或者其活性部分、片段或同源物作為能被靶細(xì)胞群攝取的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的應(yīng)用。
2．權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白至少包括VP22的C端34個(gè)氨基酸。
3．權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與一個(gè)或多個(gè)需要轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞群的其它分子結(jié)合。
4．權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中的一個(gè)或多個(gè)相關(guān)分子是非肽基分子。
5．前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中的蛋白質(zhì)還能從表達(dá)它的靶細(xì)胞群的第一部分輸出，并被不直接產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的靶細(xì)胞群的第二部分?jǐn)z取。
6．轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，它包括VP22或者其活性部分、片段或同源物，該蛋白質(zhì)結(jié)合需要轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞群的一個(gè)或多個(gè)其它分子。
7．權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中的一個(gè)或多個(gè)相關(guān)分子是非肽基分子。
8．權(quán)利要求6或權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中的蛋白質(zhì)還能從表達(dá)它的靶細(xì)胞群的第一部分輸出，并被不直接產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的靶細(xì)胞群的第二部分?jǐn)z取。
9．核酸，它編碼權(quán)利要求6、7和8中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
10．表達(dá)載體，它包括權(quán)利要求9的核酸。
11．哺乳動(dòng)物或微生物宿主細(xì)胞，它包括權(quán)利要求10的載體或權(quán)利要求9的核酸。
12．轉(zhuǎn)運(yùn)所需蛋白質(zhì)或肽至靶細(xì)胞群的方法，該方法包括ⅰ)將權(quán)利要求9或權(quán)利要求10的核酸或載體引入靶細(xì)胞群的第一部分；ⅱ)表達(dá)該核酸而產(chǎn)生蛋白質(zhì)，隨后從細(xì)胞中輸出該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，連同與之結(jié)合的其它任何蛋白質(zhì)，而被不直接產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的靶細(xì)胞群的第二部分?jǐn)z取。
13．權(quán)利要求12的方法，其中通過重組病毒將核酸引入靶細(xì)胞群的第一部分。
14．權(quán)利要求12的方法，其中通過轉(zhuǎn)染將核酸引入靶細(xì)胞群的第一部分。
15．權(quán)利要求12的方法，其中通過顯微注射將核酸引入靶細(xì)胞群的第一部分。
16．將所需分子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞群的方法，該方法包括ⅰ)將所需分子與包括VP22或其活性部分、片段或同源物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白偶聯(lián)而形成復(fù)合體；和，ⅱ)使細(xì)胞與該復(fù)合體接觸使細(xì)胞能攝取該復(fù)合體。
17．權(quán)利要求16的方法，其中所需的分子是非肽基分子。
18．權(quán)利要求16或權(quán)利要求17的方法，其中通過摻入脂質(zhì)基載體而將所需分子與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白偶聯(lián)。
全文摘要
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,具體涉及VP22及其同源物,并涉及遞送這些蛋白質(zhì)和任何結(jié)合的分子至靶細(xì)胞群的方法。該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可應(yīng)用于基因治療和引導(dǎo)試劑至需要高效導(dǎo)向的細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)C12N15/38GK1208438SQ9619584
公開日1999年2月17日 申請(qǐng)日期1996年7月25日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月28日
發(fā)明者P·F·J·奧黑爾, G·D·埃利奧特 申請(qǐng)人:瑪麗·柯里癌癥治療中心