專利名稱：用于位點(diǎn)特異性重組的方法和載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)特異性重組的方法以及可以用于這類方法的載體。本發(fā)明的方法和載體可以用來獲得細(xì)胞內(nèi)持續(xù)的基因表達(dá)并調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。
背景技術(shù)：
過去幾年已經(jīng)宣布，在基因治療新途徑的可用性和看來潛在地適合于用所謂“治療基因”治療的疾病數(shù)將迅速增加。一般來說，治療基因是在給定疾病或綜合癥中，更正或補(bǔ)償加下劃線蛋白缺陷的基因，或者是能夠調(diào)節(jié)下游一個(gè)特殊基因或抵消其編碼產(chǎn)物負(fù)作用的基因。此外，治療基因可以是例如在癌的基因治療中介導(dǎo)細(xì)胞殺傷的基因。采用基因治療，治療結(jié)果成功的關(guān)鍵在于治療基因的適當(dāng)表達(dá)及其在宿主中潛在的長期穩(wěn)定性。盡管通常采用的本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的各種克隆策略可以有效地控制表達(dá)，但已經(jīng)證明穩(wěn)定性(即基因在宿主細(xì)胞中的長期表達(dá))更難以捉摸。
關(guān)于獲得較長時(shí)間基因表達(dá)的一般方法，研究人員使用證明在宿主中有耐久性的載體作為治療基因轉(zhuǎn)移的一種載體。使用整合到宿主基因組的載體，使穩(wěn)定性最大，便于同時(shí)整合該載體攜帶的治療基因。根據(jù)這些方法，在其部分生活周期整合到宿主基因組中的逆轉(zhuǎn)錄病毒證明是有用的工具。然而，逆轉(zhuǎn)錄病毒的使用不是沒有其伴隨的問題。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的穩(wěn)定整合限于活躍合成DNA的靶細(xì)胞；由于該載體的大小相對小，因此其攜帶容量有限；該載體表現(xiàn)出缺乏組織向性；以及當(dāng)全身性給予時(shí)，這一載體容易被抗體失活。由于使用逆轉(zhuǎn)錄病毒伴隨的這些和其它缺點(diǎn)，許多研究人員已經(jīng)轉(zhuǎn)向作為基因治療另一選擇載體的腺病毒(Ad)(參見例如Rosenfeld等，Science，252，431-434(1991)；Rosendeld等，Cell，68，143-155(1992))。
Ad為無包膜規(guī)則二十面體，直徑為65-80納米，它由外部衣殼和內(nèi)部核心組成(Ginsberg(ed.)腺病毒，Plenum Press，NY(1984))。Ad核心含有一個(gè)線性雙鏈DNA分子。已經(jīng)廣泛地研究了兩種人血清型腺病毒，即Ad2和Ad5，并提供了可獲得的Ad的大多數(shù)資料。這種資料以及Ad的各種有用性質(zhì)(除其它性質(zhì)外，采用互補(bǔ)細(xì)胞系容易大量制備和生產(chǎn)復(fù)制缺陷型重組病毒，Ad能夠感染幾乎所有的細(xì)胞類型，包括最終分化的細(xì)胞或非多育細(xì)胞，惡性腫瘤與Ad感染無關(guān))已經(jīng)使得研究人員能夠研究作為體內(nèi)和體外有效基因傳遞載體的Ad(參見例如Rosenfeld等，(1991)，見上述；Rosenfeld等，(1992)，見上述；Engelhardt等，Hum.Gene Ther.，4，79-769(1993)；Crystal等，Nat.Genet.，8，42-51(1994)；Lemarchand等，Circ.Res，72，1132-1138(1993)；Guzman等，Circ Res，73，1202-1207(1993)；Bajocchi等，Nat.Genet.，3，229-234(1993)；Mastrangeli等，J.Clin.Invest，91，225-234(1993))。
盡管Ad載體有這些優(yōu)點(diǎn)，但采用Ad作為基因轉(zhuǎn)移載體尚未令人滿意地得到給予的治療基因的長期表達(dá)。第一代Ad載體缺失該病毒基本的E1區(qū)(Rosenfeld等，(1992)，見上述；Boucher等，Hum.Gene Ther.，5，615-39(1994))。在嚙齒動(dòng)物模式系統(tǒng)中來自這些病毒載體的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物在回到背景水平前，可在大約2周在內(nèi)檢測到。相比之下，在免疫抑制的小鼠中，在感染后可以檢測到基因表達(dá)的時(shí)間大大增加，表達(dá)水平也大幅增加(Yang等，J.Virol，69，2004-15(1995)；Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.，10，4407-11(1994))。這些數(shù)據(jù)表明，免疫監(jiān)視是造成第一代Ad載體表現(xiàn)相對差的原因。此外，要在細(xì)胞內(nèi)維持的Ad不能整合到宿主基因組中意味著，表達(dá)該載體編碼的治療基因的細(xì)胞最終將從細(xì)胞中消失。
因此，許多研究Ad的研究人員已經(jīng)尋找了可供選擇的穩(wěn)定重組載體的方法，以便可以獲得長期的基因表達(dá)。一個(gè)在其它系統(tǒng)證明有效的這類方法是以附加體形式在該宿主中保持該轉(zhuǎn)移基因完整的方法。附加體是一種獨(dú)立于宿主染色體外進(jìn)行復(fù)制的染色體外遺傳因子。為此，研究人員已經(jīng)利用愛坡斯坦-巴爾皰疹病毒(EBV)在潛伏狀態(tài)下形成附加體的能力作為由各種雙鏈DNA模板產(chǎn)生附加體的手段。
EBV是引起傳染性單核細(xì)胞增多癥的一種人嗜淋巴皰疹病毒，至少與兩種人類癌癥有關(guān)(Reisman等，Molec.Cell Biol.5，1822-1832(1985))。EBV含有兩個(gè)復(fù)制起點(diǎn)oriLyt和oriP。潛伏期間，EBV以閉環(huán)雙鏈DNA分子存在，在其復(fù)制中使用oriP，并且每個(gè)細(xì)胞保持10-200個(gè)拷貝(Young等，Gene，62，171-185(1988))。含有oriP的質(zhì)?？梢栽谝脖磉_(dá)核抗原EBNA-1的細(xì)胞中保持(參見例如Yates等，Nature，313，812-815(1985)；Jalanko等，Biochemica et Biophysica Acta，949，206-212(1988)；Kioussis等，EMBO J-6，355-361(1987)；Jalanko等，Arch.Virol.，103.，157-166(1988)；Sugden等，J.Virol.，63，2644-2649(1989))。在EBNA-1存在時(shí)，oriP允許質(zhì)粒在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制，且在培養(yǎng)時(shí)EBV不能感染這些細(xì)胞(Reisman等，見上述；Yates等，Proc Natl.Acad.Sci.，81，3806-3810(1984))。oriP原點(diǎn)含有其活性需要的兩個(gè)順式作用元件(在Middleton等，Advances in Virus Research，40，19-55(1991)中進(jìn)行了綜述)。這些元件被1,000堿基對(bp)分離，兩個(gè)元件都由多個(gè)簡并拷貝組成，該拷貝為30bp區(qū)段。稱為重復(fù)家族或FR的第一個(gè)元件含有20個(gè)串聯(lián)的30bp重復(fù)。第二個(gè)元件由包含65bp二重對稱元件或DS的114bp區(qū)段組成。
誘變研究揭示，oriP的兩個(gè)區(qū)域以與定向和距離無關(guān)的方式相互面對面起作用(Middleton等，見上述)。間插間隔區(qū)的缺失或在該區(qū)插入大于1,000bp的片段不影響oriP的功能。已知FR元件具有增強(qiáng)子的功能，但它在復(fù)制中的作用仍是未知的。此外，包含F(xiàn)R的20個(gè)串聯(lián)重復(fù)可以由多拷貝DS取代。在FR增強(qiáng)子中發(fā)現(xiàn)的20個(gè)串聯(lián)重復(fù)少至8個(gè)，在兩個(gè)增強(qiáng)子活性和質(zhì)粒復(fù)制的短期分析中是足夠的。
EBNA-1結(jié)合到存在于oriP的兩個(gè)元件中的30bp重復(fù)上。在EBV細(xì)胞周期的S期期間，每個(gè)周期在DS附近發(fā)生一次的DNA復(fù)制的起始需要EBNA-1蛋白(Middleton等，見上述)。甘氨酸-丙氨酸重復(fù)序列約占該蛋白的1/3，該蛋白羧基末端的一個(gè)小區(qū)是質(zhì)粒復(fù)制非必需的(Yates等，(1985)，見上述；Lupton等，Mol.Cell Biol.，5.，2533-2542(1985))。然而，該序列組織阻止免疫系統(tǒng)檢測到EBNA-1，因此大概是EBV和EBV衍生載體的穩(wěn)定所必需的(Levitskaya等，Nature，375，685-688(1995))。
由于在子細(xì)胞之間分配新合成的附加體可能至少有一些錯(cuò)誤，并且由于對染色體外遺傳因子的普遍負(fù)選擇壓力，因此用EBV獲得的附加體的穩(wěn)定性潛在地限制治療基因的長期穩(wěn)定性和表達(dá)。該附加體整合到該基因組的無害座位即轉(zhuǎn)移基因的安全庇護(hù)所中，將消除這種穩(wěn)定性的潛在喪失。根據(jù)這些方法，腺病毒相關(guān)病毒(AAV)表明具有高頻整合到人染色體19q13.3-qter的獨(dú)特能力(Kotin等，Human GeneTherapv.5，793-801(1994))。AAV整合到限定的良性基因組位點(diǎn)的這種能力消除了由伴隨DNA隨機(jī)插入而引起的不慎基因激活或失活所造成的插入誘變風(fēng)險(xiǎn)(Shelling等，Gene Therapy，165-169(1994))。
根據(jù)AAV的一般特征，它是一種人細(xì)小病毒，可以作為整合的前病毒繁殖，或者通過裂解性感染繁殖(Muzyczka，Current Topics inMivrobiol and Immunol，158，97-129(1992))，它已經(jīng)用作真核細(xì)胞的載體(參見例如美國專利4,797,368和5,173,414；Tratschin等，Mol.CellBiol.，4，2072-2081(1984)；GenBank資料庫登記號J01901或AA2C)。AAV感染的裂解期需要表達(dá)Ad早期基因產(chǎn)物E1a、E1b、E2a、E4和VA RNA(Kotin等，見上述)。在缺乏輔助病毒的情況下感染AAV，產(chǎn)生潛伏感染。在這些情況下，AAV有效地整合到細(xì)胞基因組中，并以該狀態(tài)保持，除非用Ad攻擊。
將外源基因定點(diǎn)整合到人基因組中只需要兩個(gè)AAV組分Rep蛋白和AAV反向末端重復(fù)(ITR)。四種Rep蛋白的每種由同一基因編碼，并且通過新生mRNA的選擇剪接產(chǎn)生(Kysti等，J.Virol.，68，2947-2957(1994))。兩個(gè)較大的Rep蛋白Rep78和Rep68結(jié)合AAV的ITR，象依賴于ATP的序列特異性內(nèi)切核酸酶那樣起作用，并具有在AAV DNA復(fù)制期間使ITR區(qū)域解旋的螺旋酶活性(Hlscher等，J.Virol.，68，7169-7177(1994))。較小的Rep蛋白Rep52和Rep40看來對用于包裝該病毒的單鏈子代基因組的累積是必需的。
AAV ITR位于該基因組的兩端。當(dāng)病毒ITR為單鏈時(shí)，它們形成T形發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Snyder等，J.Virol，67，6096-6104(1993))。也發(fā)現(xiàn)復(fù)制起點(diǎn)、包裝、整合和切除信號位于該病毒的ITR區(qū)域內(nèi)。Rep蛋白與AAVITR的結(jié)合與該區(qū)域在依賴于ITR的復(fù)制和座位指導(dǎo)的整合中的基本作用相符。缺乏Rep蛋白時(shí)，不發(fā)生復(fù)制，在基因組中的整合看來是隨機(jī)事件(Kotin等，見上述)。ITR可以或者以其天然狀態(tài)起作用，或者象雙鏈DNA一樣克隆到一個(gè)質(zhì)粒中。適當(dāng)?shù)貞?yīng)用Rep蛋白(例如通過反式存在的編碼序列提供Rep蛋白)時(shí)，在ITR之間整合的外源序列可以從質(zhì)粒上切除、復(fù)制并整合到宿主細(xì)胞基因組中。
實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生附加體的EBV策略、或穩(wěn)定附加體或通過整合到宿主細(xì)胞基因組中穩(wěn)定附加體攜帶的序列的AAV策略，需要在每個(gè)系統(tǒng)中緊密調(diào)節(jié)相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白(例如用于EBV的EBNA-1和用于AAV的Rep蛋白)。研究人員已經(jīng)用來得到基因表達(dá)緊密調(diào)節(jié)的一種方法是通過定點(diǎn)重組事件控制一個(gè)基因或遺傳序列的表達(dá)。通過很好研究、允許實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組并已經(jīng)用于多種應(yīng)用的兩個(gè)系統(tǒng)是噬菌體P1的Cre/Lox系統(tǒng)和酵母的Flp/Frt系統(tǒng)。
Cre蛋白和Flp蛋白屬于DNA重組酶的λ整合酶家族(在Kilby等，TIG，9，413-421(1993)；Landy，Current Opinion in Genetics andDevelopment，3，699-707(1993)；Argos等，EMBO J.，5，433-440(1986)中進(jìn)行了綜述)。Cre和Flp重組酶在它們進(jìn)行的反應(yīng)類型上和在它們的重組靶位點(diǎn)結(jié)構(gòu)和重組機(jī)制方面都顯示出驚人的相似性(參見例如Jayaram，TIBS，19，78-82(1994)；Lee等，J.Biolog.Chem.，270，4042-4052(1995)；Whang等，Molec.Cell Biolog.，14，7492-7498(1994)；Lee等，EMBO J，5，5346-5354(1994)；Abremski等，J.Mol.Biol.，192，17-26(1986)；Adams等，J.Mol.Biol，226，661-673(1992))。例如，重組事件與復(fù)制和外源能源(諸如ATP)無關(guān)，在超螺旋DNA模板和線性DNA模板上都起作用。
Cre和Flp重組酶通過分別促進(jìn)它們的兩個(gè)靶重組位點(diǎn)Lox和Frt之間的重組而施加其影響，兩個(gè)靶位點(diǎn)由一對不對稱序列分隔的反向回文結(jié)構(gòu)組成(參見例如Mack等，Nucleic Acids Research，20，4451-4455(1992)；Hoess等，Nucleic Acids Research 14，2287-2300(1986)；Kilby等，見上述)。不對稱性提供重組事件的方向性。即在同一線性DNA分子上平行布置的靶位點(diǎn)(即所謂的“直接重復(fù)”)之間的重組導(dǎo)致間插DNA序列作為環(huán)狀分子而被切除(Kilby等，見上述)。在環(huán)狀DNA分子上直接重復(fù)之間的重組切除間插DNA，產(chǎn)生兩個(gè)環(huán)狀分子。相比之下，線性或環(huán)狀DNA分子上的反向平行位點(diǎn)(即相反定向的位點(diǎn)或所謂的“反向重復(fù)序列”)之間的重組導(dǎo)致內(nèi)部序列的倒位。即使這些靶存在于分開的線性分子上時(shí)，重組酶的作用可以導(dǎo)致該靶位點(diǎn)末端區(qū)域的相互交換，但與分子間重組相比，更優(yōu)選分子內(nèi)重組。
Cre/Lox和Flp/Frt重組系統(tǒng)都已經(jīng)用于多種目的。例如，已經(jīng)報(bào)道了植物、昆蟲、細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物染色體中的位點(diǎn)特異性整合(參見例如Sauer等，Proc.Natl.Acad.Sci.，85，5166-5170(1988)；Fukushige等，Proc.Natl Acad Sci.89，7905-7907(1992)；Baubonis等，NucleicAcids Research，21，2025-2029(1993)；Hasan等，Gene，150.，51-56(1994)；Golic等，Cell，59，499-509(1989)；Sauer等，Mol.Cell Biolog.，7，2087-2096(1987)；Sauer等，MethodsCompanion to Methods in Enzvmol.，4，143-149(1992)；Sauer等，The New Biologist，2，441-449(1990)；Sauer等，Nucleic Acids Res.，17，147-161(1989)；Qin等，Proc.Natl.Acad.Sci.，91，1706-1710(1994)；Orban等，Proc.Natl.Acad.Sci.，89，6861-6865(1992))。已經(jīng)用這些系統(tǒng)裝配了真核病毒載體，并且回收了插入的DNA(參見例如Sauer等，Proc Natl Acad Sci.，84，9108-9112(1987)；Gage等，J.Virol.，66，5509-5515(1992)；Holt等，Gene，133，95-97(1993)；Peakman等，Nucleic Acids Res.，20，495-500(1992))。染色體序列的特異性缺失和重排也已工程化了，將外源DNA作為質(zhì)粒從λ載體上切除目前是可能的(參見例如Barinaga等，Science，265，27-28(1994)；Rossant等，Nature Medicine，1，592-594(1995)；Sauer等，Methods in Enzvmol.，225，890-900(1993)；Sauer等，Gene，70，331-341(1988)；Brunelli等，Yeast，9，1309-1318(1993)；InVitrogen(San Diego，CA)1995目錄，35；Clontech(Palo Alto，CA)1995/1996目錄，187-188)。已經(jīng)產(chǎn)生了克隆流程，使得通過重組位點(diǎn)之間序列的缺失或者倒位，進(jìn)行重建或失活一個(gè)功能轉(zhuǎn)錄單位(參見例如Odell等，Plant Phvsiol.，106，447-458(1994)；Gu等，Cell，73，1155-1164(1993)；Lakso等，Proc Natl.Acad.Sci.，89，6232-6236(1992)；Fiering等，Proc.Natl.Acad.Sci.，90，8469-8473(1973)；O’Gorman等，Science，251，1351-55(1991)；Jung等，Science，259，984-987(1993))。同樣地，已經(jīng)開發(fā)了選擇和篩選重組體的積極策略和消極策略(參見例如Sauer等，J.Mol Biol.，223，911-928(1992))。已經(jīng)提供了在組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或者發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子控制下的編碼Cre或Flp重組酶的反式基因，或者導(dǎo)入純化的重組酶(參見例如Baubonis等，見上述；Dang等，Devolp.Genet，13，367-375(1992)；Chou等，Genetics，131，643-653(1992)；Morris等，Nncleic Acids Res 19，5895-5900(1991))。其中，在轉(zhuǎn)基因小鼠、植物和昆蟲中使用重組系統(tǒng)或其組分揭示出，宿主表達(dá)重組酶基因且沒有出現(xiàn)明顯的有害影響，因此證實(shí)宿主一般能很好地耐受這些蛋白(參見例如Orbin等，Proc.Natl.Acad.Sci，89，6861-6865(1992))。
新近，研究人員已經(jīng)采用含有噬菌體P1 Cre基因的復(fù)制缺陷型Ad載體作為研究細(xì)胞內(nèi)Cre介導(dǎo)的重組的一個(gè)工具(Anton等，J.Virol.，69，4600-4606(1995))。在這些實(shí)驗(yàn)中，將表達(dá)Cre的Ad載體與另一Ad載體一起供應(yīng)給細(xì)胞，其中側(cè)翼為平行Lox位點(diǎn)的外源間隔序列將報(bào)道基因的編碼序列與任一啟動(dòng)子分離。Cre介導(dǎo)的重組導(dǎo)致間隔序列的切除，開啟從前沉默的報(bào)道基因。由于只要復(fù)制缺陷型Ad載體保持在宿主細(xì)胞中，由重組事件開啟的該基因就能表達(dá)，因此該方法看來只允許基因表達(dá)的正調(diào)節(jié)，而不是穩(wěn)定的基因表達(dá)。此外，由于Cre繼續(xù)在該宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，有可能在反向重組反應(yīng)的同時(shí)關(guān)閉該報(bào)道基因，并在獲得的表達(dá)水平上加上一個(gè)上限(Anton等，見上述，第4605頁)。
因此，仍需要一些可以更完全地實(shí)現(xiàn)Ad和其它基因治療載體潛力的表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明設(shè)法提供這類表達(dá)系統(tǒng)。具體地說，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)特異性重組的方法，提供可以用于這類方法的載體，以達(dá)到較長時(shí)間的基因表達(dá)以及調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，克服現(xiàn)有基因表達(dá)系統(tǒng)中固有的上述一些問題。從本文提供的本發(fā)明說明書中將明顯地看出本發(fā)明的這些和其它目的和優(yōu)點(diǎn)以及本發(fā)明另外的特征。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)特異性重組的方法以及可以用于這類方法的載體。本發(fā)明的方法和載體可以用來在細(xì)胞中獲得持久的基因表達(dá)和調(diào)節(jié)基因表達(dá)。
更具體地講，按照本發(fā)明的一個(gè)推薦方法包括以下步驟(a)將一個(gè)細(xì)胞與一種載體接觸，后者包含一個(gè)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用的位于平行設(shè)置的第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間的復(fù)制起點(diǎn)，接觸使得該載體被該細(xì)胞內(nèi)在化，以及(b)為該細(xì)胞提供在該載體第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn)重組的位點(diǎn)特異性重組酶。
按照本發(fā)明的另一推薦方法，部分地包括以下步驟(a)將一個(gè)細(xì)胞與一種載體接觸，使得該載體被該細(xì)胞內(nèi)在化，該載體包含反向定向的第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)，以及(b)為該細(xì)胞提供在該載體第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn)重組的位點(diǎn)特異性重組酶。
圖的簡述

圖1A-1C為示意圖，描述在傳遞到宿主細(xì)胞前用于本發(fā)明正文的具有平行重組位點(diǎn)的一種載體(圖1A)和縮短的病毒或環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖1B)以及附加體(圖1C)，后者由在該載體按照本發(fā)明傳遞到該宿主細(xì)胞后發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)重組事件產(chǎn)生。或閉環(huán)載體(即虛線表示的側(cè)翼質(zhì)?；虿《拘蛄?或線性載體(即虛線盒表示的側(cè)翼病毒序列)可以被用來將該附加體傳遞到宿主細(xì)胞中。在FRS和SCS之間并包括FRS和SCS的區(qū)域相對于側(cè)翼載體序列可以有兩種定向。箭頭表示轉(zhuǎn)錄方向?？s寫RS，重組位點(diǎn)；FRS，第一重組位點(diǎn)；SRS，第二重組位點(diǎn)；SA，剪接受體位點(diǎn)；SD，剪接供體位點(diǎn)；FCS，第一編碼序列；SCS，第二編碼序列；P，啟動(dòng)子；PG，過客基因；ori，復(fù)制起點(diǎn)。
圖2A-2F為示意圖，描述甘氨酸-丙氨酸(Gly Ala)重復(fù)序列相對于該編碼序列(CS)和激素結(jié)合域(HBD)的潛在位置。甘氨酸-丙氨酸重復(fù)序列可以在缺乏激素結(jié)合域的情況下同樣使用。
圖3A-3X為示意圖，描述平行重組方法按照本發(fā)明的其它應(yīng)用。箭頭表示轉(zhuǎn)錄方向。虛線表示該載體可以或者為線性，或者為環(huán)狀?？招奶}卜表示特定序列可以存在于該載體的任何地方。該載體特定區(qū)域內(nèi)的空心棒表示該特定序列可以定位的載體部分?？s寫RS，重組位點(diǎn)；FRS，第一重組位點(diǎn)；SRS，第二重組位點(diǎn)；SA，剪接受體位點(diǎn)；SD，剪接供體位點(diǎn)；FCS，第一編碼序列；SCS，第二編碼序列；TCS，第三編碼序列；P，啟動(dòng)子；SP，第二啟動(dòng)子；PG，過客基因；N，復(fù)制起點(diǎn)；ITR，反向末端重復(fù)；Rep，Rep蛋白編碼序列。
圖4為描述一載體的示意圖，該載體具有反向平行重組位點(diǎn)，用于本發(fā)明，特別是用于通過定點(diǎn)重組調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，而沒有附加體的切除?？梢曰蛘呤褂瞄]環(huán)載體(即虛線表示的側(cè)翼質(zhì)?；虿《拘蛄?，或者使用線性載體(即虛線盒表示的側(cè)翼病毒序列)。在FCS和SCS之間并包括FRS和SCS的區(qū)域可以相對于側(cè)翼載體序列為兩種定向。箭頭表示轉(zhuǎn)錄方向。縮寫FRS，第一重組位點(diǎn)；SRS，第二重組位點(diǎn)；SA，剪接受體位點(diǎn)；SD，剪接供體位點(diǎn)；FCS，第一編碼序列；SCS，第二編碼序列；P，啟動(dòng)子。
圖5A-5G為示意圖，描述反向重組方法按照本發(fā)明的其它應(yīng)用。箭頭表示轉(zhuǎn)錄方向。虛線表示該載體可以或者為線性，或者為環(huán)狀?？s寫RS，重組位點(diǎn)；FRS，第一重組位點(diǎn)；SRS，第二重組位點(diǎn)；SA，剪接受體位點(diǎn)；SD，剪接供體位點(diǎn)；FCS，第一編碼序列；SCS，第二編碼序列；P，啟動(dòng)子。
圖6為描述質(zhì)粒pEOBspLx-Puro-CMVLx的限制圖譜。
圖7為描述質(zhì)粒pEOBspLx-Puro-CMVLx-βglu的限制圖譜。
圖8為描述質(zhì)粒pAdCMV Cre的限制圖譜。
圖9為描述質(zhì)粒pAdCMVCreRSVOrf6的限制圖譜。
圖10為描述質(zhì)粒pKSEBNAOriP(NR)的限制圖譜。
圖11為描述質(zhì)粒pKSEBNA(NS)的限制圖譜。
圖12為描述質(zhì)粒pAdCLxPyTagOri的限制圖譜。
圖13為描述質(zhì)粒pAdEPrRlr的限制圖譜。
圖14為描述線性質(zhì)粒pCGE1E2ori的限制圖譜。該質(zhì)粒通常以閉環(huán)狀式存在。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供在宿主細(xì)胞中獲得持久性基因表達(dá)的方法和可以用于這類方法的載體。這些方法和載體也可以用來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。按照本發(fā)明的方法和載體以新方式結(jié)合(1)獨(dú)特能力的EBV和AAV(即EBV產(chǎn)生附加體的能力，AAV整合到人基因組中的能力)，(2)重組系統(tǒng)(諸如Cre/Lox和Flp/Frt重組系統(tǒng))的重組酶活性，(3)Ad和其它相似的病毒載體和質(zhì)粒載體的各種所需性質(zhì)。定義為了易于參考，本文所用的描述本發(fā)明方法和載體的縮寫和命名示于表1中。表1. 縮寫和命名AAV腺病毒相關(guān)病毒Ad 腺病毒bp 堿基對cDNA 互補(bǔ)DNACMV巨細(xì)胞病毒Cre噬菌體P1的位點(diǎn)特異性重組酶DNA脫氧核糖核酸DS 包含一個(gè)oriP元件的二重對稱元件EBV愛坡斯坦-巴爾病毒EBNA-1 結(jié)合oriP并調(diào)節(jié)EBV和EBV衍生的附加體復(fù)制的蛋白質(zhì)FCS第一編碼序列Flp由酵母Frt蛋白識別的靶位點(diǎn)FR 包含一個(gè)orip元件的EBV重復(fù)家族FRS第一重組位點(diǎn)Frt酵母的位點(diǎn)特異性重組酶HSVI型和II型單純皰疹病毒ITR含有具復(fù)制起點(diǎn)功能序列的AAV反向末端重復(fù)序列kb 千堿基對Lox 由噬菌體P1 Cre蛋白識別的靶位點(diǎn)oriLyt參與裂解期復(fù)制的EBV復(fù)制起點(diǎn)orip 參與潛伏期復(fù)制的EBV復(fù)制起點(diǎn)P 啟動(dòng)子PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PG過客基因Rep 結(jié)合ITR的蛋白，ITR在AAV和AAV衍生載體復(fù)制和整合到基因組中起作用RNA 核糖核酸RS重組位點(diǎn)RSV 勞氏肉瘤病毒SA剪接受體位點(diǎn)SCS 第二編碼序列SD剪接供體位點(diǎn)SRS 第二重組位點(diǎn)SV40 猿猴病毒40此外，按照本發(fā)明和按照本文進(jìn)一步的定義，“載體”為用來將編碼信息轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中的一個(gè)分子(例如病毒或質(zhì)粒)?！皬?fù)制起點(diǎn)”為載體或宿主細(xì)胞染色體上的一個(gè)序列(例如病毒或質(zhì)粒)，提供能夠獨(dú)立于宿主細(xì)胞基因組而進(jìn)行復(fù)制的基因組外元件(例如病毒或質(zhì)粒)。
“基因”為編碼一個(gè)蛋白或新生RNA分子的任一核酸序列?！斑^客基因”為通常不存在于按照本發(fā)明的載體中并被亞克隆到按照本發(fā)明載體中的任一基因，當(dāng)它導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，伴隨細(xì)胞內(nèi)環(huán)境可識別的變化(例如脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽或蛋白濃度的增加，或改變它們的生產(chǎn)速率或降解速率)?！盎虍a(chǎn)物”或者是由給定基因或編碼序列轉(zhuǎn)錄的尚未翻譯的RNA分子(例如mRNA或反義RNA)，或者是由給定基因或編碼序列轉(zhuǎn)錄的mRNA分子翻譯的多肽鏈(即蛋白或肽)。基因包括編碼序列加上任何非編碼序列，而“編碼序列”不包括任何非編碼(例如調(diào)節(jié))DNA。如果沿該分子的堿基序列已經(jīng)由通常天然發(fā)現(xiàn)的該基因或該編碼序列發(fā)生改變，或者如果通常在自然界中沒有發(fā)現(xiàn)該堿基序列，那么該基因或編碼序列為“重組體”。按照本發(fā)明，一個(gè)基因或編碼序列可以全部合成制備或部分合成制備，可以包含基因組序列或互補(bǔ)DNA(cDNA)序列，可以以或者DNA或者cDNA的形式提供。
非編碼序列或調(diào)節(jié)序列包括啟動(dòng)子序列?！皢?dòng)子”為指導(dǎo)RNA聚合酶結(jié)合并由此啟動(dòng)RNA合成的DNA序列?！霸鰪?qiáng)子”為刺激或抑制相鄰基因轉(zhuǎn)錄的DNA順式作用元件。抑制轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子也稱為“沉默子”。增強(qiáng)子不同于僅在啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的序列特異性DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)(它也稱為“啟動(dòng)子元件”)，因?yàn)樵鰪?qiáng)子可以以兩個(gè)方向中任何一個(gè)而起作用，并且越過至多幾個(gè)千堿基對的距離起作用，甚至在轉(zhuǎn)錄區(qū)下游位置起作用。
按照本發(fā)明，“重組位點(diǎn)”由被不對稱序列分離的可以發(fā)生位點(diǎn)特異性重組反應(yīng)的反向回文結(jié)構(gòu)組成。本發(fā)明描述了推薦實(shí)施方案，其中最好使用重組位點(diǎn)(例如第一和/或第二重組位點(diǎn))。然而，也可以使用更多或更少的重組位點(diǎn)(例如1個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)，諸如3、4、5或6個(gè)重組位點(diǎn))。此外，可以使用不同類型的重組位點(diǎn)，例如兩個(gè)Lox位點(diǎn)與兩個(gè)Flp位點(diǎn)的組合?！爸亟M酶”為在特殊重組位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn)重組的蛋白質(zhì)。
此外，按照本發(fā)明，當(dāng)一個(gè)啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)一個(gè)編碼序列轉(zhuǎn)錄時(shí)，將該編碼序列與該啟動(dòng)子“操作性地連接”。當(dāng)一個(gè)啟動(dòng)子能夠通過重組位點(diǎn)區(qū)域?qū)D(zhuǎn)錄和對連接重組位點(diǎn)的序列施加影響時(shí)，該啟動(dòng)子“鄰接”一個(gè)重組位點(diǎn)(即第一或第二重組位點(diǎn))。當(dāng)一個(gè)編碼序列(即一個(gè)編碼序列或一個(gè)第二編碼序列)距重組位點(diǎn)的距離，使得它可以由一個(gè)連接重組位點(diǎn)的啟動(dòng)子(該啟動(dòng)子通過重組位點(diǎn)區(qū)域?qū)υ摼幋a序列施加影響)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄控制時(shí)，該編碼序列“鄰接”一個(gè)重組位點(diǎn)(即第一或第二重組位點(diǎn))。為此，該編碼序列最好位于大約1000bp的重組位點(diǎn)內(nèi)，甚至該編碼序列更優(yōu)選位于大約500bp的重組位點(diǎn)在內(nèi)。然而，當(dāng)一個(gè)反向間插編碼序列將該啟動(dòng)子與它控制的編碼序列分離時(shí)，該啟動(dòng)子和它控制的編碼序列之間的距離最好為不大于大約5000bp，更優(yōu)選不大于大約2000bp?！岸囗樂醋有攀埂睘閱蝹€(gè)mRNA，如本文進(jìn)一步描述的，由它翻譯一個(gè)以上的肽或蛋白質(zhì)。定點(diǎn)重組方法本發(fā)明提供實(shí)施細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)特異性重組的兩種方法。兩個(gè)重組方法都包括將一個(gè)細(xì)胞與一個(gè)包含第一和第二重組位點(diǎn)的載體接觸，使得該載體被該細(xì)胞內(nèi)在化，然后為細(xì)胞提供在該載體第一和第二重組位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn)重組的位點(diǎn)特異性重組酶。第一個(gè)位點(diǎn)特異性重組方法包括使用包含平行定向的第一和第二重組位點(diǎn)的一種載體(即“平行重組載體”)，而第二個(gè)位點(diǎn)特異性重組方法包括使用包含反向(或相反)定向的第一和第二重組位點(diǎn)的一種載體(即“反向重組載體”)。
平行重組方法能夠在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組，使得該重組事件產(chǎn)生一個(gè)包含能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用的復(fù)制起點(diǎn)的附加體，當(dāng)載體攜帶一個(gè)或多個(gè)過客基因時(shí)，它可以于宿主基因組外自主復(fù)制并可以用來在宿主細(xì)胞內(nèi)提供穩(wěn)定的持久性。平行重組方法的用處在于，它通過賦予通常不整合到宿主細(xì)胞基因組中的載體(例如Ad或HSV載體)通過“溶原樣”途徑進(jìn)行復(fù)制的能力，可以用來穩(wěn)定這類載體。因此，該方法可以用來通過穩(wěn)定攜帶一個(gè)或多個(gè)過客基因的載體，用來獲得穩(wěn)定的基因表達(dá)。
平行重組方法也可以用來在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組，使得該重組事件產(chǎn)生一個(gè)所謂的“小質(zhì)?！保笳卟话軌蛟诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中起作用的復(fù)制起點(diǎn)，不能于宿主基因組外進(jìn)行自主復(fù)制。值得注意的是，平行重組事件產(chǎn)生的第二重組產(chǎn)物(即除附加體或小質(zhì)粒以外的產(chǎn)物，其本身包含不是線性結(jié)構(gòu)就是閉環(huán)結(jié)構(gòu)，取決于重組反應(yīng)的原始底物分別是線性還是閉環(huán))也可以在該細(xì)胞中起作用。如本文所述，可以證明這一小質(zhì)粒可用于向細(xì)胞短期傳遞蛋白質(zhì)(例如Rep蛋白)。
或者，用于位點(diǎn)特異性重組的載體在重組事件之前，也可以包含一個(gè)以上的復(fù)制起點(diǎn)。包含一個(gè)以上復(fù)制起點(diǎn)的載體是本領(lǐng)域已知的。
如本文進(jìn)一步描述的，平行重組方法和反向重組方法都可以用來通過重組事件，或者調(diào)節(jié)上游或下游一個(gè)編碼序列的轉(zhuǎn)錄，或者同時(shí)調(diào)節(jié)上游一個(gè)編碼序列的轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)下游另一編碼序列的轉(zhuǎn)錄。反向重組方法與平行重組方法不同，因?yàn)樗簧婕案郊芋w或小質(zhì)粒的形成。
按照本發(fā)明的重組方法是在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，最好是在真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。真核細(xì)胞是具有核膜包圍的真正核的細(xì)胞。真核細(xì)胞最好為多細(xì)胞物種的細(xì)胞(例如與單細(xì)胞的酵母細(xì)胞相對)，甚至更優(yōu)選為哺乳動(dòng)物(最好為人)細(xì)胞。然而，采用多種不同的細(xì)胞類型，諸如鳥類細(xì)胞和魚細(xì)胞以及包括(但不限于)嚙齒動(dòng)物、猿、黑猩猩、貓科動(dòng)物、犬、有蹄類動(dòng)物(諸如反芻動(dòng)物或天鵝)以及人細(xì)胞在內(nèi)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，也可以有效地進(jìn)行這些方法。此外，如果由于例如缺乏特殊病毒(諸如腺病毒)的受體，使載體向特殊細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)移受到限制，那么例如采用用來將人腺病毒攜帶到血液或其它細(xì)胞類型的方法，可以增加轉(zhuǎn)移。例如，可以將該病毒結(jié)合到含有一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞配體(例如運(yùn)鐵蛋白)的DNA-多聚賴氨酸復(fù)合體上(Wanger等，Proc Natl AcadSci，89，6099-6103(1992))，或采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它相似方法。
任何適宜的載體都可以用于本發(fā)明方法中，特別是本文描述的新載體。因此，按照本發(fā)明方法使用的載體可以包括任何線性的或環(huán)狀的載體，也就是說適于將核酸導(dǎo)入真核細(xì)胞并能夠作為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解的起作用的載體，只要該載體在其存在的某個(gè)階段主要由雙鏈DNA組成即可。產(chǎn)生的載體最好與該宿主細(xì)胞相容，即能夠轉(zhuǎn)錄該載體中亞克隆的該核酸序列，并且需要時(shí)，也能夠翻譯新生的mRNA。
該載體最好來源于病毒，并且可以含有一個(gè)或多個(gè)異源或重組序列，例如一個(gè)編碼序列、一個(gè)過客基因、啟動(dòng)子等等。該載體最好含有包裝和傳遞到該細(xì)胞所需的基本序列。希望該載體一部分由包膜或未包膜的病毒組成。例如載體最好為來自肝脫氧核糖核酸病毒科、小球病毒科、腫瘍病毒科或腺病毒科的未包膜病毒。按照本發(fā)明推薦的未包膜病毒為肝脫氧核糖核酸病毒科的病毒，特別是肝脫氧核糖核酸病毒屬病毒。小球病毒科病毒希望為小球病毒屬病毒(例如哺乳動(dòng)物和鳥的小球病毒)或依賴病毒(例如腺病毒相關(guān)病毒(AAV))。腫瘍病毒科病毒最好為乳突瘤病毒亞科病毒(例如乳突瘤病毒，包括(但不限于)人乳突瘤病毒(HPV)1-48和牛乳突瘤病毒(BPV))或多瘤病毒亞科病毒(例如多瘤病毒，包括(但不限于)JC、SV40、BK病毒和小鼠多瘤病毒)。腺病毒科病毒希望為乳腺病毒屬病毒(例如哺乳動(dòng)物腺病毒)或禽腺病毒(例如鳥類腺病毒)。同樣地，載體可以是來自皰疹病毒科的包膜病毒，或可以是辛德畢斯病毒。按照本發(fā)明推薦的包膜病毒是皰疹病毒科病毒，特別是α-皰疹病毒亞科(例如單純皰疹樣病毒)、單純病毒(Simplexvirus)屬(例如單純皰疹樣病毒)、水痘帶狀皰疹病毒屬(例如水痘帶狀皰疹病毒或偽狂犬病樣病毒)、β-皰疹病毒亞科(例如巨細(xì)胞病毒)、巨細(xì)胞病毒屬(例如人巨細(xì)胞病毒)、γ-皰疹病毒亞科(例如淋巴細(xì)胞相關(guān)病毒)或淋巴隱病毒屬(例如EB樣病毒)。具體地講，該載體的病毒組分最好選自Ad、I型和II型單純皰疹病毒(HSV)、EBV、痘苗病毒、乳突瘤病毒(例如或是人的(HPV)，或是牛的(BPV)、JC、猿猴病毒40(SV40)、多瘤病毒(例如或者人的或者小鼠的)、乙型肝炎病毒和巨細(xì)胞病毒(CMV)。此外，對于希望形成附加體的平行重組方法的實(shí)施，最好該載體部分由來源于病毒的載體組成，且該病毒不形成前病毒作為其復(fù)制周期的一部分。
按照本發(fā)明特別推薦的載體是腺病毒載體(即腺病毒科、最好是乳腺病毒屬的病毒載體)。腺病毒為任一血清型的載體。可以由目前可得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rokville，MD)的1-47型腺病毒血清型或得自任何其它來源的任何其它腺病毒血清型，擴(kuò)增可以用作腺病毒源的腺病毒貯液。例如，腺病毒可以為A亞組(例如血清型12、18、31)、B亞組(例如血清型3、7、11、14、16、21、34、35)、C亞組(例如血清型1、2、5、6)、D亞組(例如血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22-30、32、33、36-39、42-47)、E亞組(血清型4)、F亞組(血清型40、41)或任何其它腺病毒血清型。然而，腺病毒最好為Ad2或Ad5血清型。
用于核酸轉(zhuǎn)移的Ad可以是野生型的(即復(fù)制感受型)?；蛘撸珹d可以包括至少一種修飾的遺傳材料，它可以賦予該病毒復(fù)制缺陷性。對Ad基因組的修飾包括(但不限于)DNA區(qū)段的插入、DNA區(qū)段的重排、DNA區(qū)段的缺失、DNA區(qū)段的取代或DNA損害的導(dǎo)入。DNA區(qū)段可以小至1個(gè)核苷酸，大至36千堿基對(kb)(即大約Ad基因組的大小)，或者可以等于可以包裝入Ad病毒顆粒的最大量(即大約38kb)。對Ad基因組推薦的修飾包括在E1、E2、E3或E4區(qū)域中的修飾。
在本發(fā)明的方法和載體中，這些載體可以還包含一個(gè)過客基因。過客基因可以在該載體中任意定向。可以使用任何適宜的過客基因，諸如報(bào)道基因或治療基因，只要該過客基因能夠在已經(jīng)內(nèi)在化該載體的細(xì)胞中表達(dá)即可。例如，該基因可以包含一個(gè)報(bào)道基因或一個(gè)可以編碼蛋白質(zhì)的核酸序列，其編碼的蛋白質(zhì)能以某種方式在細(xì)胞中檢測到。該基因也可以包含一個(gè)治療基因，后者在RNA或蛋白質(zhì)水平上發(fā)揮其作用。例如，該蛋白可以用于遺傳病的治療，諸如用于治療胰囊性纖維變性的胰囊性纖維變性跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子cDNA。該治療基因編碼的蛋白可以通過導(dǎo)致細(xì)胞殺傷而發(fā)揮其作用。例如，該基因本身的表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞殺傷，如白喉毒素A基因的表達(dá)；或該基因的表達(dá)可能賦予細(xì)胞選擇性地對某些藥物的殺傷作用敏感，例如HSV胸苷激酶基因的表達(dá)賦予細(xì)胞對包括無環(huán)鳥苷、gancyclovir和FIAU(1-(2-脫氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶)在內(nèi)的抗病毒化合物敏感。在該載體中采用本文進(jìn)一步描述的所謂“失控復(fù)制起點(diǎn)”，可以進(jìn)一步增強(qiáng)用于基因治療的該細(xì)胞殺傷途徑(例如它可以用于癌的治療)。然而，這一失控復(fù)制系統(tǒng)的用途不限于細(xì)胞殺傷，例如可以在希望瞬時(shí)高水平表達(dá)的情況下(例如用于通過重組體方法進(jìn)行的蛋白“大丸藥型”傳遞)使用。
此外，該治療基因可以在RNA水平上發(fā)揮其作用，例如通過編碼一個(gè)反義信使或核酶、一種影響剪接或3’加工(例如多聚腺苷酸化)的蛋白，或可以編碼一個(gè)蛋白，它在細(xì)胞內(nèi)通過影響另一基因表達(dá)水平而起作用(即這里廣義地認(rèn)為基因表達(dá)包括從轉(zhuǎn)錄起始至加工蛋白產(chǎn)生的所有步驟)，也許除此之外，通過介導(dǎo)mRNA累積速率的改變、mRNA運(yùn)輸?shù)母淖兒?或轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的變化而起作用。這一過客基因可以編碼任一其它蛋白(例如EBNA-1)，并且可以單獨(dú)存在或除其它過客基因外在第一和第二重組位點(diǎn)之間存在。
采用本發(fā)明方法并鑒于病毒載體的包裝限制或質(zhì)粒載體大小的上限，被轉(zhuǎn)移的過客基因可以包括的DNA，可以小至1個(gè)重復(fù)單元(即對于DNA為1個(gè)核苷酸)，大至可以合理地分離和合成、或轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞的大小。該過客基因可以組成或編碼編碼序列或非編碼序列、包括核酶在內(nèi)的有義或反義序列、或諸如本領(lǐng)域中描述的催化性RNA物質(zhì)(Hampel等，Nucleic Acids Research，18，299-304(1990)；Cech等，Annual Rev.Biochem，55.599-629(1986))以及工程序列或體內(nèi)通常不存在的序列。
同樣地，用于平行重組方法和反向重組方法的載體可以包括其它基因或編碼序列。例如按照本發(fā)明的一個(gè)編碼序列或第二編碼序列可以包含Cre或Flp的編碼序列、EBNA-1的編碼序列或本文描述的任何其它編碼序列。
特別是，本發(fā)明的平行重組方法和反向重組方法可以用來將Rep蛋白或者作為一個(gè)編碼序列或者作為一個(gè)過客基因傳遞到細(xì)胞?？梢允褂弥T如已知的和已經(jīng)在文獻(xiàn)中報(bào)道的各種突變Rep蛋白和Rep編碼序列的變異(參見例如McCarty等，J.Virol.，66，4050-7(1992)；Kysti等，見上述)。這些方法允許以這種方式促進(jìn)Rep介導(dǎo)的重組，該重組將側(cè)翼為一個(gè)或多個(gè)腺病毒相關(guān)病毒ITR(或含有本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的這些ITR的序列)的序列重組到人第19染色體中或本領(lǐng)域描述的序列中(參見例如Linden等，Proc.Natl.Acad.Sci.，93，7966-7972(1996))。這些方法也可以用來啟動(dòng)Rep介導(dǎo)的將側(cè)翼為腺病毒相關(guān)病毒ITR的序列重組到其它基因組區(qū)域中，因?yàn)镽ep蛋白優(yōu)先指導(dǎo)重組到第19染色體中，但也可以指導(dǎo)重組到其它位點(diǎn)上。病毒ITR最好已經(jīng)提供包裝缺陷(例如Muzyczka，見上述)。
按照本發(fā)明的任何編碼序列(即第一、第二或其它編碼序列)或過客基因后面可以接允許生產(chǎn)多順反子信使的序列。有幾種方法可以生產(chǎn)這一多順反子信使，后者反映了載體空間的高效利用。例如，通過在兩個(gè)編碼區(qū)之間放置來自脊髓灰質(zhì)炎病毒的300-400bp片段，一個(gè)核糖體基本上可以補(bǔ)充到第二信使的AUG起始密碼子區(qū)上。這在真核細(xì)胞中提供不依賴于帽狀結(jié)構(gòu)的翻譯旁路或非加帽信使的翻譯。這一策略(和因此允許在其它物種中使用該策略的這類相似序列)也已經(jīng)在α花葉植物病毒中進(jìn)行了描述。在產(chǎn)生多順反子信使的第三種方法中，將一個(gè)心病毒的序列置于多順反子信使編碼序列之間的閱讀框中。下游蛋白的編碼序列不需要起始密碼子(AUG)。翻譯時(shí)，通過積極研究下的機(jī)制釋放蛋白。根據(jù)同樣的方法，允許生產(chǎn)多順反子信使的序列也可以置于該編碼序列編碼區(qū)之后。
因此，這些方法可以用來從該編碼序列和介于第一重組位點(diǎn)和該編碼序列之間的間插編碼序列產(chǎn)生一個(gè)多順反子信使。例如，EBNA-1編碼序列(或一些其它編碼序列)可以是通過重組激活的雙順反子(或多順反子)盒中的第二可讀框(ORF)。驅(qū)動(dòng)EBNA-1表達(dá)的EBV病毒啟動(dòng)子只提供使用CMV啟動(dòng)子觀察到的啟動(dòng)子活性的0.1％。然而在雙順反子盒中，第二基因的表達(dá)為第一基因的0.1％，高于背景10倍。在該方案中，通過該重組事件誘導(dǎo)EBNA-1。這在病毒載體繁殖期間EBNA-1的表達(dá)可以潛在地作用于oriP并使該病毒去穩(wěn)定的情況下特別需要?；蛘撸捎诿總€(gè)細(xì)胞周期oriP僅僅復(fù)制一次，因此在某些情況下可能產(chǎn)生一個(gè)病毒，其中EBNA-1不受調(diào)節(jié)，但在弱組成型啟動(dòng)子的控制下。
任何重組位點(diǎn)和重組酶適宜的組合都可以用于平行重組和反向重組方法和載體。最好是第一和第二重組位點(diǎn)包含Lox位點(diǎn)，而重組酶包含Cre，或第一和第二重組位點(diǎn)包含F(xiàn)rt位點(diǎn)，而重組酶包含F(xiàn)lp。或者，該重組酶可以為重組酶λ整合酶家族的另一成員(或任何其它適宜的重組酶)，而重組位點(diǎn)可以為該重組酶作用的相應(yīng)序列?？梢酝ㄟ^任何適宜的方法，為細(xì)胞提供該重組酶，例如通過將該重組酶編碼序列置于傳遞載體上(例如作為一個(gè)編碼序列或過客基因)，共同給予編碼該重組酶基因的第二載體，或供應(yīng)異源重組酶。
Cre編碼序列最好由噬菌體P1的重組酶Cre的編碼序列組成或包括諸如本領(lǐng)域描述的該序列的各種突變(例如Wierzbicki等，J.Mol.Biol.195，785-794(1987)；Abremski等，J.Mol.Biol.，202，59-66(1988)；Abremski等，J.Mol.Biol.，184，211-20(1988)；Abremski等，ProteinEngineering，5，87-91(1992)；Hoess等，Proc.Natl.Acad.Sci，84 6840-6844(1987)；Sternberg等，J.Mol. Biol.，187.，197-212(1986))，或通過重組方法，由這些序列中的一個(gè)產(chǎn)生供應(yīng)給細(xì)胞的Cre蛋白。也可以使用尚待分離的該編碼序列的其它突變，只要由這類突變產(chǎn)生的變異蛋白能夠在Lox位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)重組即可。此外，可以將一個(gè)核定位信號附在Cre編碼序列上，以提高細(xì)胞核中Cre蛋白的濃度。此外，考慮到通過基因內(nèi)或基因間互補(bǔ)的重組酶活性，可以共同供應(yīng)給細(xì)胞編碼互補(bǔ)Cre或其它突變重組酶蛋白的載體。可以按Abremski等(Abremski等，J.Biolog.Chem.，259，1509-1514(1984))和Sauer等(Sauer等，(1990)，見上述)描述的方法分析Cre在Lox位點(diǎn)功能。
在Cre/Lox驅(qū)動(dòng)的重組方面，loxP位點(diǎn)最好用作Lox位點(diǎn)，或加入諸如文獻(xiàn)中已經(jīng)描述的該序列的各種突變(例如參見Mack等，見上述；Hoess等，(1986)，見上述；Hoess等，Biochemitrsy，81，1026-29(1984)；Hoess等，Gene，40，325-329(1985)；Abemski等，J.Biolog.Chem.，261，391-396(1986))。也可以使用尚待分離的loxP的相似突變序列，只要這類序列能夠作為Cre的重組位點(diǎn)即可。
參考本文提供參考的附圖，特別是圖1A-1C至圖5A-5G，后者描述分別用于本發(fā)明平行重組方法和反向重組方法的平行重組載體和反向重組載體的各種說明性實(shí)施方案，可以使人們更好地理解第一個(gè)或平行重組方法和第二個(gè)或反向重組方法。
a.平行重組方法本發(fā)明的平行重組方法為來自染色體外遺傳因子的或者小質(zhì)?；蛘吒郊芋w的產(chǎn)生創(chuàng)造條件。盡管小質(zhì)粒不在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制(因此在需要瞬時(shí)傳遞或整合一個(gè)序列時(shí)使用)，但附加體卻能夠在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行基因組外復(fù)制。當(dāng)在由于重組事件環(huán)化的重組底物的部分中存在復(fù)制起點(diǎn)時(shí)，獲得一個(gè)附加體(如圖1A-1C中描述的)；當(dāng)沒有這種原點(diǎn)時(shí)，獲得小質(zhì)粒。因此，平行重組方法已經(jīng)具體用于由于不能作為前病毒整合到該宿主基因組中而不穩(wěn)定保持在細(xì)胞中的病毒載體，或用于諸如在潛伏期中基因組靜止的HSV之類的病毒。通過賦予通常不穩(wěn)定保持或潛伏時(shí)靜止的攜帶過客基因的載體在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定的保持，該方法可以用來獲得持久的基因表達(dá)，或該方法也可以用來調(diào)節(jié)該載體攜帶基因的表達(dá)。一般來講，按照該方法傳遞附加體有三點(diǎn)考慮(1)復(fù)制起點(diǎn)，(2)從該傳遞載體上切下該附加體的方法，以及(3)確保子分子在減數(shù)分裂時(shí)分配到每個(gè)細(xì)胞的方法。
因此，在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組的平行重組方法包括(a)使該細(xì)胞與包含復(fù)制起點(diǎn)的載體接觸，使得該載體被該細(xì)胞內(nèi)在化，該復(fù)制起點(diǎn)在哺乳動(dòng)物中起作用，且位于平行布置的第一和第二重組位點(diǎn)之間，(b)為該細(xì)胞提供在該載體的第一和第二重組位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn)重組的位點(diǎn)特異性重組酶。
如圖1A中描述的推薦載體所示，或者線性病毒(即虛線盒顯示的病毒序列)或環(huán)狀分子(即虛線表示的質(zhì)粒或病毒序列)可以與平行重組方法結(jié)合使用。按照上述附加體傳遞的考慮，平行重組方法和最好是反向重組方法可以利用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有功能的復(fù)制起點(diǎn)(例如由哺乳動(dòng)物細(xì)胞分離的原點(diǎn)或病毒復(fù)制起點(diǎn)，諸如(但不限于)來自Ad、HSV、EBV、乳突瘤病毒、痘苗病毒或多瘤病毒的復(fù)制起點(diǎn)。因此，本發(fā)明提供一組載體，它們或者提供單個(gè)整合模板，提供每個(gè)細(xì)胞少數(shù)或中等數(shù)量的附加體或小質(zhì)粒，或者提供至多每個(gè)細(xì)胞上千個(gè)附加體，其中每個(gè)附加體或小質(zhì)?？梢园鞣N編碼序列、啟動(dòng)子和/或過客基因，如本文所述。
希望用于本發(fā)明方法的載體具有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，它包含EBV潛伏復(fù)制子的序列oriP或本領(lǐng)域已知并已經(jīng)描述的該序列的變異(例如Middleton等，見上述；Reisman等，見上述)。該序列可以還包含尚待獲得的orip序列的變異，只要這類突變的序列按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(例如Muddleton等，見上述；Reisman等，見上述)測定，能夠提供基因組外DNA的自主復(fù)制即可。此外，在平行重組方法和反向重組方法中，該復(fù)制起點(diǎn)可以是能夠在包括非真核或單細(xì)胞真核細(xì)胞(例如原核生物和酵母)在內(nèi)的任何細(xì)胞中起作用的任一復(fù)制起點(diǎn)(參見例如Depamphilis，Ed.，DNA Replication in Eukaryotic Cells(Cold SpringHarbor Press，NY，1996))。
值得注意的是，oriP的生物學(xué)功能與已經(jīng)由病毒表征的許多DNA復(fù)制起點(diǎn)的生物系功能不同。即oriP允許質(zhì)粒DNA的受控復(fù)制，使得不損害細(xì)胞的存活。相反，稱為“失控復(fù)制起點(diǎn)”的其它復(fù)制起點(diǎn)在細(xì)胞周期內(nèi)允許以指數(shù)速率進(jìn)行DNA復(fù)制，最終可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡，隨該載體上存在的其它基因而定。這類失控復(fù)制起點(diǎn)包括(但不限于)SV40、BK、多瘤病毒、Ad和HSV-1的復(fù)制起點(diǎn)。最好這些失控復(fù)制起點(diǎn)也可以用于本發(fā)明的方法和載體中，并且可以用于細(xì)胞殺傷以外的應(yīng)用。當(dāng)然，可能需要其它輔助因子共同為該細(xì)胞供應(yīng)在該細(xì)胞中適當(dāng)起作用的原點(diǎn)。
特別是，采用多瘤病毒的失控復(fù)制起點(diǎn)(例如Muller，Mol.CellBio1，8，5000-5015(1988)和GenBank資料庫登記號J02288或PLY2CG中描述的)時(shí)，需要病毒的大T抗原起始病毒DNA的復(fù)制。該蛋白通過結(jié)合到復(fù)制起點(diǎn)區(qū)內(nèi)，將其附近的DNA解旋并允許其它細(xì)胞酶(諸如DNA聚合酶)起作用而起作用。因此，采用這一多瘤病毒的復(fù)制原點(diǎn)時(shí)，最好至少也將病毒T抗原提供給該細(xì)胞，例如或者作為一個(gè)編碼序列(例如第一、第二或其它編碼序列)或作為過客基因(即以順式或反式)。也可以從外部提供病毒T抗原。在某些情況下，可能需要提供其它允許因子，例如以使病毒復(fù)制最適化。希望使用的多瘤病毒原點(diǎn)為小鼠多瘤病毒原點(diǎn)。然而，該原點(diǎn)也優(yōu)選人的或其它的多瘤病毒原點(diǎn)。編碼這些原點(diǎn)的序列以及這些序列的變異是本領(lǐng)域已知的(Muller，見上述)。
同樣地，可以使用允許每個(gè)細(xì)胞獲得多拷貝附加體的原點(diǎn)。例如乳突瘤病毒原點(diǎn)(如GenBank資料庫登記號PAPABPV1中描述的，在GenBank資料庫登記號X02346中描述了BPV1的整個(gè)基因組，而在GenBank資料庫登記號D00146中描述了BPV4的早期編碼序列)可以用于本發(fā)明的載體中。乳突瘤病毒基因組在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中作為多拷貝質(zhì)粒而保持。使用這一乳突瘤病毒原點(diǎn)時(shí)，希望也將該病毒的E1蛋白提供給該細(xì)胞(例如作為一個(gè)順式或反式定位的編碼序列或過客基因，或由外部提供)。在某些情況下，也可能希望同樣為該細(xì)胞供應(yīng)病毒的E2蛋白源，以使復(fù)制最適化。乳突瘤病毒原點(diǎn)和E1蛋白和E2蛋白是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可以使用這些序列或這些序列的變異(參見例如Pirsoo等，EMBO J，15，1-11(1996)，Grossel等，Virology.217，301-310(1996))。特別是，該乳突瘤病毒原點(diǎn)最好是牛乳突瘤病毒原點(diǎn)?；蛘?，該乳突瘤病毒最好是人乳突瘤病毒，但可以是該病毒的任何其它來源。
盡管同樣賦予環(huán)狀DNA元件在宿主細(xì)胞基因組內(nèi)自主復(fù)制能力的這些和其它復(fù)制起點(diǎn)可以用來代替oriP，但使用oriP原點(diǎn)時(shí)，也可以將EBNA-1供應(yīng)給該細(xì)胞。對于其它細(xì)胞復(fù)制蛋白，可以以所描述的將重組酶傳遞到細(xì)胞的相同方式，從外部提供EBNA-1蛋白，或可以提供對oriP為順式或反式的EBNA-1編碼序列。盡管缺乏EBNA-1蛋白時(shí)具有oriP的質(zhì)?？梢苑€(wěn)定地保持在感染EBV的細(xì)胞中(Lupton等，見上述；Teshigawara等，Nuc.Acids Res.，20，2607(1992))，但在EBV感染時(shí)，EBNA-1的編碼序列與oriP一起組成缺乏EBV衍生的環(huán)狀質(zhì)粒在培養(yǎng)細(xì)胞中穩(wěn)定保持的基本的必需組分。此外，如本文進(jìn)一步描述的，平行重組方法可以用來將Rep蛋白(以及其它蛋白)傳遞到?jīng)]利用復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)胞中。
通過應(yīng)用在該載體內(nèi)包含第一和第二重組位點(diǎn)(圖1A中的FRS和SRS)的重組系統(tǒng)和作用于該載體第一和第二重組位點(diǎn)以在第一和第二重組位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn)重組的位點(diǎn)特異性重組酶，完成從平行重組載體上切下該附加體或小質(zhì)粒及其隨后的環(huán)化。在單個(gè)DNA分子上存在平行布置的兩個(gè)重組位點(diǎn)導(dǎo)致由適當(dāng)?shù)闹亟M酶切下該間插序列，以便形成一個(gè)閉環(huán)分子。通過應(yīng)用EBNA-1或具有相似功能的蛋白，可以在子細(xì)胞之間分配該附加體，EBNA-1看來是通過結(jié)合到宿主細(xì)胞基因組和oriP(或其它復(fù)制起點(diǎn))上而起作用的，并且基本上將該附加體拉到新生細(xì)胞中。
因此，通過在該載體的兩個(gè)平行重組位點(diǎn)之間編碼oriP或在哺乳動(dòng)物中有功能的其它復(fù)制起點(diǎn)，當(dāng)適當(dāng)?shù)貙⒅亟M酶用于該細(xì)胞時(shí)，將通過重組產(chǎn)生一個(gè)附加體。即提供給將該平行重組載體內(nèi)在化的細(xì)胞這一位點(diǎn)特異性重組酶時(shí)，該平行重組載體(如圖1A例舉的)在第一和第二重組位點(diǎn)之間重組，以便形成一個(gè)附加體(如圖1C中例舉的)。同樣可以產(chǎn)生在平行重組位點(diǎn)之間不存在復(fù)制起點(diǎn)的小質(zhì)粒。當(dāng)一個(gè)病毒載體用作一個(gè)附加體或小質(zhì)粒傳遞載體時(shí)，重組事件的第二產(chǎn)物(如圖1B例舉的)為一個(gè)縮短的病毒，而使用質(zhì)粒時(shí)，同樣地將產(chǎn)生縮短的質(zhì)粒或小質(zhì)粒。
該載體最好還包含重組酶的編碼序列，特別是Cre的編碼序列。該載體最好也能包含一個(gè)或多個(gè)其它編碼序列，諸如第一編碼序列、第二編碼序列和/或第三編碼序列，和/或包含一個(gè)啟動(dòng)子的另外的編碼序列，諸如一個(gè)過客基因。因此，在平行重組方法中，該載體最好還包含一個(gè)過客基因。該過客基因最好位于第一和第二重組位點(diǎn)之間，如圖1A的平行重組載體中描述的，產(chǎn)生攜帶該過客基因(PG)的附加體，如圖1C中描述的。
同樣地，該載體最好還包含一個(gè)編碼序列。這一編碼序列可以是任一適宜的編碼序列，最好為EBNA-1或Rep的編碼序列或本領(lǐng)域已知和已經(jīng)描述的這些序列的各種變異(參見例如Yates等，(1985)，見上述；Lupton等，見上述；Middleton等，J.Virol.，66，1795-1798(1992)；Levitskaya等，見上述)。使用oriP之外的復(fù)制起點(diǎn)時(shí)，可以同樣提供作為一個(gè)編碼序列的其它病毒復(fù)制蛋白(例如大T抗原、E1或E1和E2)。希望該編碼序列位于含有該復(fù)制起點(diǎn)的第一和第二重組位點(diǎn)之間，產(chǎn)生攜帶該編碼序列的一個(gè)附加體。
根據(jù)這些方法，該平行重組方法使得可以通過重組事件，調(diào)節(jié)上游或下游的一個(gè)編碼序列，或同時(shí)調(diào)節(jié)上游一個(gè)編碼序列和下游另一個(gè)編碼序列。例如如圖1A所示，第一編碼序列(FCS)可以位于第一和第二重組位點(diǎn)(FRS和SRS)之間，其定向使其轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺牡谝恢亟M位點(diǎn)(FRS)至第二重組位點(diǎn)(SRS)。在同一DNA分子上，一個(gè)啟動(dòng)子(P)可以位于FCS和SRS之間，使得P能夠轉(zhuǎn)錄SRS下游的一個(gè)編碼序列。在這一情況下，在重組之前，F(xiàn)CS不轉(zhuǎn)錄為新生的mRNA。然而在重組后，由于重組事件將FCS置于P的控制下，因此將轉(zhuǎn)錄FCS。
平行重組方法也使得可以通過重組事件，調(diào)節(jié)下游一個(gè)編碼序列的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)調(diào)節(jié)上游另一編碼序列。即如果一個(gè)第二編碼序列(SCS)恰好位于P下游，并且操作性地連接P，使得P能夠控制SCS的表達(dá)，那么在重組前轉(zhuǎn)錄SCS。在重組后，先前命令SCS轉(zhuǎn)錄的P將置于FCS的上游，因此轉(zhuǎn)錄FCS，而不轉(zhuǎn)錄SCS。然而，在重組前該啟動(dòng)子不必控制任何下游序列的表達(dá)。同樣地，該啟動(dòng)子在重組后不必控制另一編碼序列的表達(dá)。該方法也可以例如在缺乏FCS時(shí)通過將SCS加入圖1A的載體中，允許獨(dú)立地調(diào)節(jié)下游單個(gè)編碼序列。
因此，在可以用來調(diào)節(jié)上游一個(gè)編碼序列的平行重組方法的一個(gè)實(shí)施方案中，最好進(jìn)行這樣的方法，其中(a)該編碼序列位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該原點(diǎn)的區(qū)域中，并鄰接第一重組位點(diǎn)，使得該編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺牡谝恢亟M位點(diǎn)通過該編碼序列進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)，(b)該編碼序列不操作性地連接任何啟動(dòng)子，以及(c)一個(gè)啟動(dòng)子位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該原點(diǎn)的區(qū)域中，并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，使得該啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺牡谝恢亟M位點(diǎn)通過該啟動(dòng)子進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)。在第一重組位點(diǎn)和該編碼序列之間最好沒有編碼序列、啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。
用來調(diào)節(jié)上游一個(gè)編碼序列表達(dá)的載體最好還包含一個(gè)第二編碼序列，后者位于在第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)區(qū)域外的一個(gè)區(qū)域中，并鄰接第二重組位點(diǎn)，該第二編碼序列操作性地連接該啟動(dòng)子。該方法便于同時(shí)調(diào)節(jié)上游和下游獨(dú)立的編碼序列。在該啟動(dòng)子和該第二編碼序列之間最好沒有編碼序列、啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。
在不調(diào)節(jié)上游另一序列的情況下，可以用來獨(dú)立地調(diào)節(jié)下游一個(gè)編碼序列的平行重組方法的另一實(shí)施方案中，最好進(jìn)行這樣的方法，其中(a)一個(gè)啟動(dòng)子位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該原點(diǎn)的區(qū)域中，并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，使得該啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺牡谝恢亟M位點(diǎn)通過該啟動(dòng)子進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)，并且(b)該編碼序列位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該原點(diǎn)區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中，并鄰接第二重組位點(diǎn)，使得該編碼序列操作性地連接該啟動(dòng)子。
當(dāng)該附加體傳遞載體還攜帶一個(gè)過客基因時(shí)，最好也可以使用這些其它方法。此外，為了在重組后優(yōu)化由該編碼序列編碼的蛋白的生產(chǎn)，在用于平行重組方法中的載體中可以包括剪接供體位點(diǎn)和剪接受體位點(diǎn)。
按照本發(fā)明，任何啟動(dòng)子(例如由于重組與一個(gè)編碼序列連接的一個(gè)啟動(dòng)子以及作為一個(gè)過客基因一部分存在的啟動(dòng)子)不管是從天然分離的，還是由重組DNA或合成技術(shù)生產(chǎn)的，都可以用來提供基因轉(zhuǎn)錄，只要該啟動(dòng)子最好能夠指導(dǎo)真核(希望是哺乳動(dòng)物)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄即可。
適于在真核細(xì)胞中表達(dá)的DNA序列(即“真核啟動(dòng)子”)不同于適于在原核細(xì)胞中表達(dá)的那些DNA序列。一般來講，真核啟動(dòng)子和伴隨的遺傳信號在原核系統(tǒng)中不被識別或不起作用，原核啟動(dòng)子在真核細(xì)胞中不被識別或不起作用。
在真核生物中起作用的啟動(dòng)子的序列比較已經(jīng)揭示出保守序列元件。一般來講，由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的真核啟動(dòng)子的特征為中心約在-25位的“TATA盒”，后者看來是轉(zhuǎn)錄起始精確定位所必需的。TATA盒在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中指導(dǎo)RNA聚合酶開始轉(zhuǎn)錄下游大約30bp。TATA盒通常與至少兩個(gè)位于轉(zhuǎn)錄起始上游大約40bp和110bp的其它上游序列結(jié)合而起作用。所謂的“CCAAT盒”通常作為兩個(gè)上游序列中的一個(gè)，另一個(gè)序列通常為富含GC的區(qū)段(例如由例如序列GGGCGG或序列GCCACACCC和ATGCAAAT組成的“GC盒”)。CCAAT的同源性可以位于該DNA的不同鏈上。上游啟動(dòng)子元件也可以是一個(gè)特定信號，諸如本領(lǐng)域已經(jīng)描述并且似乎表征某個(gè)基因亞組的那些信號。
為了起始轉(zhuǎn)錄，TATA盒和上游序列分別由與這些位點(diǎn)結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白識別，并通過使RNA聚合酶II結(jié)合該DNA區(qū)段而激活轉(zhuǎn)錄，并適當(dāng)?shù)仄鹗嫁D(zhuǎn)錄。在TATA盒和上游序列內(nèi)堿基的改變實(shí)際上可以降低轉(zhuǎn)錄速率(例如Myers等，Science，229，242-7(1985)；McKnight等，Science，217，316-324(1982))。這些元件相互之間和相對于起始位點(diǎn)的位置和定向?qū)δ承?但不是所有的)編碼序列的有效轉(zhuǎn)錄是重要的。例如，某些啟動(dòng)子在缺乏TATA盒時(shí)很好地起作用。同樣地，由RNA聚合酶I或III或其它RNA聚合酶識別的啟動(dòng)子的這些和其它序列的需要可以不同。
因此，啟動(dòng)子區(qū)域的長度和序列不同，可以還包括一個(gè)或多個(gè)序列特異性DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)和/或一個(gè)增強(qiáng)子或沉默子。本發(fā)明優(yōu)先采用CMV啟動(dòng)子或P5啟動(dòng)子作為調(diào)節(jié)一個(gè)感興趣的基因或編碼序列(例如本文進(jìn)一步描述的“第一編碼序列”或“第二編碼序列”)的啟動(dòng)子。這類啟動(dòng)子及其突變是本領(lǐng)域已知的和已經(jīng)描述的(參見例如Hennighausen等，EMBO J.，5，1367-1371(1986)；Lehner等，J.Clin.Microbiol.，29，2494-2502(1991)；Lang等，Nucleic Acids Res，20，3287-95(1992)；Srivastava等，J.Virol.45，555-564(1983)；Green等，J.Virol，36，79-92(1980)；Kysti等，見上述)。然而，也可以使用其它啟動(dòng)子，諸如Ad2或Ad5的主要晚期啟動(dòng)子和三分前導(dǎo)序列、勞氏肉瘤病毒(RSV)的長末端重復(fù)序列和諸如文獻(xiàn)中已經(jīng)描述的其它組成型啟動(dòng)子。例如，可以使用皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子(Wagner等，Proc Natl.Acad.Sci.，78，144-145(1981))、金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster等，Nature，296，39-42(1982))、來自酵母或其它真菌的啟動(dòng)子元件，諸如Gal4啟動(dòng)子、乙醇脫氫酶啟動(dòng)子、磷酸甘油激酶啟動(dòng)子和堿性磷酸酶啟動(dòng)子。同樣地，可以使用由哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組分離的啟動(dòng)子或由生長于這些細(xì)胞中的病毒(例如Ad、SV40、CMV等等)分離的啟動(dòng)子。
除使用組成型啟動(dòng)子外，最好也可以響應(yīng)適當(dāng)?shù)男盘柖{(diào)節(jié)上游和/或調(diào)節(jié)下游的該啟動(dòng)子。例如，可以使用諸如IL-8啟動(dòng)子之類的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，后者響應(yīng)TNF或另一細(xì)胞因子。適宜的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)的其它實(shí)例包括(但不限于)金屬硫蛋白誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)、細(xì)菌lac表達(dá)系統(tǒng)和T7聚合酶系統(tǒng)。此外，可以使用在不同發(fā)育階段選擇性激活的啟動(dòng)子(例如球蛋白基因在胚和成體中進(jìn)行分化性轉(zhuǎn)錄)。特別是，可以使用能由外源因子(諸如四環(huán)素)或合成激素(諸如RU-486)調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子(和同樣可以提供給該細(xì)胞的伴隨調(diào)節(jié)因子)全是本領(lǐng)域已經(jīng)描述的(參見例如Delort等，Human Gene Therapy，7，809-820(1996)；Clontech，CLONTECHniques.“Tet-offTM和Tet-onTM基因表達(dá)系統(tǒng)和細(xì)胞系”，第XI卷，第3期，2-5(1996年7月))。
另一選擇是采用組織特異性啟動(dòng)子(即在給定組織中優(yōu)先激活并導(dǎo)致激活組織中基因產(chǎn)物表達(dá)的啟動(dòng)子)，諸如用于白蛋白和α-抗胰蛋白酶的肝細(xì)胞特異性啟動(dòng)子(Frain等，Mol.Cell Biol.，10991-999(1990)；Ciliberto等，Cell 41531-540(1985)；Pinkert等，Genes and Devel.，1，268-276(1987)；Kelsey等，Genes and Devel.，1，161-171(1987))、在胰腺泡細(xì)胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(qū)(例如Swift等，Cell，38，639-646(1984)；MacDonald，Hepatology，7，425-515(1987))、在胰β細(xì)胞中有活性的胰島素基因控制區(qū)(Hanahan，Nature，315，115-122(1985))、在睪丸細(xì)胞、乳房細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞和肥大細(xì)胞中有活性的小鼠乳房腫瘤病毒控制區(qū)(Leder等，Cell，45，485-495(1986))、在腦中少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中有活性的髓磷脂堿性蛋白基因控制區(qū)(Readhead等，Cell，48，703-712(1987))和在丘腦下部有活性的促性腺釋放素基因控制區(qū)(Mason等，Science，234，1372-1378(1986))。同樣地，在該載體中可以使用諸如用于結(jié)腸癌的癌胚抗原(Schrewe等，Mol.Cell Biol.102738-2748(1990))之類的腫瘤特異性啟動(dòng)子。按照本發(fā)明，可以通過誘變改變?nèi)魏螁?dòng)子，只要它具有所需的結(jié)合能力和啟動(dòng)子強(qiáng)度即可。
此外，現(xiàn)在已知通過將激素受體的C-末端配體結(jié)合域融合到特殊蛋白的編碼序列上，可以獲得誘導(dǎo)活性(參見例如Kellendock等，Nucleic Acids Res，24，1404-1411(1996)；Metzger等，Proc.Natl.Acad.Sci.，92，6991-6995(1995))。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于，當(dāng)用來創(chuàng)造一個(gè)重組酶融合物時(shí)，它賦予重組事件誘導(dǎo)性，并且在結(jié)合類固醇受體的外源物質(zhì)控制下。然而，該方法最好也用于按照本發(fā)明的任何編碼序列(例如第一和第二編碼序列)和/或任何過客基因。特別是，最好采用能夠結(jié)合異源(但不是天然產(chǎn)生的)類固醇的激素受體的配體結(jié)合域(例如一個(gè)激素結(jié)合域)，使用該方法。例如，可以使用突變的激素黃體酮受體(hPR891)的配體結(jié)合域，后者對低水平的合成類固醇(諸如RU-486)反應(yīng)，但對內(nèi)源類固醇不反應(yīng)(Kellendock等，見上述)?；蛘?，可以將來自雌激素、糖皮質(zhì)激素和雄激素受體的配體結(jié)合域與重組酶或其它編碼序列融合。本領(lǐng)域也已經(jīng)描述了其它相似的方法，在此可以用來或者通過創(chuàng)造產(chǎn)生嵌合蛋白的翻譯融合，或者通過將該基因置于外源物質(zhì)控制下的轉(zhuǎn)錄融合，提供該重組酶活性或由按照本發(fā)明的配體依賴性編碼序列編碼的其它蛋白的活性，如前所述。此外，諸如雷帕霉素之類的獨(dú)特蛋白允許通常相互忽視的蛋白進(jìn)行連接，增加對本文描述系統(tǒng)的另一水平的控制(參見例如Balter等，Science，273，183(1996)；Choi等，Science，273，239-242(1996))。
此外，在某些情況下，用來自主復(fù)制載體的原點(diǎn)也可以包含起啟動(dòng)子作用的序列(例如由于DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的緊密纏繞)。例如，多瘤病毒原點(diǎn)含有一個(gè)組成型啟動(dòng)子，可以用來例如驅(qū)動(dòng)一個(gè)過客基因的表達(dá)。同樣地，牛乳突瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)包含一個(gè)由乳突瘤病毒E2蛋白誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。在按照本發(fā)明的載體中，該原點(diǎn)可以潛在地用作基因工具。同樣地，EBV原點(diǎn)含有在EBNA-1存在下起增強(qiáng)子作用的重復(fù)序列。這些重復(fù)序列例如在進(jìn)行重組介導(dǎo)的調(diào)節(jié)上游的EBNA-1時(shí)，可以用來調(diào)節(jié)上游一個(gè)基因的表達(dá)。
普通技術(shù)人員知道，諸如轉(zhuǎn)錄、mRNA翻譯和翻譯后加工之類的不同的遺傳信號和加工事件控制細(xì)胞中核酸和蛋白/肽的水平。將DNA轉(zhuǎn)錄為RNA需要一個(gè)功能啟動(dòng)子。RNA聚合酶可以在特定信號上進(jìn)行識別、起始和終止轉(zhuǎn)錄的效率調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄量。這些步驟以及新生mRNA的延伸和其它步驟都易受同樣存在于該細(xì)胞中的各種其它組分的影響，例如受可能是轉(zhuǎn)錄過程部分的其它蛋白、該細(xì)胞中存在的核糖核酸濃度等等的影響。
蛋白的表達(dá)也取決于由DNA信號和DNA模板水平調(diào)節(jié)的RNA轉(zhuǎn)錄水平。同樣地，mRNA的翻譯起碼需要一個(gè)起始密碼子(最好是AUG起始密碼子)，后者通常位于該信使5’端的10-100個(gè)核苷酸內(nèi)。在AUG起始密碼子側(cè)翼的序列已經(jīng)表明影響真核核糖體的識別，與導(dǎo)致最佳翻譯的理想的Kozak共有序列一致(參見例如Kozak，J.Molec.Biol.，196，947-950(1987))。此外，外源核酸序列在細(xì)胞中的成功表達(dá)可能需要所產(chǎn)生的蛋白/肽的翻譯后修飾。因此，一個(gè)重組蛋白或肽的生產(chǎn)可能受DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA的效率、mRNA翻譯為蛋白質(zhì)的效率和該細(xì)胞進(jìn)行翻譯后修飾的能力的影響。這些都是普通技術(shù)人員知道并能夠采用標(biāo)準(zhǔn)方法操作，以達(dá)到所需最終結(jié)果的所有因素。
根據(jù)這些方法，為了優(yōu)化重組后的蛋白生產(chǎn)，用來同時(shí)調(diào)節(jié)上游和下游各個(gè)編碼序列的載體最好還包含(a)一個(gè)剪接受體位點(diǎn)，位于在第一重組位點(diǎn)和該編碼序列之間包含該原點(diǎn)區(qū)域中的第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間，(b)一個(gè)剪接供體位點(diǎn)，位于在第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間包含該原點(diǎn)區(qū)域中的該啟動(dòng)子和第二重組位點(diǎn)之間，以及(c)一個(gè)剪接受體位點(diǎn)，位于在第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間包含該原點(diǎn)區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中的第二重組位點(diǎn)和第二編碼序列之間。
普通技術(shù)人員也知道，對某些免疫原蛋白的免疫應(yīng)答可導(dǎo)致體內(nèi)該蛋白水平的降低。Cre蛋白是這樣一種可以對其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的蛋白的實(shí)例。相比之下，EBV的EBNA-1蛋白有效地逃避免疫系統(tǒng)的探測。因此，本發(fā)明也提供一種方法，提供Cre或用于本發(fā)明正文中不被免疫系統(tǒng)察覺的其它相似的免疫原蛋白。該方法包括將多拷貝EBNA-1蛋白的甘氨酸-丙氨酸重復(fù)(或其保守變異)置于該蛋白的或者C-末端或者N-末端。這種放置最好在編碼序列(例如第一或第二編碼序列、其它編碼序列或過客基因)中的DNA水平上進(jìn)行。該甘氨酸-丙氨酸重復(fù)是本領(lǐng)域已知的(參見例如Yates等，見上述；Lupton等，見上述；Levitskaya等，見上述)。這最好通過在目的編碼序列的或者5’端或者3’端加入該甘氨酸-丙氨酸重復(fù)的核酸序列(或其變異體)來進(jìn)行。特別是，也可以采用前述配體結(jié)合域使用該方法。如圖2A-2F中描述的，可以將該甘氨酸-丙氨酸重復(fù)(Gly Ala)用于與該編碼序列(CS)和配體結(jié)合域(HBD)(如果存在)相對的多個(gè)位置中。
平行重組方法可以用來提供基因和編碼序列的暫時(shí)的調(diào)節(jié)。例如，第一編碼序列可以是前述EBNA-1或Rep的編碼序列。同樣地，第二編碼序列可以包括前述Cre或Flp的編碼序列。然而，更一般的是，不是第一編碼序列就是第二(或其它)編碼序列可以包含不是EBNA-1、Rep、Flp、Cre、大T抗原、E1，就是E2編碼序列。
由于重組事件而進(jìn)行的調(diào)節(jié)也可以用來提供重組酶編碼序列的暫時(shí)表達(dá)。即重組酶的編碼序列可以位于圖1A中的SCS位置中。切下該附加體后，該宿主細(xì)胞中不再生產(chǎn)該重組酶。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于，最好在附加體產(chǎn)生后不產(chǎn)生重組酶活性。這降低該附加體重新整合的可能性或由于分子間重組引起的多聚化。
根據(jù)同樣的方法，EBNA-1的編碼序列可以位于圖1A中的FCS位置中。由于在病毒生產(chǎn)期間，EBNA-1介導(dǎo)的順式oriP的復(fù)制(即當(dāng)病毒用作附加體傳遞載體時(shí))在某些情況下可能導(dǎo)致不希望的基因組的不穩(wěn)定性和產(chǎn)量的降低，因此這允許調(diào)節(jié)EBNA-1編碼序列的表達(dá)，這是有利的。如果EBNA-1編碼序列作為FCS提供，那么當(dāng)最需要它時(shí)，其表達(dá)將僅僅發(fā)生在該附加體切下之后。
通過將SRS置于一個(gè)內(nèi)含子內(nèi)，可以將EBNA-1或由P命令轉(zhuǎn)錄的編碼序列(即FCS或SCS)編碼的任何蛋白的生產(chǎn)最大化。這排除了在SRS內(nèi)存在的任何意外的起始密碼子上起始的可能性，同樣排除了任何融合蛋白的形成。如圖1A所述，這可以通過將多個(gè)剪接受體位點(diǎn)(SA)置于FRS和FCS之間以及SRS和SCS之間，并且將一個(gè)剪接供體位點(diǎn)(SD)也置于P和SRS之間來完成。通過將加A位點(diǎn)恰好置于FCS、SCS或TG序列編碼區(qū)的下游，同樣可以使FCS、SCS或TG編碼的蛋白生產(chǎn)最大化。
用來控制EBNA-1表達(dá)的方法同樣可以用作控制AAV的Rep蛋白轉(zhuǎn)錄和隨后翻譯的方法。希望嚴(yán)格調(diào)節(jié)Rep基因的暫時(shí)表達(dá)和表達(dá)水平，以避免兩個(gè)潛在的問題。第一，與EBNA-1相似，當(dāng)將一個(gè)病毒用作附加體傳遞載體時(shí)，在病毒生產(chǎn)期間，宿主細(xì)胞中Rep蛋白的存在可能引起病毒不穩(wěn)定并降低產(chǎn)量。第二，Rep基因的過量表達(dá)對該細(xì)胞有細(xì)胞毒性，并且可能引起免疫應(yīng)答。將Rep編碼序列克隆到圖1A中的FCS位置中，可以避免這些潛在的問題。這確保在病毒生產(chǎn)期間缺乏Rep基因的表達(dá)。感染并將重組酶傳遞到含有Rep編碼載體的細(xì)胞時(shí)(例如或者通過在同一載體上供應(yīng)可能作為SCS的重組酶編碼序列，或者在共同給予的載體上供應(yīng)重組酶編碼序列)，將發(fā)生重組，將P帶到Rep編碼序列的上游，將Rep編碼序列置于P的控制下。Rep基因的天然啟動(dòng)子P5啟動(dòng)子可以用作P，因?yàn)樵搯?dòng)子應(yīng)該命令適當(dāng)水平的Rep基因表達(dá)，以允許Rep介導(dǎo)基因組的整合而沒有細(xì)胞毒性作用或引起免疫應(yīng)答。
當(dāng)存在Rep蛋白時(shí)，側(cè)翼為一個(gè)或多個(gè)AAV ITR的序列優(yōu)先整合到人第19染色體上。因此在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，該編碼序列為Rep編碼序列。該載體最好還包含一個(gè)或多個(gè)(例如第一和第二)腺病毒相關(guān)病毒的ITR。在本發(fā)明方法中，由于理論上ITR與位置無關(guān)的，因此可以使用AAV ITR的多個(gè)位置。因此，在該方法中，一個(gè)或多個(gè)AAV的ITR最好位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該原點(diǎn)的區(qū)域中。然而，一個(gè)或多個(gè)ITR也可以位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該原點(diǎn)區(qū)域之外的一個(gè)區(qū)域中。將一個(gè)或多個(gè)AAV的ITR恰好定位于該過客基因的側(cè)翼，將允許該基因整合到另一遺傳位置中。也可以將一個(gè)或多個(gè)AAV的ITR如此定位，使得在Rep介導(dǎo)重組時(shí)Rep蛋白失活。例如，一個(gè)或多個(gè)AAV的ITR可以置于編碼Rep的FCS和一個(gè)下游加A位點(diǎn)之間。這樣，Rep介導(dǎo)的將附加體序列重組到另一遺傳位點(diǎn)使Rep編碼序列與加A位點(diǎn)分離，那么由于轉(zhuǎn)錄物在真核細(xì)胞中易于降解，因此消除Rep活性，除非轉(zhuǎn)錄物多聚腺苷酸化。同樣地，采用本發(fā)明的平行重組方法，可以同樣地調(diào)節(jié)、激活或失活其它基因。
或者，通過提供用平行重組方法產(chǎn)生的小質(zhì)粒編碼的Rep蛋白，可以將Rep蛋白傳遞到細(xì)胞中。如前所述的該方法包括，通過采用包含位于兩個(gè)直接重復(fù)的重組位點(diǎn)之間的感興趣的序列的載體，產(chǎn)生一個(gè)含有Rep蛋白編碼序列或其它蛋白編碼序列的小質(zhì)粒，其中沒有同樣位于重組位點(diǎn)之間的復(fù)制起點(diǎn)。
因此，將Rep蛋白提供給細(xì)胞的方法包括(a)將該細(xì)胞與一種載體接觸，使得該載體被該細(xì)胞內(nèi)在化，該載體包含位于平行布置的第一和第二重組位點(diǎn)之間的一個(gè)Rep編碼序列，以及(b)為該細(xì)胞提供一個(gè)位點(diǎn)特異性重組酶，該酶在該載體的第一和第二重組位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn)重組。最好Rep編碼序列操作性地與該載體內(nèi)的一個(gè)啟動(dòng)子連接，或由于重組事件Rep編碼序列操作性地與該載體內(nèi)的一個(gè)啟動(dòng)子連接。
該方法最好如下進(jìn)行，其中(a)Rep編碼序列鄰接第一重組位點(diǎn)，使得該編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺牡谝恢亟M位點(diǎn)通過該編碼序列進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)，(b)該編碼序列不操作性地與任何啟動(dòng)子連接，以及(c)一個(gè)啟動(dòng)子位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該編碼序列的區(qū)域內(nèi)，并鄰接第二重組位點(diǎn)，使得該啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺牡谝恢亟M位點(diǎn)通過該編碼序列進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)。
此外，用于傳遞Rep蛋白的載體最好還包含第一和第二腺病毒相關(guān)病毒的ITR。最好一個(gè)或多個(gè)ITR位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該編碼序列的區(qū)域內(nèi)?；蛘撸粋€(gè)或多個(gè)ITR位于第一和第二重組位點(diǎn)之間包含該原點(diǎn)區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域內(nèi)。
這些平行重組方法實(shí)施方案中的一些在圖3A-3X中進(jìn)行了描述。具體地講，圖3A描述了這樣一個(gè)本發(fā)明方法，其中提供給細(xì)胞一種載體，它包含平行重組位點(diǎn)(FRS和SRS)和一個(gè)位于這些位點(diǎn)之間的原點(diǎn)。最好也為細(xì)胞提供或者順式或者反式的重組酶。用于該方法的載體(或者線性或者環(huán)狀)最好也包含一個(gè)編碼序列(CS)，后者可以位于該載體的任何位置上(圖3B)，在第一和第二重組位點(diǎn)之間并含ori的區(qū)域中(圖3C)，或在第一和第二重組位點(diǎn)之間的區(qū)域之外的一個(gè)區(qū)域中(圖3D)。該載體最好還能包含位于該載體任何位置的一個(gè)或多個(gè)ITR(圖3E)，和/或可以包含一個(gè)或多個(gè)過客基因(PG；圖3F)。
當(dāng)一個(gè)啟動(dòng)子位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該原點(diǎn)的區(qū)域中時(shí)，該平行重組方法可以用來通過重組事件，調(diào)節(jié)下游一個(gè)編碼序列(圖3G)，調(diào)節(jié)上游一個(gè)編碼序列(圖3H)，或同時(shí)調(diào)節(jié)上游一個(gè)第一編碼序列(CS)和下游一個(gè)第二編碼序列(SCS；圖3I)。可以將一個(gè)或多個(gè)剪接供體(SD)和/或剪接受體(SA)位點(diǎn)加入該載體中，以使蛋白生產(chǎn)最適化(圖3J)。
采用一個(gè)啟動(dòng)子位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并含ori的區(qū)域之外一個(gè)區(qū)域中的載體，同樣可以完成通過重組事件實(shí)現(xiàn)的基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。這樣一種載體可以用來通過重組事件，調(diào)節(jié)上游一個(gè)編碼序列(圖3K)，或同時(shí)調(diào)節(jié)上游一個(gè)第一編碼序列和下游一個(gè)第二編碼序列(圖3L)。也可以采用通過重組事件同時(shí)調(diào)節(jié)上游一個(gè)第一和第二編碼序列的第二啟動(dòng)子(SP)，使用該平行重組方法(圖3M)。此外，可以將一個(gè)第三編碼序列插入該載體第一啟動(dòng)子和第一重組位點(diǎn)之間(圖3N)。特別是，當(dāng)?shù)谌幋a序列的定向與第一啟動(dòng)子方向(圖3N)相同時(shí)，通過該重組事件可以產(chǎn)生雙順反子信使(例如當(dāng)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)也適當(dāng)?shù)匚挥谠撦d體中時(shí))。當(dāng)?shù)谌幋a序列的定向與第一啟動(dòng)子方向(圖3N)相反時(shí)，通過重組事件調(diào)節(jié)下游的第三編碼序列，同時(shí)調(diào)節(jié)上游的第一編碼序列(例如最好當(dāng)剪接供體和受體位點(diǎn)適當(dāng)?shù)匚挥谠撦d體中時(shí))。
特別是，平行重組方法提供一個(gè)便利的方法，將Rep蛋白提供給細(xì)胞，例如其中Rep基因最初是沉默的，通過重組事件調(diào)節(jié)上游的Rep基因(圖30)。同其它實(shí)施方案一樣，在該實(shí)施方案中，該載體還可以加入位于該載體上任何位置的一個(gè)或多個(gè)ITR(圖30)，在重組位點(diǎn)之間并含ori的區(qū)域中(圖3P)，或在該含ori區(qū)域之外(圖3Q)。
也可以采用在第一和第二重組位點(diǎn)之間不包含復(fù)制起點(diǎn)的一種載體(圖3R)進(jìn)行平行重組方法。也可以可選地進(jìn)行該方法，以將Rep或者作為存在于重組事件形成的小環(huán)上的一個(gè)過客基因或者編碼序列傳遞到細(xì)胞(圖3S)。這樣一種載體還可以包含通過重組事件在上游受調(diào)節(jié)的另一編碼序列(圖3T)。同采用含ori的載體一樣，缺乏復(fù)制起點(diǎn)的載體可以通過重組事件，用來調(diào)節(jié)上游的一個(gè)編碼序列(圖3U)，同時(shí)調(diào)節(jié)上游一個(gè)第一編碼序列和下游一個(gè)第二編碼序列(圖3V)，以及調(diào)節(jié)上游的第一編碼序列和第二編碼序列(圖3W)。也可以采用前述的一個(gè)第三編碼序列(圖3X)應(yīng)用該實(shí)施方案。按照本發(fā)明，任一編碼序列(即第一、第二或第三)和/或該過客基因都可以編碼EBNA-1、Rep、Flp、Cre、大T抗原、E1和E2編碼序列。該方法的其它變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
b.反向重組方法反向重組方法與平行重組方法的相似之處在于，它依賴于通過適當(dāng)?shù)闹亟M系統(tǒng)(諸如最好是噬菌體P1的Cre/Lox系統(tǒng)、酵母的Flp/Frt系統(tǒng)或其它合適的重組系統(tǒng))實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組。然而，與平行重組方法相反，反向重組方法涉及的載體具有反向定位于同一DNA分子上的第一和第二重組位點(diǎn)。這種重組位點(diǎn)的另一種布置導(dǎo)致應(yīng)用重組酶時(shí)間插序列的倒位，而不是切下附加體。反向重組方法可以用來通過重組事件調(diào)節(jié)基因表達(dá)，例如通過提供調(diào)節(jié)上游或下游一個(gè)編碼序列，或同時(shí)調(diào)節(jié)上游一個(gè)編碼序列和下游一個(gè)編碼序列。
根據(jù)這些方法，在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組的反向重組方法包括(a)將該細(xì)胞與一種載體接觸，使得該載體被該細(xì)胞內(nèi)在化，其中該載體包含(i)一個(gè)啟動(dòng)子，位于反向的第一和第二重組位點(diǎn)之間并鄰接第二重組位點(diǎn)，使得該啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺牡谝恢亟M位點(diǎn)通過該啟動(dòng)子進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)，以及(ii)一個(gè)編碼序列，位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該啟動(dòng)子區(qū)域之外的一個(gè)區(qū)域中，鄰接第一重組位點(diǎn)，使得該編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向與從第一重組位點(diǎn)通過該啟動(dòng)子進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)的方向相反，其中該編碼序列不操作性地連接任何啟動(dòng)子；并且(b)提供給該細(xì)胞一個(gè)位點(diǎn)特異性重組酶，后者在該載體的第一和第二重組位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn)重組。在第一重組位點(diǎn)和該編碼序列之間最好沒有編碼序列、啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。
該方法最好還包含一個(gè)第二編碼序列，它位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該啟動(dòng)子的區(qū)域之外的一個(gè)區(qū)域中，并鄰接第二重組位點(diǎn)，該第二編碼序列操作性地連接該啟動(dòng)子。在該啟動(dòng)子和第二編碼序列之間最好沒有編碼序列、啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。
此外，反向重組方法也可以用來在不調(diào)節(jié)上游另一編碼序列的情況下調(diào)節(jié)下游單個(gè)編碼序列。該方法包括(a)將該細(xì)胞與一種載體接觸，使得該載體被該細(xì)胞內(nèi)在化，其中該載體包含(i)一個(gè)啟動(dòng)子，位于反向的第一和第二重組位點(diǎn)之間并鄰接第二重組位點(diǎn)，使得該啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺牡谝恢亟M位點(diǎn)通過該啟動(dòng)子進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)，以及(ii)一個(gè)編碼序列，位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該啟動(dòng)子區(qū)域之外的一個(gè)區(qū)域中，并鄰接第二重組位點(diǎn)，使得該編碼序列操作性地連接該啟動(dòng)子；并且(b)提供給該細(xì)胞一個(gè)位點(diǎn)特異性重組酶，后者在該載體的第一和第二重組位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn)重組。在重組后，在該啟動(dòng)子和該編碼序列之間最好沒有編碼序列、啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)插入。
此外，用來調(diào)節(jié)上游和/或下游一個(gè)編碼序列的任何載體最好可以還包含一個(gè)過客基因和/或前述的或者Rep、EBNA-1、Cre或者Flp基因的編碼序列。對于反向重組方法，任何編碼序列(例如第一、第二或其它編碼序列)和/或過客基因都可以包含EBNA-1、Rep、Flp、Cre、大T抗原、E1或E2編碼序列。
此外，為了優(yōu)化重組后的蛋白生產(chǎn)，用來同時(shí)調(diào)節(jié)上游和下游獨(dú)立編碼序列的載體最好還包含(a)一個(gè)剪接受體位點(diǎn)，位于第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間包含該啟動(dòng)子區(qū)域之外一個(gè)區(qū)域中的第一重組位點(diǎn)和該編碼序列之間，(b)一個(gè)剪接供體位點(diǎn)，位于第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間并包含該啟動(dòng)子區(qū)域中的該啟動(dòng)子和第二重組位點(diǎn)之間，以及(c)一個(gè)剪接受體位點(diǎn)，位于第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間并包含該啟動(dòng)子區(qū)域之外的一個(gè)區(qū)域中的第二重組位點(diǎn)和第二編碼序列之間。
圖4描述了結(jié)合反向重組方法使用的一個(gè)推薦載體。如圖4描述的，該反向重組載體包含一個(gè)鄰接第一重組位點(diǎn)(FRS)的第一編碼序列(FCS)，使得FCS的定向使其轉(zhuǎn)錄方向與從第一重組位點(diǎn)(FRS)至第二重組位點(diǎn)(SRS)的方向相反。由于FCS不操作性地連接任何上游啟動(dòng)子，因此它不被轉(zhuǎn)錄。放置一個(gè)第二編碼序列(SCS)，鄰接第二重組位點(diǎn)(SRS)，其定向使其轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺牡谝恢亟M位點(diǎn)(FRS)至第二重組位點(diǎn)(SRS)。
例如通過重組事件調(diào)節(jié)上游一個(gè)編碼序列的表達(dá)，但不調(diào)節(jié)下游另一編碼序列時(shí)，不必存在SCS。然而，當(dāng)存在SCS時(shí)，由于它操作性地連接位于第一和第二重組位點(diǎn)(FRS和SRS)之間的一個(gè)啟動(dòng)子(P)，因此它至少最初是轉(zhuǎn)錄的。同樣地，例如當(dāng)通過重組事件調(diào)節(jié)下游一個(gè)編碼序列的表達(dá)，但不調(diào)節(jié)上游另一編碼序列時(shí)，不必存在FCS。然而，存在FCS時(shí)，在重組后，將P置于FCS上游，F(xiàn)CS轉(zhuǎn)錄。
因此，在將重組酶用于含有該載體的細(xì)胞之前，SCS轉(zhuǎn)錄而FCS不轉(zhuǎn)錄。應(yīng)用重組酶后，重組事件將P置于FCS上游，F(xiàn)CS轉(zhuǎn)錄，而SCS不轉(zhuǎn)錄。在FCS和FRS之間以及SCS和SRS之間最好都沒有編碼序列、其它啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。
此外，為了使基因表達(dá)和蛋白生產(chǎn)最大化，可以將多個(gè)剪接受體位點(diǎn)(SA)置于FCS和FRS之間以及SCS和SRS之間。此外，可以將一個(gè)剪接供體位點(diǎn)(SD)置于P和SRS之間。同樣地，可以在FCS和SCS序列的編碼區(qū)之后插入加A位點(diǎn)。
在這樣一種重組方法中，SCS最好可以編碼一個(gè)重組酶編碼序列，并且最好FCS可以編碼一個(gè)Rep編碼序列或一個(gè)EBNA-1編碼序列。圖4中描述的反向重組載體及其變異同樣可以用于其它基因，例如用于需要適當(dāng)暫時(shí)表達(dá)的基因(諸如發(fā)育調(diào)節(jié)的基因)，或其表達(dá)必須嚴(yán)格控制的基因(諸如編碼有毒或有害蛋白的那些基因)。
此外，按照反向重組方法，也可以通過將該編碼序列置于重組位點(diǎn)之間，并將一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子置于重組位點(diǎn)之外，調(diào)節(jié)上游和/或下游一個(gè)編碼序列(例如一個(gè)Rep、EBNA-1或重組酶的編碼序列)。在允許調(diào)節(jié)上游的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括(a)將該細(xì)胞與一種載體接觸，使得該載體被該細(xì)胞內(nèi)在化，其中該載體包含(i)一個(gè)編碼序列，位于反向定向的第一和第二重組位點(diǎn)之間，并鄰接第二重組位點(diǎn)，使得該編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向與從第一重組位點(diǎn)通過該編碼序列進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)的方向相反，其中該編碼序列不操作性地連接任何啟動(dòng)子；以及(ii)一個(gè)啟動(dòng)子，位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該編碼序列區(qū)域之外的一個(gè)區(qū)域中，并鄰接第一重組位點(diǎn)，使得該啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺牡谝恢亟M位點(diǎn)通過該編碼序列進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)，并且(b)提供給細(xì)胞一個(gè)位點(diǎn)特異性重組酶，后者在該載體的第一和第二重組位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn)重組。
為了便于同時(shí)調(diào)節(jié)上游和下游單獨(dú)的編碼序列，該載體最好還包含一個(gè)第二編碼序列，后者位于第一重組位點(diǎn)和該編碼序列之間并包含該編碼序列的區(qū)域中，第二編碼序列不操作性地連接該啟動(dòng)子。
此外，在提供調(diào)節(jié)下游單個(gè)編碼序列的另一實(shí)施方案中，該方法包括(a)將該細(xì)胞與一種載體接觸，使得該載體被該細(xì)胞內(nèi)在化，其中該載體包含(i)一個(gè)編碼序列，位于反向定向的第一和第二重組位點(diǎn)之間，并鄰接第一重組位點(diǎn)，使得該編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺牡谝恢亟M位點(diǎn)通過該編碼序列進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)，以及(ii)鄰接第一重組位點(diǎn)的一個(gè)啟動(dòng)子，位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該編碼序列區(qū)域之外的一個(gè)區(qū)域中，使得該啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺牡谝恢亟M位點(diǎn)通過該編碼序列進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)，其中該編碼序列操作性地連接該啟動(dòng)子，并且(b)提供給該細(xì)胞一個(gè)位點(diǎn)特異性重組酶，后者在該載體的第一和第二重組位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn)重組。
這些載體最好還包含一個(gè)或多個(gè)過客基因。在該啟動(dòng)子和該重組位點(diǎn)之間，或在該編碼序列或第二編碼序列和該重組位點(diǎn)之間最好沒有編碼序列、啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。此外，可以將多個(gè)剪接位點(diǎn)(即剪接受體位點(diǎn)和剪接供體位點(diǎn))和加A位點(diǎn)方法加入用于前述這些方法中的載體中，以使編碼蛋白的基因表達(dá)和生產(chǎn)最大化。
圖5A-5G描述了這些反向重組方法實(shí)施方案中的一些。具體地講，描述了其中提供給細(xì)胞一個(gè)包含反向重組位點(diǎn)(FRS和SRS)的載體的本發(fā)明方法，最好也將或者順式或者反式的重組酶提供給該細(xì)胞。用于該方法的載體(或者線性或者環(huán)狀)最好也包含一個(gè)編碼序列(CS)。當(dāng)一個(gè)啟動(dòng)子位于第一和第二重組位點(diǎn)之間的區(qū)域中時(shí)，反向重組方法可以用來通過重組事件，調(diào)節(jié)上游一個(gè)編碼序列(圖5A)，調(diào)節(jié)下游一個(gè)編碼序列(圖5B)，或同時(shí)調(diào)節(jié)上游一個(gè)第一編碼序列(CS)和下游一個(gè)第二編碼序列(SCS；圖5C)?？梢詫⒁粋€(gè)或多個(gè)剪接供體(SD)和剪接受體(SA)位點(diǎn)加入該載體中，以使蛋白生產(chǎn)最適化(圖5D)。
采用在第一和第二重組位點(diǎn)之間并含ori區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中具有一個(gè)啟動(dòng)子的載體，同樣可以完成通過重組事件實(shí)現(xiàn)的基因表達(dá)的調(diào)節(jié)(例如當(dāng)使用線性底物時(shí))。這樣一種載體可以用來通過重組事件，調(diào)節(jié)上游一個(gè)編碼序列(圖5E)，調(diào)節(jié)下游一個(gè)編碼序列(圖5F)，或同時(shí)調(diào)節(jié)上游一個(gè)第一編碼序列和下游一個(gè)第二編碼序列(圖5G)。按照本發(fā)明，該載體中存在的任一編碼序列(即第一、第二和任一其它編碼序列)和/或任一過客基因都可以編碼EBNA-1、Rep、Flp、Cre、大T抗原、E1或E2編碼序列。該方法的其它改變對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。新載體盡管如上面關(guān)于本發(fā)明方法所述的，有多種可以用于本發(fā)明正文的載體，但本發(fā)明也提供一些在本發(fā)明平行重組方法和反向重組方法中特別有用的新載體。
本發(fā)明的載體包含平行定向或反向定向的第一和第二重組位點(diǎn)。第一和第二重組位點(diǎn)可以是任何適宜的重組位點(diǎn)，使得該載體被細(xì)胞內(nèi)在化和接觸適當(dāng)?shù)闹亟M酶后，在該載體的第一和第二重組位點(diǎn)之間發(fā)生重組。
關(guān)于位于本發(fā)明正文的所有載體中的重組位點(diǎn)、重組酶、編碼序列、重組位點(diǎn)之間的區(qū)域、啟動(dòng)子、過客基因等等，這類元件如前已經(jīng)描述的，它們可以作為一個(gè)盒的部分或者獨(dú)立存在，或者結(jié)合存在。在本發(fā)明的正文中，一個(gè)“盒”就是一個(gè)特殊的堿基序列，它具有便于亞克隆和回收核酸序列(例如一個(gè)或多個(gè)限制位點(diǎn))或表達(dá)(例如加A位點(diǎn)或剪接位點(diǎn))特殊核酸序列的功能。
采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法，可以完成載體的鑒定和/或選擇。例如，通過雜交、所謂“標(biāo)記”基因功能的存在和缺乏以及特殊插入序列的表達(dá)，可以鑒定含有特殊基因或編碼序列的載體。在第一種方法中，采用包含與插入核酸序列同源的序列的探針，通過雜交(例如通過DNA-DNA雜交)，可以檢測插入載體中的外源序列的存在。在第二種方法中，通過將編碼這些功能的特殊基因插入該載體中引起某些標(biāo)記基因功能(諸如抗生素抗性、胸苷激酶活性等等)的存在或缺乏，在此基礎(chǔ)上，可以鑒定和選擇重組載體/宿主系統(tǒng)。在第三種方法中，通過分析插入的核酸序列表達(dá)的外源基因產(chǎn)物，可以鑒定載體。這類分析可以基于該基因產(chǎn)物的物理性質(zhì)、免疫學(xué)性質(zhì)或功能性質(zhì)。
下面進(jìn)一步描述在平行重組方法和反向重組方法中特別有用的本發(fā)明載體。
a.平行重組載體在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的平行重組載體包含(a)平行定位的第一和第二重組位點(diǎn)，(b)位于第一和第二重組位點(diǎn)之間的一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，(c)一個(gè)編碼序列，它在第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該原點(diǎn)的區(qū)域中，并鄰接第一重組位點(diǎn)，使得該編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺牡谝恢亟M位點(diǎn)通過該編碼序列進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)，該編碼序列不操作性地連接任何啟動(dòng)子，(d)一個(gè)啟動(dòng)子，位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該原點(diǎn)的區(qū)域中，并鄰接第二重組位點(diǎn)，使得該啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺牡谝恢亟M位點(diǎn)通過該啟動(dòng)子進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)。在第一重組位點(diǎn)和該編碼序列之間最好沒有編碼序列、啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。
此外，該載體最好還包含一個(gè)第二編碼序列，后者位于第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間并包含該原點(diǎn)的區(qū)域之外的一個(gè)區(qū)域中，并鄰接第二重組位點(diǎn)，第二編碼序列操作性地連接該啟動(dòng)子。在該啟動(dòng)子和第二編碼序列之間最好沒有編碼序列、啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。該載體還可以包含其它編碼序列，例如前述的一個(gè)第三編碼序列。
為了優(yōu)化基因表達(dá)和蛋白生產(chǎn)，該載體最好還包含(a)一個(gè)剪接受體位點(diǎn)，位于第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間并包含該原點(diǎn)區(qū)域中的第一重組位點(diǎn)和該編碼序列之間，(b)一個(gè)剪接供體位點(diǎn)，位于第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間并包含該原點(diǎn)區(qū)域中的該啟動(dòng)子和第二重組位點(diǎn)之間，以及(c)一個(gè)剪接受體位點(diǎn)，位于第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間并包含該原點(diǎn)區(qū)域之外的一個(gè)區(qū)域中的第二重組位點(diǎn)和第二編碼序列之間。這樣一種載體提供一個(gè)通過提供一個(gè)附加體調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法，其中通過形成附加體的重組事件，調(diào)節(jié)上游第一編碼序列和調(diào)節(jié)下游第二編碼序列。
在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明的平行重組載體包含(a)平行定位的第一和第二重組位點(diǎn)，(b)位于第一和第二重組位點(diǎn)之間的一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，(c)一個(gè)啟動(dòng)子，位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該原點(diǎn)的區(qū)域中，并鄰接第二重組位點(diǎn)，使得該啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺牡谝恢亟M位點(diǎn)通過該啟動(dòng)子進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)，以及(d)一個(gè)編碼序列，位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該原點(diǎn)的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中，并鄰接第二重組位點(diǎn)，使得該編碼序列操作性地連接該啟動(dòng)子。
該平行重組載體內(nèi)的重組位點(diǎn)可以是上述本發(fā)明方法描述的任何適宜的重組位點(diǎn)。該平行重組載體內(nèi)的重組位點(diǎn)最好是Lox位點(diǎn)，在該情況中，該平行重組載體最好還包含或者位于第一Lox位點(diǎn)上游或者位于第二Lox位點(diǎn)下游的Cre編碼序列，或該平行重組載體內(nèi)的重組位點(diǎn)是Frt位點(diǎn)，在該情況下該平行重組載體最好還包含或者位于第一Frt位點(diǎn)上游或者位于第二Frt位點(diǎn)下游的Flp編碼序列。
該復(fù)制起點(diǎn)在前面進(jìn)行了描述，它最好包含一個(gè)EBV的oriP序列、一個(gè)多瘤病毒或乳突瘤病毒的復(fù)制起點(diǎn)或任何其它復(fù)制起點(diǎn)。采用這些(以及其它)復(fù)制起點(diǎn)，最好可以將能使細(xì)胞復(fù)制或便于細(xì)胞復(fù)制的其它蛋白提供給該細(xì)胞。在某種意義上可以認(rèn)為是“細(xì)胞復(fù)制蛋白”的這些其它蛋白最好選自EBNA-1、大T抗原、E1和E2蛋白。
該編碼序列可以是任一適宜的編碼序列。最好第一編碼序列為EBNA-1或Rep編碼序列，如本發(fā)明方法所述的。然而，第一編碼序列(和第二編碼序列或任一其它編碼序列)最好也可以包含一個(gè)Flp、Cre、大T抗原、E1和/或E2編碼序列。這樣一種載體提供一種方法，通過提供一個(gè)附加體調(diào)節(jié)基因表達(dá)，其中通過形成附加體的重組事件，調(diào)節(jié)該編碼序列。
該載體最好還包含一個(gè)過客基因，后者最好位于該編碼序列和該啟動(dòng)子之間。可以使用任一適宜的過客基因，諸如一個(gè)報(bào)道基因，或最優(yōu)選使用本發(fā)明方法正文中描述的一個(gè)治療基因。此外，本發(fā)明提供前述和附圖中描述的其它載體。
b.反向重組載體本發(fā)明的反向重組載體包含(a)一個(gè)啟動(dòng)子，位于反向定向的第一和第二重組位點(diǎn)之間并鄰接第二重組位點(diǎn)，使得該啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺牡谝恢亟M位點(diǎn)通過該啟動(dòng)子進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)，(b)一個(gè)編碼序列，位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該啟動(dòng)子區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域域中，并鄰接第一重組位點(diǎn)，使得該編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向與從第一重組位點(diǎn)通過該啟動(dòng)子進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)的方向相反，其中該編碼序列不操作性地連接任何啟動(dòng)子。
該載體最好還包含一個(gè)第二編碼序列，后者位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該啟動(dòng)子的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域域中，并鄰接第二重組位點(diǎn)，第二編碼序列操作性地連接該啟動(dòng)子。在第一重組位點(diǎn)和第一編碼序列之間，或在該啟動(dòng)子和第二編碼序列之間最好沒有編碼序列、啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。
此外，在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中提供的一種載體包含(a)一個(gè)啟動(dòng)子，位于反向定向的第一和第二重組位點(diǎn)之間并鄰接第二重組位點(diǎn)，使得該啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺牡谝恢亟M位點(diǎn)通過該啟動(dòng)子進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)，(b)一個(gè)編碼序列，位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該啟動(dòng)子的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域域中，并鄰接第二重組位點(diǎn)，使得該編碼序列操作性地連接該啟動(dòng)子。
為了優(yōu)化基因表達(dá)和蛋白生產(chǎn)，該反向重組載體還包含(a)一個(gè)剪接受體位點(diǎn)，位于第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間并包含該啟動(dòng)子的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域域中的第一重組位點(diǎn)和該編碼序列之間，(b)一個(gè)剪接供體位點(diǎn)，位于第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間并包含該啟動(dòng)子區(qū)域中的該啟動(dòng)子和第二重組位點(diǎn)之間，以及(c)一個(gè)剪接受體位點(diǎn)，位于第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間并包含該啟動(dòng)子區(qū)域之外的區(qū)域中的第二重組位點(diǎn)和第二編碼序列之間。
此外，本發(fā)明也提供一個(gè)反向重組載體，它包含(a)一個(gè)編碼序列，位于反向定向的第一和第二重組位點(diǎn)之間并鄰接第二重組位點(diǎn)，使得該編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向與從第一重組位點(diǎn)通過該編碼序列進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)的方向相反，其中該編碼序列不操作性地連接任何啟動(dòng)子，(b)一個(gè)啟動(dòng)子，位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該編碼序列的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中，并鄰接第一重組位點(diǎn)，使得該啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺牡谝恢亟M位點(diǎn)通過該編碼序列進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)。
該載體最好還包含一個(gè)第二編碼序列，它位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該編碼序列的區(qū)域中，并鄰接第一重組位點(diǎn)，第二編碼序列操作性地連接該啟動(dòng)子。該載體最好也包含前述其它編碼序列(例如一個(gè)第三編碼序列和/或其它編碼序列)。
此外，在另一實(shí)施方案中，該載體包含(a)一個(gè)編碼序列，位于反向定向的第一和第二重組位點(diǎn)之間并鄰接第一重組位點(diǎn)，使得該編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺牡谝恢亟M位點(diǎn)通過該編碼序列進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)，(b)一個(gè)鄰接第一重組位點(diǎn)的啟動(dòng)子，位于第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含該編碼序列的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中，使得該啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺牡谝恢亟M位點(diǎn)通過該編碼序列進(jìn)行至第二重組位點(diǎn)，其中該編碼序列操作性地連接該啟動(dòng)子。
這些載體最好還包含一個(gè)過客基因。在該啟動(dòng)子和該重組位點(diǎn)之間，或在該編碼序列或第二編碼序列和該重組位點(diǎn)之間最好沒有編碼序列、啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。此外，可以將剪接位點(diǎn)(即剪接受體位點(diǎn)和剪接供體位點(diǎn))和加A位點(diǎn)加入用于前述這些方法的載體中，以使編碼蛋白的基因表達(dá)和生產(chǎn)最大化。
按照本發(fā)明的這樣一種載體提供一個(gè)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法，由于重組酶驅(qū)動(dòng)的重組事件而不產(chǎn)生附加體。本發(fā)明也提供前述和附圖中描述的其它載體。其它一般性考慮在本發(fā)明方法中，通過將本發(fā)明的各個(gè)方面提供給細(xì)胞，將載體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，該宿主細(xì)胞最好是真核宿主細(xì)胞中。真核宿主細(xì)胞可以體外存在或體內(nèi)存在。按照本發(fā)明，通過將載體導(dǎo)入該細(xì)胞的任何方法，可以使細(xì)胞“接觸”本發(fā)明的載體。最好利用病毒能夠進(jìn)入細(xì)胞的天然能力(例如，腺病毒通過受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞的能力)，通過感染導(dǎo)入病毒載體。然而，可以通過任何適宜的方法，例如轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔、滲透沖擊等等，導(dǎo)入該病毒載體和質(zhì)粒載體。同樣地，在本發(fā)明的一個(gè)推薦實(shí)施方案中，考慮進(jìn)行載體的體內(nèi)轉(zhuǎn)移。因此，本發(fā)明方法也計(jì)劃通過本文提出的方法或通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行載體的體內(nèi)轉(zhuǎn)移。
此外，按照本發(fā)明方法，“提供給該細(xì)胞一個(gè)位點(diǎn)特異性重組酶”包括提供載體編碼的重組酶，或提供蛋白形式的重組酶。可以通過適于將蛋白導(dǎo)入細(xì)胞的方法，例如微注射和用于體外傳遞的腺病毒介導(dǎo)的吸收、注射或浸漬或本文描述的用于體內(nèi)傳遞的其它方法，以及通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)入方法導(dǎo)入蛋白。
體內(nèi)實(shí)施時(shí)，載體或蛋白傳遞的靶可以是任何適宜的器官或組織或組成細(xì)胞。所用的器官/組織/細(xì)胞最好屬于循環(huán)系統(tǒng)(即心臟、血管或血液)、呼吸系統(tǒng)(即鼻、咽、喉、氣管、支氣管、細(xì)支氣管、肺)、消化系統(tǒng)(即口、咽、食管、胃、腸、唾液腺、胰、肝、膽囊)、泌尿系統(tǒng)(即腎、輸尿管、膀胱、尿道)、神經(jīng)系統(tǒng)(即腦和脊髓，以及特殊感覺器官，諸如眼)和外皮系統(tǒng)(即皮膚)。甚至更優(yōu)選的靶細(xì)胞選自心臟、血管、肺、肝、膽囊、膀胱和眼細(xì)胞。
對于這些實(shí)施方案，當(dāng)以本文描述的方法使用一種或多種載體時(shí)，或當(dāng)諸如Cre或Frt之類的重組酶以蛋白形式由外部給予時(shí)，細(xì)胞與本發(fā)明各種組分的接觸可以以任何順序進(jìn)行或可以同時(shí)進(jìn)行。該接觸最好同時(shí)進(jìn)行。在一個(gè)推薦實(shí)施方案中，本發(fā)明的組分載體可以一起混合，并在接觸該細(xì)胞前進(jìn)行預(yù)保溫。當(dāng)給予多載體時(shí)，該細(xì)胞最好在接觸第一載體不到大約6周后或不到6周前，接觸另一載體。甚至優(yōu)選該細(xì)胞在接觸第一載體不到大約2周后或不到2周前，接觸另一載體。當(dāng)結(jié)合諸如Cre或Frt之類的重組酶給予載體時(shí)，該細(xì)胞最好在接觸該蛋白不到大約12小時(shí)后或不到12小時(shí)前，接觸一種載體。甚至更優(yōu)選該細(xì)胞最好在接觸該蛋白不到大約12小時(shí)后或不到12小時(shí)前，接觸一種載體。
本發(fā)明的組合物(即包含本發(fā)明的載體和/或重組酶的一個(gè)組合物)可以制成具有適當(dāng)藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物，合適時(shí)，可以制成固體、半固體、液體或氣體形式的制劑，諸如片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、軟膏劑、溶液劑、栓劑、注射劑、吸入劑和氣霧劑，以通常方式用于各自的給藥途徑?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法防止該組合物的釋放和吸收，直至該組合物到達(dá)靶器官、組織或細(xì)胞，或確保該組合物的定時(shí)釋放。應(yīng)該使用不使本發(fā)明組合物失效的藥學(xué)可接受形式?？梢詥为?dú)使用藥物劑量形式的該組合物，或適當(dāng)?shù)芈?lián)合以及結(jié)合其它藥學(xué)活性化合物使用。
因此，本發(fā)明的藥物組合物可以通過各種途徑傳遞，并傳遞到動(dòng)物體內(nèi)的各個(gè)位點(diǎn)，以達(dá)到特殊的效果?？梢酝ㄟ^包括將該制劑涂到或裝入體腔內(nèi)、吸入或吹入氣霧劑在內(nèi)的給藥，或通過包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜、皮下、皮內(nèi)在內(nèi)的非胃腸導(dǎo)入以及局部的給藥，完成局部性傳遞或全身性傳遞。
可以提供單位劑量形式的本發(fā)明的組合物，其中每個(gè)劑量單位例如一茶匙、一片、一定量的溶液或一個(gè)栓劑，含有預(yù)定量的單獨(dú)或適當(dāng)?shù)嘏c其它活性藥劑一起使用的該組合物。本文使用的術(shù)語“單位劑量形式”是指適用作人或動(dòng)物對象的物理上分離的單位，每個(gè)單位含有預(yù)定量的單獨(dú)使用或與其它活性藥劑一起使用的本發(fā)明組合物，按足以產(chǎn)生所需效果的量計(jì)算，該組合物合適時(shí)與藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體或賦形劑結(jié)合使用。本發(fā)明新單位劑量形式的規(guī)格取決于待到達(dá)的特定作用和與該藥物組合物在特定宿主中有關(guān)的特定藥效學(xué)。
因此，本發(fā)明也提供一個(gè)獲得宿主內(nèi)穩(wěn)定基因表達(dá)、或調(diào)節(jié)宿主內(nèi)基因表達(dá)的方法，該方法包括采用任何上述給藥途徑或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并適用于特殊應(yīng)用的可供選擇的途徑，給予本發(fā)明的組合物。該組合物的“有效量”使得在宿主中產(chǎn)生所需效果，后者可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的幾個(gè)終點(diǎn)進(jìn)行監(jiān)測。例如，一個(gè)所需作用可能包括將核酸有效地轉(zhuǎn)移至一個(gè)宿主細(xì)胞中?？梢酝ㄟ^治療效果(例如減輕與待治療疾病或綜合癥有關(guān)的癥狀)，或通過宿主內(nèi)該轉(zhuǎn)移基因或編碼序列或其表達(dá)的進(jìn)一步的證據(jù)(例如采用檢測宿主細(xì)胞內(nèi)該核酸的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、Northern或Southern雜交或轉(zhuǎn)錄分析，或采用免疫印跡分析、或抗體介導(dǎo)的檢測、或列舉的檢測該轉(zhuǎn)移核酸編碼的或由于這種轉(zhuǎn)移影響水平或功能的蛋白或多肽的分析)監(jiān)測這種轉(zhuǎn)移。在下面實(shí)施例中描述的一個(gè)這種詳述分析包括一種用于β-葡糖苷酸酶基因表達(dá)的分析。
這些描述的方法決不是包括所有方法，適合特定應(yīng)用的其它方法對本領(lǐng)域一般技術(shù)人員是顯而易見的。此外，如上所述，可以通過該重組反應(yīng)的適當(dāng)分析，進(jìn)一步接近該組合物的有效量。
一般來講，為了確保本發(fā)明載體的有效轉(zhuǎn)移，在考慮到給定給藥途徑接觸的大致細(xì)胞數(shù)的基礎(chǔ)上，最好每個(gè)待接觸細(xì)胞使用大約1-5,000拷貝的該載體，甚至更優(yōu)選每個(gè)細(xì)胞進(jìn)入大約1-300pfu。然而，這僅僅是一個(gè)一般方針，決不排除在體外或體內(nèi)的特定應(yīng)用中使用較高或較低量的組分。例如，實(shí)際劑量或時(shí)間表的變化可以取決于該組合物是否結(jié)合其它藥物組合物給藥，或取決于藥物動(dòng)力學(xué)個(gè)體間的差異、藥物配置和代謝。同樣地，體外應(yīng)用用量的變化可以取決于所用的特定細(xì)胞類型或轉(zhuǎn)移該載體的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以按照特殊情況的需要，容易地作出必要的調(diào)整。
實(shí)施例以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是當(dāng)然不應(yīng)解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1該實(shí)施例描述可以用來產(chǎn)生圖1A-1C中提出的附加體的細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)特異性重組方法和重組載體。特別是，該實(shí)施例證明通過重組事件傳遞附加體和調(diào)節(jié)上游基因轉(zhuǎn)錄的方法。
可以進(jìn)行諸如產(chǎn)生菌株和質(zhì)粒、凝膠電泳、DNA操作，包括粒子分離、DNA克隆和測序、Southern印跡分析等等的標(biāo)準(zhǔn)分子和遺傳技術(shù)，諸如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)手冊中詳細(xì)描述的(例如Maniatis等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，第二版(Cold Spring Harbr，NY，1992)；Ausubel等，當(dāng)前分子生物學(xué)的操作步驟，(1987))。限制酶和用于分子操作的其它酶由商業(yè)來源購買(例如Boehrringer Mannheim，Inc.，Indianapolis，Indiana；New England Biolabs，Beverly，Massachusetts；Bethesda Research Laboratories，Bethesda，Maryland等等)，并按照生產(chǎn)商的建議使用。采用以前描述的標(biāo)準(zhǔn)無菌培養(yǎng)試劑、培養(yǎng)基和培養(yǎng)技術(shù)(Erzerum等，Nucleic Acids Research，21.1607-1612(1993))培養(yǎng)和保持轉(zhuǎn)化的人胚性腎細(xì)胞系293細(xì)胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心CRL1573)。合適時(shí)，使用嘌呤霉素用于選擇轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
產(chǎn)生幾個(gè)質(zhì)粒，以測試和證實(shí)圖1A-1C中提出的本發(fā)明方法。這些質(zhì)粒包括圖6描述的pEOBspLx-Puro-CMVLx，它包含作為FCS的EBNA-1編碼序列。圖7描述了質(zhì)粒pEOBspLx-Puro-CMVLx-βglu，它包含作為FCS的β-葡糖苷酸酶編碼序列。質(zhì)粒pEOBspLx-Puro-CMVLx和pEOBspLx-Puro-CMVLx-βglu都包含Lox位點(diǎn)(平行)作為重組位點(diǎn)，并包含一個(gè)CMV啟動(dòng)子作為調(diào)節(jié)上游基因表達(dá)的啟動(dòng)子。使用CMV啟動(dòng)子是因?yàn)樗诖蠖鄶?shù)組織培養(yǎng)細(xì)胞中能夠驅(qū)動(dòng)相對高水平的組成型基因表達(dá)(Boshart等，Cell 41，521-530(1985))。同樣地，質(zhì)粒pEOBspLx-Puro-CMVLx和pEOBspLx-Puro-CMVLx-βglu都包含RSV啟動(dòng)子控制下的嘌呤霉素編碼序列。圖8描述了Cre的表達(dá)質(zhì)粒pAdCMV Cre，后者將噬菌體P1的Cre編碼序列置于CMV啟動(dòng)子和SV40加A信號的控制下。
由Invitrogen的pREP 4載體(Invitrogen，San Diego，California)產(chǎn)生質(zhì)粒pEOBspLx-Puro-CMVLx。pREP 4用HpaI和BsmI進(jìn)行限制性酶解，將含有MluI、PvuII和KpnI限制位點(diǎn)的寡核苷酸在修飾該載體中特有的MluI位點(diǎn)后導(dǎo)入。將MluI/PvuI DNA片段上含有SRV啟動(dòng)子和牛生長激素(BGH)的加A信號控制下的嘌呤霉素基因的一個(gè)盒克隆到該載體骨架中。將含有一個(gè)剪接信號、后面接一個(gè)多接頭和SV40加A序列的一個(gè)CMV啟動(dòng)子導(dǎo)入該載體骨架的PvuII/KpnI位點(diǎn)中。將一個(gè)Lox位點(diǎn)導(dǎo)入CMV表達(dá)盒的內(nèi)含子中。通過加入合成的剪接受體位點(diǎn)和Lox位點(diǎn)，修飾EBNA-1編碼序列上游的序列。該剪接受體位點(diǎn)接近pEOBspLx-Puro-CMVLx中的EBNA-1。
用β-葡糖苷酸酶編碼序列和SV40加A信號取代EBNA-1編碼序列，由pEOBspLx-Puro-CMVLx衍生質(zhì)粒pEOBspLx-Puro-CMVLx-βglu。在EBNA-1編碼序列內(nèi)產(chǎn)生的缺失橫跨從起始密碼子至EBNA-1的BsgI位點(diǎn)的區(qū)域。
質(zhì)粒pAdCMV Cre含有側(cè)翼為Ad5序列的1-355和3333-5788的一個(gè)表達(dá)盒，包含CMV啟動(dòng)子、Cre編碼序列和SV40加A信號。當(dāng)然，用于重組的序列的精確限制可以隨所需的特定重組產(chǎn)物而變化(例如大約為1-100bp)。pAdCMV Cre質(zhì)?？梢耘cAd重組，產(chǎn)生一個(gè)E1缺陷型病毒(參見例如Rosenfeld等，(1991)，見上述；Rosenfeld等，(1992)，見上述)。
為了測試通過選擇RSV/嘌呤霉素盒賦予的嘌呤霉素抗性選擇含有pEOBspLx-Puro-CMVLx-βglu的細(xì)胞的能力，可以進(jìn)行CaPO4-介導(dǎo)的將pEOBspLx-Puro-CMVLx-βglu轉(zhuǎn)染入表達(dá)EBNA-1的293細(xì)胞中(293-EBNA；Invitrogen，San Diego，CA)。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞在大約0.5mg/ml的嘌呤霉素存在下保持。存活的細(xì)胞群體由于RSV/嘌呤霉素盒表達(dá)嘌呤霉素而對嘌呤霉素有抗性。
將pEOBspLx-Puro-CMVLx-βglu與或不與pAdCMV Cre一起通過CaPO4-介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中(Graham等，J.Gen.Virol.，36，59-72(1977))，以測定由反式供應(yīng)給293細(xì)胞的Cre基因產(chǎn)生的Cre重組酶是否在pEOBspLx-Puro-CMVLx-βglu中存在的Lox位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn)重組，由此產(chǎn)生一個(gè)附加體，并將該附加體中的β-葡糖苷酸酶編碼序列置于CMV啟動(dòng)子的控制下。48小時(shí)后，加工細(xì)胞，采用市售試劑盒，按照生產(chǎn)商的建議(Tropix Inc.，Beford，MA)分析β-葡糖苷酸酶活性。表2表示獲得的結(jié)果。表2.轉(zhuǎn)染后的β-葡糖苷酸酶水平質(zhì)粒 β-葡糖苷酸酶單位無質(zhì)粒 850pEOBspLx-Puro-CMVLx-βglu 6.9×103pEOBspLx-Puro-CMVLx-βglu+pAdCMV Cre1.6×105如表2所示，在含有pEOBspLx-Puro-CMVLx-βglu和pAdCMVCre兩者的那些細(xì)胞中β-葡糖苷酸酶水平最高。缺乏pEOBspLx-Puro-CMVLx-βglu和pAdCMV Cre時(shí)(即“無質(zhì)?！睏l件)，盡管觀察到低的基礎(chǔ)水平活性，但在293細(xì)胞中幾乎檢測不到β-葡糖苷酸酶的水平。相比之下，在缺乏pAdCMV Cre的情況下，在含有pEOBspLx-Puro-CMVLx-βglu的細(xì)胞中觀察到較高水平的β-葡糖苷酸酶。
后來，我們發(fā)現(xiàn)pEOBspLx-Puro-CMVLx-βglu中的重組位點(diǎn)是反向定向，而不是平行定向。因此，觀察到的β-葡糖苷酸酶活性顯然是因?yàn)橥ㄟ^重組事件置于該報(bào)道基因上游的隱性啟動(dòng)子的存在。然而，這些結(jié)果確實(shí)證實(shí)本發(fā)明的方法可以用來獲得反向重組載體。
實(shí)施例2該實(shí)施例描述用于細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)特異性重組的載體，它可以用來產(chǎn)生一個(gè)附加體，如圖1A-1C所示。更具體地講，該實(shí)施例描述線性Ad載體的這類載體。
通過修改前一實(shí)施例中描述了這些載體和途徑，本發(fā)明方法同樣可以用于病毒附加體傳遞載體，特別是Ad附加體傳遞載體。即通過將pEOBspLx-Puro-CMVLx-βglu轉(zhuǎn)染到組成型表達(dá)EBNA-1的細(xì)胞系中，可以證實(shí)這一病毒載體中oriP或能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用的相似的復(fù)制起點(diǎn)的功能性(諸如Reisman等描述的，見上述)?？梢赃x擇和增殖抗嘌呤霉素的細(xì)胞?？梢杂肧outhern印跡分析證實(shí)該質(zhì)粒作為附加體保持?？梢酝瑯幼C實(shí)EBNA-1的功能性。
為了產(chǎn)生Ad載體，可以將EBNA-1和基于β-葡糖苷酸酶的質(zhì)粒都轉(zhuǎn)移到穿梭載體中，并以與pAdCMV Cre的相似方式進(jìn)行構(gòu)建?；旧?，該穿梭載體基本上包含一個(gè)側(cè)翼為BclI和BamHI限制位點(diǎn)的填充片段，一端周圍為左側(cè)的355bp，另一端周圍為Ad5的殘基3333-5788。用含有來自產(chǎn)生pEOBspLx-Puro-CMVLx的質(zhì)粒pAdER-Puro的兩個(gè)Lox位點(diǎn)的BglII-BamHI限制片段取代該填充片段。同樣地，可以用含有來自pEOBspLx-Puro-CMVLx-βglu的兩個(gè)Lox位點(diǎn)的BglII-BamHI限制片段取代該填充片段。然后，可以用這些載體中的一個(gè)，通過先前描述的同源重組(參見例如Rosenfeld等，(1991)，見上述；Rosenfeld等，(1992)，見上述)產(chǎn)生基于Ad5的載體。
實(shí)施例3附錄實(shí)施例進(jìn)一步描述可以用來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)特異性重組的載體。具體地講，該實(shí)施例描述可以用來提供Cre重組酶的載體一個(gè)代表實(shí)施例。
為了便于構(gòu)建載體，特別是圖1A-1C描述的載體，將Cre基因亞克隆到一個(gè)單獨(dú)的Ad中。由ATCC獲得的P1用作Cre重組酶編碼序列源，采用PCR將其克隆到pCR-ScriptTM(Stratagene，La Jolla，CA)中，提供一個(gè)更易接近的該基因源。然后，將該Cre基因轉(zhuǎn)移到一個(gè)穿梭載體中，將其置于CMV啟動(dòng)子的控制下，后接一個(gè)SV40加A信號，產(chǎn)生圖9描述的載體pAdCMVCreRSVOrf6。該穿梭載體用來產(chǎn)生Ad載體AdCMVCre6(采用前述方法)，其中Cre基因取代腺病毒基因組的E1區(qū)。
通過PCR并采用實(shí)施例1中描述的功能性分析，證實(shí)了AdCMVCre6的產(chǎn)生。即在基于293的細(xì)胞系835中以及在人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中采用一個(gè)測試質(zhì)粒，證實(shí)AdCMVCre6指導(dǎo)的重組的Southern印跡分析。同樣地，也證實(shí)用于該實(shí)施例和先前實(shí)施例中各種構(gòu)建物中的啟動(dòng)子、剪接供體位點(diǎn)和剪接受體位點(diǎn)的功能性。特別是，將β-葡糖苷酸酶置于圖1A中的第一編碼序列位置中，產(chǎn)生質(zhì)粒pEOBglugl。pEOBglugl與一個(gè)表達(dá)Cre的質(zhì)粒的共同轉(zhuǎn)染導(dǎo)致β-葡糖苷酸酶高于千倍(3-log)的誘導(dǎo)。
這些結(jié)果證實(shí)該載體中Cre重組酶的功能性，并且進(jìn)一步證實(shí)用于隨后載體構(gòu)建的基本載體組分的功能性。
實(shí)施例4該實(shí)施例進(jìn)一步描述用來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)特異性重組的載體。具體地說，該實(shí)施例描述的載體包含一個(gè)多瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)并可以用來例如獲得失控復(fù)制。
采用先前實(shí)施例描述的標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)構(gòu)建含有多瘤病毒原點(diǎn)的載體。采用DpnI分析，證實(shí)各種載體中含有的和復(fù)制需要的EBV系統(tǒng)和多瘤病毒系統(tǒng)組分(特別是復(fù)制起點(diǎn))的功能性。該分析的基礎(chǔ)是大腸桿菌中產(chǎn)生的質(zhì)粒甲基化，這些質(zhì)粒對DpnI的限制性酶切敏感。相比之下，如果該質(zhì)粒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制，那么它或者半甲基化或者根本不甲基化，這賦予它對DpnI限制性酶切有抗性。
測試同基因構(gòu)建物pKSEBNAOriP(NR)(圖10中描述的)和pKSEBNA(NS)(圖11中描述的)，以證實(shí)BEV組分的功能性。這些質(zhì)粒在或者存在(即質(zhì)粒pKSEBNAOriP(NR))或者缺乏(即質(zhì)粒pKSEBNA(NS))恰好位于該基因5’端的oriP的情況下，含有在其自身病毒啟動(dòng)子控制下的EBNA-1。pKSEBNAOriP(NR)中的oriP原點(diǎn)具有一個(gè)從NcoI至EcoRV(即EBV的坐標(biāo)為8033-8995)的缺失，導(dǎo)致缺失962bp。將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到得自293的細(xì)胞中，5天后收獲細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀經(jīng)過Hirt抽提(Hirt，J.Mol.Biol.，26，365-369(1967))，進(jìn)行DpnI分析。發(fā)現(xiàn)僅有含有oriP的質(zhì)粒進(jìn)行復(fù)制。
同樣地，將質(zhì)粒pAdCLxPyTagOri(圖12描述的)轉(zhuǎn)染到NIH 3T3細(xì)胞中。該質(zhì)粒含有CMV啟動(dòng)子控制下的多瘤病毒大T抗原編碼序列，也含有多瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)，后者恰好在T抗原編碼序列側(cè)翼的加A信號的3’端。發(fā)現(xiàn)當(dāng)將T抗原提供給該細(xì)胞時(shí)，含有T抗原以外的這些元件的一個(gè)相似質(zhì)粒進(jìn)行復(fù)制。因此，這些結(jié)果證實(shí)，同pKSEBNAOrip(NR)中存在的EBV組分一樣，該載體中存在的多瘤病毒組分能夠在它存在的質(zhì)粒上提供自主復(fù)制。
證實(shí)多瘤病毒組分的功能后，將pAdCLxPyTagOri中存在的盒轉(zhuǎn)移到圖13描述的Ad E1缺失的穿梭載體pADEPrRLr中。該質(zhì)粒基本上如圖1A描述的，具有第一編碼序列(FCS)，后者包含T抗原編碼序列，該操縱子為多瘤病毒的復(fù)制起點(diǎn)。該質(zhì)粒中的啟動(dòng)子(P)是RSV啟動(dòng)子，第二編碼序列(SCS)包含一個(gè)熒光素酶報(bào)道基因。證實(shí)了熒光素酶轉(zhuǎn)錄單位的活性。此外，具有Cre表達(dá)盒的該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致該穿梭載體的位點(diǎn)特異性重組。因此，這些結(jié)果證實(shí)這些載體中各種組分的功能。
這些結(jié)果證實(shí)，可以構(gòu)建并按照本發(fā)明使用用來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)特異性重組的其它載體。特別是，這些結(jié)果證實(shí)，可以構(gòu)建包含多瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)的載體，并用它來例如獲得失控復(fù)制。
實(shí)施例5該實(shí)施例進(jìn)一步描述用來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)特異性重組的載體。具體地講，該實(shí)施例描述包含牛乳突瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)并用來在多種宿主中獲得多拷貝數(shù)的載體。
使用先前實(shí)施例中描述的相似技術(shù)，構(gòu)建包含牛乳突瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)的載體。具體地講，構(gòu)建圖14描述的載體pCGE1E2ori。該載體包含具有CMV啟動(dòng)子控制下的牛乳突瘤病毒E1和E1基因的一個(gè)雙順反子表達(dá)盒。該載體恰好在該表達(dá)盒3’端包含乳突瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)，后者包括牛乳突瘤病毒基因組的第7351-57核苷酸。以前已報(bào)道了含有該牛乳突瘤病毒原點(diǎn)的另一構(gòu)建物在E1和E2存在下穩(wěn)定保持，它支持pCGElE2ori載體的復(fù)制感受態(tài)。
本文引用的所有參考文獻(xiàn)(包括專利、專利應(yīng)用和出版物)都通過引用結(jié)合到本文中。
盡管重點(diǎn)在推薦實(shí)施方案上描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員會明顯看出，可以進(jìn)行和使用推薦實(shí)施方案中的變更法，可以在本文具體描述的實(shí)施方案之外實(shí)施本發(fā)明。本發(fā)明將包括這類變更法和其它的實(shí)施。因此，本發(fā)明包括下面權(quán)利要求書限定的本發(fā)明精神和范圍內(nèi)包括的所有修改。
權(quán)利要求
1.在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組的方法，包括(a)將所述細(xì)胞與一種載體接觸，后者包含一個(gè)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用的位于平行設(shè)置的第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間的復(fù)制起點(diǎn)，使得所述載體被所述細(xì)胞內(nèi)在化，以及(b)為所述細(xì)胞提供在所述載體的所述第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn)重組的位點(diǎn)特異性重組酶。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述載體還包含一個(gè)編碼序列。
3.權(quán)利要求2的方法，其中(a)所述編碼序列位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)的區(qū)域中，并鄰接所述第一重組位點(diǎn)，使得所述編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃龅谝恢亟M位點(diǎn)通過所述編碼序列進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)，(b)所述編碼序列不操作性地連接任何啟動(dòng)子，以及(c)一個(gè)啟動(dòng)子位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)的區(qū)域中，并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，使得所述啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃龅谝恢亟M位點(diǎn)通過所述啟動(dòng)子進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)。
4.權(quán)利要求2的方法，其中(a)一個(gè)啟動(dòng)子位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)的區(qū)域中，并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，使得所述啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃龅谝恢亟M位點(diǎn)通過所述啟動(dòng)子進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)，以及(b)所述編碼序列位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中，并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，使得所述編碼序列操作性地連接所述啟動(dòng)子。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述載體還包含一個(gè)第二編碼序列，后者位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中，并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，所述編碼序列操作性地連接所述啟動(dòng)子。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述載體還包含(a)一個(gè)剪接受體位點(diǎn)，位于所述第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)區(qū)域中的所述第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間，(b)一個(gè)剪接供體位點(diǎn)，位于所述第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)區(qū)域中的所述啟動(dòng)子和所述第二重組位點(diǎn)之間，以及(c)一個(gè)剪接受體位點(diǎn)，位于所述第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間包含所述原點(diǎn)區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中的所述第二重組位點(diǎn)和所述第二編碼序列之間。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述載體還包含(a)一個(gè)啟動(dòng)子，位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)中，并鄰接第一重組位點(diǎn)，使得該啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃鰡?dòng)子通過所述第一重組位點(diǎn)進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)，以及(b)一個(gè)編碼序列，位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)中，并鄰接所述第二重組位點(diǎn)。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述載體還包含一個(gè)第二編碼序列，后者位于所述第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)區(qū)域中，并鄰接所述第一重組位點(diǎn)，使得所述第二編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃龅谝恢亟M位點(diǎn)通過所述第二編碼序列進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述載體還包含(a)一個(gè)第二編碼序列，位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)的區(qū)域中，并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，使得所述第二編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向與從所述第一重組位點(diǎn)通過所述第二編碼序列進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)的方向相反，而且其中所述第二編碼序列不操作性地連接任何啟動(dòng)子，以及(b)一個(gè)第二啟動(dòng)子，位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)的區(qū)域中，并鄰接所述第一重組位點(diǎn)，使得所述第二啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向與從所述第一重組位點(diǎn)通過所述第二啟動(dòng)子進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)的方向相反。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述載體還包含一個(gè)第三編碼序列，后者(a)位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)的區(qū)域以外一個(gè)區(qū)域中，并且在所述啟動(dòng)子和所述第一重組位點(diǎn)之間，(b)鄰接所述第一重組位點(diǎn)，使得所述第三編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向與從所述第一重組位點(diǎn)通過所述第二啟動(dòng)子進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)的方向相反，以及(c)操作性地連接所述第二啟動(dòng)子。
11.實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)特異性重組的方法，包括(a)將所述細(xì)胞與一種載體接觸，使得所述載體被所述細(xì)胞內(nèi)在化，其中所述載體包含(i)一個(gè)啟動(dòng)子，位于反向定向的第一和第二重組位點(diǎn)之間并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，使得所述啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃龅谝恢亟M位點(diǎn)通過所述啟動(dòng)子進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)，以及(ii)一個(gè)編碼序列，位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述啟動(dòng)子的區(qū)域之外的一個(gè)區(qū)域中，并鄰接所述第一重組位點(diǎn)，使得所述編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向與從所述第一重組位點(diǎn)通過所述啟動(dòng)子進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)的方向相反，其中所述編碼序列不操作性地連接任何啟動(dòng)子；以及(b)提供給所述細(xì)胞一個(gè)位點(diǎn)特異性重組酶，后者在所述載體的所述第一和第二重組位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn)重組。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述載體還包含一個(gè)第二編碼序列，后者位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述啟動(dòng)子的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中，并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，所述第二編碼序列操作性地連接所述啟動(dòng)子。
13.實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)特異性重組的方法，包括(a)將所述細(xì)胞與一種載體接觸，使得所述載體被所述細(xì)胞內(nèi)在化，其中所述載體包含(i)一個(gè)啟動(dòng)子，位于反向定向的第一和第二重組位點(diǎn)之間并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，使得所述啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃龅谝恢亟M位點(diǎn)通過所述啟動(dòng)子進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)，以及(ii)一個(gè)編碼序列，位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述啟動(dòng)子的區(qū)域之外的一個(gè)區(qū)中，鄰接所述第二重組位點(diǎn)，使得所述編碼序列操作性地連接所述啟動(dòng)子；以及(b)提供給所述細(xì)胞一個(gè)位點(diǎn)特異性重組酶，后者在所述載體的所述第一和第二重組位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn)重組。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述載體還包含(a)一個(gè)剪接受體位點(diǎn)，位于所述第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述啟動(dòng)子區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中的所述第一重組位點(diǎn)和所述編碼序列之間，(b)一個(gè)剪接供體位點(diǎn)，位于所述第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述啟動(dòng)子的區(qū)域中的所述啟動(dòng)子和所述第二重組位點(diǎn)之間，以及(c)一個(gè)剪接受體位點(diǎn)，位于所述第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間包含所述原點(diǎn)區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中的所述第二重組位點(diǎn)和所述第二編碼序列之間。
15.實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)特異性重組的方法，包括(a)將所述細(xì)胞與一種載體接觸，使得所述載體被所述細(xì)胞內(nèi)在化，其中所述載體包含(i)一個(gè)編碼序列，位于反向定向的第一和第二重組位點(diǎn)之間并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，使得所述編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向與從所述第一重組位點(diǎn)通過所述編碼序列進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)的反向相反，其中所述編碼序列不操作性地連接任何啟動(dòng)子，以及(ii)一個(gè)啟動(dòng)子，位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述編碼序列的區(qū)域之外的一個(gè)區(qū)中，鄰接所述第一重組位點(diǎn)，使得所述啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃龅谝恢亟M位點(diǎn)通過所述編碼序列進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)；以及(b)提供給所述細(xì)胞一個(gè)位點(diǎn)特異性重組酶，后者在所述載體的所述第一和第二重組位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn)重組。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述載體還包含一個(gè)第二編碼序列，后者位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述編碼序列的區(qū)域中，并鄰接所述第一重組位點(diǎn)，所述第二編碼序列操作性地連接所述啟動(dòng)子。
17.實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)特異性重組的方法，包括(a)將所述細(xì)胞與一種載體接觸，使得所述載體被所述細(xì)胞內(nèi)在化，其中所述載體包含(i)一個(gè)編碼序列，位于反向定向的第一和第二重組位點(diǎn)之間并鄰接所述第一重組位點(diǎn)，使得所述編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃龅谝恢亟M位點(diǎn)通過所述編碼序列進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)，以及(ii)鄰接所述第一重組位點(diǎn)的一個(gè)啟動(dòng)子，位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述編碼序列的區(qū)域之外的一個(gè)區(qū)域中，使得所述啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃龅谝恢亟M位點(diǎn)通過所述編碼序列進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)，其中所述編碼序列操作性地連接所述啟動(dòng)子；(b)提供給所述細(xì)胞一個(gè)位點(diǎn)特異性重組酶，后者在所述載體的所述第一和第二重組位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn)重組。
18.將Rep蛋白提供給細(xì)胞的方法，包括(a)將所述細(xì)胞與一種載體接觸，使得所述載體被所述細(xì)胞內(nèi)在化，所述載體包含位于平行定位的第一和第二重組位點(diǎn)之間的一個(gè)Rep編碼序列，(b)提供給所述細(xì)胞一個(gè)位點(diǎn)特異性重組酶，后者在所述載體的所述第一和第二重組位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn)重組。
19.權(quán)利要求18的方法，其中(a)所述載體還包含一個(gè)鄰接所述第一重組位點(diǎn)的編碼序列，使得所述編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃龅谝恢亟M位點(diǎn)通過所述編碼序列進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)，(b)所述編碼序列不操作性地連接任何啟動(dòng)子，以及(c)一個(gè)啟動(dòng)子位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)的區(qū)域中，并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，使得所述啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃龅谝恢亟M位點(diǎn)通過所述編碼序列進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)。
20.在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組的方法，包括(a)將所述細(xì)胞與一個(gè)包含平行的第一和第二重組位點(diǎn)的載體接觸，使得所述載體被所述細(xì)胞內(nèi)在化，以及(b)提供給所述細(xì)胞一個(gè)位點(diǎn)特異性重組酶，后者在所述載體的所述第一和第二重組位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn)重組。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述載體還包含(a)一個(gè)鄰接所述第一重組位點(diǎn)的啟動(dòng)子，使得該啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃鰡?dòng)子通過所述第一重組位點(diǎn)進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)，以及(b)一個(gè)鄰接所述第二重組位點(diǎn)的編碼序列。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述載體還包含一個(gè)鄰接所述第一重組位點(diǎn)的第二編碼序列，使得第二編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃龅谝恢亟M位點(diǎn)通過所述第二編碼序列進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述載體還包含(a)一個(gè)第二編碼序列，位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間的區(qū)域中，并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，使得所述第二編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向與從所述第一重組位點(diǎn)通過所述第二編碼序列進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)的方向相反，其中所述第二編碼序列不操作性地連接任何啟動(dòng)子，以及(b)一個(gè)第二啟動(dòng)子，位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間區(qū)域中，并鄰接所述第一重組位點(diǎn)，使得所述第二啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向與從所述第一重組位點(diǎn)通過所述第二啟動(dòng)子進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)的方向相反。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述載體還包含一個(gè)第三編碼序列，后者(a)位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述第二啟動(dòng)子和第二編碼序列的區(qū)域以外一個(gè)區(qū)域中，并且在所述啟動(dòng)子和所述第一重組位點(diǎn)之間，(b)鄰接所述第一重組位點(diǎn)，使得所述第三編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向與從所述第一重組位點(diǎn)通過所述第二啟動(dòng)子進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)的方向相反，以及(c)操作性地連接所述第二啟動(dòng)子。
25.一種載體，包含(a)平行定位的第一和第二重組位點(diǎn)，(b)位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間的一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，(c)一個(gè)編碼序列，在所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)的區(qū)域中，并鄰接所述第一重組位點(diǎn)，使得所述編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃龅谝恢亟M位點(diǎn)通過所述編碼序列進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)，所述編碼序列不操作性地連接任何啟動(dòng)子，以及(d)一個(gè)啟動(dòng)子，位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)的區(qū)域中，并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，使得所述啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃龅谝恢亟M位點(diǎn)通過所述啟動(dòng)子進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)。
26.權(quán)利要求25的載體，其中所述載體還包含一個(gè)第二編碼序列，后者位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中，并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，所述編碼序列操作性地連接所述啟動(dòng)子。
27.權(quán)利要求26的載體，它還包含(a)一個(gè)剪接受體位點(diǎn)，位于所述第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)的區(qū)域中的所述第一重組位點(diǎn)和所述編碼序列之間，(b)一個(gè)剪接供體位點(diǎn)，位于所述第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)區(qū)域中的所述啟動(dòng)子和所述第二重組位點(diǎn)之間，以及(c)一個(gè)剪接受體位點(diǎn)，位于所述第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間包含所述原點(diǎn)區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中的所述第二重組位點(diǎn)和所述第二編碼序列之間。
28.一種載體，包含(a)平行定位的第一和第二重組位點(diǎn)，(b)位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間的一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，(c)一個(gè)啟動(dòng)子，位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)的區(qū)域中，并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，使得所述啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃龅谝恢亟M位點(diǎn)通過所述啟動(dòng)子進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)，以及(d)一個(gè)編碼序列，位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中，并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，使得所述編碼序列操作性地連接所述啟動(dòng)子。
29.一種載體，包含(a)平行定位的第一和第二重組位點(diǎn)，(b)一個(gè)或多個(gè)鄰接所述第一或第二重組位點(diǎn)的啟動(dòng)子，(c)一個(gè)或多個(gè)鄰接所述第一和第二重組位點(diǎn)的編碼序列。
30.一種載體，包含(a)平行定位的第一和第二重組位點(diǎn)，(b)一個(gè)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用的并位于所述第一或第二重組位點(diǎn)之間的原點(diǎn)。
31.權(quán)利要求30的載體，其中所述載體還包含一個(gè)或多個(gè)鄰接所述第一或第二重組位點(diǎn)的啟動(dòng)子。
32.權(quán)利要求30的載體，其中所述載體還包含一個(gè)或多個(gè)鄰接所述第一或第二重組位點(diǎn)的編碼序列。
33.一種載體，包含(a)反向定位的第一和第二重組位點(diǎn)，(b)一個(gè)啟動(dòng)子，位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，使得所述啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃龅谝恢亟M位點(diǎn)通過所述啟動(dòng)子進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)，(c)一個(gè)編碼序列，位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述啟動(dòng)子的區(qū)域以外的區(qū)域中，并鄰接所述第一重組位點(diǎn)，使得所述編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向與從所述第一重組位點(diǎn)通過所述啟動(dòng)子進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)的方向相反，其中所述編碼序列不操作性地連接任何啟動(dòng)子。
34.權(quán)利要求33的載體，它還包含一個(gè)第二編碼序列，后者位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述啟動(dòng)子的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中，并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，所述第二編碼序列操作性地連接所述啟動(dòng)子。
35.權(quán)利要求34的載體，其中所述載體還包含(a)一個(gè)剪接受體位點(diǎn)，在所述第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述啟動(dòng)子的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中，位于所述第一重組位點(diǎn)和所述編碼序列之間，(b)一個(gè)剪接供體位點(diǎn)，在所述第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述啟動(dòng)子的區(qū)域中，位于所述啟動(dòng)子和所述第二重組位點(diǎn)之間，以及(c)一個(gè)剪接受體位點(diǎn)，在所述第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間包含所述啟動(dòng)子區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中，位于所述第二重組位點(diǎn)和所述第二編碼序列之間。
36.一種載體，包含(a)反向定位的第一和第二重組位點(diǎn)，(b)一個(gè)啟動(dòng)子，位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，使得所述啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃龅谝恢亟M位點(diǎn)通過所述啟動(dòng)子進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)，以及(c)一個(gè)編碼序列，位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述啟動(dòng)子的區(qū)域以外的區(qū)域中，并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，使得所述編碼序列操作性地連接所述啟動(dòng)子。
37.一種載體，包含(a)反向定位的第一和第二重組位點(diǎn)，(b)一個(gè)編碼序列，位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并鄰接所述第二重組位點(diǎn)，使得所述編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向與從所述第一重組位點(diǎn)通過所述編碼序列進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)的方向相反，其中所述編碼序列不操作性地連接任何啟動(dòng)子，以及(c)一個(gè)啟動(dòng)子，位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述編碼序列的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中，并鄰接所述第一重組位點(diǎn)，使得所述啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃龅谝恢亟M位點(diǎn)通過所述編碼序列進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)。
38.權(quán)利要求37的載體，它還包含一個(gè)第二編碼序列，后者位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述編碼序列的區(qū)域中，并鄰接所述第一重組位點(diǎn)，所述第二編碼序列操作性地連接所述啟動(dòng)子。
39.一種載體，包含(a)反向定位的第一和第二重組位點(diǎn)，(b)一個(gè)編碼序列，位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并鄰接所述第一重組位點(diǎn)，使得所述編碼序列的定向使其轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃龅谝恢亟M位點(diǎn)通過所述編碼序列進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)，以及(c)一個(gè)鄰接所述第一重組位點(diǎn)的啟動(dòng)子，位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述編碼序列的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中，使得所述啟動(dòng)子的定向使其指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺乃龅谝恢亟M位點(diǎn)通過所述編碼序列進(jìn)行至所述第二重組位點(diǎn)，其中所述編碼序列操作性地連接所述啟動(dòng)子。
40.權(quán)利要求1-24的方法，其中所述重組酶包括Cre。
41.權(quán)利要求1-24的方法，其中所述第一和第二重組位點(diǎn)包括Lox位點(diǎn)。
42.權(quán)利要求1-24的方法，其中所述載體還包含一個(gè)過客基因。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述過客基因選自EBNA-1、Rep、Flp、Cre、大T抗原、E1和E2編碼序列。
44.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述原點(diǎn)來自多瘤病毒。
45.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述原點(diǎn)來自乳突瘤病毒。
46.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述原點(diǎn)來自愛坡斯坦-巴爾病毒。
47.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述原點(diǎn)包括oriP原點(diǎn)。
48.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括提供給所述細(xì)胞順式或反式的細(xì)胞復(fù)制蛋白。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述細(xì)胞復(fù)制蛋白選自EBNA-1、大T抗原、E1和/或E2蛋白。
50.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述載體還包含一個(gè)或多個(gè)腺病毒相關(guān)病毒的ITR。
51.權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的方法，其中所述載體還包含一個(gè)或多個(gè)腺病毒相關(guān)病毒的ITR。
52.權(quán)利要求15-19中任一項(xiàng)的方法，其中所述載體還包含一個(gè)或多個(gè)腺病毒相關(guān)病毒的ITR。
53.權(quán)利要求20-21中任一項(xiàng)的方法，其中所述載體還包含一個(gè)或多個(gè)腺病毒相關(guān)病毒的ITR。
54.權(quán)利要求22-24中任一項(xiàng)的方法，其中所述載體還包含一個(gè)或多個(gè)腺病毒相關(guān)病毒的ITR。
55.權(quán)利要求50的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)ITR位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)的區(qū)域中。
56.權(quán)利要求51的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)ITR位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述啟動(dòng)子的區(qū)域中。
57.權(quán)利要求52的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)ITR位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述編碼序列的區(qū)域中。
58.權(quán)利要求54的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)ITR位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述第二編碼序列的區(qū)域中。
59.權(quán)利要求50的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)ITR位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中。
60.權(quán)利要求51的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)ITR位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述啟動(dòng)子的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中。
61.權(quán)利要求52的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)ITR位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述編碼序列的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中。
62.權(quán)利要求54的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)ITR位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述編碼序列的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中。
63.權(quán)利要求2-19和21-24中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼序列選自EBNA-1、Rep、Flp、Cre、大T抗原、E1和E2編碼序列。
64.權(quán)利要求5、6、8-10、13、14、16和22-24中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二編碼序列選自EBNA-1、Rep、Flp、Cre、大T抗原、E1和E2編碼序列。
65.權(quán)利要求10或24中任一項(xiàng)的方法，其中所述第三編碼序列選自EBNA-1、Rep、Flp、Cre、大T抗原、E1和E2編碼序列。
66.權(quán)利要求2-19和21-24中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼序列包括一個(gè)編碼一個(gè)激素受體配體結(jié)合域的序列，該結(jié)合域能夠結(jié)合外源(但不是天然產(chǎn)生的)激素。
67.權(quán)利要求5、6、8-10、13、14、16和22-24中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二編碼序列包括一個(gè)編碼一個(gè)激素受體配體結(jié)合域的序列，該結(jié)合域能夠結(jié)合外源(但不是天然產(chǎn)生的)激素。
68.權(quán)利要求10或24中任一項(xiàng)的方法，其中所述第三編碼序列包括一個(gè)編碼一個(gè)激素受體配體結(jié)合域的序列，該結(jié)合域能夠結(jié)合外源(但不是天然產(chǎn)生的)激素。
69.權(quán)利要求42的方法，其中所述過客基因包括一個(gè)編碼一個(gè)激素受體配體結(jié)合域的序列，該結(jié)合域能夠結(jié)合外源(但不是天然產(chǎn)生的)激素。
70.權(quán)利要求2-19、21-24和66中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼序列包含一個(gè)或多個(gè)編碼甘氨酸-丙氨酸重復(fù)的序列。
71.權(quán)利要求5、6、8-10、13、14、16、22-24和67中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二編碼序列包含一個(gè)或多個(gè)編碼甘氨酸-丙氨酸重復(fù)的序列。
72.權(quán)利要求10、24和68中任一項(xiàng)的方法，其中所述第三編碼序列包含一個(gè)或多個(gè)編碼甘氨酸-丙氨酸重復(fù)的序列。
73.權(quán)利要求42或69的方法，其中所述過客基因包含一個(gè)或多個(gè)編碼甘氨酸-丙氨酸重復(fù)的序列。
74.權(quán)利要求25-29中任一項(xiàng)的載體，其中所述第一和第二重組位點(diǎn)包括Lox位點(diǎn)。
75.權(quán)利要求25-29中任一項(xiàng)的載體，其中所述載體還包含一個(gè)過客基因。
76.權(quán)利要求75的載體，其中所述過客基因選自EBNA-1、Rep、Flp、Cre、大T抗原、E1和E2編碼序列。
77.權(quán)利要求25-28中任一項(xiàng)的載體，其中所述原點(diǎn)來自多瘤病毒。
78.權(quán)利要求25-28中任一項(xiàng)的載體，其中所述原點(diǎn)來自乳突瘤病毒。
79.權(quán)利要求25-28中任一項(xiàng)的載體，其中所述原點(diǎn)來自愛坡斯坦-巴爾病毒。
80.權(quán)利要求79的載體，其中所述原點(diǎn)包括oriP原點(diǎn)。
81.權(quán)利要求29-31中任一項(xiàng)的載體，其中所述載體還包含一個(gè)或多個(gè)腺病毒相關(guān)病毒的ITR。
82.權(quán)利要求25-28和32中任一項(xiàng)的載體，其中所述載體還包含一個(gè)或多個(gè)腺病毒相關(guān)病毒的ITR。
83.權(quán)利要求33-36中任一項(xiàng)的載體，其中所述載體還包含一個(gè)或多個(gè)腺病毒相關(guān)病毒的ITR。
84.權(quán)利要求37或39的載體，其中所述載體還包含一個(gè)或多個(gè)腺病毒相關(guān)病毒的ITR。
85.權(quán)利要求38的載體，其中所述載體還包含一個(gè)或多個(gè)腺病毒相關(guān)病毒的ITR。
86.權(quán)利要求82的載體，其中所述一個(gè)或多個(gè)ITR位于所述第一和第二重組位點(diǎn)并包含所述原點(diǎn)的區(qū)域中。
87.權(quán)利要求83的載體，其中所述一個(gè)或多個(gè)ITR位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述啟動(dòng)子的區(qū)域中。
88.權(quán)利要求84的載體，其中所述一個(gè)或多個(gè)ITR位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述編碼序列的區(qū)域中。
89.權(quán)利要求85的載體，其中所述一個(gè)或多個(gè)ITR位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述編碼序列的區(qū)域中。
90.權(quán)利要求82的載體，其中所述一個(gè)或多個(gè)ITR位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述原點(diǎn)的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中。
91.權(quán)利要求83的載體，其中所述一個(gè)或多個(gè)ITR位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述啟動(dòng)子的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中。
92.權(quán)利要求84的載體，其中所述一個(gè)或多個(gè)ITR位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述編碼序列的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中。
93.權(quán)利要求85的載體，其中所述一個(gè)或多個(gè)ITR位于所述第一和第二重組位點(diǎn)之間并包含所述第二編碼序列的區(qū)域以外的一個(gè)區(qū)域中。
94.權(quán)利要求25-29、31和33-39中任一項(xiàng)的載體，其中所述編碼序列選自EBNA-1、Rep、Flp、Cre、大T抗原、E1和E2編碼序列。
95.權(quán)利要求26、27、34、35和38中任一項(xiàng)的載體，其中所述第二編碼序列選自EBNA-1、Rep、Flp、Cre、大T抗原、E1和E2編碼序列。
96.權(quán)利要求25-29、31和33-39中任一項(xiàng)的載體，其中所述編碼序列包括一個(gè)編碼一個(gè)激素受體配體結(jié)合域的序列，該結(jié)合域能夠結(jié)合外源(但不是天然產(chǎn)生的)激素。
97.權(quán)利要求26、27、34、35和38中任一項(xiàng)的載體，其中所述第二編碼序列包括一個(gè)編碼一個(gè)激素受體配體結(jié)合域的序列，該結(jié)合域能夠結(jié)合外源(但不是天然產(chǎn)生的)激素。
98.權(quán)利要求75的載體，其中所述過客基因包括一個(gè)編碼一個(gè)激素受體配體結(jié)合域的序列，該結(jié)合域能夠結(jié)合外源(但不是天然產(chǎn)生的)激素。
99.權(quán)利要求25-29、31、33-39和96中任一項(xiàng)的載體，其中所述編碼序列包含一個(gè)或多個(gè)編碼甘氨酸-丙氨酸重復(fù)的序列。
100.權(quán)利要求26、27、34、35、38和97中任一項(xiàng)的載體，其中所述第二編碼序列包含一個(gè)或多個(gè)編碼甘氨酸-丙氨酸重復(fù)的序列。
101.權(quán)利要求75或98的載體，其中所述過客基因包含一個(gè)或多個(gè)編碼甘氨酸-丙氨酸重復(fù)的序列。
全文摘要
本發(fā)明提供用于細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)特異性重組的方法以及用于這類方法的載體。本發(fā)明的方法和載體可以用來獲得細(xì)胞內(nèi)持久的基因表達(dá)和用來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。按照本發(fā)明的一種推薦方法包括將細(xì)胞與一種載體接觸,該載體包含一個(gè)在哺乳動(dòng)物中有功能的復(fù)制起點(diǎn),后者位于平行定位的第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間。另一種推薦的方法,部分包括將細(xì)胞與一種包含反向定向的第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)的載體接觸,使得該載體被該細(xì)胞內(nèi)在化。在兩種方法中,還提供給該細(xì)胞一種位點(diǎn)特異性重組酶,后者在該載體的第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之間實(shí)現(xiàn)重組。
文檔編號C12N15/34GK1200149SQ96197732
公開日1998年11月25日 申請日期1996年8月27日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月1日
發(fā)明者D·L·麥維, I·科維斯迪 申請人:金維克有限公司