專利名稱：發(fā)酵生產(chǎn)l－賴氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物工業(yè)，特別是涉及經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，用于該生產(chǎn)方法中的DNA和微生物。
背景技術(shù)：
在以前的領(lǐng)域中，當(dāng)L-賴氨酸用發(fā)酵法生產(chǎn)時，為了提高產(chǎn)率，使用從自然環(huán)境中分離的微生物菌株或用由此微生物菌株得到的人工突變株。已知的生產(chǎn)L-賴氨酸的人工突變株有很多。其中的大多數(shù)是S-2-氨乙基半胱氨酸(AEC)抗性突變株，并且屬于短桿菌屬，棒桿菌屬，芽孢桿菌屬，埃希氏菌屬或沙雷氏菌屬。進而，已公開了多種技術(shù)用于提高氨基酸產(chǎn)量。例如，利用重組DNA轉(zhuǎn)化子(美國專利No.4,278,765)。
例如，屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌被廣泛用于生產(chǎn)不同種類的氨基酸，如L-脯氨酸，L-組氨酸，L-精氨酸，L-蘇氨酸，L-纈氨酸和L-異亮氨酸并且作為氨基酸生產(chǎn)菌，正如Kodangha Scientific 1986年出版的“應(yīng)用分子遺傳學(xué)”中所述，沙雷氏菌在不同的(ISBN4-06-139659-5)和學(xué)會中心1986出版的“氨基酸發(fā)酵”(ISBN4-7622-9454-3)中所述，沙雷氏菌在不同的方面有著杰出的特性。用屬于沙雷代菌屬的細(xì)菌生產(chǎn)不同的氨基酸已有報道。根據(jù)一個報導(dǎo)(特公昭51-9393(1976))，其報導(dǎo)了一種L-賴氨酸多產(chǎn)菌，其產(chǎn)率(用產(chǎn)生的L-賴氨酸鹽酸鹽的濃度除以初始的碳源濃度而得到的值)經(jīng)計算為5.4％。
粘質(zhì)沙雷氏菌，沙雷氏菌屬的一個代表菌株，其在基因結(jié)構(gòu)及基因表達和調(diào)控機制上同埃希氏桿菌屬的細(xì)菌相似，并且適用于埃希氏桿菌屬細(xì)菌的重組DNA克隆載體可用于沙雷氏菌屬細(xì)菌(特開平2-27980(1990)和5-10076(1993))。
另外，二氫吡啶二羧酸合酶(DDPS)是一種用于脫水并縮合天冬氨酸半醛和丙酮酸以合成二氫吡啶二羧酸的酶。該反應(yīng)位于進入分枝反應(yīng)的入口處，該分枝繼續(xù)天冬氨酸家族氨基酸的生物合成中L-賴氨酸生物合成系統(tǒng)。已知該酶與天冬氨酸激酶在埃希氏桿菌屬細(xì)菌中一樣，是負(fù)責(zé)L-賴氨酸生物合成中的一個重要調(diào)控位點的酶。
在大腸桿菌(Escherichia coli)中，編碼DDPS的基因是名為dapA的基因。dapA已被克隆，且其堿基序列已被測定(Richaud，F(xiàn).et al.，細(xì)菌學(xué)雜志，297(1986))。
另一方面，天冬氨酸激酶(此后有時縮寫為“AK”)是催化天冬氨酸轉(zhuǎn)化為β-磷酸天冬氨酸反應(yīng)的酶，該酶是作為天冬氨酸家族氨基酸生物合成系統(tǒng)中的主要的調(diào)節(jié)酶。大腸桿菌的AK有三種(AKI，AKII，AKIII)，其中的二種是復(fù)合酶，有高絲氨酸脫氫酶(以后有時縮寫為“HD”)。復(fù)合酶中的一個為由thrA基團編碼的AKI-HDI，另一個為由metLM基因編碼的AKII-HDII。AKI受蘇氨酸和異亮氨酸協(xié)同抑制并被蘇氨酸所抑制，而AKII則受甲硫氨酸阻遏抑制。
相反，已知僅有AKIII是一單功能酶，該酶是各為LysC基因的產(chǎn)物，該酶可受L-賴氨酸的阻遏及反饋抑制。細(xì)胞中它們的活性比是AKI∶AKII∶AKIII＝約5∶1∶4。
如上所述，DDPS和AKIII受L-賴氨酸的反饋抑制，這阻遏了有效生產(chǎn)L-賴氨酸。如果期望得到一種不受L-賴氨酸反饋抑制的突變體酶DDPS或AKIII，通過使用屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌就可以通過發(fā)酵有效地生產(chǎn)L-賴氨酸。然而，雖然只有1篇關(guān)于AKIII酶的突變體酶的報導(dǎo)，此前沒有文獻記述DDPS的突變體酶，(Boy，E.，等，細(xì)菌學(xué)雜志，112，84(1972))，但已知沒有實例表明這樣的突變體酶可以提高L-賴氨酸的產(chǎn)率。此外，就沙雷氏菌屬菌的L-賴氨酸生物合成系統(tǒng)的基因方面而言也是未知的。

發(fā)明內(nèi)容
考慮到前述的觀點，完成了本發(fā)明，其中的一個目的就是從沙雷氏菌屬細(xì)菌中得到對于L-賴氨酸的反饋抑制有效脫敏的DDPS和AK，特別是，DDPS和AKIII，并且提供了用沙雷氏菌屬的細(xì)菌生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，該法較以前領(lǐng)域的方法更為有效。
為了達到上述的目的，作為勤奮和反復(fù)研究的結(jié)果，本發(fā)明人成功地從埃希氏菌屬的一種細(xì)菌中得到了編碼DDPS的DNA，該菌中L-賴氨酸的反饋抑制被有效脫敏。這種從對L-賴氨酸反饋抑制被有效脫敏的大腸桿菌中得到的編碼DDPS的DNA在這里有時稱為突變體dapA或dapA*。
本申請的發(fā)明人進一步創(chuàng)造了一種屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌，其中帶有對于L-賴氨酸的反饋抑制被脫敏的天冬氨酸激酶以及帶有對于L-賴氨酸反饋抑制被有效脫敏的DDPS。來自對于L-賴氨酸反饋抑制有效脫敏的大腸桿菌的編碼天冬氨酸激酶的DNA在這里有時稱為突變體LysC或Lys*。
本發(fā)明人進一步創(chuàng)造了一種屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌，其中帶有突變體dapA和突變體LysC。并且已發(fā)現(xiàn)通過將前述的屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌培養(yǎng)于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，培養(yǎng)物中可產(chǎn)生和集累相當(dāng)大量的L-賴氨酸。
即，本發(fā)明提供了一種屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌，該菌通過將編碼含有突變的二氫吡啶二羧酸合酶的DNA導(dǎo)入到菌中而被轉(zhuǎn)化，突變使得該酶對于L-賴氨酸的反饋抑制劑脫敏。用來自埃希氏菌屬細(xì)菌的二氫吡啶二羧酸合酶舉例說明。關(guān)于來自屬于埃希氏菌屬細(xì)菌的二氫吡啶二羧酸合酶，對于L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的突變用以下的突變加以舉例說明，即從序列表中SEQ ID NO4中定義的二氫吡啶二羧酸合酶氨基酸序列中的N-末端計數(shù)，以纈氨酸殘基代替81位的丙氨酸殘基的突變，用酪氨酸殘基代替118位組氨酸殘基的突變，以及用纈氨酸和酪氨酸殘基分別代替81位丙氨酸殘基和118位組氨酸殘基的突變。該二氫吡啶二羧酸合酶如果含有對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的突變，對于屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌而言，它可能是一天然的類型。
本發(fā)明進一步提供了前述的屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌，該菌帶有對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的天冬氨酸激酶。允許屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌帶有對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的天冬氨酸激酶的方法以下面的方法為例加以說明，該方法用于將來自埃希氏菌屬細(xì)菌的具有對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的突變的編碼天冬氨酸激酶III的DNA導(dǎo)入到細(xì)菌細(xì)胞中。
來自埃希氏桿菌屬細(xì)菌的對于L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的天冬氨酸激酶III的突變通過以下突變加以舉例說明，即將323位的甘氨酸殘基用天冬氨酸殘基替換的突變，將323位的甘氨酸殘基用天冬氨酸殘基替換并且將408位的甘氨酸殘基也用天冬氨酸殘基替換的突變，將34位的精氨酸殘基用半胱氨酸殘基替換并且將323位的甘氨酸殘基用天冬氨酸殘基替換的突變，將325位的亮氨酸殘基用苯丙氨酸殘基替換的突變，將318位甲硫氨酸殘基用異亮氨酸殘基代替的突變，將318位甲硫氨酸殘基用異亮氨酸殘基代替并且將349位纈氨酸殘基用甲硫氨酸殘基代替的突變，將345位絲氨酸殘基用亮氨酸殘基代替的突變，將347位纈氨酸殘基用甲硫氨酸殘基代替的突變，將352位蘇氨酸殘基用異亮氨酸殘基代替的突變，將352位蘇氨酸殘基用異亮氨酸殘基代替并且將369位絲氨酸殘基用苯丙氨酸殘基代替的突變，將164位谷氨酸殘基用賴氨酸殘基代替的突變，以及將417位甲硫氨酸殘基用異亮氨酸殘基代替并且將419位半胱氨酸殘基用酪氨酸殘基代替的突變，氨基酸的計數(shù)是從序列表中SEQ ID NO8中定義的天冬氨酸激酶III氨基酸序列的N末端開始計數(shù)。
不必說，對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的天冬氨酸激酶對于屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌而言，可能是一天然的類型。
編碼具有對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏突變的二氫吡啶二羧酸合酶的DNA，和編碼具有對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏突變的天冬氨酸激酶的DNA可能均存在于一種屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌中，二種DNA可以在同一質(zhì)粒上或者在不同的質(zhì)粒上。
屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌，其中有編碼具有對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏突變的二氫吡啶二羧酸合酶的DNA，通過一種賴氨酸脫羧酶缺陷的細(xì)菌加以舉例說明。
本發(fā)明進一步提供了生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，該方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)任一種前述的屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌，在其培養(yǎng)物中產(chǎn)生并積累L-賴氨酸，以及從培養(yǎng)物中收集L-賴氨酸。
在此說明書中，編碼DDPS或AKIII的DNA，或者是其中再含有啟動子的DNA，有時稱為“DDPS基因”或“AKIII基因”。進一步，突變體酶是指對L-賴氨酸反饋抑制脫敏的酶，而且編碼其DNA或再含有啟動子的DNA有時分別簡稱為“突變體酶”和“突變體基因”。進而，詞組“對L-賴氨酸反饋抑制脫敏”意思是對抑制基本上脫敏是充分的，并不需要完全脫敏。
下面將詳細(xì)解釋本發(fā)明。<1>用于本發(fā)明的方法中的編碼突變體二氫吡啶二羧酸合酶(DDPS)的DNA。
用于本發(fā)明方法中的編碼突變體DDPS的DNA具有突變，突變使得編碼野生型DDPS的DNA編碼的DDPS對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏。DDPS通過那些來自屬于埃希氏菌屬細(xì)菌的DDPS，特別是來自大腸桿菌的DDPS加以舉例說明。進而，也可使用沙雷氏菌屬的細(xì)菌的DDPS。如果其含有對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的突變。來源于埃希氏菌屬的細(xì)菌的對L-賴氨酸反饋抑制脫敏的DDPS突變通過以下實例加以說明(1)將81位丙氨酸殘基用纈氨酸殘基代替的突變；(2)用酪氨酸殘基代替118位組氨酸殘基的突變；和(3)用纈氨酸殘基代替81位丙氨酸殘基并且用酪氨酸殘基代替118位的組氨酸殘基的突變；氨基酸的計數(shù)是從序列表中的SEQ ID NO4中定義的DDPS的氨基酸序列的N末端開始的。
編碼野生型DDPS的DNA并不特別地受到限制，如果DNA是編碼來自屬于埃希氏菌屬或沙雷氏菌屬的細(xì)菌的DDPS。編碼來自屬于埃希氏桿菌屬細(xì)菌的DDPS的DNA具體地通過編碼SEQ ID NO4中定義的氨基酸序列的DNA加以舉例說明，并且進一步具體地通過由SEQID NO3中所定義的堿基序列中272～1147堿基所代表的DNA序列加以具體說明。在這些序列中，那些含有堿基突變進而導(dǎo)致上述氨基酸替換的序列為用于本發(fā)明中的編碼突變體DDPS的DNA的實例。如果它是編碼同一個氨基酸殘基，相應(yīng)于被替換氨基酸殘基的任何密碼子都是可用的，特別是同其種類無關(guān)時。進一步，假設(shè)已有的DDPS根據(jù)細(xì)菌種類和細(xì)菌菌株的不同在序列上具有輕微差異，然而，那些在同酶活性無關(guān)的位置上有氨基酸殘基的替換、缺失或插入的DDPS也包括在本發(fā)明中的突變體DDPS基因中。
得到這種突變體基因的方法如下。首先，含有野生型DDPS基因的DNA或含有對DDPS的酶活性基本上無影響的突變的DDPS基因的DNA進行體外突變處理，并且突變處理后將DNA同適于宿主的載體DNA連接以得到重組體DNA。將重組體DNA導(dǎo)入一宿主微生物以得到轉(zhuǎn)化子。當(dāng)在前述的轉(zhuǎn)化子中篩選到表達突變體DDPS的轉(zhuǎn)化子時，該轉(zhuǎn)化子帶有突變體基因。另一種方法是，將含有野生型DDPS基因的DNA或?qū)⒑袆e的突變的DDPS基因的DNA同適合于宿主的載體DNA連接的獲得重組體DNA。然后將此重組DNA在體外進行突變處理，并且在突變處理后將重組體DNA導(dǎo)入到宿主微生物中以得到轉(zhuǎn)化子。當(dāng)在前述的轉(zhuǎn)化子中篩選到一表達突變體DDPS的轉(zhuǎn)化子時，這一轉(zhuǎn)化子也將帶有突變體基因。
這樣也是可以接受的，即將產(chǎn)生野生型酶的微生物經(jīng)突變處理后產(chǎn)生突變體菌株，該菌株生產(chǎn)突變體酶，且然后從突變體菌株中得到突變體基因。另一種方法是，將同野生型基因相連接的重組體DNA導(dǎo)入其中的轉(zhuǎn)化子進行突變處理以產(chǎn)生一突變菌株，該突變株可產(chǎn)生突變體酶。當(dāng)之后從突變體菌株中回收重組DNA時，在前述DNA中產(chǎn)生突變體基因。
用于體外DNA突變處理的試劑通過羥胺等加以舉例說明。羥胺是一種化學(xué)的突變處理試劑，它通過使胞嘧啶轉(zhuǎn)化為N4-羥基胞嘧啶而導(dǎo)致胞嘧啶變?yōu)樾叵汆奏さ耐蛔?。另一種方法是，當(dāng)將微生物自身受突變處理時，處理可用紫外光輻射來進行，或用常用于人工突變的突變劑進行，比如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或亞硝酸。
作為含有野生型DDPS基因或含有上述的其它突變的DDPS基因的DNA的供體微生物，可以用包括屬于埃希氏桿菌屬或沙雷氏菌屬的細(xì)菌在內(nèi)的任一種微生物。具體地說，對于屬于埃希氏菌屬的微生物，使用那些Neidhardt等寫的書中描述的微生物是可能的(Neidhardt，F(xiàn).C.等，大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌，美國微生物學(xué)會，華盛頓特區(qū)，1208，表1)。例如，提到大腸桿菌JM 109株和MC 1061菌株。當(dāng)用一野生型菌株作為含有DDPS基因的DNA的供體微生物時，能得到含有野生型DDPS基因的DNA。
另一方面，屬于沙雷氏菌屬的微生物通過粘質(zhì)沙雷氏菌，例如，粘質(zhì)沙雷氏菌AJ 13125菌株(FERM BP-5441)加以舉例說明。(1)野生型DDPS基因的制備一個制備含有DDPS基因的DNA的實例將敘述如下。描述于此的制備是就大腸桿菌而言，并且對其它的屬于埃希氏菌屬和屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌而言，DDPS基因可以同樣制得。
首先，含野生型dapA的大腸桿菌，例如MC 1061菌株，經(jīng)培養(yǎng)以得到培養(yǎng)物，當(dāng)培養(yǎng)上述的微生物時，可按照常規(guī)的固體培養(yǎng)方法進行，但是，考慮到菌體收集的效率，優(yōu)選的培養(yǎng)是用液體培養(yǎng)方法進行?？捎靡环N培養(yǎng)基，其中加入一種或多種氮源，例如酵母提取物，胰蛋白胨，肌肉提取物，玉米浸液和大豆或小麥的浸出液，培養(yǎng)基中應(yīng)含一種或多種無機鹽例如磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，硫酸鎂，氯化鈉，氯化鎂，氯化亞鐵，硫酸亞鐵或硫酸錳，而且另外應(yīng)任選和足夠含有糖類物質(zhì)、維生素等。將培養(yǎng)基的起始pH值調(diào)為6到8是合適的。培養(yǎng)可在30℃到42℃下進行4到24小時，優(yōu)選通過于37℃，在通氣和攪拌的條件下進行深層培養(yǎng)，厭菌培養(yǎng)或靜置培養(yǎng)等方法培養(yǎng)。
得到的培養(yǎng)物離心，例如，3,000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘以得到大腸桿菌MC 1061株的細(xì)胞沉淀。可用，例如Saito和Miura的方法(生物化學(xué)和生物物理學(xué)報，72，619(1963))，或用K.S.Kirby的方法(生物化學(xué)雜志，64，405(1956))從細(xì)胞沉淀中得到染色體DNA。
為了從這樣得到的染色體DNA中分離DDPS基因，制備染色體DNA文庫。首先，染色體DNA用適當(dāng)?shù)南拗菩悦高M行部分消化以得到不同片段的混合物。如果切割的程度可用切割時間等來控制，可以用很多種的限性酶。例如，Sau3AI在不低于30℃的條件下可作用于染色體DNA，優(yōu)選的是在37℃下，酶濃度為1到10單位/毫升，消化不同的時間(1分鐘到2小時)。
其次，將得到的DNA片段同能在屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌中自主復(fù)制的載體DNA連接以制得重組DNA。具體地說，一種可以在切割后產(chǎn)生同所用的切割染色體DNA的限性酶Sau3AI產(chǎn)生的末端堿基序列互補的限性酶，例如，BamHI，允許在不低于30℃的溫度，酶濃度為1到100單位/ml的條件下與載體DNA作用不少于1小時，優(yōu)選是作用1到3小時以完全消化載體DNA，并且切割之。繼而，上述得到的染色體DNA片段混合物同切割后的載體DNA相混合，其中DNA連接酶，優(yōu)選的是T4 DNA連接酶，在4到16℃，酶濃度為1到100單位/ml的條件下作用不少于1小時，優(yōu)選作用6到24小時以獲得重組體DNA。
得到的重組DNA用于轉(zhuǎn)化屬于埃希氏菌屬的微生物，例如，DDPS缺陷型突變菌株如大腸桿菌K-12株，優(yōu)選的是JE7627株(ponB704dacB12 pfv+tonA2 dapA lysA str malA38 metB1 ilvH611leuA371 proA3 lac-3 tsx-76)，以制備染色體DNA文庫。轉(zhuǎn)化可按D.M，Morrison方法(酶學(xué)方法，68，326(1979))的方法進行，或者是用將受體菌細(xì)胞用氯化鈣處理以增加DNA的通透性的方法(Mandel，M，and Higa，A.，分子生物學(xué)雜志，53，159(1970))完成。JE 7627株可從國立遺傳研究所得到(日本靜崗縣三島市)。
含有DDPS基因重組體DNA的細(xì)菌株可從以下菌株中獲得在獲得的染色體DNA文庫中那些有DDPS活性增高的菌株或是由于DDPS基因缺陷而得到的營養(yǎng)缺陷被補充的菌株，例如，DDPS缺陷型突變株需要二氨基庚二酸。這樣，當(dāng)DDPS缺陷型突變株用作宿主時，含有DDPS基因的DNA片段可以通過分離能在不含有二氨基庚二酸的培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌而得到，并且從該細(xì)菌菌株中回收重組體DNA。
證明一個含有DDPS基因的重組體DNA的候選菌株中是否真正帶著其中DDPS基因被克隆的重組體DNA，可以先從候選菌株中制備細(xì)胞提取物，并從其中制備粗酶溶液以證明DDPS的活性是否有增加來完成。DDPS酶活性的測定方法可按照Yugari等(Yugari，Y，和Gilvarg，C.生物化學(xué)雜志，240，4710(1962))的方法進行。
其中的含有DDPS基因的DNA插入到載體DNA中的重組體DNA可以從前述的細(xì)菌菌株中通過以下分離。例如可按P.Guerry等的方法(細(xì)菌學(xué)雜志，116，1064(1973))或D.B.Clewell的方法(細(xì)菌學(xué)雜志，110，667(1972))進行。
用Sioto和Miura等的方法，也可以從染色體上含有DDPS基因的菌株中制備染色體DNA而完成野生型的DDPS基因的制備，并且可用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(見White，T.J.等，遺傳學(xué)方向，5，185(1989))來擴增DDPS基因。擴增反應(yīng)用到的引物是那些同含有DDPS基因整個區(qū)域或部分區(qū)域的雙鏈DNA的3′末端互補的引物。當(dāng)只擴增DDPS基因的部分區(qū)域時，必需用這些DNA片段作為引物來進行從染色體DNA文庫中篩選含有全序列區(qū)的DNA片段。當(dāng)DDPS基因的全序列區(qū)被擴增時，含有DNA片段的PCR反應(yīng)液做瓊脂糖凝膠電泳，這些DNA片段含有擴增的DDPS基因，且然后提取目的DNA片段。這樣，含有DDPS基因的DNA片段就可以被回收。
DNA引物可以根據(jù)例如，已知的大腸桿菌的序列充足地制備(Richand，F(xiàn).等，細(xì)菌學(xué)雜志，297(1986))。具體地說，能夠擴增DDPS基因包括編碼DDPS的1150個堿基的區(qū)域的引物是優(yōu)選的，且SEQ ID NO1和NO2中定義的二種引物是合適的。引物的合成可按照常規(guī)方法如亞磷酰胺法(見四面體通訊，22，1859(1981))，用一商業(yè)上提供的DNA合成儀(例如，DNA合成儀380B型，由應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn))進行。進而，PCR反應(yīng)可用商業(yè)上提供的PCR儀(例如，DNA熱循環(huán)儀，PJ2000型，由Takara Shuzo公司生產(chǎn))，用TaqDNA聚合酶(由Takara Shuzo公司提供)，按照供應(yīng)商指定的方法進行。
就PCR方法擴增的DDPS基因而言，當(dāng)這些DDPS基因同能在屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌中進行自主復(fù)制的載體DNA相連接，并將之導(dǎo)入到屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌細(xì)胞時，一些操作，如向DDPS基因中引入突變，變得簡單化。所用的載體DNA，轉(zhuǎn)化方法及證明DDPS基因存在的方法都同前述方法一樣。
照上述的方法，也可以得到來自屬于沙雷氏菌屬細(xì)菌的DDPS基因，且用來自大腸桿菌的DDPS基因或其一部分作為探針，通過雜交，可以從屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌的染色體DNA文庫中分離得到DDPS基因。同樣，源于屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌的DDPS基因也可用PCR方法得到。PCR中用屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌的染色體DNA作為模板，并且用根據(jù)來自大腸桿菌的DDPS基因的堿基序列而制備的寡聚核苷酸作引物，例如，用具有SEQ ID NO1和NO2中所示的二種序列的寡核苷酸作引物。
屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌和屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌密切相關(guān)，并且已知細(xì)胞中蛋白的氨基酸序列和基因的堿基序列的同源性在此二類菌間是高的。對于這些基因，例如，已知的有thrA，thrB和thrC，它們的同源性分別是83％，73％和84％(K.Omori等，細(xì)菌學(xué)雜志，175，785～794(1993))。進而，作為用來自屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌的基因序列分離屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌的基因的實例，dnaA就是已知的一個這樣的例子(O.Skovgaard和F.G.Hansen，細(xì)菌學(xué)雜志，169，3976-3981(1987))。因而，這一點是肯定的，即可用基于屬于埃希氏桿菌屬細(xì)菌中的DDPS基因的堿基序列通過雜交或PCR的方法，來分離屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌中的DDPS基因。(2)向DDPS基因中導(dǎo)入突變進行例如氨基酸殘基的替換，插入或缺失的突變的方法，通過以下例子加以說明，即重組PCR法(Higuchi.R.，61，PCR技術(shù)(Erlich，H.A.編，Stockton出版社(1989))，以及定點誘變法(Kramer，W和Frits，H.J.，酶學(xué)方法，154.，350(1987))；Kunkel T.A.等，酶學(xué)方法，154，367，(1987))。通過運用這些方法，可在目的位點產(chǎn)生目的突變。
進而，根據(jù)目的基因的化學(xué)合成，向目的位點引入突變或隨機突變均是可能的。
此外，這樣的方法是可得到的，即，用羥胺直接處理含有DDPS基因的染色體或質(zhì)粒(Hashimwto，T.和Sekiguchi，M.細(xì)菌學(xué)雜志，159，1039(1984))。另一種方法是，用紫外線輻射的方法對含有DDPS基因的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌進行照射，或者用如N-甲基-N′-亞硝基胍或亞硝酸的化學(xué)試劑處理細(xì)菌，這些方法均是可接受的。運用這些方法，可以隨機地引入突變。
就突變基因的篩選而言，包含帶有DDPS基因的DNA片段和載體DNA的重組DNA首先用羥胺等直接進行突變處理，然后用于轉(zhuǎn)化例如，大腸桿菌菌株W3110。繼之，將轉(zhuǎn)化的菌株培養(yǎng)于基本培養(yǎng)基上，例如M9，它含有作為L-賴氨酸類似物的S-2-氨乙基半胱氨酸(AEC)。帶有含有野生型DDPS基因的重組DNA的菌株不能合成L-賴氨酸和二氨基庚二酸(DAP)，這樣其生長受到抑制，因為AEC可抑制由重組DNA表達的DDPS。相反，帶有含有對L-賴氨酸的抑制脫敏的DDPS基因的重組DNA的菌株含有由前述重組DNA中該基因編碼的突變體酶，它是不受AEC抑制的。這樣，這種菌就能在添加有AEC的基本培養(yǎng)基上生長。這一現(xiàn)象可用來篩選菌株，這些菌可以在生長中對作為L-賴氨酸類似物的AEC具有抗性，就是說，帶有含有突變DDPS基因的重組DNA的菌株，其對抑制是不敏感的。
這樣得到的突變基因可作為重組DNA導(dǎo)入到屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌中并表達。由此可獲得含有對反饋抑制脫敏的DDPS的細(xì)菌。另一種選擇是，可從重組DNA中取出突變的DDPS基因片段，并將之插入到另一載體中來運用。能用于本發(fā)明中的載體DNA優(yōu)選的是質(zhì)粒載體DNA，實例有pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219和pMW218。此外，也可用噬菌體DNA載體。
此外，為了有效地表達突變的DDPS基因，其它的可在屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌細(xì)胞中作用的啟動子，例如lac，trp和PL啟動子，可以連接于編碼突變的DDPS的DNA序列的上游，或者可以用DDPS基因帶有的啟動子，或在擴增啟動子后用。<2>用于本發(fā)明的編碼突變的天冬氨酸激酶的DNA用于本發(fā)明的編碼突變的AK的DNA上在編碼野生型AK的DNA中具有突變，突變使編碼AK對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏。AK的例子是那些屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌中的AK，特別是來自大腸桿菌中的AKIII。進而的例子是屬于沙雷氏菌屬細(xì)菌中的任一種天冬氨酸激酶，只要它具有對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的突變。
對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的AKIII的突變的實例有(a)用天冬氨酸殘基替換323位甘氨酸殘基的突變；(b)用天冬氨酸殘基替換323位甘氨酸殘基并用天冬氨酸殘基替換408位甘氨酸殘基的突變；(c)用半胱氨酸殘基替換34位精氨酸殘基并用天冬氨酸殘基替換323位甘氨酸殘基的突變；(d)用苯丙氨酸殘基替換325位亮氨酸殘基的突變；(e)用異亮氨酸殘基替換318位甲硫氨酸殘基的突變；(f)用異亮氨酸殘基替換318位甲硫氨酸殘基并用甲硫氨酸殘基替換349位纈氨酸殘基的突變；(g)用亮氨酸殘基替換345位絲氨酸殘基的突變；
(h)用甲硫氨酸殘基替換347位纈氨酸殘基的突變；(i)用異亮氨酸殘基替換352位蘇氨酸殘基的突變；(j)用異亮氨酸殘基替換352位蘇氨酸殘基并用苯丙氨酸殘基替換369位絲氨酸殘基的突變；(k)用賴氨酸殘基替換164位谷氨酸殘基的突變；和(1)用異亮氨酸殘基替換417位甲硫氨酸殘基并用酪氨酸殘基替換419位半胱氨酸殘基的突變；氨基酸計數(shù)是從序列列表中的SEQ ID NO8所定義的AKIII的氨基酸序列N末端開始。
就編碼野生型AKIII的DNA而言，所提及的例子是來自屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌如大腸桿菌的編碼AKIII的DNA。具體地說，實例是編碼SEQID NO8中定義氨基酸序列的DNA，以及由SEQ ID NO7中定義的堿基序列中584～1930個堿基所代表的序列。偶爾，大腸桿菌的AKIII是由lysC基因編碼的。
在這些序列中，那些堿基序列由于具有突變導(dǎo)致產(chǎn)生上述氨基酸殘基替換的序列，在本發(fā)明中是作為編碼突變的AKIII的DNA的例子。任何同被替換的氨基酸殘基相對應(yīng)的密碼子，特別在不考慮其種類時，均可得到，假若密碼子是編碼同一氨基酸殘基。此外，由于細(xì)菌菌種及菌株的不同，得到的野生型AKIII的氨基酸序列有些輕微不同。那些在同酶活性無關(guān)的位置有這種方式氨基酸殘基替換、缺失或插入的基因，也包括在用于本發(fā)明中的突變AKIII基因中。例如，下述實例2中得到的野生型lysC基因的堿基序列(SEQ ID NO7)同已發(fā)表的，大腸桿菌K-12 JC411株的lysC的序列在6個位點有所不同。(Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.，和Patte，J.C.，生物化學(xué)雜志，261，1052(1986))。其中編碼的氨基酸殘基在2個位點有差別(在JC411株的lysC中，58位甘氨酸殘基被半胱氨酸殘基代替，并且401位的甘氨酸殘基被丙氨酸殘基代替，氨基酸計數(shù)是從SEQ ID NO8中定義的lysC氨基酸序列的N-末端開始的)。如果前述的(a)到(1)中的任何的突變被引入，甚至期望得到含有與大腸桿菌K-12 JC411菌株相同序列的lysC，該菌株具有對L-賴氨酸反饋抑制脫敏的突變。
得到的編碼對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的突變AK的DNA的方法見下。首先，含有野生型AK基因或含有其它突變的AK基因的DNA進行體外突變處理，且將突變處理后的DNA同適于宿主的載體DNA連接以得到重組DNA。重組DNA導(dǎo)入宿主微生物中以得到轉(zhuǎn)化子。當(dāng)從前述轉(zhuǎn)化子中篩選到一個表達突變AK的轉(zhuǎn)化子時，則其中含有突變的基因。另一方法是，將含野生型AK基因或?qū)⒑杏衅渌蛔兊腁K基因的DNA同適合于宿主的載體DNA連接以得到重組DNA。然后將重組DNA進行體外突變處理，且隨后將之導(dǎo)入到宿主微生物中以得到轉(zhuǎn)化子。當(dāng)從此處提到的轉(zhuǎn)化子中篩選到表達突變AK的轉(zhuǎn)化子時，則此轉(zhuǎn)化子中也含有突變的基因。
或者，將產(chǎn)生野生型酶的微生物進行突變處理以制備產(chǎn)生突變酶的突變株也是可接受的，且然后從突變株中可得突變的基因。進行直接突變處理DNA的試劑的例子有羥胺等。羥胺是一種化學(xué)突變處理試劑，可通過將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為N4-羥基胞嘧啶而導(dǎo)致從胞嘧啶到胸腺嘧啶的突變。另外的選擇是，對微生物本身進行突變處理，處理可用紫外線照射，或用通常用于人工突變的如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)等突變試劑進行處理。
只要微生物屬于埃希氏菌屬或沙雷氏菌屬，則任一種均可用作供體微生物以提供前面所述的含有野生型AK基因或含有含其它突變的AK基因的DNA。具體地說，可用那些在Neidhardt等人所著的書中描述的微生物(Neidhardt，F(xiàn).C.等，大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌，美國微生物學(xué)會，華盛頓特區(qū)，1208，表1)。例如，大腸桿菌JM 109株和MC1061株即為此例。同樣，屬于沙雷氏菌屬的微生物的例子是粘質(zhì)沙雷氏菌，如，粘質(zhì)沙雷氏菌AJ 13125菌株(FERM BP-5441)。
當(dāng)從這些菌株中得到AK基因后，染色體DNA的制備，染色體DNA文庫的制備等均可按照前述與DDPS基因的制備相同方法進行。作為待用于制備文庫的宿主，優(yōu)選的是用AKI，II和III的完全缺陷株，例如大腸桿菌GT3株(可從大腸桿菌遺傳儲備中心得到(康涅狄格，美國))。
從得到的染色體DNA文庫中，可得到含有AK基因的重組DNA的細(xì)菌株，在這些株中，AK活性增加，或是營養(yǎng)缺陷得到補充。從候選菌株中制備細(xì)胞提取物，然后從中制備粗酶溶液來確定AK的活性。AK酶活的測定方法可按照Stadtman等的方法進行(Stadtman，E.R.，Cohen，G.N.，LeBras，G.，和Robichon-Szulmajstcr，H.，生物化學(xué)雜志，236，2033(1961))。
例如，當(dāng)AK完全缺陷的突變株用作宿主時，帶有AK基因的DNA片段可通過分離能在這含L-賴氨酸，L-蘇氨酸，L-甲硫氨酸和二氨基庚二酸的培養(yǎng)基上生長的轉(zhuǎn)化菌株而得到，或是經(jīng)分離能在不含高絲氨酸和二氨基庚二酸的培養(yǎng)基上生長的菌株而得到，然后就可從該細(xì)菌菌株中回收重組DNA。
當(dāng)用PCR的方法從染色體DNA擴增AK基因時，用于PCR反應(yīng)的DNA引物可根據(jù)已知的序列，而適當(dāng)?shù)刂苽?Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.和Patte，J.C.，生物化學(xué)雜志，261，1052(1986))。然而，能夠擴增編碼lysC基因的含有1347個堿基區(qū)域的引物也是合適的，并且例如，具有SEQ ID NO5和SEQ ID NO6中所定義的序列的二種引物也是合適的。
此外，來源于屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌的AK基因可按上述方法得到，并且，通過用來自大腸桿菌的AK基因或其部分作為探針，經(jīng)過雜交，可從屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌的染色體DNA文庫中分離該基因。同樣，以屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌的染色體DNA為模板且用基于大腸桿菌的AK基因的堿基序列而制備的寡聚核苷酸，可用PCR方法得到屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌的AK基因。
對于前述得到的AK基因進行諸如氨基酸殘基的替換、插入和缺失突變的方法是以重組PCR方法及定點誘變方法等同前述DDPS基因的突變處理方式一樣為例加以說明。
此外，根據(jù)目的基因的化學(xué)合成，向目的位點引入突變或引入隨機突變是可能的。
此外，有一種方法是可得到的，該法中可用羥胺直接對染色體或染色體外的重組DNA上的AK基因的DNA進行處理(Hashimoto，T和Sekiyuchi，M.細(xì)菌學(xué)雜志，159，1039(1984))。另一種選擇是，用紫外線照射染色體上含有或染色體外重組DNA上含有AK基因的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌也是可接受的，或者用諸如N-甲基-N′-亞硝基胍或亞硝酸這類化學(xué)試劑處理的方法均是可接受的。
就篩選突變AK基因的方法而言，首先用已經(jīng)過突變處理的含AK基因的重組DNA轉(zhuǎn)化一種AK完全缺陷的菌株，如大腸桿菌GT3株。然后，轉(zhuǎn)化菌株培養(yǎng)于基本培養(yǎng)基中，如含有大量L-賴氨酸的M9培養(yǎng)基中。帶有含野生型AK基因的重組DNA的菌株不能合成L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-甲硫氨酸和二氨基庚二酸(DAP)且生長受抑制，這是因為一種AK被L-賴氨酸所抑制。相反，帶有含突變AK基因的重組DNA的菌株，由于突變使AK對L-賴氨酸的抑制脫敏，而能在添加有大量的L-賴氨酸的基本培養(yǎng)基中生長。這一現(xiàn)象可用來篩選能夠抗L-賴氨酸或作為類似物的AEC而生長的菌株，也就是說，該菌株中帶有含突變的AK基因的重組DNA，其對抑制脫敏。
如此得到的突變基因可作為重組DNA導(dǎo)入到屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌中，并表達。這樣就得到了含有對反饋抑制脫敏的AK的細(xì)菌。另一種方法是從重組DNA中取出突變AK基因片段，并將之插到另一載體上來用。用于本發(fā)明中的載體DNA優(yōu)選的是質(zhì)粒載體DNA，例如pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219和pMW218。此外，也可用噬菌體DNA載體。
此外，為了有效地表達突變的AK基因，可將能在屬于沙雷氏菌屬細(xì)菌中起作用的別的啟動子，如lac，trp和PL，連接于編碼突變的AK的DNA序列的上游，或者是用包含于AK基因中的啟動子，或是在擴增其之后用該啟動子。<3>依據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)L-賴氨酸通過在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)其中導(dǎo)入了按上述獲得的并且?guī)в袑-賴氨酸反饋抑制脫敏的AK的突變的DDPS基因而轉(zhuǎn)化的屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌、在培養(yǎng)物中產(chǎn)生并集累L-賴氨酸，并且從培養(yǎng)物中收集L-賴氨酸可有效地制備L-賴氨酸。特別地，通過使屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌既帶有突變的DDPS又帶有突變的AK，可有效地生產(chǎn)L-賴氨酸。
帶有對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的AK的屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌的例子如下，將編碼帶有對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的突變的AK的DNA同可在屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌細(xì)胞中自主復(fù)制的載體DNA相連以構(gòu)建重組DNA，然后將此重組DNA導(dǎo)入到其細(xì)胞中而轉(zhuǎn)化的屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌。
此外，其中的對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的AK可以是不受L-賴氨酸反饋抑制的野生型AK，或者是以同樣的方式向?qū)儆谏忱资暇鷮俚募?xì)菌中導(dǎo)入了這樣一種野生型AK基因。此外，通過對屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌細(xì)胞進行突變處理而使之成為產(chǎn)生突變AK的屬于沙雷氏菌屬的突變株，這也是可接受的。
另一方面，為了使向?qū)儆谏忱资暇鷮俚募?xì)菌中導(dǎo)入突變的DDPS基因而完成轉(zhuǎn)化，其可以是通過向細(xì)胞中導(dǎo)入一重組DNA來完成，該重組DNA是通過將突變的DDPS基因和能在屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌細(xì)胞中自主復(fù)制的載體DNA相連接而構(gòu)建的。
當(dāng)將突變的DDPS基因和突變的AK基因同時導(dǎo)入一屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌時，這二個突變基因可在細(xì)胞中的同一質(zhì)粒上也可在各自的質(zhì)粒上。當(dāng)用不同的質(zhì)粒時，優(yōu)選的是用具有穩(wěn)定的分布機制以使它們中每個均穩(wěn)定地存在于菌體細(xì)胞中的質(zhì)粒。當(dāng)用不同的質(zhì)粒將突變的DDPS基因和突變的AK基因?qū)氲揭粚儆谏忱资暇鷮俚募?xì)菌中時，二種基因的任何一種導(dǎo)入順序均是可行的。
通過增強屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌中的二氫吡啶二羧酸還原酶(dapB，該菌中已經(jīng)導(dǎo)入了突變的DDPS基因和突變的AK基因，L-賴氨酸的產(chǎn)率可進一步增加。通過向?qū)儆谏忱资暇鷮俚募?xì)菌中導(dǎo)入來自棒狀菌的二氨基庚二酸脫氫酶基因(DDH)，前者已帶有突變的AK基因及突變的DDPS基因并且其中的二氫吡啶二羧酸還原酶基因已被增強，可進一步增加L-賴氨酸的產(chǎn)率。這種二氨基庚二酸脫氫酶基因應(yīng)被增強。另一選擇是，通過增強琥珀?；被徂D(zhuǎn)氨酶基因(dapD)和琥珀酰基二氨基庚二酸脫?；?dapE)而不是通過導(dǎo)入二氨基庚二酸脫氫酶，也可使L-賴氨酸的產(chǎn)率有相同程度的提高。
此處的基因增強指的是每個細(xì)胞中作為基因的表達產(chǎn)物的酶活性的增強。具體地說，例如細(xì)胞中基因拷貝數(shù)的增加。通過運用有高表達效率的啟動子而使每個基因的表達量增加，以及向該基因中引入突變以增強酶活性。為了增加一個細(xì)胞中基因的拷貝數(shù)，可將基因插入到一能在屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌中自主復(fù)制的載體上，并用此載體轉(zhuǎn)化屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌。該載體優(yōu)選的是一多拷貝型質(zhì)粒。另一方法是，通過擴增用Mu噬菌體等使得整合到染色體DNA上的DNA可增加拷貝數(shù)。
就所用的質(zhì)粒而言，當(dāng)質(zhì)粒是用于突變的DDPS基因和突變的AK基因的導(dǎo)入時，那些有穩(wěn)定分布機制的質(zhì)粒是優(yōu)選使用的，因其可穩(wěn)定共存在于細(xì)胞中。任意的基因?qū)腠樞蚨际强梢越邮艿摹?br> 得到大腸桿菌的L-賴氨酸生物合成系統(tǒng)的基因的方法及得到棒桿狀菌的DDH基因的方法將在下面的例子中給出。
以二種按已知的谷氨酸棒桿菌的DDH基因的DNA序列(Ishino，S，等，核酸研究，15，3917(1987))為基礎(chǔ)而制備的寡核苷酸引物(例如，SEQ ID NO9，NO10)，用PCR來擴增棒狀菌的染色體DNA，如乳酸發(fā)酵短桿菌的染色體DNA，而得到DDH基因。
以二種按已知的dapD基因的核酸序列(Richauel，C.等，生物化學(xué)雜志，259，14824(1984))為基礎(chǔ)而制備的寡聚核苷酸引物，(如，SEQ ID NO11，NO12)用PCR來擴增大腸桿菌W3110菌株的染色體DNA而得到dapD基因。
以二種按已知的dapE的核酸序列為基礎(chǔ)(Bouvier，J.等細(xì)菌學(xué)雜志，175，5265(1992))而制備的寡核苷酸引物(SEQ ID NO13，NO14)，用PCR來擴增大腸桿菌DNA而得到dapE基因。
在本發(fā)明中，假若突變的DDPS基因，突變的AK基因或其它的L-賴氨酸生物合成系統(tǒng)中的基因的啟動子，或者是用于表達這些基因的其它啟動子在細(xì)胞中有功能，并且當(dāng)突變的DDPS基因，突變的AK基因或其它的L-賴氨酸生物合成系統(tǒng)中的基因作為染色體外DNA被引入質(zhì)粒后，該載體DNA的復(fù)制起點在細(xì)菌細(xì)胞中仍有功能并能進行復(fù)制，則滿足以上條件的任一種屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌均可用作宿主。
例如，屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌是以產(chǎn)L-蘇氨酸的微生物為例說明，這是因為在產(chǎn)L-蘇氨酸的微生物中，由L-賴氨酸引起的天冬氨酸激酶的抑制通常也會脫敏。有一種屬于粘質(zhì)沙雷氏菌的產(chǎn)L-蘇氨酸細(xì)菌，其可以抗AHV(α-氨基-β-羥戊酸)，AHV是一種蘇氨酸類似物(S.Komatsubara，M，Kisumi和I.Chiba，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)，35，834(1978))。粘質(zhì)沙雷氏菌AJB 125菌株就是這樣的菌株。該菌株已于1995年6月12日根據(jù)布達佩斯條約以許可號FERM P-14983保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵政編碼305，日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號)并于1996年3月4日轉(zhuǎn)為國際保藏，并得到許可號FERM BP-5441。
此外，作為可用于本發(fā)明中用到的屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌，例子是賴氨酸脫羧酶缺陷型粘質(zhì)沙雷氏菌(特開昭50-53589(1975))。賴氨酸脫羧酶是通過L-賴氨酸脫羧催化產(chǎn)生尸胺反應(yīng)的一種降解L-賴氨酸的酶，該酶的缺陷株在L-賴氨酸的降解上受到抑制。
產(chǎn)L-蘇氨酸且是賴氨酸脫羧酶缺陷的屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌可通過紫外輻射或用諸如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍和亞硝酸等常用于人工突變的突變劑處理而得到。
用于培養(yǎng)本發(fā)明中的帶有突變基因的轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)基是含有碳源、氮源、無機離子和任選其它有機成分的常規(guī)培養(yǎng)基。
作為碳源，可用糖，如蔗糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、或淀粉水解產(chǎn)物，醇如甘油或山梨醇；或有機酸如延胡索酸、檸檬酸或琥珀酸。
作為氮源，可用無機銨鹽如尿素、硫酸銨、氯化銨或磷酸銨；有機氮如大豆水解物、氨氣，或水溶性氨。
優(yōu)選的是允許在培養(yǎng)基中含適當(dāng)量的必需的物質(zhì)，如維生素B1和L-異亮氨酸或酵母提取物作為痕量有機營養(yǎng)成分。除此之外，如果必要，加入少量磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。
優(yōu)選的培養(yǎng)是在需氧條件下培養(yǎng)16到96小時。培養(yǎng)溫度控制在25℃到45℃，且培養(yǎng)時的pH值控制在5～8。無機或有機，酸性或堿性物質(zhì)以及氨氣等可用于調(diào)節(jié)pH值。
從發(fā)酵液中收集L-賴氨酸通常是將離子交換樹脂法，沉淀法及其它已知方法相結(jié)合進行。
附圖簡述

圖1示pdapA1和pdapA2的制備步驟。
圖2示野生型和突變的DDPS被L-賴氨酸的抑制。
圖3示含有雙突變型dapA*基因的質(zhì)粒pdapAS824的制備步驟。
圖4示pLYSC1和pLYSC2的制備步驟。
圖5示羥胺處理后，轉(zhuǎn)化子的出現(xiàn)率和突變率。
圖6示野生型和突變的AKIII被L-賴氨酸的抑制劑。
圖7示源于RSF1010的含dapA*24的質(zhì)粒RSF24P的制備步驟。
圖8示質(zhì)粒pLLC*80的制備步驟。
圖9示源于RSF1010的含dapA*24和lysC*80的質(zhì)粒RSFD80的制備步驟。
實施本發(fā)明的最佳方式下面將用實施例來對本發(fā)明作更具體地解釋。
實例1突變的DDPS基因的制備<1>野生型dapA基因的克隆大腸桿菌dapA基因的堿基序列已經(jīng)報導(dǎo)過(Richavd，F(xiàn).等，細(xì)菌學(xué)雜志，297(1986))，并已知其開放閱讀框(ORF)有876個堿基對，并編碼一含292個氨基酸殘基的蛋白。因為不知該dapA基因是怎樣被調(diào)控的，所以用PCR法擴增出僅含有SD序列及ORF的區(qū)域并將之克隆，而沒有擴增啟動子區(qū)域。
按Saito和Miura的方法(生物化學(xué)和生物物理學(xué)報，72，619(1963))提取大腸桿菌K-12MC1061株的總基因組DNA。制備具有SEQ ID NO1和NO2中所示序列的二種引物，將之用于PCR反應(yīng)。PCR按Erlich等的方法進行(PCR技術(shù)，Stockton出版社(1989))，對靶DNA進行擴增。將得到的DNA插入到市售的PCR片段克隆載體pCR1000上(購自Invitroyen公司(加州，美國))。pCR1000含有l(wèi)acZ啟動子(Placz)，并且在出售時在lacZ啟動子的下游位點已為切割狀態(tài)。當(dāng)將連接PCR片段和二個pCR1000的切割末端而得到重組DNA導(dǎo)入到大腸桿菌時，PCR片段在lacZ啟動子控制下轉(zhuǎn)錄。連接PCR片段和pCR100時，得到二種質(zhì)粒，pdapA1是以正向連入的質(zhì)粒而pdapA2是以反向連入的質(zhì)粒，dapA的轉(zhuǎn)錄方向是相對于lacZ啟動子所轉(zhuǎn)錄的方向。
當(dāng)將這些質(zhì)粒導(dǎo)入到一種DDPS缺陷的大腸桿菌JE7627株時，帶有導(dǎo)入質(zhì)粒的菌株將導(dǎo)致宿主JE7627株的二氨基庚二酸營養(yǎng)缺陷得到補充。這樣，可證明插入到二種質(zhì)粒中的DNA片段帶有編碼活性DDPS的dapA基因。
通過將pdapA1導(dǎo)入野生型大腸桿菌W3110菌株(可從國家遺傳所(日本靜崗縣三島市)得到)而得到的轉(zhuǎn)化菌株命名為W3110/pdapA1，并將通過導(dǎo)入pdapA2到大腸桿菌W3110株中而得到的轉(zhuǎn)化菌株命名為W3110/pdapA2。將此二種轉(zhuǎn)化菌分別培養(yǎng)于基本培養(yǎng)基M9中，M9中含下列成分，其中AEC作為賴氨酸的類似物而被加入。作為對照，沒有導(dǎo)入質(zhì)粒的W3110株也培養(yǎng)于同樣的培養(yǎng)基中。二種轉(zhuǎn)化菌及不含質(zhì)粒的W3110株的生長受AEC抑制，然而，加入L-賴氨酸后，生長抑制得到恢復(fù)。(基本培養(yǎng)基M9)A(20×M9)Na2HPO4·12H2O 303g/LKH2PO460g/LNaCl 10g/LNH4Cl 20g/LB1M MgSO4C50％葡萄糖D1g/L維生素B1上述A、B、C、D分別滅菌，并以A∶B∶C∶D∶水＝5∶0.1∶1∶0.1∶95的比例混合。<2>突變的DDPS基因(dapA*)的制備據(jù)認(rèn)為帶有含有dapA*的質(zhì)粒的菌株可以在加入了大量AEC的基本培養(yǎng)基M9上生長，dapA*編碼對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的DDPS。帶有含dapA*的質(zhì)粒的菌株可以通過其對AEC的生長抑制的抗性而得到篩選。
為了有效地得到dapA*，將在<1>中所制備的pdapA1和pdapA2上的dapA接受突變處理。(1-2-1)帶有含dapA*的質(zhì)粒的菌株在篩選條件的研究上述得到的W3110/pdapA1和W3110/pdapA2菌株分別培養(yǎng)于含有不同濃度的AEC的M9培養(yǎng)基瓊脂板上。測量AEC的生長抑制濃度，并且研究帶有含dapA*的質(zhì)粒的菌株的篩選條件。
各轉(zhuǎn)化子在含不同濃度的AEC的M9培養(yǎng)基上的生長見表1。在此表中，+代表轉(zhuǎn)化子生長，-代表沒有生長。
表1

dapA基因在pdapA1中的轉(zhuǎn)錄方向同由lacZ啟動子引起的轉(zhuǎn)錄方向一致。因而發(fā)現(xiàn)甚至當(dāng)dapA仍是野生型時，pdapA1上的dapA基因也能提供對相當(dāng)高濃度的AEC的抗性，因為其表達量可被lacZ啟動子所增強，而在pdapA2上的dapA基因具有較小的表達量并在低濃度AEC下生長就被抑制，因其轉(zhuǎn)錄方向同lacZ啟動子相反，且dapA本身啟動子也是缺陷型的(對于W3110/pdapA1菌株，生長抑制是在30mM下發(fā)生，而對于W3110/pdapA2則是在15mM下發(fā)生)。通過同時加入L-賴氨酸證實生長抑制得到消除。
因此，pdapA2用作引入突變的對象。加入了60mM的AEC到基本培養(yǎng)基M9中而制備的培養(yǎng)基用作篩選帶有含dapA*的質(zhì)粒的菌株。這種培養(yǎng)基在下面的實施例1中稱作“選擇培養(yǎng)基”。(1-2-2)用羥胺對pdapA2作體外突變處理用一種其中質(zhì)粒直接用羥胺處理的體外突變處理方法向pdapA2質(zhì)粒中引入突變。
2μg的DNA在75℃下，以0.4M羥胺中處理1到4個小時(0.1MKH2PO4-1mM EDTA(pH6.0)100μl，1M羥胺-1mM EDTA(pH6.0)80μl，DNA2μg，總共用水補足至200μl)。處理后的DNA用玻璃粉純化，并導(dǎo)入到大腸桿菌W3110菌株中，且然后將菌鋪于完全培養(yǎng)基(L-培養(yǎng)基1％Bacto胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl，1.5％瓊脂)上以形成菌落。將它們復(fù)制到(1-2-1)中所述的選擇培養(yǎng)基上，挑取那些可在選擇培養(yǎng)基上形成菌落的細(xì)菌。二次實驗后，總共在36株得到突變質(zhì)粒的候選菌株。
將得到的總共36株候選菌再一次點于選擇培養(yǎng)基上，并證明AEC的抗性。(1-2-3)分離dapA基因及對dapA*產(chǎn)物的研究從上述36個菌株中回收突變的pdapA2。用突變的pdapA2及野生型pdapA2分別轉(zhuǎn)化dapA缺陷型JE7627菌株。從每個轉(zhuǎn)化菌株中制備無細(xì)胞提取物，并且測量DDPS的酶活性。
無細(xì)胞提取物(粗酶溶液)按下列方法制備。轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)于2×TY培養(yǎng)基中(1.6％Bacto胰蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％NaCl)，在660nm下的光密度值(OD660)約為0.8時收集細(xì)菌。用0.85％NaCl在0℃下洗滌細(xì)胞沉淀，并用含400mM KCl的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)重懸菌體。用超聲破碎細(xì)胞(0℃，200瓦，10分鐘)。破碎的細(xì)胞溶液在0℃下于33千轉(zhuǎn)/分鐘離心1小時得到上清，向其中加入硫酸銨至80％飽和度，于0℃放置過夜，然后離心。沉淀溶于20mM磷酸鉀緩沖液400mM KCl中(pH7.5)。
DDPS酶活性的測定按Yugari等的方法進行(Yugari，Y.和Gilvarg，C.生物化學(xué)雜志，240，4710(1962))。即，含以下組分的反應(yīng)液37℃下270nm的光吸收在以時間-進程方式用分光光度計測定，并且測定生成的二氫吡啶二羧酸。除去丙酮酸鈉的反應(yīng)系統(tǒng)作為空白。(反應(yīng)液組分)50mM鹽酸咪唑pH7.420mM L-天冬氨酸半醛20mM丙酮酸鈉酶溶液水(平衡)總計1.0ml
在測DDPS的酶活性時，向酶反應(yīng)液中加入不同濃度的L-賴氨酸并檢測L-賴氨酸引起的抑制程度。如圖2中所示，野生型DDPS受L-賴氨酸抑制。同野生型相比，在36種候選質(zhì)粒中，有3種來自轉(zhuǎn)化菌株具有DDPS的突變質(zhì)粒，其DDPS不容易受到L-賴氨酸抑制。將之分別命名為pdapAS8、pdapAS9和pdapAS24。根據(jù)此后的對堿基序列的測定，發(fā)現(xiàn)pdapAS8和pdapAS9具有相同的突變。
由pdapAS8，pdapAS9和pdapAS24的dapA*編碼的三種突變的DDPS中，對由L-賴氨酸引起的抑制的脫敏程度是不同的，然而，在所有三種DDPS中，對L-賴氨酸的抑制均脫敏。盡管特定的酶的活性可能受到細(xì)胞的生長狀況及樣品制備的影響。但發(fā)現(xiàn)同野生型相比，突變體在任何情況下均低一些。然而，可以斷定它們作為一種繁殖物質(zhì)不會產(chǎn)生實質(zhì)的問題。(1-2-4)突變的da3A基因堿基序列的測定用ABI373A型DNA測序儀(由應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制造)用一種常規(guī)方法測定突變的dapA基因的堿基序列。結(jié)果是顯示在pdapAS8和pdapAS9中，487位的C變?yōu)門，并且在pdapAS24中第597位的C變?yōu)門，比較的對象是SEQ ID NO3中所示的野生型dapA基因的序列。因此，結(jié)果顯示在由pdapAS8和pdapAS9編碼的DDPS中，81位的丙氨酸殘基變?yōu)槔i氨酸殘基，并且在pdapAS24編碼的DDPS中，第118位組氨酸殘基變?yōu)槔野彼釟埢?，DDPS的氨基酸序列在SEQ IDNO4中給出。(1-2-5)制備有雙突變的dapA二種突變的dapA基因如前述而得到。為了驗證對抑制的脫敏是否也對這些突變奏效，制備帶有含二種突變的突變的dapA質(zhì)粒。制備方法示于圖3中。所得到的具有雙突變的質(zhì)粒命名為pdapAS824。
實施例2突變的AKIII基因的制備<1>野生型lysC基因的克隆大腸桿菌的AKIII基因(lvsC)的堿基序列已有報導(dǎo)(Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.，和Patte，J.C.，生物化學(xué)雜志，261，1052(1986))，并且已知其開放閱讀框(ORF)含1347個堿基對，并編碼一含449個氨基酸殘基的蛋白。該基因中存在一操縱子，且其可受到L-賴氨酸的抑制。因此，為了去除此操縱子區(qū)域，用PCR法擴增了只含有SD序列和ORF的一段區(qū)域，并將之克隆。
按Saito和Miura(生物化學(xué)和生物物理學(xué)報，72，619(1963))的方法制備大腸桿菌K-12 MC1061菌株的總基因組DNA。制備含有SEQ ID NO5和NO6中所示的序列的二種引物，并用它按Erlich等的方法(PCR技術(shù)，Stockton出版社(1989))進行PCR反應(yīng)，繼而擴增lysC基因。得到的DNA用BamHI和AseI消化，然后使之末端變平，并插入到多拷貝載體pUC18的SmaI位點上。該SmaI位點位于存在于載體上的lacZ啟動子的下游一側(cè)，且當(dāng)將通過將DNA片段插入pUC18的SmaI位點而得到的重組DNA導(dǎo)入到大腸桿菌中時，插入的DNA片段在lacZ啟動子控制下通過連讀轉(zhuǎn)錄而被轉(zhuǎn)錄。當(dāng)將PCR片段插入到pUC18的SmaI位點時，得到二種質(zhì)粒，pLYSC1是以反向插入的質(zhì)粒，而pLYSC2是以正向插入的質(zhì)粒，lysC轉(zhuǎn)錄的方向相對于由lacZ啟動子所引起的轉(zhuǎn)錄方向而言(圖4)。
當(dāng)用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化AKI、II、III完全缺陷的大腸桿菌GT3菌株(thrA1016b metLM1005 lysC1004)時，GT3對高絲氨酸和二氨基庚二酸的營養(yǎng)缺陷得到補充。這樣可以確證插入到二個質(zhì)粒上的DNA片段含有編碼活性AKIII的lysC基因。
通過向AK完全缺陷的大腸桿菌GT3菌株中導(dǎo)入pLYSC1而得到的轉(zhuǎn)化菌命名為GT3/pLYSC1，并將pLYSC2導(dǎo)入到大腸桿菌GT3而得到的轉(zhuǎn)化菌命名為GT3/pLYSC2。向基本培養(yǎng)基M9中加入相當(dāng)多量的L-賴氨酸，并將GT3/pLYSC1和GT3/pLYSC2菌株分別培養(yǎng)。GT3/pLYSC1和GT3/pLYSC2兩種菌株中均帶有含野生型lysC基因的質(zhì)粒，其中的質(zhì)粒上lysC編碼的AKIII是唯一的AK。在存在有相當(dāng)多量的L-賴氨酸時，作為唯一的AK的野生型AKIII受到L-賴氨酸的抑制。這樣，二種菌株都不能合成L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-甲硫氨酸和二氨基庚二酸(DAP)，并且生長受到抑制。<2>突變的AKIII基因(lysC*)的制備據(jù)認(rèn)為帶有含編碼對L-賴氨酸的抑制脫敏的AK的lysC*的質(zhì)粒的菌株能在加入了相當(dāng)多量的L-賴氨酸的M9基本培養(yǎng)基上生長。通過篩選能抗L-賴氨酸尤其類似物AEC而生長的菌株，可以得到帶有含lysC*的質(zhì)粒的菌株。
為了有效地得到lysC*，對<1>中制備的pLYSC1和pLYSC2上的lysC進行突變處理。(2-2-1)帶有含lysC*的質(zhì)粒的菌株的篩選條件的研究將GT3/pLYSC1和GT3/pLYSC2菌株分別培養(yǎng)于含有不同濃度的L-賴氨酸或AEC的M9瓊脂板培養(yǎng)基上。檢測L-賴氨酸和AEC引起的生長抑制濃度，并研究帶有含lysC*的質(zhì)粒的菌株的篩選條件。
含有不同濃度的L-賴氨酸或AEC的M9培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化子的生長見表2。此表中，+代表轉(zhuǎn)化子生長，±代表有一點生長，而-代表沒有生長。
表2生長及L-賴氨酸的濃度

生長及AEC的濃度

<p>pLYSC2上的lysC基因的轉(zhuǎn)錄方向同由lacZ啟動子引起的轉(zhuǎn)錄的方向相一致(圖4)。這樣，發(fā)現(xiàn)pLYSC2上的lysC基因，甚至當(dāng)其是野生型的，也可提供對相當(dāng)高濃度的L-賴氨酸和AEC的抗性，這是因為其表達量被lacZ啟動子增強，而pLYSC1上的lysC基因表達量較小且在L-賴氨酸和AEC的濃度較低時生長就受到抑制，這是因為其轉(zhuǎn)錄方向同lacZ啟動子的方向相反，且其自身的啟動子也是缺陷型的(就GT3/pLYSC2菌株而言，在加入了100mM的L-賴氨酸，以及在加了3mM的AEC的情況下，生長不受抑制，而對于GT3/pLYSC1菌株，加入0.2mM的L-賴氨酸及AEC就使得生長完全受到抑制)。在同時加入高絲氨酸和二氨基庚二酸時，證明生長抑制被消除。
因而，pLYSC1用于引入突變的實驗。加入了10mM L-賴氨酸或0.2mM AEC的基本培養(yǎng)基M9而制備的培養(yǎng)基被用來篩選帶有含lysC*的質(zhì)粒的菌株。該培養(yǎng)基在下面的實施例2中被稱為“選擇培養(yǎng)基”。(2-2-2)用羥胺對pLYSC1進行體外突變處理二種方法被用于向pLYSC1質(zhì)粒中引入突變，一種是體外突變處理法，其中的質(zhì)粒用羥胺直接處理，且另一種是體內(nèi)突變處理法，即將帶有質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞用亞硝基胍(NTG)處理，之后提取質(zhì)粒以得到廣泛的突變，就是說預(yù)期得到的突變是除是用羥胺處理時得到從胞嘧啶到胸腺嘧啶的突變的其它突變。(用羥胺進行體外突變處理)2μg的DNA于75℃在0.4M羥胺中(0.1M KH2PO4-1mMEDTA(pH6.0)100μl，1M羥胺-1mM EDTA(pH6.0)80μl，DNA2μg，總共用水補充至200μl)處理到4小時。處理后的DNA用玻璃粉純化，導(dǎo)入到AK完全缺陷的大腸桿菌GT3菌株中，并將菌鋪于完全培養(yǎng)基上(L-培養(yǎng)基1％Bacto胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl，1.5％瓊脂)以形成菌落。將之復(fù)制到(2-2-1)中所描述的選擇培養(yǎng)基上，并篩選能在選擇培養(yǎng)基上生長的菌株作為候選菌株。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子的出現(xiàn)率和突變率是如圖5中所示變化的。處理4小時，在相當(dāng)高的比率下，0.5～0.8％，得到突變菌株。(用NTG進行體內(nèi)突變處理)將pLYSCl導(dǎo)入大腸桿菌MC1061菌株，并對完整的細(xì)胞進行NTG處理。處理后的細(xì)胞培養(yǎng)過夜以鞏固突變，且然后，提取質(zhì)粒并導(dǎo)入大腸桿菌GT3中。就是說，轉(zhuǎn)化菌株培養(yǎng)于2×TY培養(yǎng)基(1.6％Bacto胰蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％NaCl)，在OD660約為0.3時收集菌體，用下述的TM緩沖液洗，然后重懸于NTG溶液中(將NTG以0.2mg/ml濃度溶于TM緩沖液中而制得)，且在37℃下處理0到90分鐘。用TM緩沖液和2×TY培養(yǎng)基洗滌菌體細(xì)胞，且然后將之在2×TY培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜以鞏固突變。之后，從該細(xì)胞中提取質(zhì)粒DNA，并將之導(dǎo)入到大腸桿菌GT3菌株中。按照體外突變中相同的方法篩選候選菌株，并且得到賴氨酸抗性(LysR)和AEC抗性(AECR)的突變株。(TM緩沖液)Tris50mM馬來酸 50mM(NH4)2SO41g/LMgSO4·7H2O 0.1g/LCa(NO3)25mg/LFeSO4·7H2O 0.25mg/L用NaOH將pH調(diào)至6.0依上述方法處理后(羥胺處理；48株，NTG處理，132株)，共得到180個候選菌株，將這些菌株重新點在選擇培養(yǎng)基上，并確證得到153株AEC和L-賴氨酸的抗性株?？紤]到培養(yǎng)基中氨基酸集聚形式的差異，將此153株分為14個組，挑取每個組的代表菌株并對之進行4K活性的測定。由羥胺處理得到的突變株和由NTG處理得到的突變株的AK活性無大的差異。這樣，進行的下列實驗中未能區(qū)分它們。(2-2-3)lysC*基因的分離及l(fā)ysC*產(chǎn)物的研究24號、43號、48號、60號、80號、117號、126號、149號、150號、156號、158號、167號、169號和172號被選作前述14個組的代表菌株。從這些菌株中回收來自pLYSC1的突變的質(zhì)粒，并分別命名為pLYSC1*24、pLYSC1*43、pLYSC1*48、pLYSC1*60、pLYSC1*80、pLYSC1*117、pLYSC1*126、pLYSC1*149、pLYSC1*150、pLYSC1*156、pLYSC1*158、pLYSC1*167、pLYSC1*169和pLYSC1*172。將這些質(zhì)粒及野生型pLYSC1轉(zhuǎn)化AK完全缺陷的GT3菌株。從每個轉(zhuǎn)化菌株中制備無細(xì)胞提取物，并測定AKIII的酶活性。
無細(xì)胞提取物(粗酶溶液)按下法制備。轉(zhuǎn)化菌株培養(yǎng)于2×TY培養(yǎng)基，并在OD660約為0.8時收集菌體。用0.02M KH2PO4(pH6.75)-0.03Mβ-巰基乙醇在0℃下洗滌細(xì)胞，并用超聲(0℃，100瓦，30分鐘4次)破碎菌體細(xì)胞。經(jīng)破碎的細(xì)胞溶液于0℃下以33krpm/分鐘離心1小時，向得到的上清液中加入硫酸銨至80％飽和度。離心后，沉淀用0.02M KH2PO4(pH6.75)-0.03Mβ-巰基乙醇溶解并于4℃貯存過夜。
根據(jù)Stadtman等的方法(Stadtman，E.R.，Cohen，G.N.，LeBras，G.，和Robichon-Szulmajster，H.，生物化學(xué)雜志，236，2033(1961))測定AKIII的酶活性。就是說，含有下列組分的反應(yīng)液于27℃保溫45分鐘，加入FeCl3溶液(2.8N HCl 0.4ml+12％TCA 0.4ml+5％FeCl3·6H2O/0.1N HCl 0.7ml)以形成顏色，且離心后，于540nm測上清液的吸收值?；钚杂擅糠昼姰a(chǎn)生的氧\異羥肟酸的量來表示(1U＝1μmol/分鐘)。摩爾吸收系數(shù)為600。不含天冬氨酸鉀的反應(yīng)液作為空白。(反應(yīng)液的組成)反應(yīng)混合物*1 0.3ml羥胺溶液*2 0.2ml0.1M天冬氨酸鉀(pH7.0) 0.1ml酶溶液水 (平衡)總體積1.0ml*11M Tris-HCl(pH8.1)9ml+0.3M MgSO40.5ml+0.2M ATP(pH7.0)5ml*2在使用前用KOH將8M羥胺溶液中和。
在測AK的酶活中，向酶反應(yīng)液中加入了不同濃度的L-賴氨酸并檢測L-賴氨酸的抑制程度。結(jié)果在圖6和表3中給出。野生型和24，43，48，60，80，117和126號的結(jié)果顯示在圖6A中。149，150，156，158，167，169和172號的結(jié)果顯示在圖6B中。
正如這些結(jié)果所示，野生型AKIII受到L-賴氨酸的強烈抑制，在約0.45mM L-賴氨酸存在時，50％活性被抑制，并且在5mM L-賴氨酸存在時，約100％活性被抑制。相反，盡管這次得到的突變的AKIII具有不同程度的脫敏，然而所有14種菌株對L-賴氨酸的抑制均脫敏。特別是24，80，117，169和172號，甚至L-賴氨酸達100mM時，也很少能觀測到抑制，并且同野生型相比，它們的50％抑制濃度要高200倍以上。在幾乎所有情況中，基于總蛋白的特異酶活性，盡管其可受到細(xì)胞的生長狀況和樣品制備的影響，但同野生型的相同或高于野生型，并且?guī)缀鯖]有由于引入突變而導(dǎo)致酶活性下降的問題(表3)。依據(jù)該事實，可以預(yù)測AKIII的活性中心獨立于L-賴氨酸的調(diào)控位點。在表3中，抑制脫敏程度(％)是指反應(yīng)液中存在有100mM的L-賴氨酸時AK的活性同沒有L-賴氨酸時AK活性的比較。熱穩(wěn)定性(％)是指55℃下處理1.5小時后酶活性的保持率。
表3

*1存在100mM的L-賴氨酸時AK的活性同沒有L-賴氨酸時AK活性的比較*255℃處理1.5小時后酶活性的保持率隨后，測定了突變酶的熱穩(wěn)定性。當(dāng)有意于改善一種酶以提高其活性時，所產(chǎn)生的酶在細(xì)胞中保持穩(wěn)定是重要的。體外檢測存在一些問題，這是因為細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外蛋白酶活性差別以及用于體外酶的儲存的緩沖的影響。然而，為了方便，測量了體外突變的AKIII的熱穩(wěn)定性作為一個參數(shù)。
根據(jù)不同條件下AKIII的失活溫度的研究結(jié)果，測量了于55℃下處理90分鐘后酶活性的保持率。如表3中所示，半數(shù)的酶較野生型酶更好。一般來說，突變酶通常較野生型更不穩(wěn)定。然而，這次得到的一些突變的AKIII在穩(wěn)定性上超過野生型，并且其中的多種酶看來可以很好地實際應(yīng)用于L-賴氨酸的生產(chǎn)中。(2-2-4)野生型lysC知突變的lysC堿基序列的測定本次所得到的野生型lysC基因堿基序列用一ABI373型測序儀按常規(guī)方法進行測序(由應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制造)(SEQ ID NO7)。結(jié)果是發(fā)現(xiàn)在6個位點(2個是氨基酸水平)與已發(fā)表的大腸桿菌K-12 JC411菌株的lysC的序列不同(Cassan，M.，Karsot，C.，Cohen，G.N.，和Patte，J.C.，生物化學(xué)雜志，261，1052(1986))。推測此6個位點的不同是由于所用菌株不同所致。
以相同的方法，測定了存在于14種突變的pLYSC1中l(wèi)ysC*的每個堿基序列，確定了突變位點。結(jié)果在表4中給出。在此表中，括號中示由于核苷酸突變而引起的氨基酸殘基的突變。突變的類型為12種，因為在14種突變菌株中，有二對(48號和167號，24號和80號)實際上是相同的突變類型。就突變類型而言，149、150、156、158、167、169和172號是通過羥胺處理而得到，且24、43、48、60、80、117和126號是通過NTG處理而得到。然而，就突變的方式而言，由于非編碼鏈上的胞嘧啶到胸腺嘧啶的突變其中的任何一種都在于編碼鏈上的從胞嘧啶到胸腺嘧啶，或由鳥嘌呤到腺嘌呤的突變。
表4lysC*的突變點的確定

*H；羥胺處理，N；NTG處理實施例3用導(dǎo)入了dapA*的菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸為了用屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌來生產(chǎn)L-賴氨酸，正如特開昭56-18596，美國專利No.4,346,170和應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)，15，227-231(1982)中所說，應(yīng)考慮到在DDPS增強的宿主菌中具有一個被改變了的不受L-賴氨酸抑制的天冬氨酸激酶是至關(guān)重要的。預(yù)計屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌與屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌相似。這樣的菌株的例子是產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌。對于產(chǎn)L-蘇氨酸的粘質(zhì)沙雷氏菌，已知一種抗蘇氨酸的類似物AHV(α-氨基-β-羥基戊酸)的菌株(S.Komatsubara，M.Kisumi和I.Chiba.應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)，35，834(1978))。特別值得一提的是該菌株中的粘質(zhì)沙雷氏菌AJ 13125菌株。該菌株已于1995年6月12日根據(jù)布達佩斯條約以許可號FERM P-14983保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵政編碼305日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號)，并于1996年3月4日轉(zhuǎn)為國際保藏且得到許可號FERM BP-5441。
另一方面，含于pdapAS24中的dapA*(其118位組氨酸殘基被酪氨酸殘基所替換)被選作導(dǎo)入到粘質(zhì)沙雷氏菌中的dapA*，這是考慮了該酶對抑制的脫敏程度和其特異活性后決定的。首先，為了增加dapA*的表達量并增強質(zhì)粒的穩(wěn)定性，將存在于pdapAS24上的突變dapA*(此后稱作“dapA*24”)連接到pVIC40的四環(huán)素抗性基因的啟動子下游且RSF24P按照圖7中所示獲得。
通過將質(zhì)粒RSF24P導(dǎo)入到大腸桿菌JM109菌株而得到的菌株命名為AJ12395，該菌株于1993年10月28日根據(jù)布達佩斯條件以許可號FERM P-13935保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，并于1994年11月1日轉(zhuǎn)為國際保藏，得到許可號FERM BP-4858。含有pdapAS8和pdapS9的菌株未被保藏。然而，每個質(zhì)粒上的dapA*的所有突變點均已在前文中確定。這樣，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，容易用Maniatis等的方法(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch.，E.F，Maniatis，T.，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，1.21(1989))從前述保藏菌中回收質(zhì)粒，以及用定點誘變法(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis，T.，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，15.63(1989))得到目的基因。
用一種常規(guī)的方法將質(zhì)粒RSF24P導(dǎo)入到AJ13125株中并得到AJ13125/RSF24P。測定AJ13125/RSF24P的L-賴氨酸的產(chǎn)率。
另一方面，構(gòu)建作為對照質(zhì)粒的KSFP。即，按照圖7中所示從用BamHI和DraI雙酶消化pVIC40消化產(chǎn)物中的篩選出一大片段，并用DNA聚合酶Klenow片段將之末端變平。平末端的大片段經(jīng)自連得到質(zhì)粒RSFP。用常規(guī)方法將RSFP導(dǎo)入AJ13125菌株。且得到AJ13125/RSFP。也測AJ13125/RSFP的L-賴氨酸的產(chǎn)率。
用下述培養(yǎng)基，將菌于30℃，以114～116轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)72小時進行培養(yǎng)。結(jié)果列于表5。(用于L-賴氨酸生產(chǎn)的培養(yǎng)基)A(NH4)2SO416g/LKH2PO41g/LMgSO4·7H2O 1g/LFeSO4·7H2O 0.01g/LMnSO4·5H2O 0.01g/L酵母提取物(Difco公司)2g/LL-甲硫氨酸 0.5g/LL-蘇氨酸 0.1g/LL-異亮氨酸 0.05g/L用KOH將pH調(diào)至7，以115℃高壓滅菌10分鐘(16/20體積)B20％葡萄糖(115℃高壓滅菌10分鐘)(4/20體積)C藥用CaCO3(180℃，2天，干熱滅菌)(30g/L)A和B以A∶B＝4∶1的比例混合，向混合物中以30克每升的量加入C并使之溶解，并加入一種抗生素(鏈霉素200μg/毫升)。
表5

實施例4用導(dǎo)入了dapA*和lysC*的菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸在實施例3中已揭示了突變的DDPS對于L-賴氨酸產(chǎn)量的影響。為了獲得進一步的提高，讓實施例2中獲得的突變型AKIII基因同突變的DDPS基因共存于菌中。同突變的DDPS基因共存的突變的AKIII基因選自80號菌株(lysC*80)，這是從酶活，熱穩(wěn)定性等考慮。
通過將已存在于pLYSC1*80上的lysC*連接(此后稱為“l(fā)ysC*80)到載體pHSG399(由Takara Shuzo公司生產(chǎn))的lacZ啟動子的下游而制得質(zhì)粒pLLC*80(圖8)，pHSG399相對于pUC18而言含有一反向插入位點，將lysC*80從質(zhì)粒pLLC*80切下使用以增加lysC*的表達量。為了提高L-賴氨酸產(chǎn)率，制得質(zhì)粒pLLC*80以使lysC*80的轉(zhuǎn)錄方向相對于lacZ啟動子而言是正向的，因為pLYSC1*80上的lysC*80相對于lacZ啟動子而言其轉(zhuǎn)錄方向是反向的。
如圖9中所示，從實施例3中獲得的pLLC*80和RSF24P中制備含有dapA*和lysC*的質(zhì)粒RSFD80。RSFD80包括以此順序安排的dapA*24和lysC*80以使得其轉(zhuǎn)錄方向在tetP的下游相對于四環(huán)素抗性基因的啟動子(tetP)而言是正向的。
將RSFD80質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌JM109菌株中，命名為AJ12396。AJ12396于1993年10月28日保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，許可號為FERM P-13936，并且根據(jù)布達佩斯條約，于1994年11月1日由轉(zhuǎn)國際保藏，且其保藏許可號為FERM BP-4859儲藏。帶有pLYSC1*24、pLYSC1*43、pLYSC1*48、pLYSC1*60、pLYSC1*117、pLYSC1*126、pLYSC1*149、pLYSC1*150、pLYSC1*156、pLYSC1*158、pLYSC1*167、pLYSC1*169和pLYSC1*172的菌株未被保藏。然而，每個質(zhì)粒中的lysC*上的所有突變位點均在上文中確定。這樣，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，容易用Maniatis等的方法(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch.E.F.，Maniatis，T.，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，1.21(1989))從前述保藏菌中回收質(zhì)粒，以及用定點誘變的方法(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis，T.，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，15.63(1989))得到目的基因。以常規(guī)方法將RSFD80導(dǎo)入到AJ13125菌株且得到AJ13125/RSFD80。測定AJ13125/RSFD80的L-賴氨酸的產(chǎn)率。作為對照的AJ13125/RSFP的L-賴氨酸的產(chǎn)率也被測定。
用實施例3中的用于生產(chǎn)L-賴氨酸的相同培養(yǎng)基在30℃下， 114到116轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)72小時進行培養(yǎng)。結(jié)果見表6。
表6

工業(yè)適用性根據(jù)本發(fā)明，得到一種來自屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的DDPS突變基因，其對L-賴氨酸的反饋抑制足夠地脫敏。一種屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌，帶有產(chǎn)生相當(dāng)多量的L-賴氨酸的基因。L-賴氨酸的產(chǎn)量可按下述方法得到提高，即向?qū)儆谏忱资暇鷮俚募?xì)菌中導(dǎo)入突變的DDPS基因，這種菌中帶有對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的天冬氨酸激酶。
序列表(1)一般信息(i)申請者味之素公司(ii)發(fā)明題目發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的方法(iii)序列數(shù)14(iv)通訊地址(A)地址味之素公司(B)街道京橋1丁目15-1(C)市中央?yún)^(qū)(D)州東京都(E)國家日本(F)郵編104(v)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn(vi)當(dāng)前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日期(C)分類(vii)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)提交日期(viii)代理人/事務(wù)所信息(A)人名(B)注冊號(C)文獻/目錄號(ix)電訊信息(A)電話(B)電傳(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它..合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO1CCGCAACTAC TGACATGACG 20(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它..合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO2AGTAAGCCAT CAAATCTCCC 20(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度1197(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型基因組DNA(vi)最初來源(A)有機體大腸桿菌(B)菌株MC1061(ix)特性
(A)名稱/關(guān)鍵詞原始轉(zhuǎn)錄本(B)位置248(C)鑒定方法E(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置272..1150(C)鑒定方法E(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞引物結(jié)合(B)位置27..46(C)鑒定方法E(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞引物結(jié)合(B)位置1156..1175(C)鑒定方法E(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞RBS(B)位置261..265(C)鑒定方法S(xi)序列描述SEQ ID NO3CCAGGCGACT GTCTTCAATA TTACAGCCGC AACTACTGAC ATGACGGGTG ATGGTGTTCA 60CAATTCCACG GCGATCGGCA CCCAACGCAG TGATCACCAG ATAATGTGTT GCGATGACAG120TGTCAAACTG GTTATTCCTT TAAGGGGTGA GTTGTTCTTA AGGAAAGCAT AAAAAAAACA180TGCATACAAC AATCAGAACG GTTCTGTCTG CTTGCTTTTA ATGCCATACC AAACGTACCA240TTGAGACACT TGTTTGCACA GAGGATGGCC C ATG TTC ACG GGA AGT ATT GTC 292Met Phe Thr Gly Ser Ile Val1 5GCG ATT GTT ACT CCG ATG GAT GAA AAA GGT AAT GTC TGT CGG GCT AGC 340Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser10 15 20TTG AAA AAA CTG ATT GAT TAT CAT GTC GCC AGC GGT ACT TCG GCG ATC 388Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile25 30 35GTT TCT GTT GGC ACC ACT GGC GAG TCC GCT ACC TTA AAT CAT GAC GAA 436Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser Ala Thr Leu Asn His Asp Glu40 45 50 55CAT GCT GAT GTG GTG ATG ATG ACG CTG GAT CTG GCT GAT GGG CGC ATT 484His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu Asp Leu Ala Asp Gly Arg Ile60 65 70CCG GTA ATT GCC GGG ACC GGC GCT AAC GCT ACT GCG GAA GCC ATT AGC 532Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser75 80 85CTG ACG CAG CGC TTC AAT GAC AGT GGT ATC GTC GGC TGC CTG ACG GTA 580Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly Ile Val Gly Cys Leu Thr Val90 95 100ACC CCT TAC TAC AAT CGT CCG TCG CAA GAA GGT TTG TAT CAG CAT TTC 628Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe105 110 115AAA GCC ATC GCT GAG CAT ACT GAC CTG CCG CAA ATT CTG TAT AAT GTG 676Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val120 125 130 135CCG TCC CGT ACT GGC TGC GAT CTG CTC CCG GAA ACG GTG GGC CGT CTG 724Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu140 145 150GCG AAA GTA AAA AAT ATT ATC GGA ATC AAA GAG GCA ACA GGG AAC TTA 772Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu155 160 165ACG CGT GTA AAC CAG ATC AAA GAG CTG GTT TCA GAT GAT TTT GTT CTG 820Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu Val Ser Asp Asp Phe Val Leu170 175 180CTG AGC GGC GAT GAT GCG AGC GCG CTG GAC TTC ATG CAA TTG GGC GGT 868Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly185 190 195CAT GGG GTT ATT TCC GTT ACG ACT AAC GTC GCA GCG CGT GAT ATG GCC 916His Gly Val Ile Ser Val Thr Thr Asn Val Ala Ala Arg Asp Met Ala200 205 210 215CAG ATG TGC AAA CTG GCA GCA GAA GAA CAT TTT GCC GAG GCA CGC GTT 964Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu His Phe Ala Glu Ala Arg Val220 225 230ATT AAT CAG CGT CTG ATG CCA TTA CAC AAC AAA CTA TTT GTC GAA CCC 1012Ile Asa Gln Arg Leu Met Pro Leu His Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro235 240 245AAT CCA ATC CCG GTG AAA TGG GCA TFT AAG GAA CTG GGT CTT GTG GCG 1060Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala250 255 260ACC GAT ACG CTG CGC CTG CCA ATG ACA CCA ATC ACC GAC AGT GGT CGT 1108Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg265 270 275GAG ACG GTC AGA GCG GCG CTT AAG CAT GCC GGT TTG CTG T AAAGTTTAGG1158Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His Ala Gly Leu Leu280 285 290GAGATTTGAT GGCTTACTCT GTTCAAAAGT CGCGCCTGG 1197(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度292(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Phe Thr Gly Ser Ile Val Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys1 5 10 15Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val20 25 30Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser35 40 45Ala Thr Leu Asn His Asp Glu His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu50 55 60Asp Leu Ala Asp Gly Arg Ile Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn65 70 75 80Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly85 90 95Ile Val Gly Cys Leu Thr Val Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln100 105 110Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu115 120 125Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu130 135 140Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile145 150 155 160Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu165 170 175Val Ser Asp Asp Phe Val Leu Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu180 185 190Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly His Gly Val Ile Ser Val Thr Thr Asn195 200 205Val Ala Ala Arg Asp Met Ala Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu210 215 220His Phe Ala Glu Ala Arg Val Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His225 230 235 240Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys245 250 255Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr260 265 270Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His275 280 285Ala Gly Leu Leu290(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它..合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO5CTTCCCTTGT GCCAAGGCTG 20(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度18(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它..合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO6GAATTCCTTT GCGAGCAG 18(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征
(A)長度2147(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型基因組DNA(vi)最初來源(A)有機體大腸桿菌(B)菌株MC1061(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞-35信號(B)位置242..249(C)鑒定方法S(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞-10信號(B)位置265..273(C)鑒定方法S(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞引物結(jié)合(B)位置536..555(C)鑒定方法E(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞引物結(jié)合(B)位置2128..2147(C)鑒定方法E(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞RBS(B)位置575..578(C)鑒定方法S(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置584..1933
(C)鑒定方法S(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞終止子(B)位置1941..1968(C)鑒定方法S(xi)序列描述SEQ ID NO7TCGAAGTGTT TCTGTAGTGC CTGCCAGGCA GCGGTCTGCG TTGGATTGAT GTTTTTCATT 60AGCAATACTC TTCTGATTTT GAGAATTGTG ACTTTGGAAG ATTGTAGCGC CAGTCACAGA120AAAATGTGAT GGTTTTAGTG CCGTTAGCGT AATGTTGAGT GTAAACCCTT AGCGCAGTGA180AGCATTTATT AGCTGAACTA CTGACCGCCA GGAGTGGATG AAAAATCCGC ATGACCCCAT240CGTTGACAAC CGCCCCGCTC ACCCTTTATT TATAAATGTA CTACCTGCGC TAGCGCAGGC300CAGAAGAGGC GCGTTGCCCA AGTAACGGTG TTGGAGGAGC CAGTCCTGTG ATAACACCTG360AGGGGGTGCA TCGCCGAGGT GATTGAACGG CTGGCCACGT TCATCATCGG CTAAGGGGGC420TGAATCCCCT GGGTTGTCAC CAGAAGCGTT CGCAGTCGGG CGTTTCGCAA GTGGTGGAGC480ACTTCTGGGT GAAAATAGTA GCGAAGTATC GCTCTGCGCC CACCCGTCTT CCGCTCTTCC540CTTGTGCCAA GGCTGAAAAT GGATCCCCTG ACACGAGGTA GTT ATG TCT GAA ATT 595Met Ser Glu Ile1GTT GTC TCC AAA TTT GGC GGT ACC AGC GTA GCT GAT TTT GAC GCC ATG 643Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp Phe Asp Ala Met5 10 15 20AAC CGC AGC GCT GAT ATT GTG CTT TCT GAT GCC AAC GTG CGT TTA GTT 691Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn Val Arg Leu Val25 30 35GTC CTC TCG GCT TCT GCT GGT ATC ACT AAT CTG CTG GTC GCT TTA GCT 739Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu Val Ala Leu Ala40 45 50GAA GGA CTG GAA CCT GGC GAG CGA TTC GAA AAA CTC GAC GCT ATC CGC 787Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu Asp Ala Ile Arg55 60 65AAC ATC CAG TTT GCC ATT CTG GAA CGT CTG CGT TAC CCG AAC GTT ATC 835Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr Pro Asn Val Ile70 75 80CGT GAA GAG ATT GAA CGT CTG CTG GAG AAC ATT ACT GTT CTG GCA GAA 883Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr Val Leu Ala Glu85 90 95 100GCG GCG GCG CTG GCA ACG TCT CCG GCG CTG ACA GAT GAG CTG GTC AGC 931Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp Glu Leu Val Ser105 110 115CAC GGC GAG CTG ATG TCG ACC CTG CTG TTT GTT GAG ATC CTG CGC GAA 979His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu Ile Leu Arg Glu120 125 130CGC GAT GTT CAG GCA CAG TGG TTT GAT GTA CGT AAA GTG ATG CGT ACC 1027Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys Val Met Arg Thr135 140 145AAC GAC CGA TTT GGT CGT GCA GAG CCA GAT ATA GCC GCG CTG GCG GAA 1075Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala Ala Leu Ala Glu150 155 160CTG GCC GCG CTG CAG CTG CTC CCA CGT CTC AAT GAA GGC TTA GTG ATC 1123Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu Gly Leu Val Ile165 170 175 180ACC CAG GGA TTT ATC GGT AGC GAA AAT AAA GGT CGT ACA ACG ACG CTT 1171Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg Thr Thr Thr Leu185 190 195GGC CGT GGA GGC AGC GAT TAT ACG GCA GCC TTG CTG GCG GAG GCT TTA 1219Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala Leu200 205 210CAC GCA TCT CGT GTT GAT ATC TGG ACC GAC GTC CCG GGC ATC TAC ACC 1267His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro Gly Ile Tyr Thr215 220 225ACC GAT CCA CGC GTA GTT TCC GCA GCA AAA CGC ATT GAT GAA ATC GCG 1315Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile Asp Glu Ile Ala230 235 240TTT GCC GAA GCG GCA GAG ATG GCA ACT TTT GGT GCA AAA GTA CTG CAT 1363Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala Lys Val Leu His245 250 255 260CCG GCA ACG TTG CTA CCC GCA GTA CGC AGC GAT ATC CCG GTC TTT GTC 1411Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile Pro Val Phe Val265 270 275GGC TCC AGC AAA GAC CCA CGC GCA GGT GGT ACG CTG GTG TGC AAT AAA 1459Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu Val Cys Asn Lys280 285 290ACT GAA AAT CCG CCG CTG TTC CGC GCT CTG GCG CTT CGT CGC AAT CAG 1507Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu Arg Arg Asn Gln295 300 305ACT CTG CTC ACT TTG CAC AGC CTG AAT ATG CTG CAT TCT CGC GGT TTC 1555Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His Ser Arg Gly Phe310 315 320CTC GCG GAA GTT TTC GGC ATC CTC GCG CGG CAT AAT ATT TCG GTA GAC 1603Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn Ile Ser Val Asp325 330 335 340TTA ATC ACC ACG TCA GAA GTG AGC GTG GCA TTA ACC CTT GAT ACC ACC 1651Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr Leu Asp Thr Thr345 350 355GGT TCA ACC TCC ACT GGC GAT ACG TTG CTG ACG CAA TCT CTG CTG ATG 1699Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln Ser Leu Leu Met360 365 370GAG CTT TCC GCA CTG TGT CGG GTG GAG GTG GAA GAA GGT CTG GCG CTG 1747Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu Gly Leu Ala Leu375 380 385GTC GCG TTG ATT GGC AAT GAC CTG TCA AAA GCC TGC GGC GTT GGC AAA 1795Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys Gly Val Gly Lys390 395 400GAG GTA TTC GGC GTA CTG GAA CCG TTC AAC ATT CGC ATG ATT TGT TAT 1843Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg Met Ile Cys Tyr405 410 415 420GGC GCA TCC AGC CAT AAC CTG TGC TTC CTG GTG CCC GGC GAA GAT GCC 1891Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro Gly Glu Asp Ala425 430 435GAG CAG GTG GTG CAA AAA CTG CAT AGT AAT TTG TTT GAG TAAATACTGT 1940Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe Glu440 445ATGGCCTGGA AGCTATATTT CGGGCCGTAT TGATTTTCTT GTCACTATGC TCATCAATAA2000ACGAGCCTGT ACTCTGTTAA CCAGCGTCTT TATCGGAGAA TAATTGCCTT TAATTTTTTT2060ATCTGCATCT CTAATTAATT ATCGAAAGAG ATAAATAGTT AAGAGAAGGC AAAATGAATA2120TTATCAGTTC TGCTCGCAAA GGAATTC2147(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度449(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Ser Glu Ile Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp1 5 10 15Phe Asp Ala Met Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn20 25 30Val Arg Leu Val Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu35 40 45Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu50 55 60Asp Ala Ile Arg Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr65 70 75 80Pro Asn Val Ile Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr85 90 95Val Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp100 105 110Glu Leu Val Ser His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu115 120 125Ile Leu Arg Glu Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys130 135 140Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala145 150 155 160Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu165 170 175Gly Leu Val Ile Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg180 185 190Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu195 200 205Ala Glu Ala Leu His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro210 215 220Gly Ile Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile225 230 235 240Asp Glu Ile Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala245 250 255Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile260 265 270Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu275 280 285Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu290 295 300Arg Arg Asn Gln Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His305 310 315 320Ser Arg Gly Phe Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn325 330 335Ile Ser Val Asp Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr340 345 350Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln355 360 365Ser Leu Leu Met Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu370 375 380Gly Leu Ala Leu Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys385 390 395 400Gly Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg405 410 415Met Ile Cys Tyr Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro420 425 430Gly Glu Asp Ala Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe435 440 445Glu(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它..合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO9CATCTAAGTA TGCATCTCGG 20(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它..合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO10TGCCCCTCGA GCTAAATTAG 20(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它..合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO11TTTATTCATA ATTGCCACCG 20(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它..合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO12CACGGTAATA CATATAACCG 20(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它..合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO13CCTGCAATTG TCAAACGTCC20(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它..合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO14GTCGACGCGC TTGAGATCTT 20
權(quán)利要求
1.一種屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌，該菌通過向其中導(dǎo)入了編碼帶有突變的二氫吡啶二羧酸合酶的DNA而被轉(zhuǎn)化，突變使L-賴氨酸的反饋抑制脫敏。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，其中的二氫吡啶二羧酸合酶來源于沙雷氏菌屬的細(xì)菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌，其特征在于使對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的突變選自如下即用纈氨酸殘基代替81位的丙氨酸殘基，用酪氨酸殘基代替118位的組氨酸殘基，以及用纈氨酸殘基代替81位的丙氨酸殘基并用酪氨酸殘基代替118位的組氨酸殘基的突變，氨基酸的計數(shù)是從序列表中SEQ ID NO4中所定義的二氫吡啶二羧酸合酶的氨基酸序列的N-末端開始的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌，還帶有天冬氨酸激酶，該酶對L-賴氨酸的反饋抑制被脫敏。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌，帶有對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的天冬氨酸激酶，該菌是通過向細(xì)菌菌體中導(dǎo)入編碼含有對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的突變的天冬氨酸激酶的DNA而獲得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌，其中的天冬氨酸激酶是來源于埃希氏菌屬細(xì)菌的天冬氨酸激酶III。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌，其中的使天冬氨酸激酶III對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的突變選如下用天冬氨酸殘基替代323位甘氨酸殘基，用天冬氨酸殘基替代323位甘氨酸殘基并用天冬氨酸殘基替代408位的甘氨酸殘基，用半胱氨酸殘基替代34位的精氨酸殘基并用天冬氨酸殘基替代323位的甘氨酸殘基，用苯丙氨酸殘基替代325位的亮氨酸殘基，用異亮氨酸殘基替代318位甲硫氨酸殘基，用異亮氨酸殘基替代318位甲硫氨酸殘基并用甲硫氨酸殘基替換349位纈氨酸殘基，用亮氨酸殘基替換345位絲氨酸殘基，用甲硫氨酸殘基替代347位纈氨酸殘基，用異亮氨酸殘基替換352位蘇氨酸殘基，用異亮氨酸殘基替換352位蘇氨酸殘基并用苯丙氨酸殘基替代369位絲氨酸殘基，用賴氨酸殘基替換164位谷氨酸殘基，以及用異亮氨酸殘基替換417位甲硫氨酸殘基并用酪氨酸殘基替換419位半胱氨酸殘基的突變，氨基酸計數(shù)是從序列表內(nèi)的SEQ ID NO8中所定義的天冬氨酸激酶III的氨基酸序列的N-末端開始的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌，該菌是賴氨酸脫羧酶缺陷型菌。
9.一種生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，其特征在于包括以下步驟在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1到8中任一項中所定義的屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌，在其培養(yǎng)物中產(chǎn)生并積累L-賴氨酸并且從培養(yǎng)物中收集L-賴氨酸。
全文摘要
一種用于制備L－賴氨酸的方法,其中包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌,該菌通過導(dǎo)入以下的DNA于細(xì)胞中而被轉(zhuǎn)化,其一為編碼來自屬于埃希氏菌屬或沙雷氏菌屬的細(xì)菌并具有消除L－賴氨酸反饋抑制突變的二氫吡啶二羧酸合酶的DNA且另一種為編碼來自屬于埃希氏菌屬或沙雷氏菌屬的細(xì)菌并具有消除L－賴氨酸反饋抑制突變的天冬氨酸激酶的DNA,并且收獲這樣積累于培養(yǎng)物中的L－賴氨酸。
文檔編號C12N9/12GK1203629SQ96196197
公開日1998年12月30日 申請日期1996年3月14日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月13日
發(fā)明者児島宏之, 尾川由理, 川村和枝, 佐野孝之輔 申請人:味之素株式會社