專利名稱：：用高酯果膠在酸性環(huán)境中穩(wěn)定蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種方法和用于該方法的酶。具體地說，本發(fā)明涉及用于制備和使用酶修飾的果膠的方法。在今天的工業(yè)中，果膠是一種重要的商品。例如，在食品工業(yè)中它可用作增稠或膠化劑，如在果醬的制備中。果膠是一種在植物細胞壁中常見的原果膠形式的結(jié)構(gòu)多糖。果膠的骨架包括α-1-4連接的半乳糖醛酸殘基，它被少量1，2連接的α-L-鼠李糖單位打斷。另外，果膠包括高度分枝的區(qū)域，具有一個幾乎交錯的鼠李糖-聚半乳糖醛酸鏈。這些高度分枝的區(qū)域還含有以糖苷鍵連接到鼠李糖單位的C3和C4原子或半乳糖醛酸單位的C2或C3原子上的其它糖單位(如D-半乳糖，L-阿拉伯糖和木糖)。α-1-4連接的半乳糖醛酸殘基的長鏈通常稱為“光滑區(qū)”，而高度分枝的區(qū)域常稱為“多毛區(qū)”。半乳糖醛酸殘基的一些羧基被酯化(例如，羧基被甲基化)。一般，羧基的酯化在半乳糖醛酸殘基聚合后出現(xiàn)。然而，所有的羧基被酯化(例如，甲基化)的極其少見。通常，酯化程度在090％間變化。如果50％或更多的羧基被酯化，那么所得的果膠稱為“高酯果膠”(縮寫為“HE果膠”)或“高甲氧基果膠”。如果不超過50％的羧基被酯化，那么所得的果膠稱為“低酯果膠”(縮寫為“LE果膠”)或“低甲氧基果膠”。如果果膠不含任何(或僅有少量)酯化基團，那么通常稱為果膠酸。果膠的結(jié)構(gòu)，特別是酯化的程度(例如，甲基化)決定著果膠的許多物理和/或化學特性。例如，果膠凝膠化取決于果膠的化學特性，特別是酯化程度。然而，果膠的凝膠化也取決于可溶性固體的含量，pH和鈣離子濃度。對于后者，據(jù)信鈣離子與游離羧基形成復(fù)合物，特別是在LE果膠的游離羧基上。果膠酶根據(jù)其攻擊果膠分子的聚半乳糖醛酸部分的方式進行分類。Pilnik和Voragen已描述了一些果膠酶的綜述(食品酶學，P.F.Fox；編輯；Elsevier(1991)；pp303-337)。具體地說，果膠甲基酯酶(EC3.1.1.11)，或稱為PME將HE果膠去酯化形成LE果膠或果膠酸。相反，舉例來說，果膠解聚酶斷裂半乳糖醛酸苷甲基酯殘基間的糖苷鍵。更詳細地說，PME活性產(chǎn)生游離羧基和游離甲醇。以自動滴定很容易監(jiān)測自由羧基的增加。在這一方面，早期的研究已顯示一些PME以隨機方式使果膠去酯化，這就是說它們使超過一種果膠鏈的任一酯化(例如，甲基化的)的半乳糖醛酸殘基去酯化。對果膠隨機去酯化的PME的例子可從棘孢曲霉(見WO94/25575)和日本曲霉(Ishii等，食品科學雜志，44pp611-14)等真菌來源獲得。Baron等(Lebensm，Wiss.M-Technol.13，pp330-333)很明顯已從黑曲霉中分離出一種真菌PME。據(jù)報道這種真菌PME具有39000D的分子量，等電點為3.9，最適pH為4.5，Km值(mg/ml)為3。相反，已知一些PME以嵌段式方式使果膠去酯化，這就是說據(jù)信它們在非還原端或靠近自由羧基處攻擊果膠，然后以單鏈機制沿果膠分子前進，從而產(chǎn)生極具鈣敏感性的未酯化的半乳糖醛酸單位。以嵌段式酶促方式使果膠去酯化的這類酶的例子是植物PME。已表明在柑桔中存在多達12種PME的同工型(PilnikW.和VoragenA.G.J.(食品酶學(EdP.F.Fox)；Elsevier；(1991)；pp303-337)。這些同工型具有不同的特征。Versteeg等(食品科學雜志，45pp969-971)明顯已從橙子中分離了一種PME。據(jù)報道該植物PME存在不同特征的多種同工型。同工型I分子量為36000D，等電點為10.0，最適pH為7.6，Km值(mg/ml)為0.083。同工型II分子量為36200D，等電點為11.0，最適pH為8.8，Km值(mg/ml)為0.0046。同工型III(HMW-PE)分子量為54000D，等電點為10.2，最適pH為8，Km值(mg/ml)為0.041。然而，迄今為止該PME的序列資料還非常有限。根據(jù)Pilnik和Voragen(出處同上)，PME可在許多其它高等植物中發(fā)現(xiàn)。如蘋果、杏、鱷梨、香蕉、漿果、酸橙、葡萄柚、中國柑橘、櫻桃、茶藨子屬、葡萄、芒果、番木瓜、西番蓮、桃子、梨子、李、蠶豆、胡蘿卜、花椰菜、黃瓜、韭蔥、洋蔥、豌豆、馬鈴薯、小蘿卜和西紅柿。然而，同樣，適合對這些PME的序列資料非常有限。以高效離子交換色譜可區(qū)分游離羧基的隨機或嵌段式分布(Schols等，食品水膠體，1989，6，pp115-121)。這些試驗常用于檢測巴氏消毒后在柑桔汁中的不需要的殘留PME活性，因為殘留的PME活性除了在橙汁中積累甲醇外，還引起所謂的“霧狀消失”。PME在工業(yè)上具有重要的用途。例如，它們可用于或作為鈣離子的分離劑。在這方面，根據(jù)Pilnik和Voragen(出處同上)，經(jīng)過向汁液提取后的柑桔果皮中加入氫氧化鈣懸液可制備家畜飼料。加入后，高pH和鈣離子激活果皮中的天然PME，引起果膠的迅速脫脂化和出現(xiàn)果膠酸鈣凝固。束縛的液相被釋放且易于壓出，所以只有部分原始水份需要經(jīng)過昂貴的熱干燥來去掉。然后壓榨的溶液用作動物飼料。Pilnik和Voragen(出處同上)列出了內(nèi)源性PME的用途，包括如果果汁中含過多來自水果的果膠時，將其加入果汁以減少果汁的粘度，將它們作為果膠酶溶液加入已加熱到果心溫度為20至40℃的柑桔果實的白色層氣泡中以利于去掉果皮和從完整的果汁部分中去掉其它膜(US-A-4284651)，及其用于保護和改進諸如蘋果(Wiley&Lee1970，食品技術(shù)，24，1168-70)，罐裝西紅柿(Hsu等，1965，食品科學雜志30，pp.583-588)和馬鈴薯(Bartolome&Hoff1972，農(nóng)業(yè)食品化學雜志，20，pp.262-266)的一些加工的水果和蔬菜的質(zhì)地和硬度。Glahn和Rolin(1994，F(xiàn)oodIngredientsEurope，CoutProceedingspp.252-256)報道了關(guān)于工業(yè)“GENU果膠型YM100”與酸奶飲料相互作用的假定的用途。但根本沒有提供關(guān)于如何制備GENU果膠型YM-100的細節(jié)。EP-A-0664300公開了制備鈣敏感性果膠的化學分離方法。據(jù)說該鈣敏感性果膠對食品工業(yè)具有優(yōu)勢。因此，除PME外，果膠和去酯化果膠具有工業(yè)重要性。然而，仍然需要改進穩(wěn)定酸性環(huán)境中的蛋白質(zhì)而不對該環(huán)境的粘度產(chǎn)生有害影響的已知方法。在這方面，對環(huán)境粘度的有害影響可損害所得產(chǎn)品的總體外觀和/或質(zhì)地和/或適口性和/或口感。根據(jù)本發(fā)明的第1個方面，提供的方法包括向含至少一種蛋白質(zhì)的酸性環(huán)境中加入一種嵌段式酶促去酯化的果膠，其中該果膠是高酯果膠。根據(jù)本發(fā)明的第2個方面，提供的嵌段式酶促去酯化果膠的方法包括用包含SEQIDNO∶1或SEQIDNO∶2所示氨基酸序列中的任一個的重組酶或其變異體，衍生物或同源物，包括其組合來處理果膠。根據(jù)本發(fā)明的第3個方面，提供了包含SEQ.I.D.No.1或SEQ.I.D.No.2所示的氨基酸序列中任意一個的重組酶，其變異體，衍生物或同源物，包括其組合。根據(jù)本發(fā)明的第4個方面，提供了編碼根據(jù)本發(fā)明的重組酶的核苷酸序列，其中的核苷酸序列包含SEQ.I.D.No.3或SEQ.I.D.No.4所示的序列的任意一個或其變異體，衍生物或同源物。根據(jù)本發(fā)明的第5個方面，提供了編碼根據(jù)本發(fā)明的重組酶的核苷酸序列，其中核苷酸序列可從NCIMB40749或NCIMB40750，或其變異體，衍生物或同源物中獲得。根據(jù)本發(fā)明的第6個方面，提供了表達或包含根據(jù)本發(fā)明的重組酶或根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列的構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的第7個方面，提供了表達或包含根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體或根據(jù)本發(fā)明的重組酶或根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列的載體。根據(jù)本發(fā)明的第8個方面，提供了一種構(gòu)建體的組合，包括至少一個表達或包含根據(jù)本發(fā)明的重組酶或根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列的第一構(gòu)建體，和一個包含感興趣的基因(GOI)和啟動子的第二構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的第9個方面，提供了表達或包含根據(jù)本發(fā)明的載體或根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體或根據(jù)本發(fā)明的重組酶或根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列或根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體的組合的細胞，組織或器官。根據(jù)本發(fā)明的第10個方面，提供了表達或包含本發(fā)明的任一上述方面的轉(zhuǎn)基因生物。根據(jù)本發(fā)明的第11個方面，提供了NCIMB40749或NCIMB40750。根據(jù)本發(fā)明的第12個方面，提供了一種重組PME酶，它與針對根據(jù)本發(fā)明的第3個方面的純化重組酶而不是西紅柿PME酶產(chǎn)生的抗體具有免疫反應(yīng)性。根據(jù)本發(fā)明的第13個方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的重組酶對減少果膠的酯基數(shù)目的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的第14個方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的重組酶對果膠以嵌段式方式去酯化的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的第15個方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的重組酶影響果膠的鈣敏感性的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的第16個方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的重組酶酯化含游離羧基的果膠的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的第17個方面，提供了使用根據(jù)本發(fā)明的重組酶，如經(jīng)過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的果膠。根據(jù)本發(fā)明的第18個方面，提供了包含根據(jù)本發(fā)明的重組酶及一種真菌PME和/或其它果膠降解酶(例如，果膠裂解酶)的酶組合。本發(fā)明的其它方面包括根據(jù)本發(fā)明的果膠用于制備食品；根據(jù)本發(fā)明的果膠用于穩(wěn)定酸性環(huán)境中的蛋白質(zhì)而不對環(huán)境的粘度產(chǎn)生有害影響；以及編碼根據(jù)本發(fā)明的酶的重組核苷酸序列。因此，本發(fā)明涉及去酯化的果膠的新用途。本發(fā)明還涉及制備該果膠的新的重組PME。本發(fā)明的一些主要的優(yōu)勢在于本發(fā)明的去酯化果膠賦予蛋白質(zhì)在酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性而不對環(huán)境的粘度產(chǎn)生有害影響。本發(fā)明的第一個方面優(yōu)選的實施方案是包括向含至少一種蛋白質(zhì)的酸性環(huán)境中加入使用重組DNA技術(shù)制備的嵌段式酶促去酯化的果膠的方法，其中該果膠是一種高酯果膠。術(shù)語“使用重組DNA技術(shù)制備的嵌段式酶促去酯化果膠”指含嵌段式去酯化基團的果膠，其中經(jīng)過使用重組DNA技術(shù)制備的酶處理(例如，接觸)含酯化基團的果膠來制備該果膠。本發(fā)明的該優(yōu)選方面的一些主要優(yōu)勢在于可較容易且以相當?shù)囊恢鲁潭戎苽淙ヵセ墓z。在這方面，可相當簡單和容易地制備重組PME本身且也能達到高度的勻質(zhì)性。不象
背景技術(shù)：
PME制品，這意味著所得的PME活性更一致和勻質(zhì)，使得總的去酯化過程更易控制。嵌段式酶促去酯化的果膠(優(yōu)選使用重組DNA技術(shù)制備)在本發(fā)明的方法中用于穩(wěn)定酸性環(huán)境中的至少一種蛋白質(zhì)具有益處，因為它使乳清和乳蛋白(如酪蛋白)等蛋白質(zhì)在酸性溶液中穩(wěn)定。這對諸如脫脂奶粉，果汁和乳清蛋白飲料的飲料市場具有重要性，其中如果存在高含量的穩(wěn)定劑，只有在相當高的酸性條件(如，pH4.2)下才有可能達到關(guān)鍵蛋白的風味。現(xiàn)在我們已發(fā)現(xiàn)，對于某些應(yīng)用，可使用根據(jù)本發(fā)明的少量脫酯化的果膠。以這些較低的水平，根據(jù)本發(fā)明的去酯化果膠不僅充當穩(wěn)定劑，而且對最終產(chǎn)物無副作用。如果需要，本發(fā)明的去酯化果膠的使用能使食品制造者增加飲料等食品的pH。在這一方面，在有些情況下飲料的酸性較低可使它們對人們，特別是嬰兒更適口。因此，與
背景技術(shù)：
方法相反，經(jīng)過使用嵌段式酶促去酯化果膠，特別是使用重組DNA技術(shù)制備的嵌段式酶促去酯化果膠，現(xiàn)在可在高于4.2的pH條件下，如高達pH5.5(如pH5.2)時保留這些蛋白質(zhì)的風味。另外，據(jù)信甚至在較低的pH條件，如pH4.2或更低時，嵌段式酶促去酯化果膠(特別是用重組DNA技術(shù)制備的嵌段式酶促去酯化果膠)比用于這些pH條件的
背景技術(shù)：
的穩(wěn)定劑可穩(wěn)定更多的蛋白質(zhì)。另一個優(yōu)勢在于重組PME能產(chǎn)生基本上均一的嵌段式去酯化果膠。我們以此指基本上所有的果膠鏈包含至少2個相鄰的去酯化羧基。然而，對于某些應(yīng)用，制備或使用這些基本上均一的嵌段式去酯化果膠是不必要的。盡管不希望受理論的束縛，但據(jù)信嵌段式酶促去酯化果膠(特別是使用重組DNA技術(shù)制備的)經(jīng)過以負電荷屏蔽包圍蛋白質(zhì)，從而形成穩(wěn)定的乳膠來穩(wěn)定蛋白質(zhì)。當果膠與重組酶在基本上含水的介質(zhì)中接觸時，本發(fā)明的重組PME酶對果膠進行嵌段式去酯化是有用的。在有些情況下，去酯化果膠可增加果膠的鈣離子敏感性，而這可能具有優(yōu)勢。另外，當果膠與重組酶在基本上無水的介質(zhì)中接觸時，本發(fā)明的重組PME酶對于使果膠酯化是有用的，如在甲醇存在的條件下或在高濃度的硫酸銨存在的條件下。如果，例如，需要減小果膠的鈣敏感性時，這一方面具有優(yōu)勢。這種酯化果膠的方法具有優(yōu)勢，因為它不需要與
背景技術(shù)：
方法相關(guān)的高溫和甲醇酯化條件。因此，本發(fā)明還包括在食品制品及果膠本身中使用該酯化的果膠。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的去酯化果膠對食品的制備具有優(yōu)勢。典型的食品包括乳制品，肉制品，家禽制品，魚制品和面包制品。優(yōu)選該食品是飲料。本發(fā)明的去酯化果膠對于在藥品制備，藥品應(yīng)用，化妝品和化妝品應(yīng)用中用作穩(wěn)定劑和/或粘度修飾劑也是有優(yōu)勢的。優(yōu)選的酸性環(huán)境是水溶液。優(yōu)選的水溶液是飲料。優(yōu)選的飲料是飲用酸牛奶，果汁或包含乳清蛋白的飲料。優(yōu)選蛋白質(zhì)來自或可從諸如牛奶或奶酪的乳制品中獲得。優(yōu)選該蛋白質(zhì)是酪蛋白或乳清蛋白。優(yōu)選酸性環(huán)境具有從大約3.5到大約5.5的pH。優(yōu)選的酸性環(huán)境具有從4到大約5.5的pH。優(yōu)選其中酸性環(huán)境pH為大約4。優(yōu)選的嵌段式酶促去酯化果膠(特別是以重組DNA技術(shù)制備的)是含大約80％酯基或較少(即，酯化程度(DE)為80％或較少)的高酯果膠，優(yōu)選大約75％酯基或較少(即DE為大約75％或更少)。在這方面，果膠中游離羧基與酯化羧基的比率從1∶1到1∶4，優(yōu)選從1∶2到1∶3。優(yōu)選嵌段式酶促去酯化果膠含約76％酯基。在有些情況下，優(yōu)選的嵌段式酶促去酯化果膠對Ca2+離子具有敏感性。以下面實施例所述的方法可測定鈣敏感性。然而，更優(yōu)選的是，嵌段式酶促去酯化果膠，特別是以重組DNA技術(shù)制備的果膠對Ca2+離子不敏感。以下面實施例所述的方法可測定鈣不敏感性。優(yōu)選嵌段式酶促去酯化果膠具有高分子量。典型的是，分子量在大約50kD到大約150kD之間。優(yōu)選的是，經(jīng)過用在至少基本上全部的果膠鏈上使果膠上的2個或多個相鄰半乳糖醛酸殘基去酯化的重組果膠甲基酯酶處理果膠來制備嵌段式酶促去酯化果膠。優(yōu)選重組果膠甲基酯酶來自可從植物獲得的PME。術(shù)語“來自可從植物獲得的PME”指重組PME具有類似于可從植物獲得的PME的序列，只要重組PME能以嵌段式方式使果膠去酯化。優(yōu)選的植物是水果。優(yōu)選的水果是柑桔水果。優(yōu)選的柑桔水果是橙子。優(yōu)選重組果膠甲基酯酶來自可從橙子的瓣膜或白色層中獲得的PME。作為參考，圖1顯示了典型的柑桔水果的橫切面，其中顯示了瓣膜和白色層。術(shù)語“來自可從橙子的瓣膜或白色層中獲得的PME”指重組PME具有類似于可從橙子的瓣膜或白色層獲得的PME的序列，前提是重組PME可以嵌段式方式使果膠去酯化。優(yōu)選的是，嵌段式酶促去酯化果膠用包含SEQ.I.D.No.1或SEQ.I.D.No.2所示的任一氨基酸序列的重組酶，或其變異體，衍生物或同源物，包括其組合處理果膠來制備。優(yōu)選的是，經(jīng)過用表達包含SEQ.I.D.No.3或SEQ.I.D.No.4所示的核苷酸序列的核苷酸序列可獲得的重組酶或其變異體，衍生物或同源物或其組合處理果膠制備嵌段式酶促去酯化果膠。優(yōu)選的是，用表達包含于NCIMB40749或NCIMB40750中的PME編碼序列可獲得的重組酶或其變異體，衍生物或同源物或其組合處理果膠制備嵌段式酶促去酯化果膠。優(yōu)選的是，在鈉離子存在的條件下用重組果膠甲基酯酶處理果膠制備嵌段式酶促去酯化果膠。優(yōu)選的是，在NaCl、NaNO3或Na2SO4存在的條件下，用重組果膠甲基酯酶處理果膠來制備以重組DNA技術(shù)制備的嵌段式酶促去酯化果膠。優(yōu)選的是，重組酶包括SEQ.I.D.No.1或SEQ.I.D.No.2所示的所有序列。優(yōu)選的是，以包含SEQ.I.D.No.3或SEQ.I.D.No.4所示的所有序列的核苷酸序列表達重組酶。本發(fā)明還包括與上述序列互補的序列。術(shù)語“果膠”包括常規(guī)意義上的果膠，以及其片段和衍生物，以及修飾的果膠(例如，化學修飾的果膠和酶促修飾的果膠)。優(yōu)選的是，果膠不是預(yù)先已用多聚半乳糖醛酸酶處理過、基本上減小了果膠主鏈長度的果膠。與本發(fā)明的重組酶相關(guān)的術(shù)語“變異體”、“同源物”或“片段”包括從或?qū)π蛄羞M行任意取代、變異、修飾、替代、缺失或添加一個(或多個)氨基酸，只要所得的氨基酸序列具有PME活性，優(yōu)選具有至少等同于包含SEQ.I.D.No.1和2所示的任意一個或多個序列的重組酶的活性。特別是，術(shù)語“同源”包括關(guān)于結(jié)構(gòu)和/或功能的同源性，只要所得的重組酶具有PME活性。至于序列同源性(即，相似性)，優(yōu)選與所附序列表所示序列有至少75％，更優(yōu)選至少85％，更加優(yōu)選至少90％的同源性。更優(yōu)選的是，與所附序列表所示的序列具有至少95％，更加優(yōu)選至少98％的同源性。與編碼本發(fā)明的重組酶的核苷酸序列相關(guān)的術(shù)語“變異體”，“同源物”或“片段”包括從或?qū)υ撔蛄羞M行任意取代、變異、修飾、替代、缺失或增加一個(或多個)核酸，只要是所得的核苷酸序列編碼具有PME活性的重組酶，優(yōu)選具有至少等同于包含SEQ.I.D.Nos.1和2所示的任意一個或多個序列的重組酶的活性。具體地說，術(shù)語“同源”包括結(jié)構(gòu)和/或功能的同源性，只要所得的核苷酸序列編碼具有PME活性的重組酶。至于序列同源性(即，相似性)，優(yōu)選具有至少75％，更優(yōu)選至少85％，更加優(yōu)選至少90％的同源性。更優(yōu)選的是，具有至少95％，更加優(yōu)選至少98％的同源性。上面的術(shù)語與該序列的等位變異體同義。術(shù)語“互補”指本發(fā)明還包括能與編碼序列的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。與本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語“核苷酸”包括基因組DNA，cDNA，合成DNA和RNA。優(yōu)選的是，它指DNA，更優(yōu)選的是指本發(fā)明的編碼序列的cDNA。術(shù)語“柑桔水果”指柑桔屬的種類，包括酸橙、檸檬、橙子、葡萄柚、金橘、柚，和中國柑橘。優(yōu)選的是，它指橙子。術(shù)語“構(gòu)建體”與諸如“連接物”，“序列盒”和“雜合體”的術(shù)語同義，包括根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列，或構(gòu)建體的組合情況，直接或間接附著于啟動子上的GOI。間接附著的例子是提供諸如內(nèi)含子序列的合適的間隔區(qū)，如Sh1-內(nèi)含子或ADH內(nèi)含子，間隔啟動子與本發(fā)明的核苷酸序列或GOI。對于與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語“融合的”也是相同的，它包括直接或間接附著。在各種情況下，該術(shù)語不包括通常與野生型基因啟動子相連的編碼該酶的基因的自然組合，且此時它們均存在于其自然環(huán)境中。該構(gòu)建體甚至含有或表達一個標記，它允許在其所轉(zhuǎn)化進的，例如，絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬，如黑曲霉或植物，如馬鈴薯、甜菜等中選擇該遺傳構(gòu)建體?？墒褂玫母鞣N標記有，例如，編碼甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶(特別是對于植物)的標記或提供抗生素抗性的那些標記，例如，對G418、潮霉素、博萊霉素、卡那霉素和慶大霉素的抗性。術(shù)語“載體”包括表達載體和轉(zhuǎn)化載體。術(shù)語“表達載體”指能在體內(nèi)或體外表達的構(gòu)建體。術(shù)語“轉(zhuǎn)化載體”指能從一個物種轉(zhuǎn)移到另一物種的構(gòu)建體，如從大腸桿菌質(zhì)粒到絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬。甚至可以是能從大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到土壤桿茵并轉(zhuǎn)移到植物的構(gòu)建體。術(shù)語“組織”包括組織本身和器官。與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語“生物”包括可包含編碼根據(jù)本發(fā)明的重組酶的核苷酸序列和/或可從其獲得的產(chǎn)物的任意生物，其中當存在于生物中時，啟動子允許表達根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列。優(yōu)選的生物是絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬，更優(yōu)選黑曲霉。與本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因生物”包括包含編碼根據(jù)本發(fā)明的重組酶的核苷酸序列和/或從其獲得的產(chǎn)物的任意生物，其中該啟動子允許在生物中表達根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列。優(yōu)選核苷酸序列整合到生物的基因組中。優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因生物是絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬，更優(yōu)選黑曲霉。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物包括包含啟動子，編碼根據(jù)本發(fā)明的重組酶的核苷酸序列，根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體(包括其組合)，根據(jù)本發(fā)明的載體，根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒，根據(jù)本發(fā)明的細胞，根據(jù)本發(fā)明的組織或其產(chǎn)物的任意一種或其組合的一種生物體。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因生物”不包括在其天然環(huán)境中的其天然啟動子控制下的其天然環(huán)境中的根據(jù)本發(fā)明的天然核苷酸編碼序列。另外，本發(fā)明不包括處于其天然啟動子控制之下的其天然核苷酸序列表達的根據(jù)本發(fā)明的天然酶，其中上述啟動子，核苷酸和酶均處于其天然環(huán)境之中。轉(zhuǎn)化的細胞或生物可制備易于從細胞或生物體中回收的可接受量的所需化合物。優(yōu)選本發(fā)明的構(gòu)建體包括本發(fā)明的核苷酸序列和啟動子。術(shù)語“啟動子”以本領(lǐng)域中的正常意義使用，例如，基因表達的Jacob-Monod理論中的RNA聚合酶結(jié)合位點。在一個方面，根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列在可能是細胞或組織特異性啟動子的啟動子控制之下。例如，如果生物體是植物，那么，啟動子可以是在塊莖、莖、芽、根和葉組織的一處或多處影響核苷酸序列表達的啟動子。以舉例的方式，本發(fā)明的核苷酸序列的啟動子可以是在我們1994年10月21日申請的共同未決的英國專利申請?zhí)?421292.5中描述的α-Amy1啟動子(或者稱為Amy1啟動子，Amy637啟動子或α-Amy637啟動子)。另外，本發(fā)明的核苷酸序列的啟動子可以是在我們1994年10月21日申請的共同未決的英國專利申請?zhí)?421286.7中所述的α-Amy3啟動子(或者稱為Amy3啟動子。Amy351啟動子或α-Amy351啟動子)。另外，啟動子包括保證或增加在合適的宿主中表達的特征。例如，該特征可以是諸如PribnowBox或TATAbox的保守區(qū)。該啟動子甚至可含有對本發(fā)明的核苷酸序列或在構(gòu)建體，GOI的組合情況下影響(如維持、增強、減小)表達水平的其它序列。例如，合適的其它序列包括Sh1內(nèi)含子或ADH內(nèi)含子。其它序列包括可誘導(dǎo)的元件，如溫度，化學品，光照或壓力可誘導(dǎo)的元件。另外，可存在增強轉(zhuǎn)錄或翻譯的合適元件。后一類元件的例子有TMV5′信號序列(見Sleat基因217〔1987〕217-225；和Dawson植物分子生物學23〔1993〕97)。另外，本發(fā)明還包括啟動子和/或編碼蛋白質(zhì)或重組酶的核苷酸序列和/或元件的組合。本發(fā)明還包括使用啟動子表達編碼根據(jù)本發(fā)明的重組酶的核苷酸序列或GOI，其中啟動子部分被滅活，但其中該啟動子仍能發(fā)揮啟動子功能。在某些情況下啟動子的部分失活是有優(yōu)勢的。具體地說，對于以前提及的Amy351啟動子，可使其部分失活，以便部分失活的啟動子以更特異性的方式，如只在一種特異性組織類型或器官中表達本發(fā)明的核苷酸或GOI。術(shù)語“失活的”指部分失活，意思是啟動子的表達方式被修飾，但其中部分失活的啟動子仍發(fā)揮啟動子的功能。然而，如上所述，修飾的啟動子能在至少一種(但不是全部)原始啟動子的特異性組織中表達本發(fā)明的核苷酸或GOI。一個這類啟動子是上述的Amy351啟動子。部分失活的例子包括改變啟動子序列的折疊方式，或部分核苷酸序列的結(jié)合種類，使部分核苷酸序列不被，例如，RNA聚合酶識別。部分失活的啟動子的另一個且是優(yōu)選的方式是將其截短以形成其片段。另一方式可誘變至少部分序列，使RNA聚合酶不能結(jié)合到該部分或另一部分上。另一類修飾是誘變調(diào)節(jié)蛋白(例如從絲狀真菌了解的CreA蛋白)的結(jié)合位點以產(chǎn)生碳降解產(chǎn)物阻遏，從而廢除天然啟動子的降解產(chǎn)物阻遏。與根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體組合有關(guān)的術(shù)語“GOI”指任何目的基因。GOI可以是對所討論的生物體(例如，絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬或植物)是外來的或天然的任意核苷酸。典型的GOI的例子包括編碼修飾代謝性和分解性過程的蛋白質(zhì)和酶的基因。GOI可編碼用于導(dǎo)入或增加病原體抗性的因素。GOI甚至可以是修飾存在于相關(guān)組織的天然轉(zhuǎn)錄子表達的反義構(gòu)建體。GOI甚至可編碼絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬的非天然蛋白質(zhì)或?qū)游锘蛉祟愑幸娴幕衔?。GOI的例子包括其它果膠酶，果膠解聚酶，多聚半乳糖醛酸酶，果膠酸裂解酶，果膠裂解酶，鼠李糖半乳糖醛酸酶，半纖維素酶，內(nèi)-β-葡聚糖酶，阿聚糖酶或乙酰酯酶或其組合及其反義序列。GOI可以是對食品或作物提供營養(yǎng)價值的蛋白質(zhì)。典型的例子包括能抑制抗營養(yǎng)因子形成的植物蛋白質(zhì)和有更需要的氨基酸組成(例如，比非轉(zhuǎn)基因植物更高的賴氨酸含量)的植物蛋白質(zhì)。GOI甚至可編碼能用于食品加工的酶，如凝乳酶，奇甜蛋白和α-半乳糖苷酶。GOI可以是編碼任一害蟲毒素和反義轉(zhuǎn)錄子的基因，如編碼patatin或α-淀粉酶，ADP-葡萄糖焦磷酸酶(例如，見EP-A-0455316)，蛋白酶反義物，葡聚糖酶或基因組PME的基因。GOI甚至可編碼特定酶的內(nèi)含子，但其中內(nèi)含子可以是有義或反義方向。在后一種情況下，具體的酶可以是基因組PME?；蚪M外顯子或內(nèi)含子序列作為GOI的反義表達指天然PME表達減少或消除，但其中重組PME表達不受影響。對反義內(nèi)含子或有義內(nèi)含子的表達尤其如此。GOI可以是編碼α-淀粉酶的核苷酸序列，它是我們1994年7月4日申請的共同未決的英國專利申請9413439.2的主題。GOI可以是編碼α-淀粉酶的核苷酸序列，它是我們1994年10月21日申請的共同未決的英國專利申請9421290.9的主題。GOI可以是編碼ADP-葡萄糖焦磷酸酶的任意核苷酸序列，它是我們1994年4月7日申請的共同未決的PCT專利申請PCT/EP94/01082的主題。GOI可以是任一編碼α-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列，它在我們1994年10月15日申請的共同未決的PCT專利申請PCT/EP94/03397中描述。宿主生物可以是原核或真核生物。合適的原核宿主的例子包括大腸桿菌和枯草桿菌。關(guān)于原核宿主轉(zhuǎn)化的指導(dǎo)在本領(lǐng)域中有充分的記載，例如，見Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，第二版，1989，冷泉港實驗室出版)。如果使用原核宿主，那么基因在轉(zhuǎn)化前需適當修飾，如經(jīng)過去掉內(nèi)含子。如上所述，優(yōu)選的宿主生物是曲霉屬，如黑曲霉。根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因曲霉可按下面的指導(dǎo)來制備Rambosek.J.和Leach.J.1987(絲狀真菌中的重組DNA進展和前景，CRCCrit.Rev.Biotechnol.6357-393)，DavisR.W.1994(曲霉中的異源基因表達和蛋白質(zhì)分泌，在MartinelliS.D.KinghornJ.R.(編輯)，曲霉工業(yè)微生物學進展50年，vol.29，ElsevierAmsterdam1994，pp.525-560)，Ballance.D.J.1991(絲狀真菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)及真菌基因結(jié)構(gòu)綜述。見Leong，S.A.，BerkaR.M.(編輯)，分子工業(yè)真菌學。絲狀真菌的系統(tǒng)和應(yīng)用。MarcelDekkerInc.NewYork，1991，pp.1-29)和TurnerG.1994(遺傳操作的載體，在MartinelliS.D.KinghornJ.R.(編輯)曲霉50年工業(yè)微生物學進展，vol.29，ElsevierAmsterdam.1994，pp.641-666)。盡管如此，下面的描述提供了用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因曲霉的指導(dǎo)的小結(jié)。幾乎在一個世紀的時間里，絲狀真菌被廣泛用于許多類生產(chǎn)有機化合物和酶的工業(yè)中。例如，傳統(tǒng)的日本酒曲和醬油發(fā)酵已使用曲霉屬種類。另外，在本世紀，黑曲霉已用于生產(chǎn)有機酸，特別是檸檬酸及用于生產(chǎn)各種酶以便在工業(yè)上使用。絲狀真菌被廣泛用于工業(yè)上有兩個主要的原因。首先絲狀真菌可產(chǎn)生高含量的細胞外產(chǎn)物，例如，酶和諸如抗生素或有機酸的有機化合物。其次，絲狀真菌可在諸如谷物、糠、甜菜果肉等的廉價底物上生長。相同的原因使絲狀真菌成為用于根據(jù)本發(fā)明的異源表達宿主的有吸引力的生物。為了制備轉(zhuǎn)基因曲霉，將根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列(或甚至GOI)插入設(shè)計成在絲狀真菌中表達的構(gòu)建體中可制備表達構(gòu)建體。已形成了用于異源性表達的一些類型的構(gòu)建體。這些構(gòu)建體優(yōu)選含在真菌中有活性的啟動子。啟動子的例子包括用于高表達細胞外酶的真菌啟動子，如葡糖淀粉酶啟動子或α-淀粉酶啟動子。根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列(或甚至是GOI)可與信號序列融合，該信號序列指導(dǎo)由根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列(或甚至是GOI)編碼的蛋白質(zhì)的分泌。通常使用真菌來源的信號序列。真菌中有活性的終止子終止表達系統(tǒng)。在真菌中已形成另一類表達系統(tǒng)，其中根據(jù)本發(fā)明的核苷酸(或甚至是GOI)與編碼穩(wěn)定蛋白質(zhì)的較小的或較大的部分真菌基因融合。這可穩(wěn)定由根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列(或甚至是GOI)編碼的蛋白質(zhì)。在這一系統(tǒng)中，由特異性蛋白酶識別的裂解位點可導(dǎo)入真菌蛋白和由根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列(或甚至是GOI)編碼的蛋白質(zhì)之間，如此產(chǎn)生的融合蛋白質(zhì)可由特異性蛋白酶在該位置裂解，從而釋放由根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列(或甚至是GOI)編碼的蛋白質(zhì)。以舉例的方式說明，可導(dǎo)入由至少在一些曲霉中發(fā)現(xiàn)的KEX-2樣肽酶識別的位點。這種融合導(dǎo)致在體內(nèi)裂解產(chǎn)生對表達產(chǎn)物而不是較大的融合蛋白的保護。已報道了在曲霉中異源表達編碼細胞，真菌、脊椎動物和植物蛋白的一些基因。如果根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列(或甚至是GOI)不與信號序列融合，該蛋白質(zhì)可沉積在細胞內(nèi)。該蛋白質(zhì)可在細胞質(zhì)中積累，且通常不被糖基化，對于某些細菌蛋白質(zhì)來說，這可能是一種優(yōu)勢。如果根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列(或甚至是GOI)帶有信號序列，該蛋白質(zhì)將在細胞外積累。至于產(chǎn)品穩(wěn)定性和宿主菌株的修飾，一些異源性蛋白質(zhì)當它們分泌進真菌培養(yǎng)液中時不是太穩(wěn)定。大多數(shù)真菌產(chǎn)生一些降解異源性蛋白質(zhì)的細胞外蛋白酶。為了避免該問題，將具有減小蛋白酶產(chǎn)量的特定真菌菌株用作異源性生產(chǎn)的宿主。為了轉(zhuǎn)化絲狀真菌，建立了一些轉(zhuǎn)化方案，用于許多絲狀真菌(gallance1991，出處同上)。其中的一些以原生質(zhì)的制備為基礎(chǔ)且使用PEG和Ca2+離子將DNA導(dǎo)入原生質(zhì)體中。轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體然后再生且使用各種選擇性標記選擇轉(zhuǎn)化的真菌。用于轉(zhuǎn)化的標記中有許多營養(yǎng)缺陷型標記，如argB、trpC、niaD和pvrG，抗生素抗性標記，如苯菌靈抗性，潮霉素抗性和腐草霉素抗性。常用的轉(zhuǎn)化標記是構(gòu)巢曲霉的amds基因，其高拷貝數(shù)允許真菌以丙烯酰胺作為唯一氮源進行生長。在另一實施方案中，轉(zhuǎn)基因生物是酵母。在這方面，酵母還廣泛用作異源基因表達的載體。啤酒糖酵母種類具有較長的工業(yè)應(yīng)用歷史，包括其用于異源基因的表達。異源基因在啤酒糖酵母中的表達由Goodey等(1987，酵母生物技術(shù)，D.R.Berry等，編輯，pp.401-429，Allen和Unwin，倫敦)和由King等(1989，酵母分子和細胞生物學，E.F.Walton和G.T.Yarronton編輯，pp.107-133，Blackie，Glasgow)進行了綜述。由于一些原因，啤酒糖酵母非常適用于異源基因的表達。首先，它對人類是非致病性的，它不能產(chǎn)生某些內(nèi)毒素。其次，在幾個世紀的為各種目的進行的商用開發(fā)后，它具有較長的安全使用歷史。這導(dǎo)致被公眾廣泛接受。第三，對該生物進行的廣泛商業(yè)應(yīng)用和研究導(dǎo)致對啤酒糖酵母的遺傳學和生理學及大規(guī)模發(fā)酵特征具有充分的了解。對在啤酒糖酵母中表達異源基因和分泌基因產(chǎn)物的綜述由E.HinchcliffeE.Kenny(1993，“酵母作為表達異源基因的載體”，酵母，vol.5，AnthonyH.Rose和J.StuartHarrison編輯，第二版，學術(shù)出版有限公司)給出?？傻玫揭恍╊愋偷慕湍篙d體，包括整合載體(它需要與宿主基因組進行重組以便于其維持)和自主復(fù)制質(zhì)粒載體。為了制備轉(zhuǎn)基因糖酵母，經(jīng)過將本發(fā)明的核苷酸序列插入設(shè)計成在酵母中表達的構(gòu)建體中來制備表達構(gòu)建體。已形成了用于異源性表達的一些類型的構(gòu)建體。構(gòu)建體含有在酵母中有活性的，且融合到本發(fā)明的核苷酸序列上的啟動子，通常使用酵母來源的啟動子，如GAL1啟動子。通常使用酵母來源的信號序列，如編碼SUC2信號肽的序列。在酵母中有活性的終止子終止表達系統(tǒng)。為轉(zhuǎn)化酵母，已形成了一些轉(zhuǎn)化方法。例如，可按Hinnen等(1978，美國科學院學報，75，1929)；Beggs，J.D.(1978，自然，倫敦，275，104)和Ito.H.等(1983，細菌學雜志，153，163-168)的指導(dǎo)制備根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因糖酵母。使用各種選擇性標記可選擇轉(zhuǎn)化的酵母細胞。用于轉(zhuǎn)化的標記中有許多營養(yǎng)缺陷型標記，如LEU2，HIS4和TRP1，和顯性抗生素抗性標記，如氨基糖苷類抗生素標記，例如G418。另一宿主生物是植物。盡管在EP-B-0470145和CA-A-2006454中未公開該酶及編碼它們的核苷酸序列，但這兩篇文獻提供了關(guān)于可用來制備根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)類型的一些有用的背景描述。一些這類
背景技術(shù)：
現(xiàn)在包括在下面的描述中。構(gòu)建遺傳修飾的植物的基本原理是將遺傳信息插入植物基因組以便獲得所插入的遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定維持。對插入遺傳信息有一些技術(shù)，兩個主要的原則是直接導(dǎo)入遺傳信息及經(jīng)過使用載體系統(tǒng)導(dǎo)入遺傳信息。一般技術(shù)的綜述可見于Potrkus(植物生理學和植物分子生物學年鑒〔1991〕，42205-225)和Christou(Agro-Food-IndustryHi-TechMarch/April199417-27)的文章。因此，在一個方面，本發(fā)明涉及一種載體系統(tǒng)，它攜帶根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列或構(gòu)建體，且它能將核苷酸序列或構(gòu)建體導(dǎo)入生物體，如植物的基因組中。載體系統(tǒng)可包括一個載體，但它可包含兩個載體。在兩個載體的情況下，載體系統(tǒng)一般稱為二元載體系統(tǒng)。二元載體系統(tǒng)在GynheungAn等(1980)，二元載體，植物分子生物學手冊A3，1-19中進行了更詳細的描述。一個具有給定啟動子或核苷酸序列或構(gòu)建體，廣泛用于轉(zhuǎn)化植物細胞的系統(tǒng)以使用來自根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒或來自發(fā)根土壤桿菌的Ri質(zhì)粒為基礎(chǔ)，An等(1986)，植物生理學，81，301-305及ButcherD.N.等(1980)，植物病理學家的組織培養(yǎng)方法，編輯；D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203208。已構(gòu)建了一些不同的Ti和Ri質(zhì)粒，它們適用于構(gòu)建上面所述的植物或植物細胞構(gòu)建體。這類Ti質(zhì)粒的一個非限制性的例子是pGV3850。本發(fā)明的核苷酸序列或構(gòu)建體應(yīng)優(yōu)選插入Ti質(zhì)粒的T-DNA末端序列之間或相鄰于T-DNA序列，以避免破壞剛好在T-DNA邊界周圍的序列，因為至少一個這類區(qū)域似乎對將修飾的T-DNA插入植物基因組是必需的。從上面的解釋可了解到，如果生物體是植物，那么本發(fā)明的載體系統(tǒng)優(yōu)選含感染植物所必需的序列(例如，vir區(qū))和至少一個T-DNA序列的邊界部分，該邊界部分位于作為遺傳構(gòu)建體的相同載體上。優(yōu)選的是，該載體系統(tǒng)是根癌土壤桿菌Ti-質(zhì)?；虬l(fā)根土壤桿菌的Ri-質(zhì)?；蚱溲苌?，因為這些質(zhì)粒是熟知的，且廣泛用于轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建，存在許多以這些質(zhì)粒或其衍生物為基礎(chǔ)的載體系統(tǒng)。在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物時，可首先在微生物中構(gòu)建本發(fā)明的核苷酸序列或構(gòu)建體，其中該載體可復(fù)制且在插入植物前易于操作。一個有用的微生物的例子是大腸桿茵，但可使用具有上面特征的其它微生物。當按上面限定的載體系統(tǒng)的載體在大腸桿菌中構(gòu)建時，如果需要的話，將它轉(zhuǎn)移進合適的土壤桿菌菌株，例如，根癌土壤桿菌中。因此，含本發(fā)明的核苷酸序列或構(gòu)建體的Ti質(zhì)粒優(yōu)選轉(zhuǎn)移進合適的土壤桿菌菌株，例如根癌土壤桿菌中，以獲得含本發(fā)明的核苷酸序列或構(gòu)建體的土壤桿菌細胞，隨后將DNA轉(zhuǎn)移進待修飾的植物細胞中。如在CA-A-2006454中所報道的，可獲得大量克隆載體，它含有大腸桿菌中的復(fù)制系統(tǒng)和允許選擇轉(zhuǎn)化細胞的標記。該載體包括，例如，pBR322，pUC系列，M13mp系列，pACYC184等。以這種方式，可將本發(fā)明的核苷酸或構(gòu)建體導(dǎo)入載體的合適限制性位置上。所包含的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化進大腸桿菌。在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌細胞，然后收獲并裂解。然后回收該質(zhì)粒。至于分析方法，一般使用的有序列分析，限制性分析，電泳和其它生物化學-分子生物學方法。在每種操作后，可限制性消化所用的DNA序列并與下一DNA序列相聯(lián)。各序列可克隆在相同或不同的質(zhì)粒中。在根據(jù)本發(fā)明的所需啟動子或構(gòu)建體或核苷酸序列的每種導(dǎo)入方法后，在植物中存在和/或插入其它DNA序列是必需的。例如，對于轉(zhuǎn)化，如果使用植物細胞的Ti-或Ri-質(zhì)粒，可連接至少右側(cè)邊界且通常是Ti-或Ri-質(zhì)粒T-DNA的右側(cè)和左側(cè)邊界，作為導(dǎo)入基因的側(cè)翼區(qū)。已深入研究了用于轉(zhuǎn)化植物細胞的T-DNA的使用且在EP-A-120516；Hoekema，在二元植物載體系統(tǒng)，Offset-drukkerijKantersB.B.，Alblasserdam，1985，ChapterV；Fraley等，Crit，Rev.PlantSci.41-46；和An等，EMBOJ.(1985)4277-284中進行了描述。用土壤桿菌直接感染植物組織是一種簡單的技術(shù)，它已被廣泛地采用且在ButcherD.N.等(1980)，植物病理學家的組織培養(yǎng)方法，編輯D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208中進行了描述。關(guān)于該主題的進一步的指導(dǎo)，參見Potrykus(植物生理學和植物分子生物學年鑒〔1991〕42205-225和Christou(Agro-Food-IndustryHi-TechMarch/April199417-27)。使用該技術(shù)，可在植物的某部分或組織對植物進行感染，即在葉、根、莖的一個部分或植物的另一部分。一般用攜帶啟動子和/或GOI的土壤桿菌直接感染植物組織時，使待感染的植物受傷，例如，用刀片切斷植物或用針刺穿植物或用研磨物擦破植物而使植物感染。然后用土壤桿菌接種傷口。然后使接種的植物或植物部分在合適的培養(yǎng)基上生長且使其發(fā)育成成熟植物。當構(gòu)建植物細胞時，可按熟知的組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)和維持這些細胞，如在加有必需的生長因子，如氨基酸，植物激素，維生素等的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。轉(zhuǎn)化的細胞再生成遺傳修飾的植物可使用從細胞或組織培養(yǎng)物再生植物的已知方法來實現(xiàn)，例如，使用抗生素選擇轉(zhuǎn)化苗或在含合適的營養(yǎng)成分，植物激素等的培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)幼苗來實現(xiàn)。關(guān)于植物轉(zhuǎn)化的進一步的指導(dǎo)參見EP-A-0449375。總之，本發(fā)明提供了在酸性環(huán)境中穩(wěn)定至少一種蛋白質(zhì)的方法，包括將蛋白質(zhì)與嵌段式酶促去酯化果膠，特別是以重組DNA技術(shù)制備的嵌段式酶促去酯化果膠接觸。另外，本發(fā)明提供了在該方法中有用的重組酶。本發(fā)明優(yōu)選的實施方案涉及在酸性環(huán)境中穩(wěn)定至少一種蛋白質(zhì)的方法，包含將蛋白質(zhì)與經(jīng)重組DNA技術(shù)制備的嵌段式酶促去酯化果膠接觸，其中嵌段式酶促去酯化果膠使用重組酶來制備，且其中重組酶包含SEQ.I.D.No.1或SEQ.I.D.No.2所示的任一氨基酸序列或其變異體，衍生物或同源物，包括其組合，且具有下列特征1.分子量從大約36kD到大約64kD；2.當用0.5％的酸橙果膠在0.15MNaCl中測量時最適pH為pH7-8；3.最適溫度為至少50℃；4.在從10℃到至少40℃的范圍內(nèi)具有溫度穩(wěn)定性；5.Km值為0.07％；6.在大約0.25MNaCl水平時具有最大活性；7.在大約0.2MNa2SO4水平時具有最大活性；和8.在大約0.3MNaNO3水平時具有最大活性。本發(fā)明的另一優(yōu)選的實施方案涉及以嵌段式使果膠酶促去酯化的方法，包括用包含SEQ.I.D.No.1或SEQ.I.D.No.2所示的任一氨基酸序列的重組酶或其變異體，衍生物或同源物，包括其組合處理果膠，其中重組酶具有下列特征1.分子量從大約36kD到大約64kD；2.當用0.5％的酸橙果膠在0.15MNaCl中測量時最適pH為pH7-8；3.最適溫度為至少50℃；4.在從10℃到至少40℃的范圍內(nèi)具有溫度穩(wěn)定性；5.Km值為0.07％；6.在大約0.25MNaCl水平時具有最大活性；7.在大約0.2MNa2SO4水平時具有最大活性；和8.在大約0.3MNaNO3水平時具有最大活性。本發(fā)明的另一優(yōu)選的實施方案涉及包含SEQ.I.D.No.1或SEQ.L.D.No.2所示的任一氨基酸序列的重組酶，或其變異體，衍生物或同源物，包括其組合，其中該重組酶具有下列特征1.分子量從大約36kD到大約64kD；2.當用0.5％的酸橙果膠在0.15MNaCl中測量時最適pH為pH7-8；3.最適溫度為至少50℃；4.在從10℃到至少40℃的范圍內(nèi)具有溫度穩(wěn)定性；5.Km值為0.07％；6.在大約0.25MNaCl水平時具有最大活性；7.在大約0.2MNa2SO4水平時具有最大活性；及8.在大約0.3MNaNO3水平時具有最大活性。本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案涉及上述優(yōu)選的過程，方法和重組酶，其中，以包含SEQ.I.D.No.3或SEQ.I.D.No.4所示序列的核苷酸序列或其變異體，衍生物或同源物表達重組酶。下列樣品按照布達佩斯條約于1995年7月6日保存在認可的保藏單位；國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)23St.MacharDrive，Aberdeen，蘇格蘭，AB21RY，英國NCIMB40749(它相應(yīng)于質(zhì)粒pO34)。下列樣品按照布達佩斯條約于7月12日保存于認可的保藏單位國立工業(yè)和海洋微生物有限公司(NCIMB)23St.MacharDrive，Aberdeen，蘇格蘭，AB21RY，英國NCIMB40750(它相應(yīng)于質(zhì)粒pO17)。因此，本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案涉及上述過程，方法和重組酶，其中重組酶能由NCIMB40749或NCIMB40750表達。本發(fā)明還提供了包含SEQ.I.D.No.5所示序列的氨基酸序列或其變異體，衍生物或同源物，它適用于賦予蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性或增加其熱穩(wěn)定性。另外，本發(fā)明提供了包含SEQ.I.D.No.6所示序列的核苷酸序列或其變異體，衍生物或同源物，它適用于表達賦予蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性或增加其熱穩(wěn)定性的氨基酸序列。至于最后一個方面，同樣可應(yīng)用上面關(guān)于變異體，衍生物，同源物，構(gòu)建體，載體，宿主生物的轉(zhuǎn)化的描述，盡管在這種情況下氨基酸序列和核苷酸序列肯定會影響該蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。在該方面，據(jù)信SEQ.I.D.No.5所示氨基酸序列能賦予一種蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性或增加其熱穩(wěn)定性，如對本發(fā)明的重組PME，該氨基酸序列也可向其它蛋白質(zhì)，包括其它來源的PME增加或賦予熱穩(wěn)定性?，F(xiàn)在將以實施例的方式描述本發(fā)明，其中下列附圖作為參考圖1.柑桔水果如橙子的示意圖；圖2.本發(fā)明的重組酶的SDSPAGE凝膠；圖3.測定最適pH的曲線圖；圖4.測定最適溫度的曲線圖；圖5.測定溫度穩(wěn)定性的曲線圖；圖6.測定Km值的曲線圖；圖7.在NaCl存在或不存在時測定活性的曲線圖；圖8.在Na2SO4存在或不存在時測定活性的曲線圖；圖9.在NaNO3存在或不存在時測定活性的曲線圖；圖10.pO17的質(zhì)粒圖譜；圖11.pO34的質(zhì)粒圖譜；圖12.兩個基因的示意圖；圖13.pJK10的質(zhì)粒圖譜；圖14.pJK11的質(zhì)粒圖譜；圖15.pJK12的質(zhì)粒圖譜；圖16.pJK20的質(zhì)粒圖譜；圖17.pJK21的質(zhì)粒圖譜；和圖18.pJK22的質(zhì)粒圖譜。圖1在上面的描述中提及，其它附圖在下面的描述中討論。實驗部分用于生物化學法的材料和方法植物材料無種子的Nanelina品種I型的未成熟的西班牙橙子用于分離PME。將橙子手工剝皮并將果皮貯存于-80℃。從橙皮中提取PME根據(jù)下列方法純化PME。所有操作在4℃進行。融化600g冷凍的橙皮并切成小塊。然后將它們在Warring搗碎器中用1200ml緩沖液(100mM琥珀酸鈉pH6.2，1mMDTT)勻漿2分鐘。向勻漿物中加入36g固體NaCl達到3％(w/v)的終濃度以便分離膜結(jié)合蛋白(Versteeg等，(1978)，Lebensmittel，-Wiss.U.技術(shù)，11267-274)。在4℃輕輕攪拌保溫2小時后將懸液通過尼龍網(wǎng)過濾，濾液以10,000rpm離心20分鐘以去掉不溶性殘渣。然后使用(NH4)2SO4沉淀分離上清。首先用30％(NH4)2SO4且緩慢攪拌30分鐘沉淀上清。以20,000rpm離心10分鐘后，用60％(NH4)2SO4進一步沉淀上清30分鐘。如前所述離心懸液且沉淀重懸于50ml50mMMES，1mMDTTpH6.8中并用相同的緩沖液透析過夜。色譜經(jīng)陽離子交換色譜進一步分離透析樣品。對40-50ml樣品過兩輪CM-SepharoseTMCL-6B(1.5×15cm)柱，在兩輪間用緩沖液A50mMMES，1mMDTTpH6.8洗滌30分鐘。用緩沖液A洗下未結(jié)合的蛋白質(zhì)后，用總共500ml0-0.4MNaCl的NaCl梯度洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。流速為25ml/h，收集8.33ml的餾分。在280nm下測量蛋白質(zhì)的吸光情況。分析所有餾分的PME活性和蛋白質(zhì)。用BioRad方法以分光光度術(shù)測蛋白質(zhì)的含量。合并含PME活性的餾分并使用Amicon濾器系統(tǒng)經(jīng)加壓透析濃縮。在相同的系統(tǒng)中將緩沖液交換成50mMTris，1mMDTT，0.1MNaClpH7。然后將9ml濃縮的PME樣品過SephaerylTMS-200(2.6×70cm)凝膠過濾柱。用50mMTris，1mMDTT，0.1MNaClpH7平衡柱。流速為40ml/h，收集5.33ml的餾分。合并含PME活性的餾分并濃縮。酶活性PME催化從果膠上裂解甲基酯基。在純化步驟過程中使用甲基紅指示劑試驗以快速方法檢測PME。由于從果膠鏈的半乳糖醛酸殘基上裂解甲基基團，因此在試驗中形成羧基且pH下降。pH指示劑(甲基紅)在pH下降時顏色從黃色(pH6.2)到變?yōu)樘壹t(pH4.2)。該試驗含1ml在0.15MNaClpH7中溶解的0.5％GrindstedTM果膠1450(DE70％)(由DaniscoIngredients，DaniscoA/S提供)和125μl樣品。在30℃保溫10分鐘后甲基紅試驗陽性的樣品然后以滴定方法(Versteeg等(1978)Lebensmittel.-Wiss.U.技術(shù)，11267-274)進一步測定。至于滴定方法，該試驗含10ml溶于0.15MNaClpH6.8中的0.5％酸橙果膠(GrindstedTM果膠1450(由DaniscoIngredients，DaniscoA/S提供)和10-100μl樣品。用0.02MNaOH進行滴定并在室溫下測量反應(yīng)。使用自動滴定儀(Versteeg等(1978)Lebensmittel.-Wiss.U.技術(shù)，11267-274)。SDS-PAGE/Western印跡使用具有10-15％SDS-梯度凝膠的PharmaciaPhastSystemTM經(jīng)SDS-PAGE檢查PME餾分的純度。按Pharmacia的手冊所述進行蛋白質(zhì)的電泳和銀染。為了測定pI，使用IEF3-9PhastSystemTM凝膠。免疫凝膠電泳用于鑒定抗橙皮PME的多克隆抗體。在SDS-PAGE上分離酶餾分并以PhastSystemTM的半干轉(zhuǎn)移單位的半干印跡技術(shù)轉(zhuǎn)移到NC-紙上。用1∶50稀釋的第一抗體溫育NC-紙并用偶聯(lián)到堿性磷酸酶(DakoA/SGlsotrup，Denmark)上的以1∶1000稀釋的第二抗體染色。肽圖譜用胰蛋白酶或來自產(chǎn)酶溶桿菌的內(nèi)切蛋白酶Lys-C消化PME(兩種酶制品均是測序級，購自BoerhingerMannheim，德國)。用碘乙酰胺對100μg純化的PME進行羧甲基化以保護還原的SH基團。然后用胰蛋白酶(4μg/20-100μl)裂解該蛋白質(zhì)。在40℃下水解2×3小時。加入20μlTFA終止反應(yīng)。在15,000rpm下離心5分鐘后，在反相HPLC柱(Vydac10C18柱)上純化該肽。對2×500μl樣品進行處理。60分鐘內(nèi)用在0.1％TFA中0.05-0.35％遞增的乙腈梯度洗脫并分離肽。在Eppendorf管中手工收集該肽。為了用內(nèi)切蛋白酶Lys-C消化，冷凍干燥的PME(0.1mg)溶于50μl8M尿素，0.4MNH4HCO3，pH8.4中。用N2覆蓋并加入5μl45mMDTT后，變性蛋白質(zhì)并在N2中50℃下還原15分鐘。冷卻到室溫后，加入5μl100mM碘乙酰胺使半胱氨酸在N2中暗處及室溫下衍化15分鐘。隨后，加入90μl水和溶于50μl50mMN-三(羥甲基)甲基甘氨酸和10mMEDTA，pH8.0的5μg內(nèi)切蛋白酶Lys-C且在N2中37℃下消化24小時。按對胰蛋白酶消化的肽所述分離所得的肽。選擇的肽在Devosil3C18RP-HPLC柱0.46×10cm(NovoNordisk，丹麥)上進一步純化。然后將純化的肽上氨基酸測序儀，應(yīng)用生物系統(tǒng)476A，使用脈沖液相快速循環(huán)。研究1在PME純化期間，將600g冷凍的橙皮勻漿，用30-60％(NH4)2SO4沉淀并透析后，將樣品上陽離子交換柱(CM-SepharoseTMCL-6B)。在pH6.8時PME強烈地結(jié)合陽離子交換柱材料，而大多數(shù)蛋白質(zhì)不結(jié)合柱，因此在洗滌溶液中洗脫。隨著NaCl梯度的遞增，PME洗脫成2個峰。在0.25M的NaCl濃度下的PMEI(餾分49-53)具有主要活性。在較低NaCl濃度下洗脫出次級PME峰(餾分25-32)。只對PMEI進行進一步的純化，它含有最高活性。濃縮后，使用凝膠過濾色譜(SephacrylTMS-200柱)進一步純化PME餾分。合并含最高PME活性的餾分并在amicon濾膜透析中濃縮。從600g橙皮獲得總共大約4mgPME，相當于蛋白產(chǎn)率為12％。在純化的PME餾分中SDS-PAGE僅顯示出一條蛋白質(zhì)帶，MW為36,000D(圖2)。PME的等電聚焦顯示pI為＞9。鑒定及動力學數(shù)據(jù)PME的鑒定和最適值的測定均按材料和方法所述的滴定方法進行。用0.5％酸橙果膠(GrindstedTM果膠1450-由DaniscoIngredients，DaniscoA/S提供)在0.15MNaCl中測定PME活性的pH最適值。數(shù)據(jù)在圖3中表示。發(fā)現(xiàn)最適值為大約pH7-8。發(fā)現(xiàn)最適溫度為50℃，見圖4所示的數(shù)據(jù)。經(jīng)過將酶樣品在Eppendorf管中在不同的溫度下保溫15分鐘測定PME的熱(溫度)穩(wěn)定性。保溫后，以傳統(tǒng)試驗經(jīng)滴定方法測定酶活性。酶活性的穩(wěn)定性在10°-40℃之間，參見圖5所示的數(shù)據(jù)。以不同果膠濃度對活性的LineweaverBurk曲線圖測定對酸橙果膠(GrindstedTM果膠1450-由DaniscoIngredients，DaniscoA/S提供)的親和力。數(shù)據(jù)在圖6中顯示。從曲線計算Km為0.07％。我們還發(fā)現(xiàn)PME也能對甜菜果膠去酯化。甜菜果膠含60％半乳糖醛酸殘基，其中一些羧基被甲基化(大約DE為60％)，另外，一些半乳糖醛酸基團在C-2和/或C-3被乙?；０床牧虾头椒ㄖ兴鰷y定PME活性，但在該試驗中使用溶于0.15MNaCl中的1％甜菜果膠，因為甜菜果膠含大約60％的果膠。結(jié)果表明PME能對甜菜果膠去酯化，即使半乳糖醛酸殘基在C-2/C-3位被乙?；?。</tables>進一步的實驗表明，本發(fā)明的PME活性優(yōu)選需要NaCl-見圖7中的數(shù)據(jù)?；钚噪SNaCl濃度的遞增而增加，最適值為0.25MNaCl。與最大活性相比，更高的濃度減小活性。進一步的實驗顯示，對于PME活性，其它鹽，例如Na2SO4或NaNO3可代替NaCl。該數(shù)據(jù)在圖8和9中顯示，在0.2MNa2SO4和0.3MNaNO3時分別出現(xiàn)最適活性。N-末端分析研究顯示，天然PME的N末端序列被封閉。經(jīng)過用無水TFA在試管中45℃下處理印跡到PVDF膜上的PME4分鐘可實現(xiàn)去封閉。蒸發(fā)掉大部分TFA后，試管在65℃下放置4小時(Wellner，D等(1990)美國科學院學報，871947-1949)。獲得的序列是SSSVTPNVVVAADSSGNFK，且N-乙酰絲氨酸是PME的N-端殘基。免疫組織學定位為了制備免疫組織化學的組織樣品，將成熟水果中間部分的薄切片在用0.05M磷酸鹽緩沖液pH7緩沖的2％低聚甲醛，0.25％戊二醛和3％蔗糖中固定。25℃溫育2小時及5℃溫育63小時后，標本在0.05M磷酸鹽緩沖液pH7中洗滌3×20分鐘。使用系列乙醇洗滌(50％、70％、80％和96％)，接著以99％乙醇洗滌3次(每個乙醇濃度30分鐘)，進行脫水。用石油(ShellsolTMD70K，Q7712)再次處理2×2小時及在具有7％蜂蠟的石蠟中處理2×2小時后，將樣品包埋于石蠟中。在Supercut2050ReichartJungpyramitome中制備12.5μm的橫切片。免疫學組織切片在TBS(0.5MTris/HClpH7.6，0.15MNaCl，0.1％TritonX-100)中用20％豬血清預(yù)溫育30分鐘后用在TBS中1∶50稀釋的PME抗體處理1小時。用TBS洗滌5×5分鐘去掉多余的抗體。洗滌后切片用在TBS緩沖液中1∶20稀釋的與堿性磷酸酶偶聯(lián)的第二抗體保溫30分鐘。按上面所述用TBS洗滌去掉剩余的第二抗體。染色前，切片用佛羅那乙酸緩沖液pH9.2處理5分鐘，然后用堅牢紅和NaphtolAS-BI磷酸(SigmanoN4875)染色20分鐘。用水洗滌去掉多余的試劑。對照平行地進行且用免疫前血清處理。結(jié)果用抗果皮PME的抗體進行免疫學定位表明PME大量位于果瓣之間瓣膜外部細胞層上，果核及在果汁囊的外部細胞層上，也存在于白色層的內(nèi)部細胞層上(見圖1)。這些結(jié)果證實，抗果皮PME的抗體與果肉(果肉由果瓣組成，見圖1)的PME交叉反應(yīng)，表明分別位于果皮和果肉中的PME之間具有高度同源性。研究2從橙子果皮大量純化PME。在該方面，從5kg橙子果皮分離大約70mgPME。然后將純化的PME用于使用牛奶蛋白質(zhì)-即飲用酸牛奶的應(yīng)用試驗中。在該試驗中，嵌段式酶促去酯化果膠與非去酯化果膠相比增加了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定特征，很可能是因為形成了封閉的結(jié)構(gòu)。最終產(chǎn)物也具有較好的粘度。同工酶盡管不希望受理論的約束，據(jù)信本發(fā)明的PME可存在至少兩種同工酶。同工酶S分子量為大約36kD，可稱作“短PME”。同工酶L分子量為大約64kD，可稱作“長PME”。據(jù)信同工酶L比同工酶S具有更高的熱穩(wěn)定性。另外，據(jù)信同工酶S以嵌段式方式開始起始的去酯化步驟，然后由同工酶L代替。換句話說，據(jù)信同工酶L比同工酶S對部分去酯化果膠具有更大的親和力。據(jù)信同工酶L的熱穩(wěn)定性可能是由于SEQ.I.D.No.5所表示的氨基酸序列。進一步的研究表明，同工酶L的基因具有信號序列的N端延伸上游區(qū)。這在圖12中以圖表示。分離和鑒定可從橙子中獲得的編碼果膠甲基酯酶的cDNA分子生物學的材料和方法1.材料使用產(chǎn)自摩洛哥的橙子(甜橙)品種Navel。2.DNA按DellaportaS.L.等(1983)植物分子生物學報道1(4)19-21所述分離基因組DNA。按EP-B-0470145所述分離質(zhì)粒DNA。3.RNA從成熟的橙子中分離總RNA。按LogemannJ.，Schell.J.和WillmitzerL.(1987)。分析生物化學，16316-20“從植物組織分離RNA的改進方法”所述的方法將Navel橙子果實的果肉外部和白色層的內(nèi)部(見圖1)用于RNA分離。4.PCR用rTth反向PCR試劑盒(PerkinElmer)根據(jù)供應(yīng)商的說明以下面的溫度循環(huán)將橙子總RNA用于進行反向PCR逆轉(zhuǎn)錄70℃2分鐘60℃2分鐘50℃2分鐘45℃5分鐘40℃5分鐘30℃10分鐘42℃10分鐘70℃2.5分鐘5℃浸泡擴增(PCR)94℃2分鐘92℃1分鐘45℃2分鐘72℃2分鐘，循環(huán)40次72℃5分鐘5℃浸泡5.PCR片段的克隆按供應(yīng)商的說明將PCR片段克隆進載體pT7Blue(Novagen)的EcoRV位點。6.DNA測序基本上按Sanger等(1979)的雙脫氧方法使用自動閱讀測序試劑盒(Pharmaeia)和PharmaciaLKBA.L.F.DNA測序儀(參見Sanger，F(xiàn).，Nicklen，S.，和Coulson，A.R.(1979)。用鏈決定抑制劑進行DNA測序，美國科學院學報745463-5467)對雙鏈DNA測序。用于測序的引物在下面列出(按5′至3′提供)UNI(M13-20引物)-17MerGTAAACGACGGCCAGTREV-19MERGGAAACAGCTATGACCATG01-20MERGACAACGGCAACGAGCCTCA02-22MERGCACTTGTAATAACCCTAAAT03-20MERCAGGGTAGTTTCCCGACGTA04-20MERTACGTCGGGAAACTACCCTG05-21MERCTCCTGGAAGCTTCATTGCTG06-20MERGAAGCTTCTTGAAGAGAACG07-20MERCGTTCTCTTCAAGAAGAAGCTTC08-22MERGAGGATAGCATGATGAGGCTCG09-22MERGCAGTTCACAAAGAACTGGCGG010-22MERCCTCATGATCATCATGTCAGTG011-21MERGCTCCTCAGGGAGGCACTAAG012-21MERCAGCAATGAAGCTTCCAGGAG013-21MERCTTAGTGCCTCCCTGAGGAGC014-18MERGCCACCGCCTGGTGCTTT015-18MERAAAGCACCAGGCGGTGGC016-20MERGCGGGATGCGTTGTCAGACG017-20MERGAGGCACTAAGCGGTATATT018-18MERGCAACTGTAGCAGACTTG019-20MERCACTGACATGATGATCATGA020-20MERCAATTAAGCAGTTCACAAAG021-20MERAATATACCGCTTAGTGCCTC測序的核苷酸序列以SEQ.I.D.No.3(來自pO17)和SEQ.I.D.No.4(來自pO34)表示。N-端序列以SEQ.I.D.No.6表示。7.文庫的篩選用合適的放射性標記的PCR探針篩選從橙子果實果肉和白色層分離的mRNA所制備的λZapII(Stratagene)中的cDNA文庫。根據(jù)供應(yīng)商的說明進行篩選，但預(yù)雜交和雜交在2×SSC，0.1％SDS，10×Denhardt's和100μg/ml變性鮭精DNA中進行。在67℃雜交過夜。濾膜在2×SSC，0.1％SDS中洗滌2次，在1×SSC，0.1％SDS中洗滌2次，在0.1×SSC，0.1％SDS中洗滌2次。8.探針經(jīng)過用合適的限制性酶消化以pT7blue載體中分離克隆的PCR片段。以瓊脂糖凝膠電泳從載體中分離片段，純化片段，并使用ReadytoGOTMDNA標記試劑盒(Pharmacia)進行放射性標記。9.Southern分析用合適的限制性酶消化基因組橙子DNA或質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)移到HybondN+TM膜上并按供應(yīng)商(Amersham)的說明進行雜交。10.原位雜交實驗原位雜交技術(shù)以反義核糖核苷酸序列與mRNA的雜交原理為基礎(chǔ)。該技術(shù)用于觀察存在所說mRNA的顯微切片區(qū)域。在該具體情況下，該技術(shù)用于定位甜橙切片中的編碼果膠甲基酯酶的mRNA。用于原位雜交的組織樣品的制備用FAA固定液(45％乙醇，5％福爾馬林(40％多聚甲醛)和5％乙酸)對成熟橙子水果的中部的薄切片進行固定并在25℃保溫2小時，在5℃保溫63小時。將這些樣品在0.05M磷酸緩沖液pH7中洗滌3×20分鐘。使用系列乙醇洗滌(50％，70％，80％，96％)及最后在99％乙醇中洗滌3次進行脫水。每次洗滌30分鐘。然后將樣品用石油(ShellsolTMD70K，Q7712)處理2×2小時，在含7％蜂蠟的石蠟中再處理2×2小時。然后將樣品包埋于石蠟中。使用Supercut2050ReichartJungpyramitome制備12.5μm的橫切片。用于原位雜交的35S標記探針的制備將來自第二次PCR擴增的501bpPCR片段以兩個方向克隆進pT7blue載體(Novagen)中。pT7載體含T7啟動子。用BamHI消化質(zhì)粒后以SP7啟動子啟動反義RNA和有義RNA的轉(zhuǎn)錄。按下面的改進使用Maxiscript.KitTM(Ambion)。轉(zhuǎn)錄子走6％測序凝膠以去掉摻入的核苷酸并用與T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion)一起提供的洗脫緩沖液洗脫。轉(zhuǎn)錄子在一端含55個非編碼核苷酸，在另一端也含9個非編碼核苷酸。為進行雜交，使用107cpm/ml的35S標記探針?；旧习碙angedaleJ.A.(1994)在theMaizeHandbook.M.Freeling和V.Walbot編輯，pp.165-180Springer-Verlag，NewYork，Inc所述進行原位雜交。發(fā)現(xiàn)雜交溫度在57℃為最適。在57℃洗滌后，用KodakK-5照相乳膠覆蓋切片并在黑暗中5℃放置3天。11.結(jié)果下列序列信息用于產(chǎn)生用于下面提及的PCR反應(yīng)的引物及檢查由各核苷酸序列(見所附的SEQ.I.D.No.s7-19)產(chǎn)生的氨基酸序列。用于產(chǎn)生引物的果膠甲基酯酶的肽序列AsnCysAspMetLeuAlaTyrGlnAspThrLeuTyr(PE492B)ValILeThrSerAlaThrGluAlaGlnAlaPheThrProGlySerPheIleAlaGlySerSerTrpLeuGlySerThrGlyPhe(PE70I)用于產(chǎn)生引物A的氨基酸序列(PE492B，4-7)(MetLeuAlaTyrGlnAspThr)引物AATG(CT)T(GATC)GC(GATC)TA(TC)CA(AG)GA(TC)AC256mix用于產(chǎn)生引物B(GluAlaGlnAlaPheThrPro)的氨基酸序列(PE701，7-13)引物BGT(AG)AA(GATC)GC(TC)TG(GATC)GC(TC)TC128mix(該序列相應(yīng)于互補鏈)產(chǎn)生部分編碼果膠甲基酯酶的PCRDNA片段兩個非重疊肽的氨基酸序列(上述)用于產(chǎn)生混合的寡核苷酸。它們用作反轉(zhuǎn)錄及隨后的總RNA擴增(PCR)的引物。測序所得的PCR克隆發(fā)現(xiàn)其具有501bp的插入片段。從核苷酸序列推斷的氨基酸序列幾乎完全相應(yīng)于SEQ.I.D.No.s7-19給出的肽序列。原位雜交分析用針對果膠甲基酯酶mRNA的核糖探針(從合適的PCR克隆產(chǎn)生)進行的原位雜交實驗(見材料和方法)顯示出在果瓣向瓣膜的外部細胞層中(見圖1)的強烈雜交。從果汁囊的外部細胞層，白色層的內(nèi)部細胞層和果核也獲得了強烈的信號。這些結(jié)果與用按前面所述抗果皮PME的抗體所見的免疫學定位結(jié)果非常吻合。Southern分析Southern分析表明在甜橙基因組中存在分離的PME基因的其它拷貝(由cDNA克隆代表)。這些其它的PME基因與在pO17和pO34中代表的基因相當同源。在這一方面，我們在每條泳道中觀察到一條強雜交信號帶，2條中等雜交信號帶及至少超過2條的與其余相比更弱的信號帶。這一帶型表明甜橙在基因組中具有至少5到7個拷貝的PME基因。新PMEcDNA的分離和鑒定用來自PCR克隆的放射性標記的501bp插入片段篩選按材料和方法中所述制備的λZapII(Stratagene)中的cDNA文庫。鑒定了一些雜交克隆，根據(jù)供應(yīng)商的說明體內(nèi)切除質(zhì)粒DNA。經(jīng)過用EcoRV和SmaI消化并接著進行瓊脂糖凝膠電泳測定克隆中的cDNA插入片段的大小。一個克隆pO34具有大約2kb的插入片段，而另一克隆pO17具有大約1.4kb的插入片段。選擇這些克隆用于進一步的分析。測定核苷酸序列并且pO17和pO34的核苷酸序列分別如SEQ.I.D.No.3和SEQ.I.D.No.4所示。起始于核苷酸29且終止于核苷酸1780的O34中的開放閱讀框編碼包括推斷的信號肽的584個氨基酸的PME。在位置46的甘氨酸和位置47的異亮氨酸之間的可能的裂解位點可根據(jù)VonHeijne，G.(1986)核酸研究14，4683-4690“推測信號序列裂解位點的新方法”的規(guī)則推測，從而產(chǎn)生具有計算的分子量為58386道爾頓的538個氨基酸長的成熟PME酶。包括信號序列的長PME的分子量可計算為63502道樂頓。pO34核苷酸序列包括29個核苷酸的非翻譯5′區(qū)和186個核苷酸的非翻譯3′區(qū)，末端為polyA尾。O17中的開放閱讀框以核苷酸18開始且以核苷酸1103終止。它編碼包括44個氨基酸的信號肽的362個氨基酸的短PME?？深A(yù)測推斷的裂解位點在44位的谷氨酰胺和45位的絲氨酸之間，剩下的成熟短PME以氨基酸序列Ser-Ser-Ser-Val-Thr-Pro開始。這一N端氨基酸序列與生化部分所述的PME的純化短類型的N-端氨基酸序列相同。將從純化酶獲得的氨基酸序列與推斷的pO17成熟氨基酸序列進行了序列對比。發(fā)現(xiàn)肽片段完全相同。所有測序的肽和推斷的pO17氨基酸序列及推斷的pO34(長PME)氨基酸序列具有幾乎完全相同。在這一方面，pO17在一個氨基酸位置有區(qū)別(編碼成熟多肽的序列中第24號)。成熟短PME蛋白質(zhì)具有計算的33954道爾頓的分子量。包含信號肽的短PME形式計算的分子量是39088道爾頓。O17包括17個核苷酸的5′非翻譯區(qū)和180個核苷酸的3′非翻譯區(qū)，以polyA尾結(jié)尾。長的和短的PME酶的主要區(qū)別是來自O(shè)34、SEQ.I.D.No.5所示的成熟酶中存在的220個氨基酸的N-端延伸。編碼長PME酶該區(qū)域的相應(yīng)核苷酸序列如SEQ.I.D.No.6所示。PME在微生物中的表達將編碼長或短形式的橙子PME的DNA序列導(dǎo)入微生物中以產(chǎn)生大量具有高比活的重組酶，以便用于酶促處理果膠。在巴斯德畢赤氏酵母中的表達pJK10，pJK11和pJK12的構(gòu)建(見圖13-15)pO34質(zhì)粒DNA模板DNA，使用下面引物對進行PCR反應(yīng)5′-GAATTCATTGTCGCCGGAGTGAAC-3′，在一端具有EcoRI位點，和5′-AAGACCAGAGACCTATGGATCCAC-3′，在近末端具有BamHI位點。在下面的緩沖液中混合AmpliTaqRDNA聚合酶(PerkinElmer)、模板DNA，dATP，dGTP，dCTP和dTTP以及兩種引物60mMTris-HCl(pH8.5)，15mM(NH4)2SO4和1.5mMMgCl2，使用下列溫度循環(huán)94℃2分鐘94℃1分鐘55℃2分鐘72℃2分鐘，循環(huán)35次72℃7分鐘5℃浸泡產(chǎn)生1690bp的預(yù)期的PCR產(chǎn)物，將它純化并按供應(yīng)商的說明亞克隆進載體pT7Blue(來自Novagen)。含預(yù)期大小的EcoRIBamHI片段的所得克隆(稱為pT7-O34)經(jīng)DNA測序進一步證實(見分子生物學的材料和方法)。含正確序列的pT7-O34亞克隆用EcoRI和BamHI消化，純化1685bp的片段并亞克隆進用相同酶消化的巴斯德畢赤氏酵母載體pHIL-S1(來自InVitrogen)；編碼PME成熟長形式的序列以這種方式克隆在載體的具有PHO1分泌信號(S)的讀框中。所得的質(zhì)粒是所謂的pJK10且在圖13中示出。為了產(chǎn)生pJK11(見圖14)，將pT7-O34克隆的EcoRI-BamHI片段進一步亞克隆進用相同酶消化的pBSK-載體(來自Stratagene)中。然后，來自一個所得克隆(經(jīng)DNA測序證實)的EcoRI-NotI片段亞克隆進用相同酶消化的巴斯德畢赤氏酵母表達載體pPIC9(來自Invitrogen)中。這樣在pPIC9中。插入了編碼PME長形式成熟蛋白的閱讀框，它在α-因子分泌信號(S)的下游且符合讀框地與其相連，見圖14。另外，來自pT7-O34的EcoRI-NotI片段也亞克隆進pPIC9K(Invitrogen)載體中產(chǎn)生圖15所示的pJK12質(zhì)粒。pJK11和pJK12間的唯一區(qū)別是編碼卡那霉素抗性的基因，該基因位于pJK12中。pJK10中的PHOl分泌信號和pJK11和pJK12中的α泌信號均能指導(dǎo)編碼PME長形式的成熟多肽的分泌。pJK20，pJK21和pJK22的構(gòu)建pO17質(zhì)粒DNA在使用下列引物的PCR反應(yīng)中用作模板DNA5′-GAATTCTCCTCGTCGGTGACACCG-3′，在一端具有EcoRI位點，和5＇-AAGACCAGAGACCTATGGATCCAC-3′在近末端具有BamHI位點。將模板DNA，AmpliTaqR聚合酶，dATP，dGTP，dCTP和dTTP與緩沖液(60mMTris-HCl，pH8.5；15mM(NH4)2SO4和1.5mMMgCl2)混合且放入具有下列溫度循環(huán)的thermoblok中94℃2分鐘94℃1分鐘55℃2分鐘72℃2分鐘，循環(huán)35次72℃7分鐘5℃浸泡由此產(chǎn)生1008bp的預(yù)期的PCR帶，將它純化并亞克隆進pT7Blue(Novagen)中。所得的克隆經(jīng)上面所述的DNA測序證實。用EcoRI和BamHI消化具有正確序列的質(zhì)粒且將所得的片段進一步亞克隆進pHIL-S1載體(Invitrogen)，所得的質(zhì)粒稱為pJK20(在圖16中顯示)，且其中具有位于閱讀框內(nèi)的編碼PME短形式的成熟多肽的區(qū)域且在PHO1分泌信號的下游。與pJK11和pJK12所述相同的方式構(gòu)建質(zhì)粒pJK21和pJK22，但EcoRI-NotI片段從pBSK-O17克隆獲得。圖17和18顯示了所得的質(zhì)粒，其中編碼成熟多肽的區(qū)域位于閱讀框中分別在pPIC9和pPIC9K中的α分泌信號的下游。經(jīng)原生質(zhì)球形成和轉(zhuǎn)化將長或短形式的PME導(dǎo)入巴斯德畢赤氏酵母中在不同的實驗中將質(zhì)粒pJK10，pJK11，pJK12，pJK20，pJK21和pJK22導(dǎo)入巴斯德畢赤氏酵母GS115細胞中。在這一方面，從在28-30℃生長于酵母提取物胨葡萄糖培養(yǎng)基(VPD)的GS115細胞制備原生質(zhì)球。原生質(zhì)球的制備和轉(zhuǎn)化程序按在半赤氏酵母表達試劑盒說明書(Invitrogen)中所述進行。經(jīng)過使用在生化材料和方法中所述的方法分析上清中的PME活性分析所得的巴斯德畢赤氏酵母Mut+或Muts轉(zhuǎn)化子的重組PME基因表達。篩選高效表達PME的長或短形式的轉(zhuǎn)化子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(如在Invitrogen畢赤氏酵母表達試劑盒說明書中說明的基礎(chǔ)葡萄糖培養(yǎng)基或基礎(chǔ)甘油培養(yǎng)基)中進一步培養(yǎng)推斷的陽性轉(zhuǎn)化子，分離基因組DNA并按說明書所述經(jīng)PCR進行分析。選擇在初次篩選中發(fā)現(xiàn)的陽性克隆，它也產(chǎn)生預(yù)期大小的PCR帶，按畢赤氏酵母說明書所述的方法在28-30℃的培養(yǎng)瓶中使其進一步生長。篩選各構(gòu)建體(pJK10，pJK11，pJK12，pJK20，pJK21和pJK21)的至少10個經(jīng)證實的重組克隆用于分泌PME，每隔2到6小時取樣在一段時間內(nèi)測定其相對表達水平。沉淀樣品中的細胞，按生化材料和方法中所述的方法試驗上清的PME活性。按ScorerC.A.等(1994)生物/技術(shù)，vol.12，pp.181-184和LarocheY等(1994)生物/技術(shù)，vol.12，pp.1119-1124所述使用整合的卡那霉素抗性基因作為選擇基因預(yù)選用pJK12或pJK22轉(zhuǎn)化后獲得的克隆。以這種方式獲得多拷貝整合轉(zhuǎn)化子并按上面所述進一步篩選。選擇代表長或短形式的PME并且顯示出高水平表達重組蛋白的轉(zhuǎn)化子并以Western印跡分析(見生化材料和方法)進一步分析。重組PME的純化和鑒定按需要使用生化材料和方法中所述的方法從培養(yǎng)物上清中純化重組PME蛋白質(zhì)。經(jīng)過按在鑒定和動力學數(shù)據(jù)部分中所述在不同溫度下培養(yǎng)后試驗酶活性來證實長形式PME推測的高溫穩(wěn)定性。按在鑒定和動力學數(shù)據(jù)部分所述進一步鑒定純化的重組酶(長的及短的PME形式)。這些分析表明，兩種類型的pH最適值為大約7-8，發(fā)現(xiàn)短重組PME在10到40℃之間具有溫度穩(wěn)定性，對于長的重組PME高達80℃仍穩(wěn)定。在黑曲霉中的表達在另一實施方案中，用合適的限制性酶消化pO34或pO17，將本發(fā)明的PME的長或短形式的編碼序列克隆進曲霉表達載體pBAMTE1(含來自粗糙鏈孢霉的甲基色氨酸抗性啟動子)用于在黑曲霉中表達(Pall等(1993)FungalGenetNewslett，vol.40，pp.59-62)。使用裂解酶SigmaL-2773和溶細胞酶SigmaL-8012根據(jù)Daboussi等(當代遺傳學(1989)vol.15，pp.453-456)制備原生質(zhì)球。原生質(zhì)球的轉(zhuǎn)化按Buxton等(基因(1985)vol.37，pp.207-214)所述的方法進行，但涂布轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)球的方法按Punt等(酶學方法(1992)vol.216，pp.447-457)所列的方案進行，使用0.6％滲壓穩(wěn)定的頂級瓊脂糖。結(jié)果表明從黑曲霉培養(yǎng)物中可獲得純化的橙子PME活性。應(yīng)用橙子PME處理的果膠對蛋白飲料的粘度和穩(wěn)定性的影響方法用來自橙子的PME酶促處理果膠按如下方法制備一批酶促處理的果膠將125g果膠在高效攪拌的條件下溶入熱水中。加入45.3gNaCl(試劑級)并用水將體積調(diào)為4.0l。攪拌該溶液直到鹽溶解。將果膠溶液冷卻到40℃且用1NNaOH(試劑級)將pH升高到pH7.0并高效攪拌。加入合適的橙子PME樣品，繼續(xù)酶促反應(yīng)直至達到所需的酯化程度。在培養(yǎng)期間經(jīng)1NNaOH(試劑級)的自動加樣保持pH恒定于pH7，以NaOH消耗監(jiān)視酶反應(yīng)。當果膠樣品達到所需程度的去酯化時，終止NaOH加入，經(jīng)過加入2％HCl將溶液的pH降低到大約3.0。然后將果膠溶液加熱到70℃5分鐘以完全滅活酶。用1體積的異丙醇沉淀處理的果膠，用60％異丙醇洗滌并加壓到大約50％干燥狀態(tài)。然后在40℃空氣干燥酶處理的果膠產(chǎn)品，最后磨成干粉。方案果膠樣品的鈣敏感性指數(shù)(CF)的測定鈣敏感性以溶于具有57.6mg鈣1g果膠的溶液中的果膠的粘度除以完全相同量的果膠但未加鈣的溶液粘度來測量。非鈣敏感性果膠的CF值為1。將4.2g果膠樣品以高效攪拌溶于550ml熱水中。將該溶液冷卻到大約20℃并用1NHCl將pH調(diào)到1.5。用水將果膠溶液調(diào)到700ml并攪拌。分別量取145g該溶液至4個粘度杯中。向兩個杯中加入10ml水(雙倍測量)，在攪拌條件下向其它2個杯中加入10ml250mMCaCl2溶液。在高效磁力攪拌條件下將50ml乙酸緩沖液(0.5M，pH大約4.6)加入所有4個粘度杯中，從而使果膠溶液的pH上升到pH4.0以上。取出磁棒，將杯放于20℃過夜。用Brookfield粘度計在第二天測量粘度。鈣敏感性指數(shù)計算如下果膠樣品酯化程度的測定(％DE)向50ml60％異丙醇和5％HCl溶液中加入2.5g果膠樣品并攪拌10分鐘。將果膠溶液通過一個玻璃濾器過濾并用15ml60％異丙醇/5％HCl溶液洗滌6次，接著用60％異丙醇再洗滌直到濾液無氯。將濾液在80℃干燥過夜。將20.0ml0.5NNaOH和20.0ml0.5NHCl在錐形瓶中混合并加入2滴酚酞。用0.1NNaOH滴定，直至獲得永久的顏色變化。0.5NHCl應(yīng)略強于0.5NNaOH。所加的0.1NNaOH的體積記錄為V0。稱取0.5g干燥的果膠樣品(過濾物)放入錐形瓶中，用96％的乙醇濕潤該樣品。加入100ml剛煮沸并冷卻的蒸餾水，攪拌所得的溶液直至果膠完全溶解。然后加入5滴酚酞并用0.1NNaOH滴定溶液(直至顏色改變且pH為8.5)。這里使用的0.1NNaOH的量記錄為V1。加入20.0ml0.5N的NaOH并劇烈搖動瓶子，然后靜置15分鐘。加入20.0ml0.5NHCl并搖動瓶子直至桃紅色消失。然后加入3滴酚酞，用0.1NNaOH滴定所得的溶液。使用的0.1NNaOH的體積記錄為V2。酯化的程度(％DE總羧基％)計算如下%DE=V2-V0V1-(V2-V0)]]>酸牛奶的生產(chǎn)標準化的脫脂牛奶(經(jīng)過將奶粉與適當體積的水混合來制備)在90℃加熱5分鐘，然后在200kp/cm2勻漿并將牛奶冷卻到31℃。加入酸牛奶培養(yǎng)物，將牛奶發(fā)酵至大約pH4.0。將酸牛奶冷卻到大約20℃，以飽和的糖溶液(大約65％糖)加入果膠樣品并攪拌15分鐘。用乳酸將pH調(diào)至pH4.0。將酸牛奶在88℃以巴氏消毒法消毒15秒，并以150kp/cm2勻漿。然后冷卻到20℃并裝入無菌的250ml藍蓋瓶中(200ml/瓶)。終產(chǎn)物的組成為7.6％MSNF(牛奶固體含量)，9.15％糖和0.25％或0.35％果膠樣品。使固體總量為17.0％或17.10％。酸牛奶飲料的粘度測定使用具有剪切率18.5-46.0的BohlinRheometerTM(由BohlinInstruments提供)或使用具有相同剪切率的StressTechTM(RheologicaInstrumentsAB)測定酸牛奶樣品的粘度(雙重測定)。以離心試驗測定蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性在10℃，2300×g下離心20g樣品(例如，酸奶飲料)20分鐘。棄去上清，將離心管倒置30分鐘，稱重離心管，沉降％計算如下其中，Wgt＝重量，centri＝離心以樣品中的顆粒大小分布判斷蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性使用Malvern2600EasyTM大小測定儀測定酸牛奶樣品中的顆粒大小分布。以該方法用激光散射測定顆粒大小。向9ml脫氣的緩沖液(30.7％0.1M檸檬酸，19.3％0.2MNa2HPO4和50.0％水)中加入1ml酸牛奶樣品并混合。向測量杯中加入脫氣的緩沖液，逐滴加入樣品/緩沖液混合物直至獲得最佳濃度。以測量值計算平均顆粒大小。平均顆粒大小在大約3μm下的酸牛奶被認為相當穩(wěn)定，而平均顆粒大小超過大約10μm和更高的酸牛奶據(jù)認為長期貯存不穩(wěn)定。長期穩(wěn)定性的測定將樣品在4℃或環(huán)境溫度下貯存且測量乳清的分離(在瓶中樣品頂部的乳清mm數(shù))。樣品裝入250ml藍蓋瓶中(雙重測定)。每例中樣品深度為大約70mm-它相應(yīng)于每瓶200ml標記。實施例1酸奶飲料向酸奶飲料(例如酸牛奶飲料)中加入果膠的目的是為了產(chǎn)生在飲料的細菌學和感官的貨架壽命期間保持物理學上勻質(zhì)的飲料。另外，為長期貯存而對酸奶飲料的處理使飲料中的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，如果不加入果膠，會產(chǎn)生具有沙狀口感和顯示出相當快脫水收縮的飲料。果膠的處理選擇可由商業(yè)途徑獲得的高酯果膠；GrindstedTMPectinURS(UltraRapidSet果膠型)作為親代果膠，因為它具有高酯水平(％DE為82，見圖19)。在方法部分描述了用橙子PME酶處理該親代果膠。終止酶促反應(yīng)，用方法部分所述的方法研究所得的實驗果膠(稱為果膠號1944-96-2)的酯化程度。另外，為了比較兩種果膠類型，在實驗中包括了親代果膠和處理的果膠以及一種已知較好的商業(yè)飲料酸奶果膠型，GrindstedTM果膠AM453。按方法部分果膠樣品鈣敏感性指數(shù)(CF)的測定中所述測定3種選擇的果膠的相對鈣敏感性，結(jié)果在下面表中顯示。GrindstedTM果膠URS親代果膠從82％DE下降到75％DE的去酯化對這兩種果膠的鈣敏感性方面幾乎無變化(ΔCF為1，無敏感性)。經(jīng)過用橙子PME酶進一步處理親代果膠至70％DE可產(chǎn)生具有可測量的鈣敏感性的果膠，因為該果膠ΔCF為14。酸牛奶/飲用酸牛奶分析的結(jié)果按方法部分所述生產(chǎn)酸牛奶。三種果膠(GrindstedTM果膠URS，果膠1944-96-2和GrindstedTM果膠AM453)分別用于下面配方在最終產(chǎn)物中含7.6％MSNF(牛奶固形物含量)，9.15％糖和0.25％或0.35％果膠樣品，固形物總量為17.0％或17.10％。按方法部分所述在離心試驗中觀察每一種酸牛奶的沉降％，測量酸牛奶中的顆粒大小，測量其粘度及檢查長時間貯存期間可能的乳清分離來研究產(chǎn)生的各種酸奶的質(zhì)量。用3種果膠類型產(chǎn)生的酸牛奶的沉降在下表中列出。酸奶的沉降(以％)結(jié)果是1到4個各產(chǎn)品的平均值很明顯親代果膠(URS類型)具有較高的沉降％，且由此產(chǎn)生的酸牛奶經(jīng)常顯示出乳清分離且在所用的兩種果膠濃度(0.25和0.35％)下不穩(wěn)定。這并不奇怪，因為正常情況下URS果膠類型不能用于穩(wěn)定為長期貯存而加熱處理的酸牛奶類型。由上面的結(jié)果可見用果膠1944-96-2生產(chǎn)的酸牛奶在所用的兩種果膠劑量下顯示出穩(wěn)定性及較低的沉降，且在75天的貯存期后無乳清分離。相比之下，正常情況下用于酸牛奶生產(chǎn)的優(yōu)良GrindstedTM果膠AM453與預(yù)期一樣顯示出較低的沉降且產(chǎn)生無乳清分離的穩(wěn)定的酸牛奶(見上面結(jié)果)。經(jīng)過用橙子PME處理親代URS果膠，將一種不適用的果膠變成在酸牛奶中適用于作為穩(wěn)定劑，且這種處理果膠的作用與優(yōu)良的商用穩(wěn)定劑一樣好。經(jīng)顆粒大小測定(見方法部分)對產(chǎn)生的酸牛奶進行進一步的檢查，結(jié)果在下表中顯示。酸牛奶的顆粒大小(以μm)</tables>與預(yù)期一樣，用親代URS果膠產(chǎn)生的酸牛奶的平均顆粒大小(顯示了相應(yīng)于D(4.3)部分使用Malvern儀器的數(shù)值)較高。同樣該結(jié)果是一到四個產(chǎn)品的平均值。從果膠1944-96-2和GrindstedTM果膠AM453產(chǎn)生的酸牛奶的平均顆粒大小在所用的兩種果膠劑量下都較小(見上面結(jié)果)。再次表明用這些果膠類型生產(chǎn)的酸牛奶適于生產(chǎn)穩(wěn)定的酸牛奶。最后且非常重要的是，對于長期貯存的飲用酸牛奶產(chǎn)品，測定了其粘度，結(jié)果在下面表中顯示。酸牛奶的粘度(以MPa表示)</tables>由于親代URS果膠不能穩(wěn)定酸牛奶，因此與預(yù)期一樣，在兩種果膠濃度下獲得的粘度相當高。產(chǎn)生具有低沉降和低顆粒大小的穩(wěn)定酸牛奶的優(yōu)良GrindstedTM果膠AM453在0.25％果膠劑量下顯示出的粘度大約為用GrindstedTM果膠URS果膠所見粘度的一半且在0.35％果膠劑量下幾乎與URS果膠相同-盡管事實上只有AM453果膠產(chǎn)生穩(wěn)定的酸牛奶。在URS和AM453的例子中所見的更高粘度可能部分是由于所加的果膠的量，特別是在AM453果膠的例子中似乎是因為所加果膠量的增加(從0.25到0.35％)產(chǎn)生幾乎粘稠2倍的酸牛奶。在0.25％濃度時與親代URS果膠相比，用橙子PME處理的果膠1944-96-2所獲得的粘度顯著下降。這部分是由于用1944-96-2果膠穩(wěn)定了酸牛奶，但這不是唯一原因，因為在該果膠劑量下AM453酸牛奶粘度高2倍。事實上，向酸牛奶中加入0.35％1944-96-2果膠僅增加了6個單位的粘度(與0.25％劑量相比)，而在AM453的例子中從0.25％到0.35％時粘度增加了19個單位。橙子PME處理的果膠1944-96-2可穩(wěn)定具有極低粘度的酸牛奶，盡管果膠劑量是0.25％(或0.35％)，使用其它未處理的果膠(例如GrindstedTM果膠AM453)產(chǎn)生幾乎高達兩倍的粘度。這對于酸奶飲料生產(chǎn)是一種新的且極重要的發(fā)展。經(jīng)過用橙子PME處理GrindstedTM果膠URS產(chǎn)生了一種新果膠類型，與親代果膠相反，它能穩(wěn)定酸牛奶，且最重要的是比正常使用的果膠顯示出低得多的粘度。經(jīng)過用橙子PME處理也可改進其它高酯果膠。實施例2乳清果汁飲料根據(jù)本發(fā)明修飾的果膠(制備如上)用于如下的乳清果汁飲料中混合干燥的PME修飾的果膠，檸檬酸鈉和糖，然后溶于80℃的水中。將該果膠溶液冷卻到5℃下，在5℃加入乳清。緩慢加入Grindsted調(diào)味品(由DaniscoIngredients，DaniscoA/S提供)和果汁，用檸檬酸或乳酸將樣品混合物的pH調(diào)到pH4.0。在攪拌條件下使樣品混合物老化大約30分鐘。以80℃/15秒進行巴氏消毒且在200bar(2900psi)下勻漿。樣品冷卻到20℃并無菌裝入容器中。室溫下溫育24小時，1個月和6個月后分析試驗樣品。研究分析包括粘度測量，穩(wěn)定性指標顆粒大小和長期穩(wěn)定性其方案在上面已描述。結(jié)果表明，與在對照試驗中采用的對照果膠相比，用PME修飾的果膠處理的乳清果汁飲料穩(wěn)定性及長期穩(wěn)定性提高。另外，乳清果汁飲料具有低于對照飲料的有利粘度。也分別用植物PME修飾的酸橙和檸檬果膠(即用本發(fā)明的PME修飾)處理了乳清果汁飲料。結(jié)果證實，與未修飾的果膠及對照果膠相比，PME修飾的果膠提高了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。實施例3牛奶/果汁飲料按對酸牛奶飲料所述，用PME修飾GrindstedTMURS(以DaniscoIngredients，DaniscoA/S獲得)。修飾的果膠用于牛奶/果汁飲料，它含有</tables>混合干燥的PME修飾的果膠和糖，然后溶于80℃的水中。果膠溶液冷卻到5℃下，在5℃加入牛奶。緩慢加入Grindsted調(diào)味品和果汁，用檸檬酸或乳酸將樣品混合物的pH調(diào)到pH4.0(如果需要的話)。按對乳清果汁飲料所述將樣品混合物老化、滅菌和勻漿。樣品冷卻到20℃并無菌裝入容器中。結(jié)果表明，與在對照試驗中所用的對照果膠相比，用PME修飾的果膠處理的牛奶/果汁飲料穩(wěn)定性(包括長期穩(wěn)定性)增加。另外，牛奶/果汁飲料具有低于對照飲料的有利的粘度。還觀察到了功能性的改進。還可用以本發(fā)明的PME修飾的酸橙和檸檬果膠處理牛奶/果汁飲料。實施例4乳清穩(wěn)定性在pH4.0試驗了酶促修飾的果膠，用KOH/HCl將所得的果膠溶液的pH調(diào)到pH4.0。果膠濃度調(diào)到1.0％。以0.1％-0.25％的濃度試驗了果膠。混合果膠，Jenness緩沖液(見下面)和乳清溶液(見下面)并在96℃加熱25分鐘。冷卻到室溫后，在500nm處測吸光率。干燥混合的Jenness緩沖液干粉Jenness(在Jenness，R和Koops，J.模擬牛奶超濾物的鹽溶液的制備和特征，NederlandsMelk-enZuiveltijdschrift.vol.16，nr.3，pp.153-164，1962)15.80gKH2PO45.08gK3·檸檬酸17.91gNa3·檸檬酸·2·H2O1.80gK2SO413.20gCaCl2·2·H2O5.02gMg3·檸檬酸·H2O3.00gK2CO310.78gKCl緩沖溶液pH4.0的7.5900g/l干粉Jenness的水溶液。乳清溶液冷凍干燥乳清蛋白濃縮物并研磨。在pH4.0的Jenness緩沖液中制備0.40％w/w乳清蛋白的溶液。果膠溶液制備pH4.0的1％w/w果膠水溶液?；旌衔餄舛劝聪卤硭净旌瞎z，Jenness緩沖液和乳清溶液。混合物在96℃加熱25分鐘，冷卻到室溫后，在分光光度計上在500nm處測樣品。結(jié)果結(jié)果在下表中顯示。引用的500nm處的吸光值是取兩次測量的平均值。為了比較不同類型的果膠及根據(jù)本發(fā)明的酶促修飾的果膠，將未修飾的果膠GrindstedTM果膠3450(由DaniscoIngredients，DaniscoA/S提供)的指數(shù)設(shè)定為100。指數(shù)＞100表示比使用樣品3450具有更差的蛋白穩(wěn)定性。指數(shù)為100表示與樣品3450具有相似的穩(wěn)定性。指數(shù)＜100表示比使用樣品3450具有更好的蛋白穩(wěn)定性。指數(shù)為95或＜95表示具有極好的蛋白穩(wěn)定性。從該結(jié)果可見，與對照GrindstedTM果膠3450和未修飾的GrindstedTM果膠URS果膠相比，根據(jù)本發(fā)明的修飾的GrindstedTM果膠URS果膠表現(xiàn)出有利的特性且在有些情況中對于增加穩(wěn)定性表現(xiàn)出極好的特性。實施例5具有長貨架壽命，低pH的Laban飲料Laban飲料是pH值低于4.2的酸化牛奶飲料。Laban飲料由與果膠溶液混合的laban基質(zhì)組成。Laban基質(zhì)的配方為</tables>標準化的全牛奶(無水牛奶脂肪和脫脂奶粉)在75-80℃及200bar(2900psi)壓力下勻漿，接著在90-95℃巴氏消毒5-10分鐘。培養(yǎng)至pH約4.0后，用檸檬酸或乳酸將pH調(diào)到3.8-4.2。然后加入果膠溶液。攪拌混合物直到形成勻質(zhì)混合物。在90-95℃巴氏消毒10-15秒并進一步在150-200bar下勻漿。冷卻到20-25℃后，將產(chǎn)物無菌裝入容器。幾天后，不穩(wěn)定的Laban飲料常表現(xiàn)出脫水收縮。然而，加入根據(jù)本發(fā)明的酶促修飾的果膠防止了脫水收縮并改進了粘度。另外，該產(chǎn)品具有顯著的酸牛奶口味和長貨架壽命。實施例6橙汁(富含蛋白質(zhì))橙汁飲料是一種含2％DANPROLACT40TM(CentralSoya.AarhusA/S)，6％糖，10％橙子濃縮物，0.4％檸檬濃縮物，0.2％果膠和81.4％水的酸化飲料(pH大約為4)。該產(chǎn)品是富含大豆蛋白的橙汁飲料。將該產(chǎn)品巴氏消毒并勻漿。冷卻到20-25℃后，將該產(chǎn)品無菌裝入容器中，并可在室溫下貯存大約6個月。在橙汁飲料(富含蛋白質(zhì))中加入根據(jù)本發(fā)明的酶促修飾的果膠顯示出有利的特征(如長期穩(wěn)定性)，且它具有較好的口感。實施例7抗體生產(chǎn)根據(jù)NHarboe和AIngild(“免疫，免疫球蛋白的分離，抗體滴度的估計”，在定量免疫電泳手冊，方法和應(yīng)用，NHAxelsen等(編輯)，Universitetsforlaget，Oslo，1973)及T.G.Cooper(“生化工具”，JohnWiley和Sons，NewYork，1977)所述的方法經(jīng)過用純化酶注射兔并從抗血清中分離免疫球蛋白來產(chǎn)生抗本發(fā)明的酶的抗體。本發(fā)明的其它修飾對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言在不偏離本發(fā)明范圍的條件下將是顯而易見的。在下面幾頁中提供了許多序列表，它們從SEQ.I.D.No.l到SEQ.I.D.No.19連續(xù)編號，表示核苷酸序列和氨基酸序列。序列表SEQ.I.D.NO.1MIKNMTDTDMMIMRTSNNRKLIEETSTVDGWPAWLSTGDRRLLQSSSVTP50NVVVAADGSGNFKTVAAAVAAAPQGGTKRYIIRIKAGVYRENVEVTKKHK100NIMFIGDGRTRTIITGSRNVVDGSTTFKSATVAVVGEGFLARDITFQNTA150GPSKHQAVALRVGADLSAFYNCDMLAYQDTLYVESNRQFFVNCLIAGTVD200FIFGNAAAVLQNCDIRARKPNSGQKNMBTAQGRADPNQNTGIVIQKSRIG250ATSDLKPVQGSFPTYLGRPWKEYSRTVIMQSSITDVIHPAGWHEWDGNFA300LNTLFYGEHQNAGAGAGTSGRVKWKGFRVITSATEAQAFTPGSFIAGSSW350LGSTGFPFSLGL362SEQ.I.D.NO.2MTRIKEFFTKLSESSTNQNISNIPKKKKKLFLALFATLLVVAAVIGIVAG50VNSRKNSGDNGNEPHAHILKSSCSSTRYPDLCFSAIAAVPEASKKVTSQK100DVIEMSLNITTTAVEHNYFGIQKLLKRTNTTKREKVALHDCLETIDETLD150ELHKAVEDLEEYPNKKSLSQHADDLKTLMSAAMTNQGTCLDGFSHDDANK200HVRDALSDGQVHVEKNCSNALAMIKNMTDTDMMIMRTSNMRKLIEETSTV250DGWPAWLSTGDRRLLQSSSVTPNVVVAADGSGNFKTVAASVAAAPQGGTK300RYIIRIKAGVYRENVEVTKKHKNIMFIGDGRTRTIITGSRNVVDGSTTFK350SATVAVVGEGFLAPDITFQNTAGPSKHQAVALRVGADLSAFYNCDMLAYQ400DTLYVHSNRQFFVNCLIAGTVDFIFGNAAAVLQNCDIHARKPNSGQKNMV450TAQGPADPNQNTGIVIQKSRIGATSDLKPVQGSFPTYLGRPWKEYSRTVI500MQSSITDVIHPAGWHEWDGNFALNTLFYGEHQNAGAGAGTSGRVKWKGFR550VITSATEAQAFTPGSFIAGSSWLGSTGFPFSLGL584SEQ.I.D.NO.3GTAGCAATGCGCTTGCTATGATCAAGAACATGACTGACACTGACATGATG50ATCATGAGGACTTCAAACAACAGGAAGCTGATAGAGGAGACCAGTACGGT100TGATGGGTGGCCGGCGTGGCTGTCCACCGGAGACAGGAGGCTGTTGCAGT150CCTCGTCGGTCACACCGAACGTGGTGGTGGCAGCAGATGGCAGCGGAAAC200TTTAAGACGGTGGCGGCAGCGGTGGCGGCGGCTCCTCAGGGAGGCACTAA250GCGGTATATTATTAGGATTAAAGCCGGTGTTTATCGGGAAAATGTTGAGG300TGACAAAGAAGCATAAAAATATAATGTTCATCGGTGACGGGAGGACTAGA350ACTATCATCACAGGAAGTAGAAATGTGGTTGATGGAAGCACAACTTTCAA400GTCTGCTACAGTTGCTGTTGTTGGTGAAGGATTCTTGGCCCGAGACATTA450CATTCCAAAACACAGCCGGCCCCTCAAAGCACCAGGCGGTGGCACTACGA500GTGGGAGCTGACCTTTCAGCATTTTACAATTGCGATATGTTAGCTTACCA550AGACACACTCTACGTCCACTCGAACCGCCAGTTCTTTGTGAACTGCTTAA600TTGCTGGCACGGTTGATTTTATTTTTGGTAACGCTGCAGCCGTGTTACAA650AATTGTGACATCCATGCACGAAAGCCCAATTCCGGCCAAAAAAATATGGT700CACAGCCCAAGGCAGGGCTGACCCTAACCAAAACACCGGCATTGTCATTC750AAAAATCTAGGATTGGTGCCACCTCCGATTTAAAACCGGTTCAGGGTAGT800TTCCCGACGTACCTCGGCAGGCCCTGGAAGGAGTACTCGAGGACGGTGAT850CATGCAGTCATCGATTACTGACGTGATCCACCCTGCCGGGTGGCACGAGT900GGGATGGTAACTTCGCGTTGAACACATTGTTTTACGGAGAGCATCAGAAC950GCCGGAGCCGGTGCCGGAACTTCAGGGAGAGTGAAATGGAAGGGATTTAG1000GGTTATTACAAGTGCTACCGAGGCTCAAGCTTTTACTCCTGGAAGCTTCA1050TTGCTGGTAGTAGCTGGCTGGGCTCCACTGGTTTCCCATTCTCCCTTGGT1100TTGTAATATTCACTAGGAGTTTTAATTAATATGTTTTGTATTAGTGGATC1150CATAGGTCTCTGGTCTTTCAATTTGTAATATTTGATTGAGCGTGTCTTAT1200TCGTGGCTTCGATTTCACAAATACTATTGTGTGATTAACAAGAAATAAAA1250TAGCATGGGAAGAATAATAATTTCCGGCTTCTTTAAAAAAAAAAAAAAAA1300AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA1323SEQ.I.D.NO.4CTTTTGTTCTCTCTTATCGAGAAAAAAAATGACCCGCATAAAAGAATTCT50TCACAAAACTTTCTGAATCTTCTACCAACCAAAACATTTCCAATATTCCC100AAGAAAAAAAAGAAACTATTCTTAGCTCTTTTTGCAACGCTACTCGTTGT150CGCTGCCGTAATCGGCATTGTCGCCGGAGTGAACTCAAGAAAAAACTCCG200GCGACAACGGCAACGAGCCTCATCATGCTATCCTCAAATCATCATGTAGC250AGCACAAGGTACCCGGACTTATGCTTTTCGGCTATTGCTGCCGTTCCAGA300GGCCTCCAAAAAGGTGACAAGCCAAAAGGACGTTATTGAGATGTCCTTAA350ACATCACAACAACAGCCGTGGAACACAACTACTTCGGGATTCAGAAGCTC400TTGAAGAGAACGAATCTCACCAAACGGGAAAAGGTTGCTCTCCATGACTG450TCTTGAGACGATCGATGAGACTCTTGATGAGTTACACAAAGCCGTCGAGG500ATCTTGAGGAGTACCCGAACAAGAAATCTTTATCACAGCATGCGGATGAT550CTCAAAACCCTAATGAGTGCCGCGATGACCAATCAGGGGACGTGTCTTGA600TGGGTTCTCTCATGATGATGCTAATAAGCACGTGCGGGATGCGTTGTCAG650ACGGCCAGGTTCATGTTGAGAAGATGTGTAGCAATGCGCTTGCTATGATC700AAGAACATGACTGACACTGACATGATGATCATGAGGACTTCAAACAACAG750GAAGCTGATAGAGGAGACCAGTACGGTTGATGGGTGGCCGGCGTGGCTGT800CCACCGGAGACAGGAGGCTGTTGCAGTCCTCGTCGGTGACACCGAACGTG850GTGGTGGCAGCAGATGGCAGCGGAAACTTTAAGACGGTGGCGGCATCGGT900GGCGGCGGCTCCTCAGGGAGGCACTAAGCGGTATATTATTAGGATTAAAG950CCGGTGTTTATCGGGAAAATGTTGAGGTGACAAAGAAGCATAAAAATATA1000ATGTTCATCGGTGACGGGAGGACTAGAACTATCATCACAGGGAGTAGAAA1050TGTGGTTGATGGAAGCACAACTTTCAAGTCTGCTACAGTTGCTGTTGTTG1100GTGAAGGATTCTTGGCCCGAGACATTACATTCCAAAACACAGCCGGCCCC1150TCAAAGCACCAGGCGGTGGCACTACGAGTGGGAGCTGACCTTTCAGCATT1200TTACAATTGCGATATGTTAGCTTACCAAGACACACTCTACGTCCACTCGA1250ACCGCCAGTTCTTTGTGAACTGCTTAATTGCTGGCACGGTTGATTTTATT1300TTTGGTAACGCTGCAGCCGTGTTACAAAATTGTGACATCCATGCACGAAA1350GCCCAATTCCGGCCAAAAAAATATGGTCACAGCCCAAGGCAGGGCTGACC1400CTAACCAAAACACCGGCATTGTCATTCAAAAATCTAGGATTGGTGCCACC1450TCCGATTTAAAACCGGTTCAGGGTAGTTTCCCGACGTACCTCGGCAGGCC1500CTGGAAGGAGTACTCGAGGACGGTGATCATGCAGTCATCGATTACTGACG1550TGATCCACCCTGCCGGGTGGCACGAGTGGGATGGTAACTTCGCGTTGAAC1600ACATTGTTTTACGGAGAGCATCAGAACGCCGGAGCCGGTGCCGGAACTTC1650AGGGAGAGTTAAATGGAAGGGATTTAGGGTTATTACAAGTGCTACCGAGG1700CTCAAGCTTTTACTCCTGGAAGCTTCATTGCTGGTAGTAGCTGGCTGGGC1750TCCACTGGTTTCCCATTCTCCCTTGGTTTGTAATATTCACTAGGAGTTTT1800AATTAATATGTTTTGTATTAGTGGATCCATAGGTCTCTGGTCTTTCAATT1850TGTAATATTTGATTGAGCGTGTCTTATTCGTGGCTTCGATTTCACAAATA1900CTATTGTGTGATTAACAAGAAATAAAATAGCATGGGAAGAATAATAATTT1950CCGGCTTCTTTAAATTAAAAAAAAA1975SEQ.I.D.NO.5IVAGVNSRKNSGDNGNEPHHAILKSSCSSTRYPDLCFSAIAAVPEASKKV50TSQKDVIEMSLNITTTAVEHNYFGIQKLLKRTNLTKREKVALHDCLETID100ETLDELHKAVEDLEEYPNKKSLSQHADDLKTLMSAAMTNQGTCLDGFSHD150DANKHVRDALSDGQVHVEKMCSNALAMIKNMTDTDMMIMRTSNNRKLIEE200TSTVDGWPAWLSTGDRRLLQ220SEQ.I.D.NO.6ATTGTCGCCGGAGTGAACTCAAGAAAAAACTCCGGCGACAACGGCAACGA50GCCTCATCATGCTATCCTCAAATCATCATGTAGCAGCACAAGGTACCCGG100ACTTATGCTTTTCGGCTATTGCTGCCGTTCCAGAGGCCTCCAAAAAGGTG150ACAAGCCAAAAGGACGTTATTGAGATGTCCTTAAACATCACAACAACAGC200CGTGGAACACAACTACTTCGGGATTCAGAAGCTCTTGAAGAGAACGAATC250TCACCAAACGGGAAAAGGTTGCTCTCCATGACTGTCTTGAGACGATCGAT300GAGACTCTTGATGAGTTACACAAAGCCGTCGAGGATCTTGAGGAGTACCC350GAACAAGAAATCTTTATCACAGCATGCGGATGATCTCAAAACCCTAATGA400GTGCCGCGATGACCAATCAGGGGACGTGTCTTGATGGGTTCTCTCATGAT450GATGCTAATAAGCACGTGCGGGATGCGTTGTCAGACGGCCAGGTTCATGT500TGAGAAGATGTGTAGCAATGCGCTTGCTATGATCAAGAACATGACTGACA550CTGACATGATGATCATGAGGACTTCAAACAACAGGAAGCTGATAGAGGAG600ACCAGTACGGTTGATGGGTGGCCGGCGTGGCTGTCCACCGGAGACAGGAG650GCTGTTGCAG660SEQ.I.D.NO.7PE511(14aa)Ser-ala-thr-val-ala-val-val-gly-glu-gly-phe-leu-ala-argSEQ.I.D.NO.8PE3252(4aa)Tyr-ila-ile-argSEQ.I.D.NO.9PE8(8aa)Asn-ile-met-phe-ile-gly-asp-glySEQ.I.D.NO.10PE21(21aa)Ile-gly-ala-thr-ser-asp-leu-lys-pro-val-gln-gly-ser-phe-pro-thr-tyr-leu-gly-arg-proSEQ.I.D.NO.11PE492D(15aa)xxx-ser-ala-thr-val-ala-val-val-gly-glu-gly-phe-leu-ala-argSEQ.I.D.NO.12PE492C(11aa)xxx-ala-tyr-pro-gly-gln-ile-thr-ser-asn-metSEQ.I.D.NO.13PE492B(12aa)Asn-cys-asp-met-leu-ala-tyr-gln-asp-thr-leu-tyrSEQ.I.D.NO.14PE492A(16aa)Val-ile-thr-ser-ala-thr-glu-ala-gln-ala-phe-thr-Pro-gly-ser-pheSEQ.I.D.NO.15PE701(28aa)Val-ile-thr-ser-ala-thr-glu-ala-gln-ala-phe-thr-pro-gly-ser-phe-ile-ala-gly-ser-ser-trp-leu-gly-ser-thr-gly-pheSEQ.I.D.NO.16PE594(13aa)Ile-ala-gly-ser-ser-trp-leu-gly-ser-thr-gly-phe-proSEQ.I.D.NO.17PE7(19aa)Asn-met-val-thr-ala-gln-gly-arg-ala-asp-pro-asn-gln-asn-thr-gly-ile-val-ileSEQ.I.D.NO.18PE251(38aa)xxx-arg-ile-gly-ala-thr-ser-asp-leu-lys-pro-val-gln-gly-ser-phe-pro-thr-tyr-leu-gly-arg-pro-(trp)-lys-glu-tyr-(sar)-arg-(thr)-val-ile-met-gln-ser-ser-ile-thrSEQ.I.D.NO.19PE201(27aa)xxx-xxx-ile-gly-ala-thr-ser-asp-leu-lys-pro-val-gln-gly-ser-phe-pro-thr-tyr-1eu-gly-arg-pro-xxx-lys-glu-tyrSEQ.I.D.NO.20PE22(21aa)Ser-arg-ile-gly-aia-thr-ser-asp-leu-lys-pro-val-gln-gly-ser-phe-pro-thr-tyr-leu-glyaa2(arg)可用val代替aa3(ile)可用met代替aa6(thr)可用Val代替權(quán)利要求1.一種包括向含有至少一種蛋白質(zhì)的酸性環(huán)境中加入嵌段式酶促去酯化果膠的方法，其中該果膠是高酯果膠。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用重組DNA技術(shù)制備嵌段式酶促去酯化果膠。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中酸性環(huán)境是水溶液，優(yōu)選其中的水溶液是飲料。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中的飲料是飲用酸奶，果汁或含有乳清蛋白的飲料。5.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項的方法，其中蛋白質(zhì)來自或可從日用品中產(chǎn)生或是一種日用品，如牛奶或奶酪。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中的蛋白質(zhì)是酪蛋白或乳清蛋白。7.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項的方法，其中酸性環(huán)境的pH為大約3.5到大約5.5，優(yōu)選其中酸性環(huán)境的pH為4到大約5.5。8.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項的方法，其中酸性環(huán)境的pH為大約4。9.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項的方法，其中以重組DNA技術(shù)制備的嵌段式酶促去酯化果膠含從大約70％到大約80％的酯基團，優(yōu)選大約76％的酯基團。10.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項的方法，其中以重組DNA技術(shù)制備的嵌段式酶促去酯化果膠根據(jù)實施例所述的方案對Ca2+離子不敏感。11.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項的方法，其中以重組DNA技術(shù)制備的嵌段式酶促去酯化果膠具有高分子量。12.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項的方法，其中用至少在基本上所有果膠鏈上使2個或更多個果膠的相鄰半乳糖醛酸殘基去酯化的重組果膠甲基酯酶處理果膠來制備以重組DNA技術(shù)制備的嵌段式酶促去酯化果膠。13.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項的方法，其中重組果膠甲基酯酶來自可從植物獲得的PME。14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中植物是水果。15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中水果是柑桔水果。16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中柑桔水果是橙子。17.根據(jù)權(quán)利要求13到16任一項的方法，其中重組果膠甲基酯酶來自可從橙子瓣膜或白色層獲得的PME。18.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項的方法，其中用含有SEQ.I.D.No.1或SEQ.I.D.No.2所示的任一氨基酸序列的重組酶或其變異體，衍生物或同源物，包括其組合處理果膠來制備嵌段式酶促去酯化果膠。19.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項的方法，其中用表達NCIMB40749或NCIMB40750所含的PME編碼序列或其變異體，衍生物或同源物，或其組合，或表達包含SEQ.I.D.No.3或SEQ.I.D.No.4所示的核苷酸序列的核苷酸序列或其變異體，衍生物或同源物，或其組合可獲得的重組酶處理果膠制備嵌段式酶促降解的果膠。20.根據(jù)權(quán)利要求12至19任一項的方法，其中在鈉離子存在下用重組果膠甲基酯酶處理果膠制備嵌段式酶促去酯化果膠。21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中在NaCl，NaNO3或Na2SO4存在的條件下用重組果膠甲基酯酶處理果膠制備嵌段式酶促去酯化果膠。22.一種以嵌段式酶促反應(yīng)使果膠去酯化的方法，包含用含有SEQ.I.D.No.1或SEQ.I.D.No.2所示的任一氨基酸序列的重組酶或其變異體，衍生物或同源物，包括其組合處理果膠。23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中用表達NCIMB40749或NCIMB40750所含的PME編碼序列或其變異體，衍生物或同源物可獲得的重組酶處理果膠來制備嵌段式酶促降解果膠。24.根據(jù)權(quán)利要求22或23的方法，其中在鈉離子存在的條件下用重組果膠甲基酯酶處理果膠來制備嵌段式酶促去酯化果膠。25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中在NaCl，NaNO3或Na2SO4存在的條件下用重組果膠甲基酯酶處理果膠來制備嵌段式酶促去酯化果膠。26.一種重組酶，包括SEQ.I.D.No.1或SEQ.I.D.No.2所示的任一項氨基酸序列或其變異體，衍生物或同源物，包括其組合。27.編碼根據(jù)權(quán)利要求26的重組酶的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包括SEQ.I.D.No.3或SEQ.I.D.No.4所示的任一序列或其變異體，衍生物或同源物。28.編碼根據(jù)權(quán)利要求26的重組酶的核苷酸序列，其中該核苷酸序列可從NCIMB40749或NCIMB40750或其變異體，衍生物或同源物獲得，或是其變異體，衍生物或同源物。29.表達或包含根據(jù)權(quán)利要求26的重組酶或根據(jù)權(quán)利要求27或28的核苷酸序列的構(gòu)建體。30.表達或包含根據(jù)權(quán)利要求29的構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求26的重組酶或根據(jù)權(quán)利要求27或28核苷酸序列的載體。31.一種構(gòu)建體的組合，包括至少一個表達或包含根據(jù)權(quán)利要求26的重組酶或根據(jù)權(quán)利要求27或28的核苷酸序列的第一構(gòu)建體和一個包括一個感興趣的基因(GOI)和一個啟動子的第二構(gòu)建體。32.表達或包含根據(jù)權(quán)利要求30的載體或根據(jù)權(quán)利要求29的構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求26的重組酶或根據(jù)權(quán)利要求27或28的核苷酸序列或根據(jù)權(quán)利要求32的構(gòu)建體的組合的細胞，組織或器官。33.表達或包含根據(jù)權(quán)利要求26到32任一項的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物。34.NCIMB40749或NCIMB40750。35.一種重組PME酶，它與抗根據(jù)權(quán)利要求26的純化的重組酶而不是西紅柿PME酶的抗體具有免疫學反應(yīng)性。36.根據(jù)權(quán)利要求26或35的重組酶在減少果膠酯基數(shù)中的應(yīng)用。37.根據(jù)權(quán)利要求26或35的重組酶在以嵌段式方式使果膠去酯化中的應(yīng)用。38.根據(jù)權(quán)利要求26或35的重組酶對影響果膠的鈣敏感性的應(yīng)用。39.根據(jù)權(quán)利要求26或3s的重組酶在使含游離羧基的果膠酯化中的應(yīng)用。40.使用根據(jù)權(quán)利要求26或35的重組酶可獲得的果膠。41.根據(jù)權(quán)利要求40的果膠在制備食品中的應(yīng)用。42.根據(jù)權(quán)利要求40的果膠在穩(wěn)定酸性環(huán)境中的蛋白質(zhì)而不對環(huán)境粘度產(chǎn)生有害影響中的應(yīng)用。43.一種酶的組合，包括根據(jù)權(quán)利要求26或35的重組酶和真菌PME或其它果膠降解酶。44.一種適用于賦予或增加蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性、包括SEQ.I.D.No.5所示的序列或其變異體，衍生物或同源物的氨基酸序列。45.一種適用于表達賦予或增加蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的氨基酸序列、包括SEQ.I.D.No.6所示的序列或其變異體，衍生物或同源物的核苷酸序列。46.編碼根據(jù)權(quán)利要求26的酶的重組核苷酸序列。47.基本上如本文所述的重組PME酶。48.使用基本上如本文所述的重組PME酶制備的果膠。全文摘要本發(fā)明描述了一種向含至少一種蛋白質(zhì)的酸性環(huán)境中加入以嵌段式方式酶促去酯化的果膠的方法,其中該果膠是高酯果膠。本發(fā)明還描述了一種重組果膠甲基酯酶。文檔編號C12N9/16GK1195970SQ96196968公開日1998年10月14日申請日期1996年7月12日優(yōu)先權(quán)日1995年7月14日發(fā)明者T·M·I·E·克里斯滕森,J·D·克雷堡,H·托爾所,H·C·布霍爾特,P·拉斯慕森,J·尼爾森申請人:丹尼斯科有限公司