專利名稱：水解聚酰胺的具有酰胺酶活性的酶和微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及酰胺特別是仲酰胺的酶水解。
更準確地講，本發(fā)明涉及能用于酰胺基團地酶水解的酶和/或微生物，優(yōu)選對含有至少一個酰胺基團的底物，如聚酰胺(PA)。本發(fā)明還涉及用于其生產(chǎn)的遺傳材料和含有這種遺傳材料并顯示這種酰胺酶活性的微生物。
在此領(lǐng)域中，Smith R.等在載于“生物醫(yī)學(xué)材料研究(Journal ofBiomedical Material Research)(1987)，vol.21，p.991-1003”的文章中披露將14C標(biāo)記的聚酰胺66樣品與木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶類的酶接觸。這些已知的多肽輕微地降解聚酰胺66，但水解不夠強，不能用于工業(yè)規(guī)模。
從Kinoshita等[歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem)116，547-551，1981]還已知，產(chǎn)黃菌屬菌株KI72能夠產(chǎn)生一種催化6-氨基己酸環(huán)狀二聚體水解成為線性二聚體的酶(E1)和能夠?qū)⒃摼€性二聚體轉(zhuǎn)變成2分子6-氨基己酸或氨基己酸的第二種酶(E2)。所述酶途徑總結(jié)如下。
(6-氨基己酸的 (6-氨基己酸的 (6-氨基己酸)環(huán)狀二聚體) 線性二聚體)
線性酰胺酶E2的活性對二聚體最佳，隨著聚合度增加而降低，對聚合度(DPn)為7以上的低聚物活性不明顯。
在發(fā)表在“細菌學(xué)雜志(Journal of Bacteriology)，1989年6月，p.3187-3191，vol.171 no.6”中的文章中，Tsuchiya等指出來自產(chǎn)黃菌屬菌株KI72的酶E1和來自假單胞菌屬菌株NK87的一種酶之間存在高度同源性。據(jù)稱酶E1和其類似物和酶E2(特別是后者)對下式的低聚物或聚酰胺(PA6)有活性
其中2≤n≤20。
這些來自產(chǎn)黃菌屬或假單胞菌屬的酶的缺點是它們對低聚物的比活性較低，對三聚體底物的比活性最高僅為1.05μmol氨基己酸/分鐘/mg蛋白。而且，這些酶對均聚低聚體特異，發(fā)現(xiàn)其對共聚低聚物的活性很差。
另外，產(chǎn)黃菌菌株KI72是發(fā)現(xiàn)另一稱為myl-c的基因的核心，該基因編碼對PA6型底物有活性的聚酰胺酶E3。
下面是特別在myl-c控制下產(chǎn)生E3的文獻之一“Negoro等(1992)-細菌學(xué)雜志，vol174，p.7948-7953”。
E3對低聚物尼龍PA66的特異性似低于對尼龍PA6的。以下比值為2左右
酶活性以單位量所用水解酶在單位時間內(nèi)所水解的底物量表示。所述底物的實例有PA66和PA6的四聚體和三聚體。
顯然，現(xiàn)有技術(shù)中并沒有高效可行可用于特別包括仲酰胺的各種類型的酰胺(特別是共聚低聚物)的酶水解酰胺基團的方法。
因此本發(fā)明的主要目的是提出具有酰胺酶活性的新酶、產(chǎn)生它們的遺傳物質(zhì)和含有這種遺傳物質(zhì)的微生物，所述酶和微生物同時具有如下特征對共聚低聚物和均聚低聚物型底物的酰胺有滿意的水解收率，對共聚低聚物(如PA66)有顯著的特異性。這種活性能提供通向產(chǎn)生尤其PA66(回收)單體的有工業(yè)價值的方法的途徑。
因此，在長期艱苦研究后，本申請人成功地分離和鑒定了一種酰胺酶型新酶，它由一種或多種多肽形成，尤其可從分離自小生境的新微生物和/或獲自這些天然微生物的新重組微生物中衍生得到。
可使用酶本身或產(chǎn)生它們的重組微生物形式。
因而本發(fā)明涉及特別對具有至少一種下述結(jié)構(gòu)式的(聚)酰胺型底物有酰胺酶活性的酶
其中·A和B為單體單位，·R1和R3為相同或不同(優(yōu)選不同)的二價基團，代表取代或未取代、直鏈或支鏈的(環(huán))亞烷基、亞芳基或亞芳烷基，其中芳香基團任選為縮聚物，亞烷基的碳原子數(shù)大于或等于4，優(yōu)選在4和12之間，·R2為選自氫和/或最好具有1-6個碳原子的烷基的相同或不同(優(yōu)選相同)的基團，·X為
*X1＝OH、OM或OR4，其中M選自金屬，優(yōu)選堿金屬和堿土金屬，R4為含1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，
*或X2＝
其中R2和R3如上所定義，R5和R6相同或不同，與上述R2的定義相同，·Y為
*Y1＝氫，
*或Y2＝
其中R1如上所定義，Z為氫，定義同M的M1或R4，
條件是-a- 如果X＝X1，則Y＝Y(jié)1，-b- 如果X＝X2，則Y＝Y(jié)2或Y1，最后，p為1.5-10，優(yōu)選1.5-5；或
其中·R2和R3如上所定義，·U和V分別與式(I)下X1和Y1的定義相同，·q＝1-20。
本發(fā)明酶的一個特別有利的特征是其對式(I)共聚低聚物的比活性(Us)遠大于對式(II)均聚低聚物的。
因而本發(fā)明酶(也稱為PAMI)的特征在于
→大于2；
→優(yōu)選大于或等于10；
→特別優(yōu)選大于或等于50。
在比率Ra中，酶活性用被水解底物的摩爾數(shù)×h-1×g-1所用酶或產(chǎn)生該酶的干細胞表示。
以下給出測定這些活性的條件，
-反應(yīng)介質(zhì)＝100mM磷酸鹽緩沖液，
-體積＝400μl，
-溫度＝30℃，
-pH＝7，
-干細胞濃度＝2.5g/l。
本發(fā)明的酶還用其一級結(jié)構(gòu)表征，如所附氨基酸序列SEQ ID NO2所示。
本發(fā)明還包括與該SEQ ID NO2序列有至少50％同源程度的任何多肽。
本發(fā)明酶的一級或甚至四級結(jié)構(gòu)成了其諸多新特征之一。
除這一結(jié)構(gòu)鑒定外，還可能通過其對一些特異底物的活性研究本發(fā)明的酶。
如上所述，特異性底物是聚酰胺，更準確地講是重復(fù)單元為上述式(I)和/或(II)的低聚物。重復(fù)單元(I)最好由兩個單體單元A和B形成，它們分別為二羰基和二胺單元，由仲胺基團連接在一起。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中·單體A為以下殘基
其中r＝4-12，優(yōu)選等于4，單體B為以下殘基
其中s＝4-12，優(yōu)選等于6。
因此，底物(I)的一個二聚體優(yōu)選實例如下組成。
相應(yīng)的聚酰胺為PA6.6。另一方面，重復(fù)單元(II)優(yōu)選由稱為
--
的單體單元形成，其中c為氨基酸型骨架，其末端a和b分別為羧基和氨基。
--
的一個典型實例是ε-氨基己酸的衍生物，即聚酰胺6(PA6)的單體。
下面提到的是適于本發(fā)明的聚酰胺型低聚物，-通過6-12個碳原子的飽和脂肪二羧酸與6-12個碳原子的脂肪伯二胺縮聚而獲得的聚酰胺低聚物，-通過含4-12個碳原子烴鏈的ω-氨基烷酸直接均聚縮合或通過從這些酸形成的內(nèi)酰胺的水解開環(huán)和聚合而獲得的聚氨基酸低聚物，-從上述聚酰胺的單體獲得的共聚酰胺低聚物，這些共聚酰胺的酸部分還可能部分由芳香酸如對苯二酸和/或間苯二酸組成，-這些聚酰胺低聚物的混合物。
以下提到的是通過二元酸和二胺縮聚而成的聚酰胺的說明性實例-聚酰胺4，6(四亞甲二胺和己二酸的聚合物)，-聚酰胺6，6(六亞甲二胺和己二酸的聚合物)(PA6.6)，-聚酰胺6，9(六亞甲二胺和壬二酸的聚合物)，-聚酰胺6，10(六亞甲二胺和癸二酸的聚合物)，-聚酰胺6，12(六亞甲二胺和十二雙酸的聚合物)。
以下提及的是適用的聚氨基酸的示例-聚酰胺4(4-氨基丁酸或γ-丁內(nèi)酰胺的聚合物)，-聚酰胺5(5-氨基戊酸或δ-戊內(nèi)酰胺的聚合物)，-聚酰胺6(ε-己內(nèi)酰胺的聚合物)，-聚酰胺7(7-氨基庚酸的聚合物)，-聚酰胺8(辛內(nèi)酰胺的聚合物)，-聚酰胺9(9-氨基壬酸的聚合物)，-聚酰胺10(10-氨基癸酸的聚合物)，-聚酰胺11(11-氨基十一酸的聚合物)，-聚酰胺12(12-氨基十二酸或十二內(nèi)酰胺的聚合物)。
下面舉出共聚聚酰胺的說明性實例-聚氨基酸6，6/6，10(六亞甲二胺、己二酸和癸二酸的共聚物)，-聚酰胺6，6/6(六亞甲二胺、己二酸和己內(nèi)酰胺的共聚物)。
無任何限制意義下，本發(fā)明的優(yōu)選底物是通過二元酸A和二胺B縮聚而獲得的聚酰胺低聚物，特別是PA6.6的低聚物。本發(fā)明底物(I)和(II)中單體A和B或
--
的數(shù)目在3-8之間為好，優(yōu)選在2-6之間。應(yīng)該指出，低聚物或聚合物分子中的這種單體殘基數(shù)目在本申請以下內(nèi)容中也稱為DPn。
特征性底物(I)例如為水溶性低聚物有利，如BAB和ABAB，但排除三聚體ABA。
這些特別底物屬于可被本發(fā)明的酶和/或其生物學(xué)前體非常高效水解的底物(I)和(II)。
當(dāng)酶底物是含有單體A和B的低聚物時，最終水解產(chǎn)物可以是二聚體AB和單體B。當(dāng)?shù)孜锸堑途畚?II)(單體
--
時)，最終水解產(chǎn)物可以是單體
--
。
本發(fā)明的酶還可以通過其對一些上述底物(I)和(II)的活性和/或親和性來表征。
因此，根據(jù)第一個有利特征，所述酰胺酶首先對ABAB型四聚體形成的底物有活性，其次能夠以大于60，優(yōu)選大于或等于100，特別優(yōu)選大于或等于1000的比活性(Us)將該底物轉(zhuǎn)變成兩個二聚體AB，比活性以在給定條件下測定的所產(chǎn)AB的μmol×h-1×mg-1蛋白表示。
該酰胺酶的第二有利特征是它對三聚體BAB形成的底物(I)有活性，能夠以大于100，優(yōu)選大于或等于500的比活性(Us)將該三聚體轉(zhuǎn)變?yōu)槎垠wAB和單體B，比活性以在給定條件下測定的所產(chǎn)AB的μmol×h-1×mg-1酶表示。
該酰胺酶的第三個有利特征是它對DPn為3-20(優(yōu)選3-10)的低聚物所形成的底物(I)有活性，能夠?qū)⑦@些低聚物轉(zhuǎn)變成單體B、二聚體AB和三聚體ABA。
純酰胺酶的酶活性在下列條件下測定
-磷酸鹽緩沖液，
-溫度＝30℃，
-底物濃度＝1.4g/l，
-pH＝7.5。
如上文已提到的那樣，本發(fā)明的酶用于酰胺的酶水解時，可僅用酶本身或僅用產(chǎn)生所述酶的生物學(xué)前體(野生型或重組的微生物)或兩者的混合物。
至于其來源，本發(fā)明的酶特別從棒狀桿菌屬的天然微生物中分離得到。
從這一起點，本申請人還鑒定了控制本發(fā)明酰胺酶合成的基因，正因為這一技術(shù)進步才使得能夠使用重組微生物。
因此，本發(fā)明的又一目的是編碼特別對如上所定義底物(I)和(II)有酰胺酶活性的酶的DNA序列，其特征在于它選自下列序列
-相應(yīng)于所附序列SEQ ID NO1并編碼具酰胺酶活性的酶的DNA序列，
-由于遺傳密碼的簡并性造成的該序列的類似物，和
-·與這些序列之一或與其片段雜交，
·與這些序列之一或與其片段具有50％以上的一致性，
·并編碼具酰胺酶活性的酶
的DNA序列。
如上定義的DNA序列(高度)表達產(chǎn)生的酶自然包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
通過選擇含有誘導(dǎo)(高度)表達的一個或多個啟動子和一個或多個核糖體結(jié)合位點的適當(dāng)表達盒在重組微生物(如含一個或多個質(zhì)粒的那些)中獲得(高度)表達。
關(guān)于重組，本發(fā)明優(yōu)選的重組微生物之一是含有質(zhì)粒pXL2564的大腸桿菌菌株，該菌株是以編號I1495于1994年11月29日保藏并注冊在Collection Nationale de Cultures de Microorganismes的菌株的衍生物。
該大腸桿菌菌株含有質(zhì)粒pXL2564，所述質(zhì)粒帶有SEQ ID NO1和一表達盒，后者例如可為附圖2中所示的Ptrp-RBSCII。
廣義上將，本發(fā)明涉及能夠產(chǎn)生本發(fā)明的酰胺酶并有利地含有上述序列中的遺傳信息或本發(fā)明主題序列的所有新的重組或非重組的微生物。
這些微生物所產(chǎn)生的酰胺酶整個在本發(fā)明范圍內(nèi)，這是不言自明的。
這些微生物的具體特征是水解含至少一個酰胺基團之聚酰胺化合物的酰胺基團的能力，更精確地說是對以上定義的底物(I)和(II)(更特別是相對底物(II)對底物(I))的特異選擇性和水解活性。
在底物(I)的情形下，這些低聚物例如為如上所述的水溶性低聚物特別是ABAB和/或BAB。
有利的是，本發(fā)明的微生物能夠水解由聚酰胺低聚物形成的至少一種底物，特別是由四聚體ABAB和/或三聚體BAB(將被轉(zhuǎn)變?yōu)閱误wB和二聚體AB)形成的底物，該微生物能以如下活性進行水解
-以在給定條件下測定的被水解底物g/h/g干細胞表示，和
-大于或等于50，優(yōu)選80，特別優(yōu)選100。
在溫度30℃，pH7和磷酸鹽緩沖液(100mM)中，磁力攪拌下在400μl反應(yīng)介質(zhì)體積中以2.5g/l的底物濃度測定該活性。
為了優(yōu)化這些微生物的性能特征，它們最好配有
-幫助它們所合成的多肽(特別是如上定義的酶)折疊的至少一種蛋白試劑，
-和/或編碼這種試劑的基因。
該試劑的存在量高于所述微生物中的基礎(chǔ)水平。
該試劑優(yōu)選為大腸桿菌的GroE陪伴分子或其真核或原核來源的同類物。
本發(fā)明還涉及水解由如上所定義的底物(I)和/或(II)至少部分形成的底物的方法，其特征在于包括使用如上所定義的至少一種酶和/或至少一種微生物。
根據(jù)本發(fā)明，具有幾種(水解)譜互補的酶可能是有利的。因此，上述方法的變異方案之一是使用至少一種其他類型的酶和/或一種其野生和/或重組和/或類似生物學(xué)前體。在此變異方案中，底物至少部分由DPn小于40(優(yōu)選20，特別優(yōu)選12)的低聚物組成，該低聚物衍生自至少由二元酸單體(A)和二胺單體(B)縮聚而成的聚酰胺。
該變異方案的水解方法的特征是
-產(chǎn)生聚合度(DPn)小于或等于8(優(yōu)選4)的低聚物，特別優(yōu)選產(chǎn)生單體A和B，
-并使用
·如上所定義的至少一種酶和/或至少一種微生物，
·至少一種其他類型的酶和/或至少一種其野生型和/或重組的生物學(xué)前體，所述酶優(yōu)選為產(chǎn)黃菌株KI72的nylB基因控制下產(chǎn)生的E2酶。
nyl-B產(chǎn)生的互補酶E2在Kinoshita等(歐洲生物化學(xué)雜志，116，547-551，1991)或在Tsuchiya等(細菌學(xué)雜志，1989-6，p.3187-3191，vol.171 no.6)中有述。
無E2酶時，該方法將優(yōu)選導(dǎo)致產(chǎn)生DPn≤4的低聚物，特別是二聚體AB。
可被上述酶水解的低聚物可通過酰胺型基團的熱裂解和/或化學(xué)(酸)裂解獲得，特別是高DPn的聚合物或低聚物的裂解。
本發(fā)明方法的其他有利的實施方案中使用酶(或多種酶)的特別是生物學(xué)的前體和含有下述物質(zhì)的培養(yǎng)基，例如-優(yōu)選含有含至少一個酰胺基團的至少一種化合物的碳源，所述碳源必要時含有最好選自糖的補充物(特別優(yōu)選蔗糖)，-和必要時的能夠誘導(dǎo)酶的產(chǎn)生而不被生物學(xué)前體所消耗的化合物，所述化合物優(yōu)選選自酰胺。
本發(fā)明的酰胺酶水解方法具有廣泛的應(yīng)用，例如從酰胺化合物制備化合物的有機合成中或處理含聚酰胺材料的處理中。
特別是在產(chǎn)生聚酰胺聚合物起始材料的領(lǐng)域中有價值。
以下實施例用于說明本發(fā)明的特征、變異方案和優(yōu)點，但不限制其范圍。
附圖描述
-序列表，按WIPO標(biāo)準ST23而建，包括以下序列
+SEQ ID NO1編碼本發(fā)明酰胺酶的DNA；
+SEQ ID NO2構(gòu)成本發(fā)明酰胺酶的多肽。
-

圖1表示含有本發(fā)明酰胺酶的編碼基因并容納在1994年11月29日以I1495號保藏在CNCM的菌株中的質(zhì)粒pXL2297的限制性酶切圖譜。
-圖2表示含有編碼本發(fā)明酰胺酶的pamI基因、提供氨芐青霉素抗性的基因和控制酰胺酶基因的Ptrp-RBScII表達盒。
本說明書其余部分所用縮寫的意義如下-SSC常用的雜交緩沖液，含有檸檬酸鈉和NaCl
(20×SSC＝NaCl 3M-檸檬酸鈉pH7，0.3M)，-SDS十二烷基硫酸鈉，-SDS-PAGE基于十二烷基硫酸鈉和聚丙烯酰胺的電泳凝膠，-IPTG異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，-HPLC高效液相色譜。
實施例
原始菌株的分離、本發(fā)明聚酰胺水解酶的純化和肽測序(PAMISEQID NO2)、編碼PAM I的pamI基因的克隆均按現(xiàn)行常規(guī)技術(shù)進行。實施例I重組PAM I在大腸桿菌中的表達
構(gòu)建一構(gòu)建體，其中位于λ噬菌體CII基因的核糖體結(jié)合位點之后的pamI基因從大腸桿菌色氨酸操縱子啟動子表達。為此，以含有1994年11月29日以I1495號保藏在CNCM中的菌株中的質(zhì)粒pXL2297(圖1)為模板用PCR技術(shù)在pamI起始密碼子處造一NdeI限制位點。PCR擴增含pamI基因5’末端的208bp Nde I-Apa I片段，通過核苷酸引物對(5’-AGCAAGCTTGGAGGCCATATGAATACGAC-3’)和(5’-CACCGGTGGGCCCCTC-3’)小心地在Nde I位點上游引入Hind III位點。將擴增的Hind III-Apa I片段克隆到用Hind III和Apa I消化的pUC29(Benes等(1993)，基因(Gene)130151-152)中，通過在Apa I位點引入pXL2297的867bp Apa I片段重建pamI基因。這樣，一個Nco I位點位于pam I終止密碼子下游約30個核苷酸處。將該質(zhì)粒臨近的500bp Nde I-EcoR I和600bp EcoR I-NcoI片段插入在Nde I位點(位于胰蛋白酶啟動子緊下游)消化的pXL2158(專利FR 92-09882)中。
這樣，質(zhì)粒pXL2564(圖2所示)是含有氨芐青霉素抗性基因和Ptrp-RBScII表達盒控制下的pamI基因的pBR322(Sucliffe(1987)，核酸研究(Nucleic Acid Res.)52721)的衍生物。
將質(zhì)粒pXL2564引入大腸桿菌株TG1中，并在氨芐青霉素LB上選擇微生物。將含pXL2564的克隆(稱為PAMI株)兩次轉(zhuǎn)移在瓊脂平皿上，在含100μg/ml氨芐青霉素的M9葡萄糖培養(yǎng)基中按專利FR2694571中所述方法于37℃培養(yǎng)。
將質(zhì)粒pXL2035(專利FR 2694571)引入TG1株(pXL2564)中，檢查GroE陪伴分子共同表達獲得可溶形式聚酰胺酶I的效率，所產(chǎn)生的菌株在相同條件下在50mg/l卡那霉素存在下培養(yǎng)。
結(jié)果顯示，使用該新重組菌株，基本以可溶性和裂解形式產(chǎn)生聚酰胺酶I。實施例II表達E3的重組菌株和如實施例I中所得表達PAM I的重組菌株的酰胺酶活性的比較
II.1 菌株的培養(yǎng)
如實施例I所示培養(yǎng)表達PAMI的菌株。
通過將如文獻“Negoro等(1992)-細菌學(xué)雜志，vol.174，p.7948-7953”所述的質(zhì)粒pUCL3引入大腸桿菌菌株TG1獲得表達E3的菌株。該菌株在補有100mg/l氨芐青霉素的M9培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)，用1％(v/v)預(yù)培養(yǎng)物接種。培養(yǎng)4.5小時后，加入誘導(dǎo)物(IPTG 1mM)。預(yù)培養(yǎng)物由10ml補有100ml/l氨芐青霉素的M9培養(yǎng)基組成，并用來自瓊脂平皿的菌落接種。培養(yǎng)結(jié)束后，105℃過夜干燥離心(12000g，10分鐘)所獲細胞，按所得干提取物確定細胞產(chǎn)量。M9培養(yǎng)基組成如下
葡萄糖 4g/l
KH2PO4 3g/l
Na2HPO4 7g/l
MgSO41mM
NH4Cl1g/l
NaCl 0.5g/l
CaCl21mM
酪蛋白氨基酸 4g/l
鹽酸硫胺素10mg/l
II.2菌株的活性
將如上所得到的細胞殘留物懸浮在含1％(v/v)甲苯的0.1M Tris-HCl、5mMEDTA緩沖液(pH8.0)中，0℃保溫1小時。離心后，經(jīng)處理的殘余物重懸在0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7)中。
對DPn2-6的PA6低聚物和DPn2-4的PA66低聚物測定表達E3和PAMI的菌株細胞懸液的酰胺酶活性。DPn2-6的PA6低聚物分別稱為CAP2-CAP6。結(jié)果列于下表I中。該活性以被水解底物mmol/小時/g干細胞表示。表I操作條件[表達E3的菌株]＝2.5g/l干提取物；[表達PAM I的菌株]＝對尼龍6低聚物為2.5g/l干提取物，對尼龍66低聚物為0.125g/l干提取物；[低聚物]=2.5g/l；0.1M磷酸鹽緩沖液，pH＝7；體積400μl；T＝30℃；磁力攪拌。
對于表達E3的菌株，測定了水解尼龍6和66低聚物3小時的動力學(xué)。
對表達PAMI的菌株，測定了水解尼龍6低聚物1小時和水解尼龍66低聚物15分鐘的動力學(xué)。
表達E3的菌株對尼龍6和66低聚物的水解活性在同一數(shù)量級上0.263mmol水解ABAB/h/g干細胞和0.140mmol水解CAP4/h/g干細胞(兩個活性差2倍)。
PAMI對尼龍66低聚物比對尼龍6低聚物更特異117mmol水解ABAB/h/g干細胞和1.79mmol水解CAP4/h/g干細胞(兩個活性差65倍)。
這一特征說明了本發(fā)明的酶與nylc控制下產(chǎn)生的已知酶相比具有新穎性。實施例III本發(fā)明的PAMI酶和nyl-B基因表達的酰胺酶E2的混合物對PA66低聚物的酶水解
本實施例中不用酶本身而用其生物學(xué)前體，即
*實施例I的表達PAMI的重組菌株，
*和含有產(chǎn)黃菌株KI72的nyl-B基因并表達E2的重組菌株。
III.1 菌株培養(yǎng)
如實施例I中所示培養(yǎng)表達PAMI的菌株。
引入如文獻“Negoro等-生物化學(xué)雜志(1984)25913648-13651”中所述的質(zhì)粒pHK4，按獲取E3表達菌株的方法獲得E2的表達菌株。該菌株在補有100mg/l氨芐青霉素的M9培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)，用1％(v/v)預(yù)培養(yǎng)物接種。預(yù)培養(yǎng)物由10ml補有100ml/l氨芐青霉素的相同M9培養(yǎng)基組成，用來自瓊脂平皿的菌落接種。培養(yǎng)結(jié)束后，105℃過夜干燥離心(12000g，10分鐘)所獲細胞，按所得干提取物確定細胞產(chǎn)量。
III.2 菌株活性
將如上所得到的細胞殘余物懸浮在含1％(v/v)甲苯的0.1M Tris-HCl、0.5mM EDTA緩沖 液(pH8.0)中，0℃保溫1小時。離心后，經(jīng)處理的殘余物重懸在0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7)中。
對低聚物ABAB、BAB、ABA和AB測試了表達E2和PAMI的菌株的細胞懸液的酰胺酶活性。
結(jié)果列于下表II中。
活性用被水解底物mmol/小時/g干細胞表示。操作條件[PAM I表達菌株]＝0.125g/l干提取物；[低聚物]＝2.5g/l；0.1M磷酸鹽緩沖液，pH＝7；體積400μl；T＝30℃；磁力攪拌。表II
序列表(1)一般信息
(i)申請人RHONE POULENC FIBRES ET POLYMERES SA
25 Quai Paul Doumer
COURBEVOIE，法國
(ii)發(fā)明名稱具酰胺酶活性的酶、獲得它們的遺傳工具和宿主微生物和利用所述酶的水解方法
(iii)序列數(shù)目2
(iv)聯(lián)系地址
(A)收信人
(B)街道
(C)城市
(D)州
(E)國家
(F)郵編
(v)計算機可讀形式
(A)媒介類型軟盤
(B)計算機IBM PC兼容
(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS
(D)軟件Patent In Release #1.0，Version #1.25
(vi)本申請資料
(A)申請?zhí)?br> (B)申請日
(C)分類
(vii)優(yōu)先申請資料
(A)申請?zhí)朏R 95 08916
(B)申請日1995年7月18日
(viii)律師/代理人信息
(A)姓名
(ix)電訊資料
(A)電話
(B)傳真(2)SEQ ID NO1的信息
(i)序列特征
(A)長度1068bp
(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型DNA(基因組的)
(iii)假擬非
(iv)反義非
(ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS
(B)位置1..1065
(xi)序列描述SEQ ID NO1ATG AAT ACG ACA CCG GTC CAC GCA CTC ACC GAC ATC GAC GGC GGG ATC 48Met Asn Thr Thr Pro Val His Ala Leu Thr Asp Ile Asp Gly Gly Ile 1 5 10 15GCC GTC GAT CCC GCA CCC CGG CTG GCC GGC CCT CCG GTC TTC GGG GGT 96Ala Val Asp Pro Ala Pro Arg Leu Ala Gly Pro Pro Val Phe Gly Gly
20 25 30 CCG GGC AAC GAC GCC TTC GAT CTC GCG CCG GTC AGG AGC ACG GGC CGC 144Pro Gly Asn Asp Ala Phe Asp Leu Ala Pro Val Arg Ser Thr Gly Arg
35 40 45GAG ATG CTG CGG TTC GAC TTC CCC GGG GTC AGC ATC GGC GCG GCG CAC 192Glu Met Leu Arg Phe Asp Phe Pro Gly Val Ser Ile Gly Ala Ala His
50 55 60TAC GAG GAG GGG CCC ACC GGT GCG ACC GTG ATC CAC ATC CCC GCC GGC 240Tyr Glu Glu Gly Pro Thr Gly Ala Thr Val Ile His Ile Pro Ala Gly 65 70 75 80GCC CGC ACC GCG GTG GAC GCG CGG GGC GGG GCG CTC GGG CTC TCC GGC 288Ala Arg Thr Ala Val Asp Ala Arg Gly Gly Ala Val Gly Leu Ser Gly
85 90 95GGC TAC GAC TTC AAC CAC GCC ATC TGC CTG GCC GGC GGA GCC TGC TAC 336Gly Tyr Asp Phe Asn His Ala Ile Cys Leu Ala Gly Gly Ala Cys Tyr
100 105 110GGG CTC GAG GCG GGC GCC GGG GTG AGC GAC GCG CTC CTG GAA CGC CTC 384Gly Leu Glu Ala Gly Ala Gly Val Ser Asp Ala Leu Leu Glu Arg Leu
115 120 125GAG CAT CGC ACC GGC TTC GCC GAG CTC CAG CTG GTG TCG TCG GCG GTC 432Glu His Arg Thr Gly Phe Ala Glu Leu Gln Leu Val Ser Ser Ala Val
130 135 140 ATC TAC GAC TTC TCG GCG CGC TCC ACC GCG GTC TAC CCC GAC AAG GCG 480Ile Tyr Asp Phe Ser Ala Arg Ser Thr Ala Val Tyr Pro Asp Lys Ala145 150 155 160CTC GGC CGC GCG GCG CTC GAA TTC GCC GTT CCC GGT GAG TTC CCG CAG 528Leu Gly Arg Ala Ala Leu Glu Phe Ala Val Pro Gly Glu Phe Pro Gln
165 170 175GGG CGG GCG GGC GCG GGC ATG AGC GCG TCC GCG GGC AAG GTG GAC TGG 576Gly Arg Ala Gly Ala Gly Met Ser Ala Ser Ala Gly Lys Val Asp Trp
180 185 190GAC CGC ACC GAG ATC ACC GGG CAG GGC GCG GCG TIC CGT CGT CTC GGC 624Asp Arg Thr Glu Ile Thr Gly Gln Gly Ala Ala Phe Arg Arg Leu Gly
195 200205GAC GTG CGC ATC CTC GCC GTC GTC GTG CCG AAC CCG GTC GGT GTG ATC 672Asp Val Arg Ile Leu Ala Val Val Val Pro Asn Pro Val Gly Val Ile
210 215 220GTG GAC CGC GCG GGC ACG GTG GTG CGC GGC AAC TAC GAC GCG CAG ACC 720Val Asp Arg Ala Gly Thr Val Val Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Gln Thr225 230 235 240GGG GTC CGG CGC CAC CCG GTG TTC GAC TAC CAG GAG GCG TTC GCC GAG 768Gly Val Arg Arg His Pro Val Phe Asp Tyr Gln Glu Ala Phe Ala Glu
245 250 255CAG GTC CCG CCC GTC ACC GAG GCC GGC AAC ACC ACG ATC AGC GCG ATC 816Gln Val Pro Pro Val Thr Glu Ala Gly Asn Thr Thr Ile Ser Ala Ile
260 265 270GTC ACG AAC GTG CGG ATG AGC CCC GTC GAG CTG AAC CAG TTC GCC AAG 864Vel Thr Asn Val Arg Met Ser Pro Val Glu Leu Asn Gln Phe Ala Lys
275 280 285CAG GTG CAC AGT TCG ATG CAC CGC GGC ATC CAG CCG TTC CAC ACC GAC 912Gln Val His Ser Ser Met His Arg G1y Ile Gln Pro Phe His Thr Asp
290 295 300ATG GAG GGC GAG ACG CTC TIC GCC GTC ACC ACC GAC GAG ATC GAT CTG 960Met Asp Gly Asp Thr Leu Phe Ala Val Thr Thr Asp Glu Ile Asp Leu305 310 315 320CCG ACG ACC CCG GGG TCG TCG CGC GGG CGG CTG TCG GTG AAC GCG ACC 1008Pro Thr Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Arg Leu Ser Val Asn Ala Thr
325 330 335GCG CTC GGC GCG ATC GCC TCC GAG GTG ATG TGG GAC GCC GTC CTC GAG 1056Ala Leu Gly Ala lle Ala Ser Glu Val Met Trp Asp Ala Val Leu Glu
340 345 350GCC GGC AAG TAG 1068Ala Gly Lys
355(2)SEQ ID NO2的信息
(i)序列特征
(A)長度355個氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型蛋白質(zhì)
(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Asn Thr Thr Pro Val His Ala Leu Thr Asp Ile Asp Gly Gly Ile 1 5 l0 15Ala Val Asp Pro Ala Pro Arg Leu Ala Gly Pro Pro Val Phe Gly Gly
20 25 30Pro Gly Asn Asp Ala Phe Asp Leu Ala Pro Val Arg Ser Thr Gly Arg
35 40 45Glu Met Leu Arg Phe Asp Phe Pro Gly Val Ser Ile Gly Ala Ala His
50 55 60Tyr Glu Glu Gly Pro Thr Gly Ala Thr Val Ile His Ile Pro Ala Gly 65 70 75 80Ala Arg Thr Ala Val Asp Ala Arg Gly Gly Ala Vel Gly Leu Ser Gly
85 90 95Gly Tyr Asp Phe Asn His Ala Ile Cys Leu Ala Gly Gly Ala Cys Tyr
100 105 110Gly Leu Glu Ala Gly Ala Gly Val Ser Asp Ala Leu Leu Glu Arg Leu
115 120 125Glu His Arg Thr Gly Phe Ala Glu Leu Gln Leu Val Ser Ser Ala Val
130 135 140Ile Tyr Asp Phe Ser Ala Arg Ser Thr Ala Val Tyr Pro Asp Lys Ala145 150 155 160Leu Gly Arg Ala Ala Leu Glu Phe Ala Val Pro Gly Glu Phe Pro Gln
165 170 175Gly Arg Ala Gly Ala Gly Met Ser Ala Ser Ala Gly Lys Val Asp Trp
180185 190Asp Arg Thr Glu Ile Thr Gly Gln Gly Ala Ala Phe Arg Arg Leu Gly
195 200 205Asp Val Arg Ile Leu Ala Val Val Val Pro Asn Pro Val Gly Val Ile
210 215 220Val Asp Arg Ala Gly Thr Val Val Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Gln Thr225 230 235 240Gly Val Arg Arg His Pro Val Phe Asp Tyr Gln Glu Ala Phe Ala Glu
245 250 255Gln Val Pro Pro Val Thr Glu Ala Gly Asn Thr Thr Ile Ser Ala Ile
260 265 270Val Thr Asn Val Arg Met Ser Pro Val Glu Leu Asn Gln Phe Ala Lys
275 280 285Gln Val His Ser Ser Met His Arg Gly Ile Gln Pro Phe His Thr Asp
290 295 300Met Asp Gly Asp Thr Leu Phe Ala Val Thr Thr Asp Glu Ile Asp Leu305 310 315 320Pro Thr Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Arg Leu Ser Val Asn Ala Thr
325 330 335Ala Leu Gly Ala Ile Ala Ser Glu Val Met Trp Asp Ala Val Leu Glu
340 345 350Ala Gly Lys
35權(quán)利要求
1.特別對具有至少一種下述結(jié)構(gòu)式的(聚)酰胺型底物有酰胺酶活性的酶
其中·A和B為單體單元，·R1和R3為相同或不同(優(yōu)選不同)的二價基團，代表取代或未取代、直鏈或支鏈的(環(huán))亞烷基、亞芳基或亞芳烷基，其中芳香基團任選為縮聚物，亞烷基的碳原子數(shù)大于或等于4，優(yōu)選在4和12之間，·R2為選自氫和/或最好具有1-6個碳原子的烷基的相同或不同(優(yōu)選相同)的基團，·X為
*X1＝OH、OM或OR4，其中M選自金屬，優(yōu)選堿金屬和堿土金屬，R4為含1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，
*或X2＝
其中R2和R3如上所定義，R5和R6相同或不同，與上述R2的定義相同，·Y為
*Y1＝氫，
*或Y2＝
其中R1如上所定義，Z為氫，定義同M的M1或R4，
條件是-a- 如果X＝X1，則Y＝Y(jié)1，-b- 如果X＝X2，則Y＝Y(jié)2或Y1，·最后，p為1.5-10，優(yōu)選1.5-5；或
其中·R2和R3如上所定義，·U和V分別與式(I)下X1和Y1的定義相同，·q＝1-8，所述酶的特征在于比率
大于2，優(yōu)選大于或等于10，特別優(yōu)選大于或等于50。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的酶，其特征在于它由如下物質(zhì)組成→所附序列SEQ ID NO2所示的肽序列，→和/或與該序列有至少50％同源性的多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的酶，其特征在于它-對ABAB型四聚體形成的底物有活性，-能夠以大于60，優(yōu)選大于或等于100，特別優(yōu)選大于或等于1000的比活性(Us)將該底物轉(zhuǎn)變成兩個二聚體AB，比活性以在給定條件下測定的所產(chǎn)AB的μmol×h-1×mg-1蛋白表示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的酶，其特征在于它-對三聚體BAB形成的底物(I)有活性，-能夠以大于100，優(yōu)選大于或等于500的比活性(Us)將該三聚體轉(zhuǎn)變?yōu)槎垠wAB和單體B，比活性以在給定條件下測定的所產(chǎn)AB的μmol×h/mg酶表示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項的酶，其特征在于它-對DPn為3-20的低聚物形成的底物(I)有活性，-能夠?qū)⑦@些低聚物轉(zhuǎn)變成單體B、二聚體AB和三聚體ABA。
6.編碼特別對如權(quán)利要求1所定義底物(I)和(II)有酰胺酶活性的酶的DNA序列，其特征在于它選自下列序列
-相應(yīng)于所附序列SEQ ID NO1并編碼具酰胺酶活性的酶的DNA序列，
-由于遺傳密碼的簡并性造成的該序列的類似物，和
-·與這些序列之一或與其片段雜交，
·與這些序列之一或與其片段具有50％以上的一致性，
·并編碼具酰胺酶活性的酶的DNA序列。
7.從權(quán)利要求6的DNA序列(高度)表達產(chǎn)生的并具有酰胺酶活性的酶。
8.由含質(zhì)粒pXL2564的大腸桿菌菌株組成的微生物，所述菌株已于1994年11月29日以I1495號注冊和保藏在Collecrion Nationale de Cultures deMicroorganiames.
9.能夠產(chǎn)生至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-5和7中任一項的酶的微生物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的微生物，其特征在于它含有權(quán)利要求6的DNA序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10任一項的微生物，其特征在于-它含有
*幫助它所合成的多肽、特別是權(quán)利要求1-5和7中任一項的酶折疊的至少一種蛋白試劑，
*和/或編碼這種試劑的基因；-該試劑的存在量高于所述微生物中的基礎(chǔ)水平。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的微生物，其特征在于該試劑為大腸桿菌的Gro E陪伴分子或其真核或原核來源的同類物。
13.酶，其特征在于它由權(quán)利要求8-11中任一項的微生物產(chǎn)生。
14.水解由如權(quán)利要求1中所定義的底物(I)和/或(II)至少部分形成的底物的方法，其特征在于它包括使用權(quán)利要求1-5、7和13中任一項的至少一種酶和/或權(quán)利要求8-12中任一項的至少一種微生物。
15.水解至少部分由DPn小于40，優(yōu)選20，特別優(yōu)選12的低聚物組成的底物的方法，所述低聚物衍生自至少由二元酸單體(A)和二胺單體(B)縮聚而成的聚酰胺，其特征在于-它產(chǎn)生聚合度(DPn)小于或等于8，優(yōu)選4的低聚物，特別優(yōu)選產(chǎn)生單體A和B，-并使用
·權(quán)利要求1-5，7和12任一項的至少一種酶和/或權(quán)利要求8-11中任一項的至少一種微生物，
·至少一種其他類型的酶和/或至少一種其野生型和/或重組的生物學(xué)前體，所述酶優(yōu)選為產(chǎn)黃菌株KI72的nyl-B基因控制下產(chǎn)生的E2酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的方法，其特征在于它包括熱裂解和/或化學(xué)裂解，以獲得DPn適于用前述權(quán)利要求所定義的酶方法水解的底物。
全文摘要
公開了特別對諸如衍生自PA6.6(式Ⅰ)和/或PA6(式Ⅱ)的低聚物底物有酰胺酶活性的酶,其特征在于如上所示的比率大于2,優(yōu)選至少為10,更優(yōu)選至少為50。特別是,所述酶由文中公開的SEQIDNO∶2相應(yīng)的肽序列組成。還公開了編碼SEQIDNO∶2的多肽并具有SEQIDNO∶1相應(yīng)序列的DNA。另外還公開了產(chǎn)生所述酶的微生物和利用所述酶和/或所述微生物的水解方法。
文檔編號C12N9/78GK1193347SQ96196379
公開日1998年9月16日 申請日期1996年7月17日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月18日
發(fā)明者J·科羅澤特, O·法偉里－布勒, C·喬丹, A－M·李科, D·佩特里 申請人:羅納普朗克纖維和聚合物股份有限公司