專利名稱：制備l－賴氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)微生物而制備L-賴氨酸的方法，該微生物通過遺傳工程技術(shù)方法修飾用于發(fā)酵制備氨基酸等的棒桿狀菌而獲得。
背景技術(shù)：
用作飼料添加劑的L-賴氨酸通常通過使用棒桿狀菌的產(chǎn)L-賴氨酸突變型菌株通過發(fā)酵方法制備，目前已知的產(chǎn)L-賴氨酸細(xì)菌為那些通過對棒桿狀菌野生型菌株的人工突變而產(chǎn)生的細(xì)菌。
對于棒桿狀菌，公開了能在細(xì)菌細(xì)胞中自主復(fù)制并具有藥物抗性標(biāo)記基因的載體質(zhì)粒(見美國專利No.4,514,502)，以及將基因?qū)爰?xì)菌細(xì)胞的方法(例如，日本專利公開No.2-207791)。也公開了使用上述技術(shù)繁殖產(chǎn)L-蘇氨酸或產(chǎn)L-異亮氨酸的細(xì)菌的可能性(見美國專利Nos.4,452,890和4,442,208)。對于繁殖產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌，技術(shù)是已知的，其中的參與L-賴氨酸生物合成的基因摻入到質(zhì)粒載體以在宿主細(xì)胞中的擴增該基因(例如，日本專利公開No.56-160997)。
已知的用于L-賴氨酸生物合成的基因包括，如，二氫吡啶二羧酸還原酶基因(日本專利公開No.7-75578)和二氨基庚二酸脫氫酶基因(Ishino，S，等，核酸研究，15，3917(1987)，其中的參與L-賴氨酸生物合成的基因被克隆以及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(日本專利公開No.60-87788)，二氫吡啶二羧酸合酶基因(日本專利公開No.6-55149)，以及二氨基庚二酸脫羧酶基因(日本專利公開No.60-62994)，其中的基因擴增影響L-賴氨酸產(chǎn)力。
對于參與L-賴氨酸生物合成的酶，已知這樣一種實例，即當(dāng)作野生型時，酶受到反饋抑制。在此情況，L-賴氨酸產(chǎn)力通過導(dǎo)入具有反饋抑制被脫敏的突變的酶基因而提高。已知這些基因具體地包括，例如，天冬氨酸激酶基因(WO94/25605國際公開手冊)。
正如上述，有些成功的結(jié)果通過L-賴氨酸生物合成系統(tǒng)基因擴增，或?qū)胪蛔冃突虻姆椒ǐ@得。例如，帶有對賴氨酸和蘇氨酸協(xié)同抑制脫敏的突變型天冬氨酸激酶基因的棒桿狀菌產(chǎn)生相當(dāng)多量的L-賴氨酸(約25g/L)。然而，此細(xì)菌與不帶有突變型天冬氨酸激酶基因的細(xì)菌相比生長速度下降。也有報導(dǎo)L-賴氨酸產(chǎn)率除了突變型天冬氨酸激酶基因以外可通過進(jìn)一步導(dǎo)入二氫吡啶二羧酸合酶基因而被提高(應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)，57(6)，1746-1752(1991))。然而，這種細(xì)菌生長速度下降。
對于二氫吡啶二羧酸還原酶基因，已證實二氫吡啶二羧酸還原酶活性在導(dǎo)入該基因的棒桿狀菌中增加，然而，沒有包括對L-賴氨酸產(chǎn)率的影響的報導(dǎo)(日本專利公開No.7-75578)。
在目前情況下，已知沒有這樣的棒桿狀菌，即在該細(xì)菌中任何人通過聯(lián)合L-賴氨酸生物合成的多個基因成功地顯著提高L-賴氨酸產(chǎn)量而不延緩生長，也沒有報導(dǎo)試圖通過增強L-賴氨酸生物合成基因而加快生長的實例。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過使用編碼從述酶DNA序列的遺傳物質(zhì)提高棒桿狀菌產(chǎn)L-賴氨酸能力和生長速度，包括天冬氨酸激酶(如果必要，則下文中稱為“AK”，前提是編碼AK蛋白的基因在下文稱為“l(fā)ysC”)。二氫吡啶二羧酸還原酶(如果必要，在下文中稱為“DDPR”假設(shè)編碼DDPR蛋白的基因在下文中稱為“dapB”)，二氫吡啶二羧酸合酶(如果必要，則在下文中簡稱為“DDPS”，前提是編碼DDPS蛋白的基因在下文中稱為“dapA”)，二氨基庚二酸脫羧酶(如果必要，則在下文中稱“DDC”，前提是編碼DDC蛋白的基因在下文中成為“l(fā)ysA”)，以及二氨基庚二酸脫氫酶(如果必要，則在下文中稱為“DDH”，前提是編碼DDH蛋白的基因在下文中稱為“ddh”)，這些酶均是棒桿狀菌細(xì)胞中L-賴氨酸生物合成中重要的酶。
當(dāng)一種目標(biāo)物質(zhì)通過使用微生物發(fā)酵而制備時，目標(biāo)物質(zhì)相對于導(dǎo)入物質(zhì)的產(chǎn)生速度，以及產(chǎn)率是一個極為重要的因素。通過增加發(fā)酵設(shè)備中每單位的產(chǎn)生速度可異常廉價地制備。因此，發(fā)酵產(chǎn)率和產(chǎn)生速度彼此兼容在工業(yè)上是極為重要的。為了通過用棒桿狀菌發(fā)酵制備L-賴氨酸本發(fā)明建議了一種上述問題的解決方法。
本發(fā)明的原理基于這樣的事實即通過下述方法棒桿狀菌的生長可加快，且其L-賴氨酸產(chǎn)生速度可加快，包括當(dāng)聯(lián)合dapB與編碼突變型AK(如果必要，下文中簡稱為“突變型AK”)的突變型lysC(如果必要，下文中簡稱為“突變型lysC”)時造成增強，與lysC被單獨增強相比，突變型AK中對賴氨酸和蘇氨酸的協(xié)同抑制被脫敏，并且L-賴氨酸生產(chǎn)速度可通過相繼增強dapA，lysA及ddh以分段的方式進(jìn)一步提高。
即，本發(fā)明在于能在棒桿狀菌細(xì)胞中自主復(fù)制的重組DNA，包括編碼其中的對L-賴氨酸和L-蘇氨酸反饋抑制被基本上脫敏的天冬氨酸激酶的DNA序列，和編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的DNA序列。除了上述的每種DNA序列以外，本發(fā)明提供了進(jìn)一步包括編碼二氫吡啶二羧酸合酶DNA序列的重組DNA。除了上述三種DNA序列外，本發(fā)明提供了進(jìn)一步包括編碼二氫吡啶二羧酸脫羧酶DNA序列的重組DNA。除了上述的四種DNA以外，本發(fā)明提供了進(jìn)一步包括編碼二氨基庚二酸脫氫酶DNA序列的重組DNA。
在另一方面，本發(fā)明提供了含有對L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制被基上脫敏的天冬氨酸激酶，并包括編碼二氫吡啶二羧酸還原酶增強的DNA的棒桿狀菌。本發(fā)明提供了進(jìn)一步包括編碼在前面提到細(xì)菌中的二氫吡啶二羧酸合酶增強的DNA的棒桿狀菌。除了上述三種DNA以外，本發(fā)明提供了進(jìn)一步包括編碼上面提到的棒桿狀菌中的二氨基庚二酸脫羧酶增強的DNA的棒桿狀菌。除了上述四種DNA之外，本發(fā)明提供了進(jìn)一步包括編碼前面提到的棒桿狀菌中的二氨基庚二酸脫氫酶增強的DNA的棒桿狀菌。
在另外一個方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生L-賴氨酸的方法，包括以下步驟在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)任何一種上述的棒桿狀菌，在細(xì)菌培養(yǎng)液中產(chǎn)生積累L-賴氨酸，并從培養(yǎng)中收集L-賴氨酸。
本發(fā)明中提及的棒桿狀菌為在伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊，第8版，599頁(1974)中定義的微生物類群，為無酸抗性且無孢子形成能力的需氧型格蘭氏陽性桿菌。該棒桿狀菌包括棒狀桿菌屬細(xì)菌、到目前為止被劃為短桿菌屬但現(xiàn)在統(tǒng)一為棒狀桿菌屬細(xì)菌的短桿菌屬細(xì)菌，以及與棒狀桿菌屬密切相關(guān)的短桿菌屬的細(xì)菌。
本發(fā)明將在下面作詳細(xì)解釋。
<1>用于本發(fā)明L-賴氨酸生物合成基因的制備用于本發(fā)明L-賴氨酸生物合成的基因分別通過以下方法獲得，包括制備細(xì)菌染色體DNA作為DNA供體，通過用質(zhì)粒載體等構(gòu)建染色體DNA文庫，篩選帶有所需基因的菌株，并從篩選到的菌株中回收該基因被插入其中的重組DNA。只要用于L-賴氨酸生物合成的所需基因表達(dá)在棒桿狀菌細(xì)胞中發(fā)揮功能的酶蛋白，用于本發(fā)明的L-賴氨酸生物合成基因的DNA供體沒有特別的限制。然而，該DNA供體優(yōu)迭棒桿狀菌。
源自棒桿狀菌的LysC，dapA及dapB基因均具有已知的序列。因此，它們可通過根據(jù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法(PCR；見White，T.J.等，遺傳學(xué)動態(tài)，5，185(1989))的擴增而獲得。
用于本發(fā)明的L-賴氨酸生物合成的每個基因可根據(jù)下面例舉的一些方法獲得。(1)突變型lysC的制備含有突變型lysC的DNA片段可從對L-賴氨酸和L-蘇氨酸AK活性的協(xié)同抑制被基本脫敏的突變型菌株中(WO94/25605國際公開手冊)制備。例如，這種突變型菌株可獲自一組源自棒桿狀菌野生型菌株的細(xì)胞，該菌株通過用普通的突變處理如紫外照射及以突變劑如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍的處理進(jìn)行突變處理?？赏ㄟ^Miyajima，R，等在生物化學(xué)雜志(1968)，63(2)，139-148中描述的方法加以測定。最優(yōu)選的這種突變型菌株由通過對乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869(具有改變的現(xiàn)名為谷氨酸棒桿菌野生型菌株的突變處理而獲得的L-賴氨酸生產(chǎn)菌AJ3445(FERM P-1944)所代表。
或者，突變型lysC也可通過對含有野生型lysC的質(zhì)粒DNA進(jìn)行體外突變處理而獲得。在另一方面，有關(guān)突變使AK對L-賴氨酸和L-蘇氨酸協(xié)同反饋抑制脫敏(WO94/25605國際公開手冊)的信息具體是已知的。因此，突變型lysC也可根據(jù)例如，定點誘變方法的信息從野生型lysC中制備。
通過，例如，Saito和Miura方法(H.Saito和K.Miura，生物化學(xué)與生物物理雜志，72，619(1963))制備染色體DNA，并根據(jù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法(PCR，見White，T.J.等，遺傳學(xué)動態(tài).，5，185(1989))擴增lysC，包括lysC的片段可分離自棒桿狀菌。
為了擴增，例如，編碼根據(jù)谷氨酸棒桿菌已知序列(見分子微生物學(xué)(1991)，5(5)，1197-1204，分子和普通遺傳學(xué).(1990)，224，317-324)編碼lysC的約1,643bp的區(qū)域，DNA引物通過具有序列表中序列1和2顯示核苷酸序列的23和21聚體的單鏈DNA來舉例說明。DNA可根據(jù)普通方法合成，該方法使用應(yīng)用生物系統(tǒng)部生產(chǎn)的380B型DNA合成儀及亞磷酸胺(phosphoamidite)方法(見四面體通迅(Tetrahedron Letters(1981)，22，1859)。PCR可用Takara Shuzo生產(chǎn)的PJ2000型DNA熱循環(huán)儀和用Taq DNA聚合酶根據(jù)供應(yīng)商指定的方法加以完成。
PCR擴增的lysC與能在大腸桿菌和/或棒桿狀菌細(xì)胞中自主復(fù)制的載體DNA連接以制備重組DNA。且將重組DNA導(dǎo)入前述的大腸桿菌細(xì)胞中是優(yōu)選的。這種措施使下面的操作變得容易。能在大腸桿菌細(xì)胞中自主復(fù)制的載體優(yōu)選為優(yōu)選能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的質(zhì)粒載體，包括，例如，pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398和RSF1010。
當(dāng)具有允許質(zhì)粒能在棒桿狀菌中自主復(fù)制能力的DNA片段插入這些載體時，它們可用作既能在大腸桿菌又能在棒桿狀菌中自主復(fù)制的所謂穿梭載體。
這種穿梭載體包括如下內(nèi)容。具有每種質(zhì)粒的微生物及國際保藏機構(gòu)的保藏號列于括弧中。
pHC4 大腸桿菌AJ12617(FERM BP-3532)pAJ655；大腸桿菌AJ11882(FERM BP-136)谷氨酸棒桿菌SR8201(ATCC 39135)pAJ1844 大腸桿菌AJ11883(FERM BP-137)谷氨酸棒桿菌SR8202(ATCC 39136)pAJ611大腸桿菌AJ11884(FERM BP-138)pAJ3148 谷氨酸棒桿菌SR8203(ATCC 39137)pAJ440枯草芽孢桿菌AJ1190(FERM BP-140)這些載體可按如下從保藏的微生物中獲得。對數(shù)期收集的細(xì)胞以溶菌酶和SDS裂解，接著通過以30,000×g離心從裂解液中分離獲得上清并向其中加入聚乙二醇，然后通過氯化銫-溴化乙錠平衡密度梯度離心方法加以分級和純化。
大腸桿菌可根據(jù)如下方法導(dǎo)入質(zhì)粒而轉(zhuǎn)化，例如，D.M.Morrison方法(酶學(xué)方法，68，326(1979)或其中的受體細(xì)胞以氯化鈣處理以增加DNA通透性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，分子生物學(xué)雜志.，53，159(1970))。
根據(jù)上述方法當(dāng)lysC分離自AK野生型菌株時獲得野生型lysC，而當(dāng)lysC分離自AK突變型菌株時獲得突變型lysC。
含有野生型lysC DNA片段核苷酸序列的一個實例列于序列表中的序列3。野生型AK蛋白的α-亞基氨基酸序列推導(dǎo)自該核苷酸序列，并與DNA序列一起列于序列表中的序列4中。序列5中僅列其氨基酸序列。野生型AK蛋白的β-亞基氨基酸序列推導(dǎo)自該DNA的核苷酸序列，并與DNA一起列于序列表中的序列6中。序列7中僅列其氨基酸序列。在每個亞基中，GTG用作起始密碼子，并且相應(yīng)的氨基酸為甲硫氨酸所代表。然而，此代表涉及甲硫氨酸、纈氨酸、或甲酰甲硫氨酸。
只要它編碼其中的對L-賴氨酸和L蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制被脫敏的AK，那么用于本發(fā)明的突變型lysC沒有特別的限制。然而，突變型lysC通過一個包括突變的實例加以舉例說明，在該突變中，野生型AK氨基酸序列的α-亞基自N-末端的279位的丙氨酸殘基變?yōu)榉潜彼岱撬嵝园被岬陌被釟埢姚?亞基30位的丙氨酸殘基變?yōu)榉潜彼岱撬嵝园被岬陌被釟埢?。野生型AK的氨基酸序列具體地包括列于序列表中序列5的α-亞基氨基酸序列和列于序列表中序列7的β-亞基氨基酸序列。
那些優(yōu)選的除丙氨酸以外的其它氨基酸殘基包括蘇氨酸、精氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸、和纈氨酸殘基。
只要其編碼氨基酸殘基，相應(yīng)于待替代氨基酸殘基的密碼子類型沒有特別的限制。據(jù)認(rèn)為已有的野生型AK的氨基酸序列依細(xì)菌種類和菌株的不同可略有不同。例如，在一個或更多個與酶活性無關(guān)的位置按上述具有一個或更多個氨基酸殘基的替代、缺失、或插入的AK也可用于本發(fā)明。只要對AK活性及L-賴氨酸和L-蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制脫敏基本上沒有影響，例如，具有其它一個或更多個氨基酸殘基替代、缺失或插入突變的其它AK也可使用。
通過導(dǎo)入突變型lysC質(zhì)粒p399AK9B于作為乳發(fā)酵短桿菌野生型菌株的AJ12036菌株(FERM BP-734)中而獲得的AJ12691菌株已于1992年4月10日以FERM P-12918的保藏號保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵政編碼305日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號)，根據(jù)布達(dá)佩斯條約于1995年2月10日轉(zhuǎn)為國際保藏，且保藏號為FERM BP-4999。(2)dapB的制備含有dapB的DNA片段可通過PCR方法從棒桿狀菌染色體中制備。DNA供體沒有特別的限制，然而，其通過乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869菌株加以說明。
對于乳發(fā)酵短桿菌，其編碼DDPR的DNA序列為已知的(細(xì)菌學(xué)雜志，175(9)，2743-2749(1993))，根據(jù)它可制備用于PCR的DNA引物。這種DNA引物通過分別具有序列表中序列8和序列9描述核苷酸序列的23聚體DNA來具體地加以說明，DNA合成、PCR及含有獲得dapB質(zhì)粒的制備可以與上述lysC相同的方式完成。
含有dapB DNA片段的核苷酸序列和自此核苷酸序列中推斷的氨基酸序列說明序列10中。序列11中僅列有氨基酸序列。除了編碼此氨基酸序列的DNA片段以外，本發(fā)明可同樣使用編碼與序列11中所列氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的DNA片段，即只要對DDPR活性基本沒有影響，具有，例如，一個或更多個氨基酸替代、缺失、或插入突變的氨基酸序列。
通過導(dǎo)入含有在后面所述實例中獲得的dapB的質(zhì)粒pCRDAPB于大腸桿菌JM109菌株而獲得的轉(zhuǎn)化子菌株已于1995年5月26日根據(jù)布達(dá)佩斯條約以FERM BP-5114的保藏號國際保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵政編碼305日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號)。(3)dapA的制備含有dapA的DNA片段可通過PCR方法從棒桿狀菌的染色體中制備。DNA供體沒有特別的限制，然而，其通過乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869菌株加以說明。
對于谷氨酸棒桿菌，編碼DDPS的DNA序列是已知的(見核酸研究，18(21)，6421(1990)；EMBL接受號X53993).，根據(jù)其可制備用于PCR的DNA引物。這種DNA引物通過分別具有序列表中序列12和13中描述的核苷酸序列的23聚體DNA加以具體說明。DNA合成、PCR和含有dapA質(zhì)粒的制備可用與上述lysC中相同的方式完成。
含有dapA DNA片段的核苷酸序列和自該核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列在序列14中加以說明。序列15中僅列有氨基酸序列。除了編碼此氨基酸序列的DNA片段之外，本發(fā)明可同樣使用編碼與序列15中所示氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的DNA片段，即只要對DDPS活性基本沒有影響，具有，例如，一個或更多個氨基酸替代、缺失、或插入突變的氨基酸序列。
通過導(dǎo)入含有在所述以后實例中獲得的dapA的質(zhì)粒pCRDAPA的大腸桿菌JM109菌株而獲得的轉(zhuǎn)化子菌株AJ13106已于1995年5月26日根據(jù)布達(dá)佩斯條約以FERM BP-5113的保藏號國際保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵政編碼305日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號)。(4)lysA的制備含有l(wèi)ysA的DNA片段可通過PCR方法從棒桿狀菌染色體中制備。DNA供體沒有特別的限制，然而，其通過乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869菌株加以說明。
在棒桿狀菌中，lysA與argS(精氨酰-tRNA合酶基因)一起形成操縱子，且lysA存在于argS的下游。lysA的表達(dá)通過存在于argS上游的啟動子調(diào)節(jié)(見細(xì)菌學(xué)雜志，11月7356-7362(1993))。對于谷氨酸棒桿菌，這些基因的DNA序列是已知的(見分子微生物學(xué)，4(11)，1819-1830(1990)；分子及普通遺傳學(xué)，212，112-119(1988))，據(jù)此可制備用于PCR的DNA引物。這種DNA引物23聚體的DNA加以具體說明，其分別具有序列表中的序列16中所列的核苷酸序列(相應(yīng)于分子微生物學(xué)，4(11)，1819-1830(1990)中描述核苷酸序列編碼的11～33核苷酸)和序列17中所列的核苷酸序列(相當(dāng)于分子及普通遺傳學(xué)，212，112-119(1988)中所述核苷酸序列的編號1370-1392核苷酸)。DNA合成、PCR和含有獲得lysA質(zhì)粒的制備可用與上述lysC相同的方式完成。
在后面描述的實例中，為了增強lysA，使用了含有啟動子、argS、和lgsA的DNA片段。然而，argS對本發(fā)明并非必要的。也可使用其中的lysA剛好連到啟動子下游的DNA片段。
含有argS和lysA DNA片段的核苷酸序列及推導(dǎo)由此核苷酸序列所編碼的氨基酸序列在序列18中加以說明。argS編碼的氨基酸序列的實例列于序列19中，且lysA編碼的氨基酸序列實例列于序列20中。除了編碼這些氨基酸序列的的DNA片段之外，本發(fā)明同樣使用編碼與序列20中所列氨基酸序列基本相同氨基酸序列的DNA片段，即只要對DDC活性基本沒有影響，具有，例如，一個或更多個氨基酸替代、缺失或插入突變的氨基酸序列。(5)ddh的制備含有ddh的DNA片段可通過PCR方法從棒桿狀菌染色體中制備。DNA供體沒有特別的限制，然而，其通過乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869菌株加以說明。
對于谷氨酸棒桿菌，DDH基因是已知的(Ishino，S.，等，核酸研究.，15，3917(1987))，據(jù)其可制備用于PCR的引物。這種DNA引物通過分別具有序列表中序列21和22所描述的核苷酸序列的20聚體DNA加以具體說明。DNA合成PCR及含有獲得ddh質(zhì)粒的制備可用與上述lysC相同的方式加以完成。
含有ddh DNA片段的核苷酸序列和從該核苷酸序列推斷的氨基酸序列說明于序列23中。序列24中僅列有氨基酸序列。除了編碼此氨基酸序列的DNA片段之外，本發(fā)明可同樣使用編碼與序列24中所列氨基酸序列基本相同氨基酸序列的DNA片段，即只要對DDH活性基本沒有影響，具有，例如，一個或更多個氨基酸替代、缺失、或插入突變的氨基酸序列。<2>本發(fā)明的重組DNA和棒桿狀菌本發(fā)明的棒桿狀菌具有其中的對L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制被基本上脫敏的天冬氨酸激酶(突變型AK)，其中的編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的DNA(dapB)被增強。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的棒桿狀菌為其中的編碼二氫吡啶二羧酸合酶DNA(dapA)被進(jìn)一步增強的棒桿狀菌。在更為優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的棒桿狀菌為其中的編碼二氨基庚二酸脫羧酶的DNA(lysA)被進(jìn)一步增強的棒狀細(xì)菌。在更為優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的棒桿狀菌為其中的編碼二氨基庚二酸脫氫酶的DNA(ddh)被進(jìn)一步增強的棒狀細(xì)菌。
術(shù)語“增強”DNA這里指這樣的事實，即由該DNA編碼的細(xì)胞內(nèi)酶活性通過以下方法加以提高，例如，增加基因的拷貝數(shù)，使用強的啟動子，使用編碼具有高度特異活性酶的基因，或聯(lián)合這些方法。
具有突變型AK的棒狀細(xì)菌可以是那些由于突變而產(chǎn)生突變型天冬氨酸激酶的棒桿狀菌或那些通過導(dǎo)入突變型lvsC而轉(zhuǎn)化的棒桿狀菌。
用于穿入上述DNA的棒桿狀菌實例包括，例如，下面的產(chǎn)L-賴氨酸野生型菌株；
嗜乙酰棒桿菌 ATCC 13870；醋谷棒桿菌 ATCC 15806；美棒桿菌 ATCC 15991；谷氨酸棒桿菌 ATCC 13032；擴展短桿菌 ATCC 14020；乳發(fā)酵短桿菌 ATCC 13869；百合花棒桿菌 ATCC 15990；黃色短桿菌 ATCC 14067；Corynebacterium melassecolaATCC 17965；解糖短桿菌 ATCC 14066；Brevibacterium immariophilum ATCC 14068；玫瑰色短桿菌 ATCC 13825；生硫短桿菌 ATCC 19240；嗜氨微桿菌 ATCC 15354；嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌 AJ12340 (FERM BP-1539)。
除了上述菌株以外，可用作宿主的菌株包括，例如，源自前面提到菌株的具有產(chǎn)L-賴氨酸能力的突變型菌株。這種人工突變型菌株包括如下S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸(以下簡稱為“AEC”)抗性突變型菌株(乳發(fā)酵短桿菌AJ11082(NRRL B-1147)，日本專利公報Nos.56-1914、56-1915、57-14157、57-14158、57-30474、58-10075、59-4993、61-35840、62-24074、62-36673、5-11958、7-112437、以及7-112438)；需要氨基酸如L-高絲氨酸用于其生長的突變型菌株(日本專利公報Nos.48-28078及56-6499)；對AEC顯示抗性并需要氨基酸如L-亮氨酸、L-高絲氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸及L-纈氨酸的突變型菌株(美國專利Nos.3,708,395和3,825,472)對DL-α-氨基-∈-己內(nèi)酰胺、α-氨基-月桂酰內(nèi)酰胺、天冬氨酸類似物、磺胺藥物、醌型(quinoid)、及N-月桂酰亮氨酸顯示抗性的產(chǎn)L-賴氨酸突變型菌株對氧化蘆薈酸(oxyaloacetate)脫羧酶或呼吸系統(tǒng)酶抑制劑顯示抗性的產(chǎn)L-賴氨酸突變型菌株(日本專利公報Nos.50-53588，50-31093，52-102498，53-9394，53-86089，55-9783，55-9759，56-32995和56-39778，以及日本專利公報Nos.53-43591和53-1833)；需要肌醇或醋酸的產(chǎn)L-賴氨酸突變型菌株(日本專利公報Nos.55-9784和56-8692)；對氟代丙酮酸或低于34℃的溫度顯示敏感性的產(chǎn)L-賴氨酸突變型菌株(日本專利公報Nos.55-9783和53-86090)；以及對乙二醇顯示抗性并產(chǎn)生L-賴氨酸的短桿菌屬或棒狀桿菌屬突變型菌株(美國專利No.4,411,997)。
在具體的實施方案中，為了增強上述宿主中L-賴氨酸生物合成的基因，基因通過用質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)座子或噬菌體載體等導(dǎo)入宿主。當(dāng)導(dǎo)入時，預(yù)期甚至通過用低拷貝型載體造成某種程度的增強。然而，使用多拷貝型載體是優(yōu)選的。這種載體包括，例如，上述的質(zhì)粒載體、pAJ655、pAJ1844、pAJ611、pAJ3148、以及pAJ440，除此之外，源自棒桿狀菌的轉(zhuǎn)座子在以下文獻(xiàn)中被描述，包括WO02/02627和WO93/18151的國際公開手冊，歐洲專利公報No.445385，日本專利公報No.6-46867，Vertes，A.A.等.，分子微生物學(xué).，14，571-581(1994)Vevtes，A.A，分子及普通遺傳學(xué).，245,397-405(1994)，Jagar，W.等.，F(xiàn)EMS微生物學(xué)快訊，126，1-6(1995)，日本專利公報No7-107976，日本專利公報No7-327680等。
在本發(fā)明中，突變型lysC必需被增強是不必要的。也可使用那些在染色體DNA中具有l(wèi)ysC突變，或突變型lysC插入其染色體DNA中的菌株，或者，突變型lysC可通過使用質(zhì)粒載體而導(dǎo)入。另一方面，為了有效地制備L-賴氨酸，dapA、dapB、lvsA及ddh優(yōu)選被增強。
lysC、dapA、dapB、lysB及ddh的每種基因可通過分別使用不同的載體而相繼導(dǎo)入宿主中?；蛘?，2種、3種、4種或5種基因可用一個載體一起導(dǎo)入。當(dāng)使用不同的載體時，基因可用任何順序?qū)?，然而，使用在宿主中具有穩(wěn)定的共享和駐留(harboring)機制并能夠彼此共存的載體是優(yōu)選的。
具有突變型AK并進(jìn)一步包括增強dapB的棒桿狀菌通過，例如，將能在棒桿狀菌細(xì)胞中自主復(fù)制的含有突變型lysC和dapB的重組DNA導(dǎo)入宿主棒桿狀菌中而獲得。
除了突變型lysC和dapB以外還進(jìn)一步包括增強dapA的棒桿狀菌，例如，通過將能在棒桿狀菌細(xì)胞中自主復(fù)制含有突變型lysC、dapB、dapA的重組DNA導(dǎo)入宿主棒桿狀菌中而獲得。
除了突變型lysC、dapB和dapA以外，還進(jìn)一步包括增強ddh的棒桿狀菌例如，通過將能在棒桿狀菌細(xì)胞中自主復(fù)制的含有突變型lysC、dapB、dapA、lysA和ddh的重組DNA導(dǎo)入宿主棒桿狀菌中而獲得。
上面提到的重組DNA可通過，例如，將參與L-賴氨酸生物合成的每個基因插入載體的上述的質(zhì)粒載體、轉(zhuǎn)座子或噬菌體載體中而獲得。
在質(zhì)粒用作載體的情況，重組DNA可根據(jù)電脈沖方法(Sugimoto等.，日本專利公報No.2-207791)導(dǎo)入宿主中。使用轉(zhuǎn)座子的基因擴增可通過將帶有轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞并誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)位而完成。(3)制備L-賴氨酸的方法L-賴氨酸可通過以下方法有效地制備，包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，培養(yǎng)包括上述用于L-賴氨酸生物合成增強基因的棒桿狀菌，在細(xì)菌培養(yǎng)液中制備和積累L-賴氨酸以及從培養(yǎng)液中收集L-賴氨酸。
待用的培養(yǎng)基通過含有碳源、氮源、無機鹽和任選其它有機成分的普通培養(yǎng)基加以說明。
作為碳源、使用糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜及淀粉水解物；和有機酸如延胡索酸、檸檬酸、及琥珀酸是可能的。
作為碳源，使用無機銨鹽如硫酸銨、氯化銨和磷酸銨；有機氮如大豆水解物；氨氣；以及氨水是可能的。
作為有機微量營養(yǎng)源，含有適當(dāng)量的必需物質(zhì)如維生素B1和L-高絲氨酸或酶母提取物等是必要的。除了上述成分外，如果必要，加入小量的磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。
培養(yǎng)優(yōu)選在有氧條件下進(jìn)行約30至90小時。培養(yǎng)過程中培養(yǎng)溫度優(yōu)選控制在25℃至37℃，且pH優(yōu)選控制在5至8。無機或有機、酸性或堿性物質(zhì)，或氨氣等可用于pH調(diào)節(jié)。通過結(jié)合普通的離子交換樹脂方法、沉淀方法及其它已知方法可從培養(yǎng)液中收集L-賴氨酸。
附圖簡述

圖1說明了包含突變型lysC質(zhì)粒p399AKYB和p399AK9B的構(gòu)建方法。
圖2說明了包含dapB和Brevi.-ori的質(zhì)粒pDPRB的構(gòu)建方法。
圖3說明了包含dapA和Brevi.-ori的質(zhì)粒pDPSB的構(gòu)建方法。
圖4說明了包含lysA的質(zhì)粒p299LYSA的構(gòu)建方法。
圖5說明了包含lysA和Brevi.-ori的質(zhì)粒pLYSAB的構(gòu)建方法。
圖6說明了包含ddh和Brevi.-ori的質(zhì)粒pPK4D的構(gòu)建方法。
圖7說明了包含lysC、dapB和Brevi.-ori的質(zhì)粒pCRCAB的構(gòu)建方法。
圖8說明了包含突變型lysC、dapB.和Brevi.-ori的質(zhì)粒的pCB的構(gòu)建方法。
圖9說明了包含dapA、dapB和Brevi.-ori的質(zhì)粒pAB的構(gòu)建方法。
圖10說明了包含ddh和lysA的質(zhì)粒p399DL的構(gòu)建方法。
圖11說明了包含ddh、lysA和Brevi.-ori的質(zhì)粒pDL的構(gòu)建方法。
圖12說明了包含突變lysC、dapA、dapB和Brevi.-ori的質(zhì)粒pCAB的構(gòu)建方法。
圖13說明了包含突變型lysC、dapA、dapB、lysA和Brevi.-ori的質(zhì)粒pCABL的構(gòu)建方法。
圖14說明了包含突變型lysC.、dapA、dapB、ddh、lysA、和Brevi-ori的質(zhì)粒pCABDL的構(gòu)建方法。
優(yōu)選實施方案描述本發(fā)明將在下面參考實施例更為具體地加以解釋。
實施例1從乳發(fā)酵短桿菌中制備野生型lysC基因和突變型lysC基因<1>野生型和突變型lysC的制備和含有它們的質(zhì)粒的制備乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869菌株和通過突變處理獲自ATCC 13869菌株的產(chǎn)L-賴氨酸突變菌株AJ3445(FERM P-1944)用作染色體DNA供體。將AJ3445菌株進(jìn)行突變處理從而使lysC發(fā)生改變以包括對賴氨酸和蘇氨酸協(xié)同抑制的基本上脫敏(生物化學(xué)雜志，68，701-710(1970))。
含有l(wèi)ysC的DNA片段用PCR方法從染色體DNA中擴增(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；見White，T.J.等.，遺傳學(xué)動態(tài).，5，185(1989))。為了根據(jù)爺氨酸棒桿菌的已知序列(見分子微生物學(xué)(1991)，5(5)，1197-1204；和分子和普通遺傳學(xué).，(1990)，224，317-324)擴增編碼lysC的約1,643bp的區(qū)域，對于用于擴增的DNA引物，合成具有列于序列1和2中核苷酸序列的23聚體和21聚體單鏈DNA，DNA用Applied Biosystems生產(chǎn)的380B型DNA合成儀和用亞磷酰胺方法(見四面體通訊(1981)，22，1859)以普通方法合成。
基因用Takara Shuzo生產(chǎn)的PJ2000型DNA熱循環(huán)儀和用Taq DNA聚合酶根據(jù)供應(yīng)商指定的方法通過PCR擴增。擴增的1,643kb的基因片段通過瓊脂糖凝膠電泳加以確證。之后，從凝膠中切下的片段根據(jù)普通方法加以純化，并以限制性酶NruI(Takara Shuzo生產(chǎn))和EcoRI(Takara Shuzo生產(chǎn))消化。
pHSG399(見Takeshita，S.等.，基因(1987)，61，63-74)用作基因片段的克隆載體。pHSG399從限制性酶Smal(由Takara Shuzo生產(chǎn))和EcoRI消化，并與擴增的lysC片段連接。DNA根據(jù)指定的方法用DNA連接試劑盒(由Takara Shuzo生產(chǎn))連接。這樣制備其中的擴增自乳發(fā)酵短桿菌染色體的lysC片段分別與pHSG399連接的質(zhì)粒。包括來自ATCC 13869(野生型菌株)lysC的質(zhì)粒命名為p399AKY，但包括來自AJ3463(L-賴氨酸生產(chǎn)菌)lysC的質(zhì)粒命名為p399AK9。
具有能使質(zhì)粒在棒桿狀菌屬細(xì)菌中自主復(fù)制能力的DNA片段(下文稱為“Brevi.-ori”)分別導(dǎo)入p399AKY和p399AK9中以制備能在棒桿狀菌屬細(xì)菌中自主復(fù)制的帶有l(wèi)ysC的質(zhì)粒。Brevi.-ori從含有Brevi.-ori并既能在大腸桿菌細(xì)胞中又能在棒桿狀菌屬細(xì)菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒載體pHK4中制備。通過以KpnI(Takara Shuzo生產(chǎn))和BamHI(Takara Shuzo生產(chǎn))消化pHC4，回收Brevi.-ori片段，并將其與也以KpnI和BamHI消化的pHSG298(見日本專利公報No.5-7491)連接。pHK4賦予宿主卡那霉素抗性。帶有pHK4的大腸桿菌命名為大腸桿菌AJ13136，并以FERM BP-5186的保藏號于1995年8月1日保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵政編碼305，日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號)。
pHK4以限制酶KpnI知BamHI消化，并將切割邊緣的末端變平。平末端形成通過用DNA變平試劑盒(Takara Shuzo生產(chǎn))以指定的方法完成。平末端形成以后，磷酸化的BamHI接頭(Takara Shuzo生產(chǎn))被連接以造成修飾從而使相應(yīng)于Brevi.-ori的DNA片段可僅用BamHI消化而從pHK4中切下。此質(zhì)粒以BamHI消化，且得到的Brevi.-ori DNA片段分別與也以BamHI消化的p399AKY和p399AK9連接以制備每個含有能在棒桿狀菌屬細(xì)菌中自主復(fù)制的lysC基因的質(zhì)粒。
含有源自p399AKY野生型lysC基因的質(zhì)粒命名為p399AKYB，且含有源自p399AK9突變型lysC基因的質(zhì)粒命名為p399AK9B。p399AK9B和p399AKYB的構(gòu)建方法列于圖1中。通過將突變型lysC質(zhì)粒p399AK9B導(dǎo)入乳發(fā)酵短桿菌野生型菌株中(AJ12036菌株，EFRMBP-734)而獲得的菌株AJ12691以FERM P-12918的保藏號于1992年4月10日保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵政編碼305日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號)，根據(jù)布達(dá)佩斯條約于1995年2月10日轉(zhuǎn)為國際保藏，且保藏號為FERM BP-4999。<2>源自乳發(fā)酵短桿菌野生型lysC和突變型lysC核苷酸序列的測定含有野生型lysC的質(zhì)粒p399AKY和含有突變型lysC的質(zhì)粒p399AK9從各自的轉(zhuǎn)化子中制備以測定野生型和突變型lysC的核苷酸序列。核苷酸序列測定根據(jù)Sanger等的方法(例如，F(xiàn).Sanger等.，美國國家科學(xué)院院報.，74，5463(1977))完成。
由p399AKY編碼的野生型lysC核苷酸序列列于序列表的序列3中。另一方面，由p399AK9編碼的突變型lysC核苷酸序列僅具有一個核苷酸的突變從而與野生型lysC相比，1051位的G變成序列3中的A。已知谷氨酸棒桿菌的lysC具有兩個亞基(α，β)，被編碼于相同閱讀框中的相同DNA鏈上(見Kalinowski，J.等.，分子微生物學(xué)(1991)5(5)，1197-1204)。根據(jù)同源性判斷，據(jù)認(rèn)為這里測序的基因也具有2個亞基(α，β)，被編碼于相同閱讀框中的相同DNA鏈上。
推斷自DNA核苷酸序列的野生型AK蛋白α-亞基氨基酸序列與其DNA序列一起列于序列4中。序列5中僅列有氨基酸序列。推斷自DNA核苷酸序列的野生型AK蛋白β-亞該氨基酸序列與DNA一起列于序列6中。序列7中僅列有氨基酸序列。在每個亞基中，GTG用作起始密碼子，且相應(yīng)的氨基酸由甲硫氨酸所代表。然而，此代表涉及甲硫氨酸、纈氨酸或甲酰甲硫氨酸。
另一方面，在突變型lysC序列中的突變意味著氨基酸殘基替代的發(fā)生從而在野生型AK蛋白的氨基酸序列中α-亞基的279位的丙氨酸殘基變成蘇氨酸殘基，且β-亞基的30位點丙氨酸殘基變成蘇氨酸殘基(序列5，7)。
實施例2從乳發(fā)酵短桿菌中制備dapB<1>dapB的制備和含有dapB質(zhì)粒的構(gòu)建野生型乳發(fā)酵短桿菌菌株ATCC 13869用作染色體DNA供體。根據(jù)普通方法從ATCC 13869菌株中制備染色體DNA。含有dapB的DNA片段用PCR從該染色體DNA中擴增。對于用于擴增的DNA引物，為了根據(jù)乳發(fā)酵短桿菌已知的序列(見細(xì)菌學(xué)雜志，157(91)，2743-2749(1993))擴增編碼DDPR的約2.0kb的區(qū)域，合成分別具有序列表中序列8和9描述核苷酸序列的23聚體DNA。DNA合成和PCR以實施例1中描述的相同的方式完成。PCR-Script(Invitrogen生產(chǎn))用作與擴增dapB片段連接的2,001bp擴增基因片段的克隆載體。因此構(gòu)建質(zhì)粒，其中的擴增自乳發(fā)酵短桿菌染色體的2,001bp dapB片段與PCR-Script連接。具有源自ATCC 13869 dapB的上述獲得的質(zhì)粒命名為pCRDAPB。通過將pCRDAPB導(dǎo)入大腸桿菌JM109菌株而獲得的轉(zhuǎn)化子菌株AI13107已于1995年5月26日根據(jù)布達(dá)佩斯條約以FERM BP-5114的保藏號國際保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵政編碼305日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號)。
含有DDPR結(jié)構(gòu)基因的1,101bp的片段通過以EcoRV和SphI消化pCRDAPB而回收。此片段與以HincII和SphI消化的pHSG399連接以制備質(zhì)粒。制備的質(zhì)粒命名為p399DPR。
將Brevi.-ori導(dǎo)入制備的p399DPR中以構(gòu)建能在棒桿狀菌中自主復(fù)制并帶有dapB的質(zhì)粒。pHK4以限制性酶KpnI(Takara Shuzo)消化且將切割邊緣變?yōu)槠侥┒?。平末端形成通過用DNA平齊試劑盒(TakaraShuzo生產(chǎn))根據(jù)指定的方法完成。平末端形成以后，連接磷酸化的BamHI接頭(Takara Shuzo生產(chǎn))以造成修飾從而使相應(yīng)于Brevi.-ori部分的DNA片段可僅以BamHI消化從pHK4中切下。此質(zhì)粒以BamHI消化，且產(chǎn)生的Brevi.-ori DNA片段與也以BamHI消化的p399DPR連接以制備能在棒桿狀菌中自主復(fù)制含有dapB的質(zhì)粒。制備的質(zhì)粒命名為pDPRB。pDPRB的構(gòu)建方法列于圖2。<2>來自乳發(fā)酵短桿菌dapB核苷酸序列的測定從具有p399DR的AJ13107菌株制備質(zhì)粒DNA，且其核苷酸序列以與實施例1中描述的相同方式測定。測定的核苷酸序列和從該核苷酸序列推斷的氨基酸序列列于序列10中。序列11中僅列有氨基酸序列。
實施例3來自乳發(fā)酵短桿菌dapA的制備<1>dapA的制備和含有dapA質(zhì)粒的構(gòu)建野生型乳發(fā)酵短桿菌菌株ATCC 13869用作染色體DNA供體。染色體DNA根據(jù)普通方法從ATCC 13869菌株中制備。含有dapA的DNA片段用PCR從染色體DNA中擴增。對于用于擴增的DNA引物，為了根據(jù)谷氨酸棒桿菌的已知序列(見核酸研究，18(21)，6421(1990)；EMBL接受號No.X53993)擴增編碼DDPS的約1.5kb的區(qū)域，合成分別具有序列表中序列12和13所列核苷酸序列的20聚體DNA。DNA合成和PCR以與實施例1中描述的相同方式完成。pCR1000(Invitrogen生產(chǎn)，見生物/技術(shù)，9，657-663(1991))用作與擴增的dapA片段連接的1,411bp擴增基因片段的克隆載體。DNA連接通過用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo生產(chǎn))根據(jù)指定的方法完成。因此構(gòu)建出質(zhì)粒，其中的擴增自乳發(fā)酵短桿菌染色體的1,411bp的dapA片段與pCR1000連接。具有源自ATCC 13869dapA的上述獲得的質(zhì)粒命名為pCRDAPA。
通過將pCRDAPA導(dǎo)入大腸桿菌JM109菌株而獲得的轉(zhuǎn)化子菌株AJ13106已于1995年5月26日根據(jù)布達(dá)佩斯條約以FERM BP-5113的保藏號國際保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵政編碼305日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號)。
將Brevi.-ori導(dǎo)入制備的pCRDAPA中以構(gòu)建能在棒桿狀菌中自主復(fù)制帶有dapA的質(zhì)粒。pHK4以限制性酶KpnI和BamHI(TakaraShuzo)消化且將切割的邊緣末端平齊化。平末端形成通過用DNA平齊化試劑盒(Takara Shuzo生產(chǎn))以指定的方法。平末端形成以后，連接磷酸化的SmaI接頭(Takara Shuzo生產(chǎn))以造成修飾從而使相應(yīng)于Breri.-ori部分的DNA片段可僅以SmaI消化從pHK4中切下。此質(zhì)粒以SmaI消化，且產(chǎn)生的Breri.-ori DNA片段與也以SmaI消化的pCRDAPA連接以制備能在棒桿狀菌中自主復(fù)制含有dapA的質(zhì)粒。此質(zhì)粒命名為pDPSB。pDPSB(kmr)的構(gòu)建方法列于圖3。<2>來自乳發(fā)酵短桿菌dapA核苷酸序列的測定從具有pCRDAPA的AJ13106桿菌中制備質(zhì)粒DNA，且其核苷酸序列以與實施例1中描述的相同的方式測定。測定的核苷酸序列和以該核苷酸序列推斷的氨基酸序列列于序列14中。序列15中僅列有氨基酸序列。
實施例4從乳酸發(fā)酵短桿菌中制備lysA<1>lysA的制備和含有l(wèi)ysA質(zhì)粒的構(gòu)建野生型乳發(fā)酵短桿菌菌株ATCC 13869用作染色體DNA供體。根據(jù)普通方法從ATCC 13869菌株中制備染色體DNA。用PCR從染色體DNA中擴增含有argS、lvsA和含有它們操縱子中的啟動子的DNA片段。對于用于擴增的DNA引物，為了根據(jù)谷氨酸棒桿菌已知的序列(見分子微生物學(xué)，4(11)，1819-1830(1990)；分子和普通遺傳學(xué)，212，112-119(1988))擴增編碼精氨酰-tRNA合酶和DDC的約3.6kb的區(qū)域，使用分別具有序列表中序列16和17中描述核苷酸序列的23聚體合成DNA。DNA的合成和PCR以與實施例1中描述的相同方式完成。pHSG399用作3,579bp擴增基因片段的克隆載體。與含有擴增lysADNA片段連接的pHSG399以限制性酶SmaI(Takara Shuzo生產(chǎn))消化。具有源自ATCC 13869 lysA的按上述獲得的質(zhì)粒命名為p399LYSA。
含有l(wèi)ysA的DNA片段通過以KpnI(Takara Shuzo生產(chǎn))和BamHI(Takara Shuzo生產(chǎn))消化p399LYSA而回收。此DNA片段與已以kpnI和BamHI消化的pHSG299連接。獲得的質(zhì)粒命名為p299LYSA。p299SLYA的構(gòu)建方法列于圖4中。
將Brevi.-ori導(dǎo)入獲得的p299LYSA以構(gòu)建能在棒桿狀菌中自主復(fù)制帶有l(wèi)ysA的質(zhì)粒。pHK4以限制性酶kpnI和BamHI消化，并將切割的邊緣末端平齊化。平末端形成用DNA補平劑盒(Takara Shuzo生產(chǎn))以指定的方法完成。平末端形成以后，連接磷酸化的KpnI接頭(TakaraShuzo制備)以造成修飾從而使相應(yīng)于Brevi.-ori部分的DNA片段可僅以KpnI消化從pHK4中切下。此質(zhì)粒以KpnI消化，且產(chǎn)生的Brevi.-ori DNA片段與也已KpnI消化的p299LYSA連接以制備能在棒桿狀菌中自主復(fù)制含有l(wèi)ysA的質(zhì)粒。制備的質(zhì)粒命名為pLYSAB。pLYSAB的構(gòu)建方法列于圖5。<2>來自乳發(fā)酵短桿菌lysA核苷酸序列的測定以與實施例1中描述的相同方式制備p299LYSA質(zhì)粒DNA并測定其核苷酸序列。測定的核苷酸序列及推斷的由此核苷酸序列編碼的氨基酸序列列于序列18中。關(guān)于核苷酸序列，由argS編碼的氨基酸序列和由lysA編碼的氨基酸序列分別列于序列19和20中。
實施例5從乳發(fā)酵短桿菌制備ddhddh基因通過用根據(jù)谷氨酸棒桿菌ddh基因的已知核苷酸序列(Ishino.，S.等.，核酸研究.，15，3917(1987))而制備的2個寡核苷酸引物(序列21，22)用PCR方法從乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869的染色體DNA中通過擴增ddh基因而獲得。獲得的擴增DNA片段以EcoT 22I和AvaI消化并使切割邊緣末端平齊。之后，將此片段插入pMW119的SmaI位點以獲得質(zhì)粒pDDH。
其次，pDDH以SalI和EcoRI消化，接著形成平末端。之后，將獲得的片段與以SmaI消化的pUC18連接。這樣獲得的質(zhì)粒命名為pUC18DDH。
將Brevi.-ori導(dǎo)入pUC18DDH中以構(gòu)建能在棒桿狀菌中自主復(fù)制帶有ddh的質(zhì)粒。pHK4以限制性酶KpnI和BamHI消化，并使切割的邊緣末端平齊化。平末端形成用DNA平齊化試劑盒(Takara Shuzo生產(chǎn))以指定的方法完成。平末端形成以后，連接磷酸化的PstI接頭(TakaraShuzo生產(chǎn))從而使其插入到pHSG299的PstI位點。按上述構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pPK4。然后，pUC18DDH以XbaI和KpnI消化，并且產(chǎn)生的片段與以KpnI和XbaI消化的pPK4連接。因此，能在棒桿狀菌中自主復(fù)制含有ddh的質(zhì)粒得以構(gòu)建。此質(zhì)粒命名為pPK4D。pPK4D的構(gòu)建方法列于圖6中。
實施例6包括突變型lysC和dapA組合的質(zhì)粒的構(gòu)建包括突變lysC、dapA和棒桿狀菌復(fù)制起點的質(zhì)粒從包括dapA的質(zhì)粒pCRDAPA和包括突變型lysC和Brevi.-ori的質(zhì)粒p399AK9B中構(gòu)建。p399AK9B以SalI完全消化，且然后使其末端平齊化，并與EcoRI接頭連接以構(gòu)建子連接以構(gòu)建其中的SalI位點被修飾成EcoRI位點的質(zhì)粒。獲得的質(zhì)粒命名為p399AK9BSE。通過以EcoRI部分消化p399AK9BSE，突變型lysC和Brevi.-ori被切割成一個片段。此片段與以EcoRI消化的pCRDAPA連接。獲得的質(zhì)粒命名為pCRCAB。此質(zhì)?？稍诖竽c桿菌和棒桿狀菌中自主復(fù)制，并且其賦予宿主卡那霉素抗性，質(zhì)粒包括突變型lysC和dapA的組合。pCRCAB的構(gòu)建方法列于圖7。
實施例7包括突變型lysC和dapB組合的質(zhì)粒的構(gòu)建包括突變型lysC和dapB的質(zhì)粒構(gòu)建自具有突變型lysC的質(zhì)粒p399AK9和具有dapB的質(zhì)粒p399DPR。含有DDPR結(jié)構(gòu)基因的1,101bp的片段通過以EcoRV和SphI消化p399DPR而回收。此片段與以SalI消化且然后末端平齊并從SphI進(jìn)一步消化的p399AK9以構(gòu)建包括突變型lysC和darB組合的質(zhì)粒。此質(zhì)粒命名為p399AKDDPR。
然后，將Brevi.-ori導(dǎo)入獲得的p399AKDDPR。含有Brevi.-ori的質(zhì)粒pHK4以限制性酶KpnI(Takara Shuzo生產(chǎn))消化，并將切割邊緣末端平齊化。平末端形成用DNA平齊化試劑盒(Takara Shuzo生產(chǎn))以指定的方法完成。平末端形成以后，連接磷酸化的BamHI接頭(TakaraShuzo生產(chǎn))以造成修飾從而使相應(yīng)于Brevi.-ori部分的DNA片段可僅以BamHI消化從pHK4中切下。此質(zhì)粒以BamHI消化，且將產(chǎn)生的Brevi.-ori DNA片段與也從BamHI消化的p399AKDDPR連接以構(gòu)建能在棒桿狀菌中自主復(fù)制含有突變型lysC和dapB的質(zhì)粒構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pCB。pCB的構(gòu)建方法列于圖8。
實施例8包括dapA和dapB組合質(zhì)粒的構(gòu)建包括dapA的質(zhì)粒pCRDAPA以KpnI和EcoRI消化以回收含有dapA的DNA片段，并將其與以KpnI和EcoRI消化的載體質(zhì)粒pHSG399連接。獲得的質(zhì)粒命名為p399DPS。
另一方面，包括dapB的質(zhì)粒pCRDAPB從SacII和EcoRI消化以回收含有編碼DDPR區(qū)域的2.0kb的DNA片段，并與以SacII和EcoRI消化的p399DPS連接以構(gòu)建包括dapA和dapB組合的質(zhì)粒。獲得的質(zhì)粒命名為p399AB。
然后，將Brevi.-ori導(dǎo)入p399AB中。含有Brevi.-ori pHK4以限制性酶BamHI(Takara Shuzo生產(chǎn))消化，并將切割的邊緣末端平齊。平末端形成用DNA平齊化試劑盒以指定的方法(Takara Shuzo生產(chǎn))完成。平末端形成以后，連接磷酸化的KpnI接頭(Takara Shuzo生產(chǎn))以造成修飾從而使相應(yīng)于Brevi.-ori部分的DNA片段可僅以KpnI消化從pHK4中切下。此質(zhì)粒以KpnI消化，且產(chǎn)生的Brevi.-ori DNA片段與也以KpnI消化的p399AB連接以構(gòu)建能在棒桿狀菌中自主復(fù)制含有dapA和darpB的質(zhì)粒。構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pAB。pAB的構(gòu)建方法列于圖9。
實施例9包括ddh和lysA組合的質(zhì)粒的構(gòu)建包括ddh的質(zhì)粒pUC18DDH以EcoRI和XbaI消化以回收含ddh的DNA片段。此ddh片段與包括lysA的質(zhì)粒p399LYSA連接，該質(zhì)粒以BamHI和XbaI消化，消化后的切割邊緣被末端平齊化。獲得的質(zhì)粒命名為p399DL。p399DL的構(gòu)建方法列于圖10。
然后，將Brevi.-ori導(dǎo)入p399DL中。pHK4從XbaI和BamHI消化，并將切割的邊緣末端平齊化。平末端形成以后，連接磷酸化的XbaI接頭以造成修飾從而使相應(yīng)于Brevi.-ori部分的DNA片段可僅從XbaI消化從pHK4中切下。此質(zhì)粒從XbaI消化，并將產(chǎn)生的Brevi.-ori DNA片段與也從XbaI消化的p399DL連接以構(gòu)建能在棒桿狀菌中自主復(fù)制含有ddh和lysA的質(zhì)粒。構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pDL。pDL的構(gòu)建方法列于圖11中。
實施例10包括突變型lysC、dapA和dapB組合質(zhì)粒的構(gòu)建p399DPS以EcoRI和SphI消化以形成平末端然后回收dapA基因片段。此片段與以SalI消化并且末端平齊化的p399AK9連接以構(gòu)建突變型lysC和dapA在其中共存的質(zhì)粒p399CA。
包括dapB的質(zhì)粒pCRDAPB以EcoRI消化且將末端平齊化，然后以SacI消化以回收包括dapB的2.0kb的DNA片段。包括dapA和突變型lysC的質(zhì)粒p399CA以SpeI消化并使末端平齊化，之后以SacI消化并與回收的dapB片段連接以獲得包括突變型lysC、dapA和dapB的質(zhì)粒。此質(zhì)粒命名為p399CAB。
然后，將Brevi.-ori導(dǎo)入p399CAB。包括Brevi.-ori的質(zhì)粒pHK4以限制性酶BamHI(Takara Shuzo生產(chǎn))消化，并使切割的邊緣末端平齊化。平末端形成用DNA平齊化試劑盒(Takara Shuzo生產(chǎn))以指定的方法完成。平末端形成以后，連接磷酸化的KpnI接頭(Takara Shuzo生產(chǎn))以造成修飾從而使相應(yīng)于Brevi.-ori部分的DNA片段可僅從KpnI消化而從pHk4中切下。此質(zhì)粒以kpnI消化，并將產(chǎn)生的Brevi.-ori DNA片段與也以kpnI消化的p399CAB連接以構(gòu)建能在棒桿狀菌中自主復(fù)制包括突變型lysC、dapA和dapB組合的質(zhì)粒。構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pCAB。pCAB的構(gòu)建方法列于圖12中。
實施例11包括突變型lysC.
dapA、dapB和lysA組合的質(zhì)粒的構(gòu)建包括lysA的質(zhì)粒p299 LYSA以kpnI和Bam HI消化并將未端平齊化，且然后回收lysA基因片段。此片段與以HpaI(Takara Shuzo生產(chǎn))消化并末端平齊化的pCAB連接以構(gòu)建能在棒桿狀菌中自主復(fù)制包括突變型lysC、dapA、dapB及l(fā)ysA組合的質(zhì)粒。構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pCABL。pCABL的構(gòu)建方法列于圖13。應(yīng)該注意到lysA基因片段插入到pCABL中含有dapG基因DNA片段中的HpaI位點，然而HpaI位點位于dapB基因啟動子(序列10中第611至616個核苷酸)的上游，且dapB基因沒有被脫偶聯(lián)。
實施例12包括突變型lysC、depA、dapB、ddh及l(fā)ysA組合的質(zhì)粒的構(gòu)建pHSG299以XbaI和KpnI消化，并與以XbaI和KpnI消化的包括ddh和lysA的p399DL連接。構(gòu)建的質(zhì)粒命名為p299DL。p299DL以XbaI和KpnI消化并將末端平齊化。平末端形成以后，回收包括ddh和lysA的DNA片段。此DNA片段與以HpaI消化并使末端平齊化包括突變型lysC、dapA和dapB組合的質(zhì)粒pCAB連接以構(gòu)建能在棒桿狀菌中自主復(fù)制包括突變型lysC、dapA、dapB、lysA和ddh組合的質(zhì)粒。構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pCABDL。pCABDL的構(gòu)建方法列于圖14。
實施例13包括用于L-賴氨酸生物合成基因的質(zhì)粒向乳發(fā)酵短桿菌產(chǎn)L-賴氨酸菌中的導(dǎo)入包括L-賴氨酸生物合成基因的質(zhì)粒按上述構(gòu)建，即將p399AK9B(Cmr)、pDPSB(Kmr)、pDPRB(Cmr)、pLYSAB(Cmr)、pPK4D(Cmr)、pCRCAB(Kmr)、pAB(Cmr)、pCB(Cmr)、pDL(Cmr)、pCAB(Cmr)、pCABL(Cmr)及pCABDL(Cmr)分別導(dǎo)入乳發(fā)酵短桿菌的產(chǎn)L-賴氨酸菌AJ11082(NRRL B-11470)中。AJ11082菌株具AEC抗性特征。質(zhì)粒以電脈沖方法(Sugimoto等.，日本專利公開No.2-207791)導(dǎo)入。根據(jù)各自質(zhì)粒所帶的藥物抗性標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化子。當(dāng)導(dǎo)入包括氯霉素抗性基因的質(zhì)粒時于含有5μg/ml的完全培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化子，或當(dāng)導(dǎo)入包括卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒時于含有25μg/ml卡那霉素的完全培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化子。
實施例14L-賴氨酸的制備實施例13中獲得的每種轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)于產(chǎn)L-賴氨酸培養(yǎng)基中以計算其L-賴氨酸的產(chǎn)率。L-賴氨酸制備培養(yǎng)基具有下面的組成。[L-賴氨酸制備培養(yǎng)基]
除碳酸鈣外溶解下面的成分(每1L)以用KOH調(diào)節(jié)pH至8.0。培養(yǎng)基于115℃滅菌15分鐘然后向其中加入在干燥狀態(tài)空氣中被單獨滅菌的碳酸鈣(50g)。
葡萄糖 100g(NH4)2SO455gKH2PO41gMgSO4·7H2O 1g生物素 500μg硫胺素 2000μgFeSO4·7H2O 0.01gMnSO4·7H2O 0.01g煙酰胺 5mg蛋白水解物(Mamenou)30ml碳酸鈣 50g各種轉(zhuǎn)化子和母本菌株中的每一種都接種至具有上述組成的培養(yǎng)基中從而于31.5℃進(jìn)行往復(fù)式振搖培養(yǎng)。培養(yǎng)40或72小時后產(chǎn)生的L賴氨酸量以及72小時后的生長(OD562)列于表1。在表中，lysC*代表突變型lysC。生長以101倍稀釋后測量560nm處的OD加以定量測定。
表1培養(yǎng)40或72小時后L-賴氨酸的積累菌株/質(zhì)粒 導(dǎo)入的基因 產(chǎn)生的L-賴氨酸量(g/L) 生長40小時后 72小時后(OD562/101)AJ11082 22.0 29.80.450AJ11082/p399AK9B lysC*16.8 34.50.398AJ11082/pDPSBdapA18.7 33.80.410AJ11082/pDRB dapB19.9 29.90.445AJ11082/pLYSAB lysA19.8 32.50.356AJ11082/pPK4Dddh 19.0 33.40.330AJ11082/pCRCAB lysC*，dapA19.7 36.50.360AJ11082/pAB dapA，dapB 19.0 34.80.390AJ11082/pCB lysC*，dapB23.3 35.00.440AJ11082/pDL ddh，lysA 23.3 31.60.440AJ11082/pCAB lysC*，dapA，dapB 23.0 45.00.425AJ11082/pCABLlvsC*，dapA，dapB.lvsA 26.2 46.50.379AJ11082/pCABDL lvsC*.dapA，dapB，lysA，ddh26.5 47.00.409如表1所示，當(dāng)突變型lysC、dapA或dapB被單獨增強時，培養(yǎng)72小時后產(chǎn)生的L-賴氨酸量大于或等于母本菌株產(chǎn)生的L-賴氨酸量，然而，培養(yǎng)40小時以后，產(chǎn)生的L-賴氨酸量小于母本菌株產(chǎn)生的L-賴氨酸量。即，在短期培養(yǎng)中L-賴氨酸產(chǎn)生速度降低。同樣地，當(dāng)突變型lysC和dapA，或dapA和dapB被聯(lián)合增強時，培養(yǎng)72小時后產(chǎn)生的L-賴氨酸量大于由母本菌株產(chǎn)生的L-賴氨酸量，然而，培養(yǎng)40小時后產(chǎn)生的L-賴氨酸量小于母本菌株產(chǎn)生的L-賴氨酸量。因此L-賴氨酸產(chǎn)生速度降低。
另一方面，當(dāng)lysA或ddh被單獨增強，或當(dāng)lysA和ddh被聯(lián)合增強時，培養(yǎng)40小時以后產(chǎn)生的L-賴氨酸量大于母本菌株產(chǎn)生的L-賴氨酸量，然而，經(jīng)長期培養(yǎng)后由于生長的下降，產(chǎn)生的L-賴氨酸量因此小于母本菌株產(chǎn)生的L-賴氨酸量。
相反，在其中的dapB與突變型lysC被一起增強的菌株中，生長加快，在短期培養(yǎng)中L-賴氨酸產(chǎn)生速度被成功恢復(fù)，并且在長期培養(yǎng)中積累的L-賴氨酸量也被提高。在其中的三種突變型lysC、dapA和dapB被同時增強的菌株中，L-賴氨酸產(chǎn)率進(jìn)一步提高。通過相繼增強lysA和ddh，L-賴氨酸產(chǎn)生速度和積累的L-賴氨酸量均逐漸提高。
工業(yè)上的可應(yīng)用性根據(jù)本發(fā)明，棒桿狀菌的產(chǎn)L-賴氨酸能力可被提高，并且生長速度也可被加快。
通過同時增強dapB與突變型lysC，產(chǎn)L-賴氨酸棒桿狀菌中L-賴氨酸生產(chǎn)速度可被提高，且產(chǎn)率也可提高。除了前面提到的基因以外通過相繼增強dapA、lysA及ddh，L-賴氨酸產(chǎn)生速度和產(chǎn)率可進(jìn)一步提高。
序列表(1)一般信息(i)申請人AJINOMOTO CO.，INC.(ii)發(fā)明題目L-賴氨酸制備方法(iii)序列數(shù)目24(iv)通訊地址(A)地址(B)街道(C)城市(E)國家(F)郵編(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.O，#1.30版(vi)當(dāng)前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)提交日期(C)分類(vii)優(yōu)先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朖P7-140614(B)提交日期1995年7月7日(viii)律師/事務(wù)所信息(A)名字(B)注冊號(ix)電訊信息(A)電話(B)電傳(2)序列1信息(i)序列特征(A)長度23個堿基
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成的DNA”(iv)反義無(xi)序列描述序列1TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 23(2)序列2信息(i)序列特征(A)長度21個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它...合成DNA(A)描述/desc＝“合成DNA”(iv)反義有(xi)序列描述序列2ACGGAATTCA ATCTTACGGC C 21(2)序列3信息(i)序列特征(A)長度1643個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iv)反義無(vi)最初來源(A)生物乳發(fā)酵短桿菌(B)菌株ATCC 13869(xi)序列描述序列3TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT CAACGCTGAT 720GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGGTGTC GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC1020GTTCTGGGTA TTTCCGATAA GCCAGGCGAG GCTGCCAAGG TTTTCCGTGC GTTGGCTGAT1080GCAGAAATCA ACATTGACAT GGTTCTGCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC1140GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTGAC GGACGCCGTG CGATGGAGAT CTTGAAGAAG1200CTTCAGGTTC AGGGCAACTG GACCAATGTG CTTTACGACG ACCAGGTCGG CAAAGTCTCC1260CTCGTGGGTG CTGGCATGAA GTCTCACCCA GGTGTTACCG CAGAGTTCAT GGAAGCTCTG1320CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATTGATT TCCACCTCTG AGATCCGCAT TTCCGTGCTG1380ATCCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTGCTGCA CGTGCATTGC ATGAGCAGTT CCAGCTGGGC1440GGCGAAGACG AAGCCGTCGT TTATGCAGGC ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTAGTT1500TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA1560CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT TCCCCGCGTT1620CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643(2)序列4信息(i)序列特征(A)長度1643個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iv)反義無(vi)最初來源(A)生物乳發(fā)酵短桿菌
(B)菌株ATCC 13869(ix)特征(A)名字/關(guān)鍵詞CDS(B)位置217..1482(xi)序列描述序列4TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT120GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG180GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG 234Met Ala Leu Val Val Gln15AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC 282Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Ile Arg Asn Val10 15 20GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT 330Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val25 30 35GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA 378Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala40 45 50GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG 426Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu55 60 65 70ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG 474Thr Ala Gly Glu 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Gln Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe185 190 195GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG858Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys Ile Leu Val Leu200 205 210CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC906Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg215 220 225 230TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG954Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ser Met Glu235 240 245GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG 1002Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys250 255 260TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG 1050Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu265 270 275GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC 1098Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp280 285 290ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC 1146Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile295 300 305 310ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG 1194Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu315 320 325AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC 1242Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp330 335 340CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA 1290Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro345 350 355GGT GTT ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC 1338Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn360 365 370ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT 1386Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg375 380 385 390GAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG 1434Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln395 400 405CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA 1482Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val 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Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly145 150 155160Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg165 170(2)序列8信息(i)序列特征(A)長度23個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iv)反義非(xi)序列描述序列8GGATCCCCAA TCGATACCTG GAA23(2)序列9信息(i)序列特征(A)長度23個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iv)反義是(xi)序列描述序列9CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT23(2)序列10信息(i)序列特征(A)長度2001個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iv)反義非(vi)最初來源(A)生物乳發(fā)酵短桿菌(B)菌株ATCC 13869(ix)特征(A)名字/關(guān)鍵詞CDS(B)位置730..1473(xi)序列描述序列10GGATCCCCAA TCGATACCTG GAACGACAAC CTGATCAGGA TATCCAATGC CTTGAATATT60GACGTTGAGG AAGGAATCAC CAGCCATCTC AACTGGAAGA CCTGACGCCT GCTCAATTGG 120ATCAGTGGCC CAATCGACCC ACCAACCAGG TTGGCTATTA CCGGCGATAT CAAAAACAAC 180TCGCGTGAAC GTTTCGTGCT CGGCAACGCG GATGCCAGCG ATCGACATAT CGGAGTCACC 240AACTTGAGCC TGCTGCTTCT GATCCATCGA CGGGGAACCC AACGGCGGCA AAGCAGTGGG 300GGAAGGGGAG TTGGTGGACT CTGAATCAGT GGGCTCTGAA GTGGTAGGCG ACGGGGCAGC 360ATCTGAAGGC GTGCGAGTTG TGGTGACCGG GTTAGCGGTT TCAGTTTCTG 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(B)菌株ATCC 13869(ix)特征(A)名字/關(guān)鍵詞CDS(B)位置533..2182(ix)特征(A)名字/關(guān)鍵詞CDS(B)位置2188..3522(xi)序列描述序列18GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGGCTGCACT GCAACGAGGT CGTAGTTTTG GTACATGGCT 60TCTGGCCAGT TCATGGATTG GCTGCCGAAG AAGCTATAGG CATCGCACCA GGGCCACCGA 120GTTACCGAAG ATGGTGCCGT GCTTTTCGCC TTGGGCAGGG ACCTTGACAA AGCCCACGCT 180GATATCGCCA AGTGAGGGAT CAGAATAGTG CATGGGCACG TCGATGCTGC CACATTGAGC 240GGAGGCAATA TCTACCTGAG GTGGGCATTC TTCCCAGCGG ATGTTTTCTT GCGCTGCTGC 300AGTGGGCATT GATACCAAAA AGGGGCTAAG CGCAGTCGAG GCGGCAAGAA CTGCTACTAC 360CCTTTTTATT GTCGAACGGG GCATTACGGC TCCAAGGACG TTTGTTTTCT GGGTCAGTTA 420CCCCAAAAAG CATATACAGA GACCAATGAT TTTTCATTAA AAAGGCAGGG ATTTGTTATA 480AGTATGGGTC GTATTCTGTG CGACGGGTGT ACCTCGGCTA GAATTTCTCC CC ATG 535Met1ACA CCA GCT GAT CTC GCA ACA TTG ATT AAA GAG ACC GCG GTA GAG GTT 583Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val Glu Val5 10 15TTG ACC TCC CGC GAG CTC GAT ACT TCT GTT CTT CCG GAG CAG GTA GTT 631Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gln Val Val20 25 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Asp Lys Asp Arg Val Val Ile Lys Ser Asp Gly290 295 300Asp Ala Ala Tyr Ile Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe305 310 315 320Ser Arg Gly His Asn Leu Asn Ile Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His325 330 335Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lys340 345 350Pro Glu Gly Val Glu Val Leu Ile Gly Gln Met Val Asn Leu Leu Arg355 360 365Asp Gly Lys Ala Val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr370 375 380Leu Asp Asp Leu Val Glu Ala Ile Gly Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Ser385 390 395 400Leu Ile Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp Ile Asp Leu Gly Leu405 410 415Trp Glu Ser Gln Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gln Tyr Gly420 425 430His Ala Arg Leu Cys Ser Ile Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Val435 440 445Thr Glu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly450 455 460Asp Leu Ile Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys Ala Ala465 470 475 480Ala Asp Leu Arg Glu Pro His Arg Ile Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu485 490 495Ala Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His Ile Leu Pro Lys500 505 510Val Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala515 520 525Ala Ala Thr Arg Gln Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val530 535 540Ser Ala Pro Glu Lys Met545 550(2)序列20信息(i)序列特征(A)長度445個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述序列20Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro1 5 10 15Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val20 25 30Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val35 40 45Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe50 55 60Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys65 70 75 80Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala85 90 95Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser100 105 110Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala115 120 125Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu130 135 140Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp145 150 155 160Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe165 170 175Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser180 185 190Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu195 200 205Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala210 215 220Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln225 230 235 240Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly245 250 255Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala260 265 270Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu275 280 285leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile290 295 300Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp305 310 315 320Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly325 330 335Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp340 345 350Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg355 360 365Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu370 375 380Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala385 390 395 400Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr405 410 415Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu420 425 430Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala435 440 445(2)序列21信息(i)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iv)反義無(xi)序列描述序列21CATCTAAGTA TGCATCTCGG 20(2)序列22信息(i)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iv)反義有(xi)序列描述序列22TGCCCCTCGA GCTAAATTAG 20(2)序列23信息(i)序列特征(A)長度1034個堿基(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iv)反義無(vi)最初來源(A)生物乳發(fā)酵短桿菌(B)菌株ATCC 13869(ix)特征(A)名字/關(guān)鍵詞CDS(B)位置61..1020(xi)序列描述序列23ATGCATCTCG GTAAGCTCGA CCAGGACAGT GCCACCACAA TTTTGGAGGA TTACAAGAAC 60ATG ACC AAC ATC CGC GTA GCT ATC GTG GGC TAC GGA AAC CTG GGA CGC108Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg1 5 10 15AGC GTC GAA AAG CTT ATT GCC AAG CAG CCC GAC ATG GAC CTT GTA GGA156Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly20 25 30ATC TTC TCG CGC CGG GCC ACC CTC GAC ACA AAG ACG CCA GTC TTT GAT204Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp35 40 45GTC GCC GAC GTG GAC AAG CAC GCC GAC GAC GTG GAC GTG CTG TTC CTG252Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu50 55 60TGC ATG GGC TCC GCC ACC GAC ATC CCT GAG CAG GCA CCA AAG TTC GCG300Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala65 70 75 80CAG TTC GCC TGC ACC GTA GAC ACC TAC GAC AAC CAC CGC GAC ATC CCA348Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro85 90 95CGC CAC CGC CAG GTC ATG AAC GAA GCC GCC ACC GCA GCC GGC AAC GTT396Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val100 105 110GCA CTG GTC TCT ACC GGC TGG GAT CCA GGA ATG TTC TCC ATC AAC CGC444Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg115 120 125GTC TAC GCA GCG GCA GTC TTA GCC GAG CAC CAG CAG CAC ACC TTC TGG492Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp130 135 140GGC CCA GGT TTG TCA CAG GGC CAC TCC GAT GCT TTG CGA CGC ATC CCT540Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro145 150 155 160GGC GTT CAA AAG GCA GTC CAG TAC ACC CTC CCA TCC GAA GAC GCC CTG588Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu165 170 175GAA AAG GCC CGC CGC GGC GAA GCC GGC GAC CTT ACC GGA AAG CAA ACC636Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr180 185 190CAC AAG CGC CAA TGC TTC GTG GTT GCC GAC GCG GCC GAT CAC GAG CGC684His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg195 200 205ATC GAA AAC GAC ATC CGC ACC ATG CCT GAT TAC TTC GTT GGC TAC GAA732Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu210 215 220GTC GAA GTC AAC TTC ATC GAC GAA GCA ACC TTC GAC TCC GAG CAC ACC780Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr225 230 235 240GGC ATG CCA CAC GGT GGC CAC GTG ATT ACC ACC GGC GAC ACC GGT GGC828Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly245 250 255TTC AAC CAC ACC GTG GAA TAC ATC CTC AAG CTG GAC CGA AAC CCA GAT876Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp260 265 270TTC ACC GCT TCC TCA CAG ATC GCT TTC GGT CGC GCA GCT CAC CGC ATG924Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met275 280 285AAG CAG CAG GGC CAA AGC GGA GCT TTC ACC GTC CTC GAA GTT GCT CCA972Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro290 295 300TAC CTG CTC TCC CCA GAG AAC TTG GAC GAT CTG ATC GCA CGC GAC GTC 1020Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val305 310 315 320TAATTTAGCT CGAG 1034(2)序列24信息(i)序列特征(A)長度320個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述序列24Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg1 5 10 15Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly20 25 30Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp35 40 45Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu50 55 60Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala65 70 75 80Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro85 90 95Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val100 105 110Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg115 120 125Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp130 135 140Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro145 150 155 160Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu165 170 175Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr180 185 190His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg195 200 205Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu210 215220Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr225 230 235 240Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly245 250 255Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp260 265 270Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met275 280 285Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro290 295 300Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val305 310 315 320
權(quán)利要求
1.能在棒桿狀菌細(xì)胞中自主復(fù)制的重組DNA，包括編碼其中對L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制被基本上脫敏的天冬氨酸激酶的DNA序列，和編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組DNA，進(jìn)一步包括編碼二氫吡啶二羧酸合酶的DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的重組DNA，進(jìn)一步包括編碼二氨基庚二酸脫羧酶的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的重組DNA，進(jìn)一步包括編碼二氨基庚二酸脫氫酶的DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項的重組DNA，其中所述的對L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制被基本上脫敏的天冬氨酸激酶是源自棒桿狀菌的天冬氨酸激酶，并且其中所述的天冬氨酸激酶作為突變型天冬氨酸激酶而被提供，其α-亞基N-末端279位的丙氨酸殘基變成非丙氨酸和非酸性氨基酸的氨基酸殘基，并且其β-亞基中30位的丙氨酸殘基變成非丙氨酸和非酸性氨基酸的氨基酸殘基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項的重組DNA，其中所述的編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的DNA序列編碼序列表中序列15描述的氨基酸序列，或與序列15描述的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的重組DNA，其中所述的編碼二氫吡啶二羧酸合酶的DNA序列編碼在序列表中序列11描述的氨基酸序列，或與序列11描述的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求3的重組DNA，其中所述的編碼二氨基庚二酸脫羧酶的DNA序列編碼序列表中序列19描述的氨基酸序列，或與序列19描述的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求4的重組DNA，其中所述的編碼二氨基庚二酸脫氫酶的DNA序列編碼序列表中序列24描述的氨基酸序列，或與序列24描述的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。
10.一種棒桿狀菌，其含有對L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制被基本上脫敏的天冬氨酸激酶，并且包括編碼二氫吡啶二羧酸還原酶增強的DNA序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的棒桿狀菌，通過導(dǎo)入權(quán)利要求1中定義的重組DNA而被轉(zhuǎn)化。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的棒桿狀菌，進(jìn)一步包括編碼二氫吡啶二羧酸合酶的增強DNA序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的棒桿狀菌，通過導(dǎo)入權(quán)利要求2中定義的重組DNA而被轉(zhuǎn)化。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的棒桿狀菌，進(jìn)一步包括編碼二氨基庚二酸脫羧酶的增強DNA序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的棒桿狀菌，通過導(dǎo)入權(quán)利要求3中定義的重組DNA而被轉(zhuǎn)化。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的棒桿狀菌，進(jìn)一步包括編碼二氨基庚二酸脫氫酶的增強DNA序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的棒桿狀菌，通過導(dǎo)入權(quán)利要求4中定義的重組DNA而被轉(zhuǎn)化。
18.一種產(chǎn)生L-賴氨酸的方法，包括步驟在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求10到17中任何一個權(quán)利要求所定義的所述棒桿狀菌，在細(xì)菌培養(yǎng)液中產(chǎn)生和積累L-賴氨酸，和從培養(yǎng)液中收集L-賴氨酸。
全文摘要
通過相繼增強編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的DNA、編碼二氫吡啶二羥酸合酶的DNA、編碼二氨基庚二酸脫羧酶的DNA,和編碼二氨基庚二酸脫氫酶的DNA提高了含有對L－賴氨酸和L－蘇氨酸的反饋抑制被基本上脫敏的天冬氨酸激酶的棒桿狀菌的產(chǎn)L－賴氨酸能力和產(chǎn)L－賴氨酸速度。
文檔編號C12N1/21GK1192242SQ96195952
公開日1998年9月2日 申請日期1996年6月5日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者乙名圣子, 杉木雅一, 泉井正子, 早川敦, 中野英一, 小林正樹, 吉原康彥, 中松亙 申請人:味之素株式會社 被以下專利引用 (2),