專利名稱：改進的靛藍微生物生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由微生物進行的染料特別是靛藍的生物合成。盡管先前已經(jīng)披露了吲哚和色氨酸(均為靛藍的前體)的生物合成方法，本發(fā)明提供了一種有效的、可商業(yè)化的生物合成系統(tǒng)，從而減少或從發(fā)酵液中除去靛藍合成中的一種抑制化合物靛紅。由于在靛藍生產(chǎn)中除去了上述抑制化合物，可以提高所需最終產(chǎn)物靛藍的產(chǎn)量和/或改善所生產(chǎn)靛藍的特性。另外，本發(fā)明還能防止或減少生物合成靛藍的副產(chǎn)品，一種紅色染料靛玉紅的產(chǎn)生。
藍色染料靛藍是人類所知最古老的染料之一。其作為織物染料的應(yīng)用至少可追溯到公元前2000年。直到18世紀后期，靛藍一直主要是從廣泛分布于非洲、亞洲、東印度群島和南美洲的槐藍屬植物中獲得的。隨著工業(yè)革命在18世紀橫掃歐洲和北美洲，對亮藍色染料的需求，使其發(fā)展成歐洲和遠東之間的主要貿(mào)易產(chǎn)品之一。1883年，由Alfred von Baeyer鑒定了靛藍的結(jié)構(gòu)式C16H10N2O2。1887年，形成了第一種商業(yè)化化學(xué)生產(chǎn)靛藍的方法。該方法一直沿用至今，該方法包括在由苛性鈉堿和氨基鈉組成的混合物中熔化苯基甘氨酸鈉，以生成3-吲哚氧基。該方法的最終產(chǎn)物3-吲哚氧基，在接觸空氣之后自動氧化成靛藍。
現(xiàn)有的商業(yè)化化學(xué)生產(chǎn)靛藍的方法會產(chǎn)生大量的有毒廢物。顯然，需要不會產(chǎn)生有毒副產(chǎn)品的靛藍生產(chǎn)方法。這種產(chǎn)生較少有毒副產(chǎn)品的方法之一涉及由微生物生物合成靛藍。
Ensley等發(fā)現(xiàn)[(1983)Science222167-169]，來源于從土壤細菌惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)中提取的一種可傳遞質(zhì)粒的一種DNA片段，使得由攜帶該片段的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，可在有吲哚或色氨酸的條件下合成靛藍。Ensley等推測，作為培養(yǎng)基添加劑加入的或由色氨酸的酶促代謝而產(chǎn)生的吲哚，被以前鑒定的由所述惡臭假單胞菌DNA編碼的多組分酶萘雙加氧酶(NDO)轉(zhuǎn)化成順-吲哚-2，3-二氫二酚和3-吲哚氧基。所產(chǎn)生的3-吲哚氧基在接觸空氣后被氧化成靛藍。正如本文將要進一步闡述的，由Ensley等所披露的雙加氧酶是可用于靛藍生產(chǎn)的優(yōu)選加氧酶。
業(yè)已證實NDO能催化芳香烴萘向(+)-順-(1R，2S)-二羥基-1，2-二氫萘轉(zhuǎn)化的氧化作用[Ensley等(1982)，J.Bacteriol.149948-954]。被收作背景技術(shù)的美國專利US4,520,103披露了一種利用諸如NDO的芳香雙加氧酶用微生物由吲哚生產(chǎn)靛藍的方法。NDO酶由多種成分組成一種還原酶多肽(Rd，分子量大約為37kD)；一種鐵硫鐵氧還蛋白(Fd，分子量大約為13kD)；及一種末端加氧酶鐵硫蛋白(ISP)。ISP本身由具有α2β2亞基結(jié)構(gòu)的4個亞基組成(亞基的大約分子量為α，55kD；β，21kD)。已知ISP能結(jié)合萘，并在有NADH、Rd、Fd和氧的條件下將其氧化成順-萘-二氫二酚。Fd被認為是該萘氧化催化作用的速度限制多肽(參見被收作本文背景技術(shù)的US5,173,425，充分闡述了各種NDO亞基和對其加以改進，以利于靛藍的生物合成的方法)。
另外，還可將NDO以外的芳香雙加氧酶用于靛藍的生物合成，例如，諸如獲自假單胞菌屬(門多薩假單胞菌)的能降解甲苯的甲苯單加氧酶(TMO)在培養(yǎng)基中添加吲哚的條件下可產(chǎn)生靛藍。詳情參見被收作背景技術(shù)的US5,017,495。原則上講，任何能將羥基部分引入吲哚的3-位以生成3-吲哚氧基的酶均可用于靛藍的生物合成。
另外，很早便已知道，微生物具有產(chǎn)生所有20種必需氨基酸(包括芳族氨基酸L-色氨酸)的生物合成途徑。芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)的從頭合成擁有直至分支酸生成的共同途徑。在分支酸合成之后，三種芳族氨基酸中的每一種采用特殊途徑完成其合成。
以分支酸為原料進行的色氨酸細菌(特別是在大腸桿菌中)生物合成受色氨酸(trp)操縱子的控制。(trp)操縱子由調(diào)節(jié)區(qū)和幾個結(jié)構(gòu)基因組成，由于其復(fù)雜性和協(xié)同調(diào)節(jié)系統(tǒng)，已對其做過深入研究。在被收作本文背景技術(shù)的PCT/US93/09433的

圖1中示出了大腸桿菌操縱子的調(diào)節(jié)和結(jié)構(gòu)組構(gòu)，以及由該操縱子的結(jié)構(gòu)基因所編碼的催化活性。PCT/US93/09433披露了吲哚胞內(nèi)生產(chǎn)的改進，特別涉及將與L-絲氨酸結(jié)合的吲哚-3′-甘油磷酸(InGP)轉(zhuǎn)化成L-色氨酸。該反應(yīng)是由多亞基酶色氨酸合酶催化的。在反應(yīng)中，吲哚以中間產(chǎn)物形式生成。不過，這種吲哚以化學(xué)計量形式很快與L-絲氨酸結(jié)合，生成L-色氨酸。因此，由于InGP+L-絲氨酸被轉(zhuǎn)化成色氨酸，未產(chǎn)生游離吲哚。
不過，Yanofsky等[(1958)Biochim.Biophys.Acta.28640-641]鑒定了一種可導(dǎo)致吲哚積累的色氨酸合酶突變型。然而，這種特殊的色氨酸合酶突變型會因為編碼色氨酸合酶的β亞基的基因上一個核苷酸堿基對變化產(chǎn)生的突變而自動回復(fù)突變成其野生型表型。
PCT/US93/09433披露了一種用于產(chǎn)生能夠大量產(chǎn)生胞內(nèi)吲哚的穩(wěn)定的色氨酸合酶突變型的方法。當(dāng)這種能積累吲哚的色氨酸合酶的突變型表達諸NDO的芳族雙加氧酶時，所積累的吲哚可以轉(zhuǎn)化成3-吲哚氧基，該3-吲哚氧基隨后又被分子氧氧化成靛藍。因此，通過重組DNA技術(shù)的商業(yè)化應(yīng)用，利用一種能連續(xù)產(chǎn)生吲哚的修飾過的trp操縱子和一種能同時將吲哚轉(zhuǎn)化成3-吲哚氧基的加氧酸的超量表達，可以用諸如葡萄糖的可再生原料生產(chǎn)靛藍。
申請人在搖瓶研究中證實，在由吲哚合成靛藍的過程中，在培養(yǎng)上清液中積累了少量的其它化合物或副產(chǎn)品。已證實上述副產(chǎn)品之一靛紅(吲哚2，3-二酮)可抑制該生產(chǎn)菌株中的加氧酶(即NDO)活性，并因此降低靛藍的總產(chǎn)量；因此，靛紅是不希望的。除了副產(chǎn)品靛紅外，在這種靛藍的生物合成方法中還會產(chǎn)生一種由靛紅衍生的紅色染料靛玉紅。據(jù)信，副產(chǎn)品靛紅可降低所述生產(chǎn)株的產(chǎn)量，而副產(chǎn)品靛玉紅被認為會導(dǎo)致由微生物生產(chǎn)的靛藍有不希望的染色特性，其表現(xiàn)為在用被靛玉紅污染的由微生物生產(chǎn)的靛藍染過的布上有紅色色澤。
由于在搖瓶生產(chǎn)中所述副產(chǎn)品的一種或多種可減少該生產(chǎn)株的產(chǎn)量和/或?qū)е掠纱怂a(chǎn)生的靛藍具有不希望的特性，本發(fā)明的一個目的是減少作為靛藍生物合成的副產(chǎn)品在微生物細胞中生成的靛紅的積累或除去這種靛紅。除去靛紅有可能提高發(fā)酵罐的靛藍總產(chǎn)量，并能減少或抑制靛玉紅的積累。本文詳細披露了減少靛紅積累或除去靛紅的一種方法，該方法涉及編碼一種具有靛紅清除活性的酶的一個基因的分離、克隆、測序和在靛藍生產(chǎn)宿主菌株中的表達。所述酶優(yōu)選為靛紅水解酶——一種能降解靛紅的酶；不過除去靛紅或抑制靛紅生成的任何方法都是本發(fā)明所希望的。因此，本發(fā)明的另一方面是通過減少靛紅積累或除去積累的靛紅來提高生物合成靛藍的產(chǎn)量，實現(xiàn)上述目的的方法包括，但不限于通過使其與諸如靛紅水解酶的靛紅清除酶接觸而對靛紅進行酶促轉(zhuǎn)化，在適當(dāng)溫度和pH下對靛紅進行一般堿催化的化學(xué)轉(zhuǎn)化，或?qū)⒌寮t吸附到碳或合適的樹脂上。下面將對本發(fā)明的以上諸方面進行詳細說明。
下面的術(shù)語按本文所下定義理解，除非另有說明。這些定義包括(未加引用)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的與這些術(shù)語相關(guān)的定義。
用于保證生物合成的吲哚積累的色氨酸途徑基因包括以純化DNA分子形式從微生物中分離的trp操縱子，它編碼一種能指導(dǎo)由分支酸生物合成L-色氨酸的酶促途徑(A.J.Pittard(1987)Biosynthesis ofAromatic Amino Acids in Escherichia coli and Salmonellatyphimurium，F(xiàn).C.Neidhardt，ed.，American Society for Microbiology，publisher，pp.368-394)。通過修飾所述途徑的一個或多個結(jié)構(gòu)因子和/或調(diào)節(jié)區(qū)可實現(xiàn)吲哚的積累。然后可將修飾過的trp操縱子導(dǎo)入合適宿主，如微生物、植物組織培養(yǎng)系統(tǒng)或其它合適的表達系統(tǒng)。應(yīng)當(dāng)指出，術(shù)語“吲哚積累”并不一定是指吲哚真的積累在細胞內(nèi)部。相反，該術(shù)語可以表示有較大量的碳流向吲哚，而吲哚可以作為諸如3-吲哚氧基生成而非L-色氨酸生產(chǎn)的胞內(nèi)催化反應(yīng)的底物。在本發(fā)明范圍內(nèi)，所述“積累的”吲哚可以在由諸如芳族雙加氧酶NDO的加氧酶或諸如TMO的芳族單加氧酶催化的吲哚向3-吲哚氧基轉(zhuǎn)化的過程中被消耗，或者當(dāng)需要的最終產(chǎn)物是吲哚或其衍生物之一時，它實際上積累在胞內(nèi)和胞外。
合適的宿主微生物或宿主細胞是可用于吲哚和/或靛藍的微生物生產(chǎn)的自主單細胞生物，包括真核微生物和原核微生物。這種宿主微生物含有由葡萄糖生成吲哚、3-吲哚氧基和/或靛藍或由色氨酸進行生物轉(zhuǎn)化所需的所有內(nèi)源或外源DNA。有用的真核生物包括諸如酵母和真菌或植物的生物?？捎糜诒景l(fā)明的原核生物包括，但不限于諸如大腸桿菌、惡臭假單胞菌和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)的細菌。
吲哚向靛藍的生物轉(zhuǎn)化被理解成包括由分子氧或空氣介導(dǎo)的3-吲哚氧基被氧化成靛藍的氧化作用。
本文所述的DNA片段可以編碼調(diào)節(jié)和/或結(jié)構(gòu)遺傳信息?？捎糜诒景l(fā)明的DNA片段還應(yīng)當(dāng)包括編碼與所提供的序列互補的序列的核酸分子；在嚴格的條件下能與所提供的分子雜交的核酸分子(DNA或RNA)；或除遺傳密碼簡并性之外，能與所提供的分子或其互補鏈雜交的核酸分子?！皣栏竦摹彪s交條件是指能使由非互補的或錯配的單鏈核酸所形成的雙鏈核酸雜合體減少到最低限度的條件。另外，雜交的嚴格性可以通過雜交反應(yīng)各種因素而實現(xiàn)，包括鹽的濃度、甲酰胺的有無、核酸分子的核苷酸組成等?？捎糜诒景l(fā)明的核酸分子可以是天然的或合成的。
“外源”DNA片段是通過任何方法導(dǎo)入宿主微生物的DNA片段，所述方法如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、電穿孔法等。另外，應(yīng)當(dāng)指出的是，其中插入了“外源”DNA片段的宿主細胞本身也可以自然攜帶有編碼相同或類似序列的分子。例如，當(dāng)大腸桿菌被用作本發(fā)明的宿主菌株時，發(fā)現(xiàn)所述宿主的染色體上通常自然帶有trp操縱子，在使該操縱子能夠表達的條件下該trp操縱子能指導(dǎo)由分支酸合成L-色氨酸。這樣的分子被稱為“內(nèi)源”DNA分子。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的微生物是指其中導(dǎo)入了一個或幾個外源DNA片段，使導(dǎo)入的分子能在生長的培養(yǎng)物中保持、復(fù)制和分離的一種微生物。穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化作用可能是因為多次或一次染色體整合或諸如質(zhì)粒載體的染色體外因子而造成的。質(zhì)粒載體能夠指導(dǎo)由特定DNA片段編碼的多肽的表達。表達可以是組成性的或由誘導(dǎo)型(或阻抑型)啟動子調(diào)控，所述啟動子使編碼特定多肽的功能性相關(guān)的DNA片段，如按本文所述修飾過的trp操縱子的結(jié)構(gòu)基因能夠高水平轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明所用的“靛紅清除酶”是指具有抑制、清除、失活、降解、水解或結(jié)合(螯合)靛紅的活性的任何酶，這種酶可導(dǎo)致靛紅酸或任何其它靛紅衍生物的生成。可用于本發(fā)明的優(yōu)選靛紅清除酶是一種靛紅水解酶，如從本文的惡臭假單胞菌(WW2)中提取的水解酶。
無論用于微生物生產(chǎn)吲哚、3-吲哚氧基和/或靛藍所需要的酶表達的確切機制如何，可以期望這種表達通常是通過重組遺傳因子向宿主細胞中的轉(zhuǎn)移而實現(xiàn)或介導(dǎo)的。本文所定義的遺傳因子包括具有諸如蛋白，特別是酶、脫輔蛋白的可表達編碼序列的核酸(通常為DNA或RNA)，或表達或調(diào)控相關(guān)酶(即靛紅水解酶、色氨酸合酶、NDO等)的表達的反義RNA。所表達的蛋白可以作為酶起作用，阻抑或脫阻抑酶活性或控制酶的表達。編碼這種可表達序列的重組DNA可以是染色體序列(例如，通過同源重組整合到宿主細胞染色體上)或染色體外序列(例如，由能夠?qū)崿F(xiàn)定向轉(zhuǎn)化的一種或多種質(zhì)粒、粘粒和其它載體所攜帶)。應(yīng)當(dāng)意識到，用于按照本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化宿主細胞的重組DNA，除了包括結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子之外，還包括表達控制序列，這些序列包括啟動子、阻抑物和增強子，其作用是控制蛋白、脫輔蛋白的編碼序列或反義RNA的表達或脫阻抑。例如，可將這種控制序列插入野生型宿主細胞中，以促進已由宿主細胞基因組編碼的選定酶的超量表達，或?qū)⑵溆糜诳刂迫旧w外編碼的酶的合成。
可以用任何方法將重組DNA導(dǎo)入宿主細胞，包括，但不限于能介導(dǎo)遺傳因子向宿主細胞中轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、酵母人工染色體或其它載體。所述載體可以包括一個復(fù)制起點，以及控制該載體復(fù)制的順式作用控制因子，和由該載體所攜帶的遺傳因子。在該載體上可帶有選擇標記，以利于鑒定導(dǎo)入了遺傳因子的宿主細胞。這種選擇標記的例子有能賦予對特定抗生素，如四環(huán)素、氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素或新霉素的抗性的基因。
一種將遺傳因子導(dǎo)入宿主細胞的方法是利用在其中插入了本發(fā)明的遺傳因子的染色體外多拷貝質(zhì)粒載體。借助質(zhì)粒將遺傳因子導(dǎo)入宿主細胞包括用一種限制酶原始裂解質(zhì)粒載體，然后連接該質(zhì)粒與編碼本發(fā)明目的酶的遺傳因子。在對連接的重組質(zhì)粒進行重新環(huán)化之后，用感染(例如，包裝在λ噬菌體中)或其它質(zhì)粒轉(zhuǎn)移機制(例如，電穿孔法、顯微注射等)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到宿主細胞中。適于將遺傳因子插入宿主細胞的質(zhì)粒為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
本發(fā)明的一個方面涉及分離具有清除靛紅的酶促活性(被稱為靛紅清除酶)的生物，以及對編碼一種優(yōu)選的靛紅清除酶—靛紅水解酶進行克隆和測序。
本發(fā)明的另一方面涉及將編碼靛紅清除酶活性的DNA分子摻到能產(chǎn)生吲哚、3-吲哚氧基和/或靛藍的宿主菌株中。該DNA分子最好被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或整合到原核或真核宿主細胞的染色體上。有用的宿主細胞可以是細菌、酵母或真菌，例如，包括鏈霉菌屬、埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、酵母屬、曲霉屬等。原核宿主大腸桿菌是一種優(yōu)選宿主生物。
本發(fā)明的再一方面涉及包括一個本發(fā)明的DNA分子的生物學(xué)功能性質(zhì)?；虿《綝NA載體。在一種優(yōu)選實施方案中，用這樣一種生物學(xué)功能性載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細胞或諸如大腸桿菌的原核宿主細胞。
本發(fā)明的其它方面涉及在合適的宿主微生物中進行靛藍的生物合成的方法，該方法包括將一個編碼靛紅清除酶活性的DNA片段導(dǎo)入宿主中，并在有利于3-吲哚氧基積累的條件下培養(yǎng)所述微生物，以便當(dāng)3-吲哚氧基轉(zhuǎn)化成靛藍時由所述靛紅清除酶活性除去所有靛紅副產(chǎn)品。合適的宿主微生物包括，但不限于能表達(內(nèi)源或外源表達)色氨酸操縱子(或修飾的trp操縱子)和/或加氧酶活性的宿主生物，該宿主生物被編碼靛紅水解酶的DNA分子轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染過。在有利于表達所述色氨酸操縱子(或修飾的trp操縱子)、吲哚氧化活性(可以生成3-吲哚氧基)和靛紅水解酶的條件下培養(yǎng)所述生物。
特別涉及在選擇的宿主微生物中進行靛藍的生物合成的改進方法，該方法包括將一個編碼能清除在靛藍生產(chǎn)過程中所積累的所有靛紅的靛紅清除酶活性的DNA片段導(dǎo)入宿主微生物內(nèi)，其前提是可以通過將編碼下列酶活性中的一種或多種的一個或多個DNA片段導(dǎo)入而對該宿主微生物做進一步修飾(i)色氨酸酶活性(能把色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚)或
(ii)能把吲哚轉(zhuǎn)化成3-吲哚氧基的加氧酶活性；還包括在有利于由所述DNA片段編碼的多肽表達的條件下培養(yǎng)修飾的微生物，以使這種多肽的表達可以積累吲哚、將吲哚轉(zhuǎn)化成3-吲哚氧基并清除靛紅。這種修飾的微生物可以產(chǎn)生3-吲哚氧基，3-吲哚氧基又被氧化成靛藍，然后可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法回收所產(chǎn)生的靛藍。
本發(fā)明的另一方面包括一種生產(chǎn)靛藍的改進方法，其中，可以用任何方法抑制或消除副產(chǎn)品靛紅和/或靛玉紅的生成，所述方法包括化學(xué)或酶促抑制/失活或用諸如碳的化合物吸附。
圖1表示用于克隆源于惡臭假單胞菌WW2株的靛紅水解酶基因的方法示意圖。
圖2表示用于亞克隆源于惡臭假單胞菌WW2株的靛紅水解酶基因的方法。
圖3a-c表示靛紅水解酶基因的核苷酸序列(序列1)和推定的氨基酸序列(序列2)，以及5′和3′非翻譯序列(分別為序列1的1-144bp和924-1006bp)和該克隆載體的多接頭序列。
圖4表示包括靛紅水解酶(IH)和色氨酸酶(tnaA)基因的質(zhì)粒pUC-IH-H的構(gòu)建。
圖5表示包括與lac啟動子處于同一取向的靛紅水解酶基因的質(zhì)粒pCL-IH-SI的構(gòu)建。
圖6表示中間質(zhì)粒即質(zhì)粒pAK1的構(gòu)建。
圖7表示包括與lac啟動子處于同一取向的靛紅水解酶基因和色氨酸酶(tnaA)基因的質(zhì)粒pCL-ISTI的構(gòu)建。
圖8表示包括與lac啟動子處于同一取向的靛紅水解酶基團的質(zhì)粒pCL-IHA的構(gòu)建。
圖9表示添加靛玉紅至染料中后對漂洗用靛藍染色的粗斜布的影響。
生物合成靛藍的現(xiàn)有生產(chǎn)方法，可以用諸如TMO的芳族單加氧酶或諸如NDO的芳族雙加氧酶或其它加氧酶進行吲哚向靛藍的生物轉(zhuǎn)化，所述其它加氧酶如由S.Hart，K.R.Koch和D.R.Woods所披露的從紅球菌屬中獲得的氧化酶[(1992)“Identification of indigo-relatedpigments produced by Escherichia coli containing a clonedRhodococcus gene”，J.Gen.Microbiology138211-216]。上述方法必須向培養(yǎng)基中添加吲哚，因為在這種系統(tǒng)中無胞內(nèi)吲哚積累。不過，向培養(yǎng)基中添加的吲哚可能對微生物有毒。當(dāng)培養(yǎng)基中有吲哚時大腸桿菌的生長可能受到抑制。Bang等[(1983)Biotechnoloy andBioengineering25999-1011]披露了添加外源吲哚對生長在搖瓶中的極限培養(yǎng)基里的大腸桿菌的影響。他們發(fā)現(xiàn)，盡管高達0.025％的濃度可減緩細菌的生長，但該細胞隨著時間推移會適應(yīng)吲哚的存在。不過，0.03％的吲哚會嚴重限制生長而無顯著的適應(yīng)性，而當(dāng)吲哚濃度超過0.04％時，可完全抑制生長。另外，Bang等(同上)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)吲哚的加入量超過0.2g/L時，L-色氨酸的合成受到抑制。
為了避免因需要向培養(yǎng)基中補充吲哚而對靛藍合成造成的固有局限，開發(fā)出了能進行內(nèi)源吲哚的生物合成的系統(tǒng)。一種這樣的系統(tǒng)可以將編碼一種修飾過的以便能促進吲哚產(chǎn)生和積累的trp操縱子(以下稱“修飾的trp操縱子”)的DNA序列的外源DNA分子轉(zhuǎn)入已經(jīng)能夠表達一種加氧酶(即NDO)活性的重組宿主微生物中。這種系統(tǒng)可用于由葡萄糖或其它碳源生產(chǎn)靛藍。最理想的是該系統(tǒng)可有效地把內(nèi)源產(chǎn)生的吲哚轉(zhuǎn)化成3-吲哚氧基，以避免胞內(nèi)吲哚積累的方式進行。在被收入本文的PCT/US93/09433中對該系統(tǒng)有詳細說明。所述系統(tǒng)與本發(fā)明靛紅清除方法的組合是本文所披露的靛藍生產(chǎn)的改進方法的一個優(yōu)選實施方案。
一般，如在PCT/US93/09433中所示，trp B基因上的某些點突變，特別是在trp B基因的382位上的點突變(被稱為trp B382)會產(chǎn)生trp B的穩(wěn)定突變型。這種突變型可提高宿主細胞中的吲哚通量，而這種突變型被優(yōu)選用于按本文所述方法結(jié)合靛紅清除活性生產(chǎn)靛藍。此外，這種色氨酸合酶突變型與諸如NDO的芳族雙加氧酶的表達會導(dǎo)致吲哚的胞內(nèi)生成，及其向3-吲哚氧基的轉(zhuǎn)化，3-吲哚氧基被自發(fā)氧化成靛藍。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案基于解決所述現(xiàn)有技術(shù)中所提出的需要消除或減少在微生物生產(chǎn)靛藍期間不希望的副產(chǎn)品靛紅和/或靛玉紅的生成的問題。下面將詳細說明為了克服申請人在試圖放大吲哚的生物合成中所遇到的問題而提出的酶促、化學(xué)或吸附方法。1、靛紅生成的酶促方法克隆源于惡臭假單胞菌WW2菌株的靛紅水解酶基因在由吲哚合成靛藍的過程中，在培養(yǎng)上清液中積累了少量其它化合物。業(yè)已證實上述副產(chǎn)品之一靛紅(吲哚2，3-二酮)可在生產(chǎn)株中抑制NDO活性，結(jié)果降低了靛藍的總產(chǎn)量。另外，靛紅是靛玉紅的前體，而靛玉紅是一種紅色染料，它可導(dǎo)致用微生物靛藍染過的材料出現(xiàn)輕度紅色色澤。因此，在尋求清除或消除靛紅積累的方法。因而促進了尋找能降解靛紅的酶的嘗試。用營養(yǎng)選擇法對若干土壤樣品進行篩選，結(jié)果鑒定了具有降解靛紅能力的生物。由Biolog、GC-FAME、明膠水解和磷脂酶C分析組成的分類學(xué)研究表明，該微生物是惡臭假單胞菌。因此，該生物被命名為惡臭假單胞菌WW2菌株。其酶促活性表現(xiàn)為將靛紅水解成靛紅酸的水解反應(yīng)。因此，該酶被命名為“靛紅水解酶”。
為了克隆編碼靛紅水解酶的基因(見圖2和3)，由惡臭假單胞菌WW2菌株制備全DNA，并用Sau3A限制內(nèi)切酶進行部分消化。然后在0.7％的瓊脂糖凝膠中在100mV的電壓下將部分消化的DNA電泳12小時。用溴化乙錠染色后，通過熒光觀察DNA，并切下含有1～10kbDNA片段的凝膠塊。通過電洗脫方法將DNA從所述凝膠塊上洗脫，并通過苯酚/氯仿處理進一步純化，乙醇沉淀，并重懸于TE緩沖液中。
先通過BamHI消化使表達載體pTrc99A(由Pharmacia Biotech，Inc.出售；產(chǎn)品目錄號#27-5007-01)線性化，并用小牛小腸堿性磷酸酶脫磷酸化，再將所分離的DNA片段連接到該表達載體上。在連接以后，用5μl連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Sure Cell(購自Stratagene，產(chǎn)品目錄號#200238)。在長出轉(zhuǎn)化體之后，以1∶1的比例用2YT培養(yǎng)基稀釋所述混合物，并鋪平板于含有50μg/ml羧芐青霉素和1mM IPTG的L-瓊脂板上。
在37℃下培養(yǎng)該平板過夜，隨后可觀察到數(shù)千個轉(zhuǎn)化體。通過在所述平板表面噴灑含有10mg/ml溶菌酶和25mM EDTA的溶液并在室溫下培養(yǎng)20分鐘來裂解菌落。然后用預(yù)先在由3.5mg5，7-二甲基靛紅和10ml 50mM Tris/HCl(pH7.5)組成的溶液中染色20分鐘的硝酸纖維素膜覆蓋所述平板。培養(yǎng)1小時，然后將硝酸纖維素膜從所述平板上揭下，并檢查橙色背景上的白色透明區(qū)。這種透明區(qū)將表明靛紅水解活性的存在。
該篩選得到了含有帶6.3kb克隆插入片段的質(zhì)粒(圖1)的陽性轉(zhuǎn)化體。該質(zhì)粒被命名為pTrc-IH。通過切除pTrc-IH上的6.3kb的插入片段實現(xiàn)靛紅水解酶的亞克隆。用SalI消化pTrc-IH得到3個片段(1.6kb、2.6kb和6.3kb)。這表明克隆的插入片段起碼帶有2個內(nèi)部SalI位點。該克隆載體在其多接頭區(qū)有一個SalI位點。當(dāng)提取該pTrc-IH的6.3kb SalI片段、再連接并轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌SureCell(Stratagene，產(chǎn)品目錄號#200238)中時，再次出現(xiàn)靛紅水解酶活性。這種新的質(zhì)粒被命名為pTrc-IH#2，并且在大約為2.3kb的克隆片段上帶有IH基因(圖1)。
對pTrc-IH#2限制作圖證實了在克隆片段上存在單一的XhoI限制位點，該位點位于從其一端起算大約400bp處。這樣就能進一步亞克隆含靛紅水的酶的片斷(見圖2)。用XhoI消化pTrc-IH#2，然后用T4 DNA聚合酶填補突出端(由此產(chǎn)生平端)。然后用SalI消化所得線性化質(zhì)粒。從瓊脂糖凝膠中純化由此產(chǎn)生的1.9kb的平端SalI片段，并連接于預(yù)先用SmaI和SalI消化的載體pUC18上。將補平的XhoI突出端連接在一個SmaI末端上，再生一個XhoI位點。用該連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM101(ATCC33876)菌株，并用上述篩選方法鑒定具有靛紅水解酶活性的轉(zhuǎn)化體。從陽性轉(zhuǎn)化體中提取的質(zhì)粒被證實含有位于1.9kb XhoI-SalI片段上的靛紅水解酶基因；該質(zhì)粒被命名為pUC18-IH(圖2)。其它實驗表明，可用IPTG誘導(dǎo)含有pUC18-IH的菌株的靛紅水解酶活性，這表明pUC18-IH上的靛紅水解酶基因的轉(zhuǎn)錄方向與lac啟動子的方向一致。
按下述方法對靛紅水解酶基因做進一步的亞克隆(見圖2)。對pUC18-IH上的1.9kb克隆片段進行的部分DNA測序和限制性作圖揭示該片段上存在特有的BbsI限制位點，該位點靠近其中央。通過用BbsI和SalI消化pUC18-IH、在瓊脂糖凝膠上分離所產(chǎn)生的片段并提取大的(3.6kb)片段可切除大約1kb的克隆DNA。用T4DNA聚合酶補平末端后，通過連接使該片段再環(huán)化。然后用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM101(ATCC33876)菌株，并篩選靛紅水解酶活性。陽性克隆產(chǎn)生一個被命名為pUC-IH(圖2)的新質(zhì)粒，并發(fā)現(xiàn)在大約900bp的片段上具有功能性靛紅水解酶基因。
靛紅水解酶基因的DNA序列。用市售lac和被設(shè)計用于pUC載體(ATCC37253)的反向引物對pUC-IH上的整個克隆的插入片段進行測序。該插入片段的全核苷酸序列如圖3所示(序列1)。用GeneticsComputer Group，Inc.的序列分析軟件證實在測序區(qū)上有一個開放讀框(序列1上從145至923位的780bp)。根據(jù)該開放讀框的核苷酸序列預(yù)測的靛紅水解酶分子量(32,886)與通過凝膠滲透層析和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳測得的靛紅水解酶蛋白的大小估計值(30,000-40,000)一致。對隨后純化的靛紅水解酶的N-末端氨基酸測序測出其序列為MTSIKLLAESLLK(序列3)。該序列與由所述單一開放讀框的核苷酸序列推測的N-末端氨基酸序列一致。上述分析表明有144bp的5′(非翻譯區(qū))和82bp的3′(非翻譯區(qū))與該開放讀框相鄰。
構(gòu)建用于靛藍生產(chǎn)菌株的含有靛紅水解酶基因和大腸桿菌K-12色氨酸酶基因的輔助質(zhì)粒。
在色氨酸向靛藍轉(zhuǎn)化的生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵中，在有以細胞提取物形式添加到發(fā)酵液中的靛紅水解酶或有由質(zhì)粒表達的該酶的條件下，發(fā)現(xiàn)靛紅濃度降低。當(dāng)源于大腸桿菌K-12的能將色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚的色氨酸酶由一種獲得了tnaA基因的質(zhì)粒超量表達時，在搖瓶中靛藍生產(chǎn)中會出現(xiàn)生產(chǎn)速度加快的優(yōu)點。因此，將靛紅水解酶和色氨酸酶基因組合在一種低拷貝數(shù)質(zhì)粒上，以實現(xiàn)上述優(yōu)點。下面說明該質(zhì)粒的構(gòu)建。
在構(gòu)建質(zhì)粒pUC-IH時，位于靛紅水解酶基因的3′末端的單一SalI位點被破壞。為了方便對來自pUC-IH的靛紅水解酶基因進行亞克隆，通過用HindIII消化pUC-IH并將一個含有大腸桿菌K-12色氨酸酶(tnaA)基因的3.2kb HindIII片段(源于pSUtna，參見圖4)克隆到該位點上(沿正確方向)[Deeley和Yanofsky(1981)“Nucleotidesequence of the Structural gene for tryptophanase of Escherichia coliK-12”，J.Bacteriol.147787-796]在靛紅水解酶基因的3′末端再生一個SalI位點。之所以選擇后一種片段，是因為它在所克隆的tnaA基因的一端有有用的多接頭序列。新構(gòu)建的質(zhì)粒被命名為pUC-IH-H(圖4)。這種中間構(gòu)建體有利于靛紅水解酶基因以大約1kb的XhoI-SalI片段形式從pUC-IH-H上切除。
沿兩種方向?qū)⒃撈慰寺〉降涂截悢?shù)載體pCL1920的單一SalI位點上[C.G.Lerner and M.Inouye(1990) Nucleic Acid Research184631]。分離帶有取向與lac啟動子相同的靛紅水解酶基因和在該靛紅水解酶基因的3′末端有單一的SalI位點的需要的質(zhì)粒(見圖5)，并命名為pCL-IH-S1。
以如下方法將克隆的大腸桿菌K-12色氨酸酶(tnaA)基因加到pCL-IH-S1上將來自pMB2190的帶有卡那霉素抗性基因的1.3kbEcoRI片段[A.Darzins，B.Frantz，R.I.VannagsA.M.Chakrabarty(1986)Gene42293-302]插入位于質(zhì)粒pSUtna上克隆的tnaA基因一端的單一EcoRI位點上。將來自質(zhì)粒pMD6[M.C.Deeley and C.Yanofskey(1981) J.Bacteriol.147787-796]的3.2kbEcoRI-BamHI片段(帶有tnaA)亞克隆到質(zhì)粒pSU18[B.Bartolome，Y.Jubete，E.Martinez，F(xiàn).dela Cruz(1991)Gene10275-78]上，構(gòu)建質(zhì)粒pSUtna。為了在接近tnaA基因處引入另一個SalI位點，將來自pMB2190[部分質(zhì)粒圖示于圖8中；A.Darzins，B.Frantz，R.I.Vanags，A.M.Chakrabarty(1986)Gene42293-302]的帶有卡那霉素抗性基因和兩個旁側(cè)多克隆位點的一個1.3kb EcoRI片段導(dǎo)入位于質(zhì)粒pSUtna上克隆的tnaA 3′端的單一EcoRI位點上。所得質(zhì)粒被命名為pAK1。
該tnaA基因可以3.2kb SalI片段形式從pAK1上切除。將該片段插入pCL-IH-S1的單一SalI位點上(參見圖7)。在該片段的兩種預(yù)測取向中，分離轉(zhuǎn)錄方向與靛紅水解酶一致的一種，并命名為pCL-IST1(圖7)。
生產(chǎn)用生物的構(gòu)建。為了制備生產(chǎn)用生物，用標準轉(zhuǎn)化方法將相容性質(zhì)粒911-ISP[Ensley等(1987)“Expression andcomplementation of naphthalene dioxygenase activity in Escherichiacoli”，見Microbial Metabolism and the Carbon Cycle，S.R.Hagdorn，R.S.Hanson和D.A.Runz著，Harwood Academic Publishers，NewYork，pp.437-455]和pCL-IST1(圖7)導(dǎo)入生產(chǎn)宿主FM5[Burnette等(1988)“Direct expression of Bordella pertussin toxin subunits tohigh levels in Escherichia coli”，Bio/technology6699-706]，采用通過氯化鈣處理變成感受態(tài)的FM5細胞。通過分別由質(zhì)粒911-ISP和pCL-IST1賦予其的氨芐青霉素和壯觀霉素抗性鑒定含有這兩種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。通過分離全質(zhì)粒DNA和限制酶分析證實了所述質(zhì)粒在FM5宿主中的存在。
以前披露了生產(chǎn)宿主菌株FM5[Burnette等(1988)“Directexpression of Bordella pertussin toxin subunits to high levels inEscherichia coli”，Bio/technology6699-706]，同樣披露了生產(chǎn)質(zhì)粒911-ISP和宿主FM5/911-ISP[Ensley等(1987)“Expression andcomplementation of naphthalene dioxygenase activity in Escherichiacoli”，見Microbial Metabolism and the Carbon Cycle，S.R.Hagdorn，R.S.Hanson和D.A.Kunz著，Harwood Academic Publishers，NewYork，pp.437-455]。業(yè)已披露了編碼色氨酸酶(tnaA)的克隆大腸桿菌K-12 tna片段(3.2kb)[Deeley and Yanofsky(1981)“Nucleotidesequence of the Structural gene for tryptophanase of Escherichia coliK-12”，J.Bacteriol.147787-796]，還披露了載體pCL1920[C.G.Lerner and M.Inouye(1990)“Low copy number plasmid forregulated low level expression of cloned genes in Escherichia coli withblue/white insert screening capability”，Nucleic Acid Research184631]。被導(dǎo)入該靛藍生產(chǎn)菌株(FM5/911-ISP，pCL-IST1)的唯一新DNA是帶有1kb XhoI-SalI片段的pCL1920載體，所述片段上帶有隨少量測序多接頭DNA一起插入的靛紅水解酶基因，這些多接頭DNA是從中間質(zhì)粒構(gòu)建體(見圖8)上帶過來的，該片段上還帶有編碼色氨酸酶的tna DNA。
可采取多種不同形式將靛紅水解酶基因用于清除靛藍發(fā)酵中所產(chǎn)生的副產(chǎn)品靛紅。我們預(yù)計所述基因產(chǎn)物靛紅水解酶可用于色氨酸向靛藍的生物轉(zhuǎn)化(生物轉(zhuǎn)化法)，并可用于在單一的宿主生物中通過該生物進行的色氨酸或吲哚的中間合成用葡萄糖生產(chǎn)靛藍(單一宿主或直接方法)。靛紅水解酶基因本身可以幾種形式存在當(dāng)該基因位于宿主的染色體上、以染色體外的自主復(fù)制的DNA因子形式提供、或為導(dǎo)入細胞并在發(fā)酵期間得以保持的任何其它形式的DNA時是有效的。基因表達的調(diào)節(jié)可以是組成型的，或是由合適的啟動子調(diào)節(jié)。
當(dāng)所述水解酶基因整合在染色體上時，它將與諸如NDO(US專利4,520,103和US專利5,173,425)、TMO(US5,017,495)的加氧酶或以源于紅球菌屬的氧化酶為例的氧化酶一起起作用[S.Hart，K.R.Koch和D.R.Woods(1992)“Identification of indigo-related pigmentsproduced by Escherichia coli containing a cloned Rhodococcusgene”，J.Gen.Microbiology138211-216]。能直接或間接產(chǎn)生3-吲哚氧基的單組分單加氧酶也可能與靛紅水解酶一起使用。上述加氧酶/氧化酶或其組分可以由宿主染色體上的基因編碼或?qū)肴旧w外因子上。編碼氧化酶的基因可以組成型形式表達，或者由適當(dāng)?shù)膯幼诱{(diào)控。該靛紅水解酶基因可以存在于與編碼氧化酶的基因相同的DNA因子上。編碼所有活性的基因的表達可以獨立調(diào)控或協(xié)同調(diào)控。
在所述直接方法，即單一宿主方法中，預(yù)計靛紅水解酶基因可與芳族氨基酸途徑的基因共表達，這些基因可以受內(nèi)源調(diào)控或由工程突變進行人工調(diào)控，所述突變可消除反饋抑制和/或?qū)е禄虺勘磉_。其包括因為編碼于多拷貝數(shù)質(zhì)粒上而得以擴增的芳族氨基酸途徑基因，由此而使得合適的基因由組成型啟動子或由可調(diào)型啟動子表達。所有基因均可由不同的啟動子或啟動子的任意組合調(diào)控。
所述芳族氨基酸途徑基因也可僅位于染色體上，或者存在由質(zhì)粒操縱的染色體編碼的芳族氨基酸途徑基因的任意組合形式。
用于本發(fā)明中的一般重組DNA技術(shù)，如DNA分離和純化、用限制酶裂解DNA、構(gòu)建重組質(zhì)粒、將DNA導(dǎo)入微生物以及定點誘變在很多出版物中均有記載，包括由Manniatis等所著的MolecularCloning-A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory(1982)和由Ausubel等所著的Curreut Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscienee(1987)。II.清除靛紅的其它方法在發(fā)酵中實施吸附或用化學(xué)方法轉(zhuǎn)化成非抑制化合物的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。其中，包括，但不限于以下方法。
取出無細胞發(fā)酵液進行處理?？梢杂梅蛛x裝置，如交叉流濾膜或離心機從發(fā)酵罐中取出無細胞的發(fā)酵液。然后可以用例1或2所述方法對該無細胞發(fā)酵液進行處理?？捎脫Q熱回路加熱，如果需要，冷卻該發(fā)酵液?？梢栽诨芈分屑尤胗糜趐H控制的堿，以提高其堿性。在本發(fā)明的一種實施方案中，通過至少將pH提高到11左右(添加合適的堿)并將溫度升高到約50-70℃處理發(fā)酵液，以清除靛紅副產(chǎn)品。該處理的處理時間足以使發(fā)酵液的橙色褪色至淡黃色(不到12小時，優(yōu)選為2-5小時左右或更短)。另外，可以讓該發(fā)酵液通過活性碳或其它吸附劑，以除去靛紅[Freemon等(1993)“In situ Product removal as atool for bioprocessing”，Bio/technology111007-1012]。
將吸附劑直接加入生物轉(zhuǎn)化液中?？蓪⑽絼┘尤肷镛D(zhuǎn)化液中，以吸附靛紅?？蓪⒒钚蕴蓟蚱渌愋偷奈絼┘尤氚l(fā)酵液，然后在發(fā)酵之后從靛藍中分離出來。
通過一般堿催化作用水解靛紅。向發(fā)酵液中加入高濃度磷酸鹽可以降低靛紅濃度，所加入的磷酸鹽可作為一般堿催化劑水解靛紅。一般堿催化作用如例4所述。實驗例1清除系統(tǒng)中的靛紅，以提高靛藍產(chǎn)量。
通過加熱和提高pH處理減輕對靛藍生成的抑制作用用能把色氨酸轉(zhuǎn)化成靛藍的菌株實施兩種發(fā)酵[FM5(911-ISP，pCL-ISP#14)]。向一個發(fā)酵罐中加入色氨酸后可產(chǎn)生靛藍，對照發(fā)酵罐中不加色氨酸，無任何靛藍生成。當(dāng)發(fā)酵到20小時時從每個發(fā)酵罐中取出發(fā)酵液，離心以除去靛藍和細胞。將葡萄糖加入上清液中，使其濃度達到10g/L。對其它對照，制備含有10g/L葡萄糖和±5mM靛紅和pH7.0的200mM磷酸鉀緩沖樣品。向每種發(fā)酵液和每種緩沖液的一份等分樣品中加入45％KOH，以便將pH提高到11.0左右。將該溶液置于一個熱板上，并加熱至50-70℃左右，直到靛紅溶液的橙色轉(zhuǎn)為淡黃色(大約2-5小時)。如以前的光譜實驗所測定的，這種顏色變化表明靛紅被水解成了靛紅酸，如方案1所示。此時，所有樣品均被冷卻，并用85％的磷酸將pH重調(diào)至7.0。
靛紅 靛紅酸方案1.靛紅水解在第21小時時從未添加色氨酸的發(fā)酵罐中取出細胞，并離心。以高細胞密度重懸于含有10g/L葡萄糖的pH7.0的200mM磷酸鉀緩沖液中，分別把最終A660為2的等分試樣加入裝在250mL的擋板式燒瓶中的25ml pH及加熱處理緩沖液和發(fā)酵液中(重復(fù)實驗)。將所述燒瓶搖30分鐘，此時進行原始靛藍測定(通過將1份培養(yǎng)液溶解在10份或更多DMF中并測其A660)，并加入吲哚，使其濃度為250mg/L。1小時后在A610下通過分光光度法測定靛藍的生產(chǎn)量，并以每小時每克重干細胞所產(chǎn)生的靛藍克數(shù)表示。在表1中給出了測定結(jié)果(重復(fù)處理的)，對用于靛藍生產(chǎn)的處理的和非處理的發(fā)酵液進行了比較。
表1.通過搖瓶分析測定的在經(jīng)過pH和加熱處理的發(fā)酵液中和緩沖液中的靛藍產(chǎn)量培養(yǎng)基 加熱和pH處理處理過的 未處理過的未加Trp的發(fā)酵液 0.400 0.4460.442 0.442加Trp的發(fā)酵液 0.314 0.3470.0843 0.0797含靛紅的緩沖液0.327 0.3270.0627 0.0764緩沖液0.285 0.3070.311 0.321結(jié)果表明，來自靛藍生產(chǎn)生物轉(zhuǎn)化的靛紅或發(fā)酵液可進一步降低靛藍產(chǎn)量。對發(fā)酵液或緩沖液進行處理，將靛紅水解成靛紅酸之后可緩解這種抑制作用。
例2用活性碳處理來自生物轉(zhuǎn)化的廢液以提高靛藍產(chǎn)量按例1所述方法收集來自生物轉(zhuǎn)化過程的發(fā)酵液。用活性碳處理一份等分發(fā)酵液樣品，另一份未作處理的發(fā)酵液等分試樣被用作對照。按例1所述方法測定的靛藍生產(chǎn)速率如表2所示。所示結(jié)果為重復(fù)實驗的結(jié)果。
表2通過搖瓶分析測出的經(jīng)活性碳處理的發(fā)酵液的靛藍產(chǎn)量靛藍產(chǎn)量發(fā)酵液 (g/g DW/hr)非活性碳處理 0.057 0.048活性碳處理 0.115 0.122以上數(shù)據(jù)表明，用碳處理可以緩解靛藍生產(chǎn)的抑制作用。抑制作用的解除歸因于靛紅被活性碳清除。
例3靛紅是純化的NDO的氧化還原循環(huán)劑用公知方法[Haigler and Gibson(1990)“Purification andproperties of NADH-ferredoxinnapreductase，a component ofnaphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. Strain NCIB9816”，J.Bacteriol.172457-464；Ensley and Gibson(1983)“Naphthalene dioxygenasePurification and properties of a terminaloxygenase component”，J.Bacteriol.155505-511；Haigler andGibson(1990)“Purification and properties of ferredoxinnap，acomponent of naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp.StrainNCIB 9816”，J.Bacteriol.172465-468]從能超量表達鐵氧還蛋白還原酶(Rd)、鐵氧還蛋白(Fd)和末端加氧酶(ISP)的大腸桿菌菌株中純化重組NDO。NDO操縱子是受phoA啟動子的操縱。將純化的組分貯存在-80℃下待用。通過在有靛紅的條件下在340nm波長下光譜監(jiān)測NADH的氧化作用證實靛紅是鐵氧還蛋白還原酶和鐵氧還蛋白的電子受體。按以下方法進行分析0.97ml 50mM Tris/HCl pH7.5，100uMNADH，氧化還原酶組分和靛紅。在某些實驗中，還要在有NDO底物(R)-1，2，3，4-四氫-1萘[(R)-THN]的條件下測定NADH。在無靛紅或底物的條件下未出現(xiàn)NADH氧化作用。通過監(jiān)測其光譜發(fā)現(xiàn)，在任何試驗中靛紅的濃度均不改變。結(jié)果歸納在下面的表3中。
表3.證實由靛紅進行的氧化還原循環(huán)的實驗總結(jié)底物被氧化的NADH 存在的酶組分(R)-THN＝1mM[NADH]，mM 靛紅＝250uM nmol/min/ml0.100 (R)-THN 9.0ISP，F(xiàn)d，Rd0.100 (R)-THN+靛紅15.0 ISP，F(xiàn)d，Rd0.100 靛紅10.9 ISP，F(xiàn)d，Rd0.100 靛紅12.3Fd，Rd0.100 靛紅3.4 Rd0.140 靛紅13.1 ISP，F(xiàn)d*，Rd0.100 靛紅12.5 ISP，F(xiàn)d*，Rd注[ISP]＝1uM，[Rd]＝60nM，[Fd]＝0.94uM，但是，當(dāng)標以*號時[Fd]為0.67uM。在上述實驗中未對試驗進行優(yōu)化。在無酶組分的條件下未見NADH的氧化作用。
以上結(jié)果清楚地表明，靛紅介導(dǎo)NADH氧化作用。由于靛紅不發(fā)生任何化學(xué)變化，它可以作為具有Rd和Fd成分的氧化還原循環(huán)劑。
例4證實由一般堿催化的靛紅水解作用在37℃和幾種不同濃度的pH為7的KPO4緩沖液中驗證由一般堿催化的靛紅水解作用。水解以后，分別在302和368nM的條件下光譜監(jiān)測靛紅的消失和靛紅酸的出現(xiàn)。靛紅的起始濃度為250uM。下表總結(jié)了水解速度并證實了速度對緩沖液濃度的依賴性。該表還示出了若干其它陰離子和緩沖液的靛紅水解速度，所有水解作用均在pH7和37℃下進行。速度以半衰期(τ1/2)形式表示。表4總結(jié)了在緩沖液中的靛紅水解速度。
表4.證實靛紅在各種緩沖液中水解的數(shù)據(jù)的總結(jié)緩沖液 濃度(mM) τ1/2Tris-HCl50 小時Tris-AcOH 50 小時Tris-HCl50+NaCl 100 小時Tris-HCl50+KCl 100 小時磷酸鉀 25 151分鐘50 85分鐘100 45分鐘200 22分鐘磷酸鈉 100 35分鐘焦磷酸鉀100 35分鐘三磷酸鈉100 70分鐘碳酸鈉 100 80分鐘例5分離能產(chǎn)生靛紅水解酶的生物靛紅水解酶生產(chǎn)生物是從位于印第安那州的Terre Haute的雜酚油工廠采集的土壤樣品中分離的。分離是通過使用極限鹽培養(yǎng)基[Stanier等(1957)J.Cell Comp.Phys.4925]的富集方法完成的，該培養(yǎng)基中含有1g土壤樣品和1.7mM作為唯一碳源和能源的吲哚。在對液體富集培養(yǎng)物進行3次連續(xù)傳代之后，純化所述生物是通過將液體培養(yǎng)物鋪板在以吲哚為唯一碳源的1.5％極限鹽培養(yǎng)基瓊脂板上，然后將一個生長集落鋪平板于LA平板上，最后用源于LA平板的單一集落的細胞在含有吲哚的1.5％極限鹽培養(yǎng)基板上劃線。在30℃下進行富集和純化。源于單一集落、在原始的含有吲哚的極限鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)的全細胞表現(xiàn)出靛紅水解酶活性。該試驗披露于例6中。所述集落被命名為WW2菌株。
例6證實在例5中分離的生物(WW2)的全細胞的靛紅水解酶活性對生長在含有1.7mM吲哚的極限鹽培養(yǎng)基中的細胞進行離心。將細胞沉淀物重新懸浮于50mM Tris-HCl，pH7.5中，使其OD600為2。將靛紅加入細胞懸浮液的1份等分試樣中，使其濃度達到200μM。其橙色在不到30秒時間內(nèi)消褪。通過離心除去樣品中的細胞，記錄其上清液的光譜。該光譜與真實靛紅酸的相同。HPLC證實了該產(chǎn)品的性質(zhì)。
例7在無細胞試驗中證實WW2的靛紅水解酶活性及其表觀天然分子量通過在French壓力室中破碎細胞制備1∶4的在50mMTris-HCl，pH7.5中制成的細胞勻漿液，所有細胞為在例5中所分離生物的細胞，該細胞生長在含有1.7mM吲哚的LB培養(yǎng)基中，或生長在含有1.7mM吲哚的極限鹽培養(yǎng)基中。直接分析所述勻漿液或在對該勻漿液進行100,000g離心后分別分析其上清液和沉淀。在全勻漿液中及高速離心的上清液中均存在靛紅水解酶活性。在高速離心的沉淀中僅測出不到5％的活性。無論細胞生長于豐富培養(yǎng)基中還是生長于極限培養(yǎng)基中，所測得的酶活性相同。在不含吲哚的豐富培養(yǎng)基中生長的細胞，其酶活性降低20倍，表明吲哚可誘導(dǎo)酶活性。
表觀天然分子量的測定方法如下。用由50mM Tris/HCl，pH7.5配制的0-500mM NaCl梯度液在DEAE纖維素上分離上述粗制勻漿液。酶促活性由大約175mM的NaCl洗脫，而85％的酶促活性在這一步驟中喪失。通過30％-40％NH4SO4沉淀進一步分離收集和透析的級分。這樣一來又會使所產(chǎn)生的原始活性進一步損失10％左右。進一步用TSK Q離子交換層析處理樣品，在用由相同緩沖液配制的0-500mM NaCl梯度洗脫時得到1.4％的原始活性。最后將殘余活性加到Sepharose S-100凝膠過濾柱上。洗脫的酶促活性相當(dāng)于表觀分子量大約為30-40,000Da。通過分光光度酶促分析法監(jiān)測上述步驟?？梢苑謩e在302或368nM下在50mM Tris/HCl，pH7.5中監(jiān)測靛紅的消失或靛紅酸的出現(xiàn)。如在例14中所述，通過將預(yù)先在5，7-二甲基靛紅中浸泡過的硝酸纖維素膜蓋在顯影的凝膠上也可以在7.5％的非變性丙烯酰胺凝膠上檢測活性。由出現(xiàn)在桃紅色膜上的白色斑點定位酶，該顏色是通過把膜與3.5mg/10ml 50mM Tris HCl pH7.5，5，7-二甲基靛紅溶液一起保溫20分鐘而產(chǎn)生的。
例8用來自能產(chǎn)生靛紅水解酶活性的WW2的提取物處理來自生物轉(zhuǎn)化的廢發(fā)酵液可提高靛藍產(chǎn)量按例1方法收集發(fā)酵液。通過用French壓力室破碎細胞并在100,000g下離心制備來自菌株WW2的胞質(zhì)細胞提取物，將其加入發(fā)酵液和大腸桿菌宿主細胞中，并在添加吲哚之前使其接觸1小時。測定靛藍生產(chǎn)速度并示于表5中。
表5.通過搖瓶分析測定的由WW2細胞提取物處理的發(fā)酵液的靛藍產(chǎn)量發(fā)酵液 靛藍產(chǎn)量(g/gDW/hr)未經(jīng)提取液處理的 0.071提取液處理的 0.234上述數(shù)據(jù)表明，用可將靛紅轉(zhuǎn)化成靛紅酸的酶進行處理，減輕了對靛藍生成的抑制作用。
例9證實在有得自惡臭假單胞菌WW2的胞質(zhì)提取物的條件下色氨酸轉(zhuǎn)化成靛藍的生物轉(zhuǎn)化期間靛紅濃度的降低在10L的發(fā)酵罐中，在添加了吲哚的極限鹽培養(yǎng)基中生長惡臭假單胞菌WW2菌株細胞。使細胞OD600達到4。收集細胞，并用French壓力室將細胞破碎成1∶1的懸浮液，以100,000g離心以制備提取液。從第16小時開始，以30分鐘的時間間隔用4.5小時將該提取物的50mL等分試樣加入由FM5/911-ISP，pCL-ISP#14進行的色氨酸向靛藍的生物轉(zhuǎn)化。在1小時之內(nèi)靛紅濃度從0.4mM降至0.06mM。在同時間內(nèi)對照罐中靛紅的濃度提高到0.95mM，達到已知可抑制NDO活性的濃度。在實驗罐中，水解產(chǎn)物靛紅酸從0.16mM提高到1.64mM，而在對照罐中其濃度從未超過0.5mM。該實驗表明，在發(fā)酵期間靛紅水解酶可明顯降低靛紅含量。該實驗還表明，在無靛紅水解酶的情況下靛紅能被轉(zhuǎn)化成某些其它產(chǎn)品，因為在發(fā)酵結(jié)束時靛紅加上靛紅酸的總量大于7mM，而在對照罐中該總量小于2mM。這一發(fā)現(xiàn)與在缺乏靛紅水解酶的發(fā)酵罐中靛玉紅的含量升高的觀察結(jié)果相吻合。靛玉紅可以由靛紅與靛藍前體3-吲哚氧基的反應(yīng)生成。
例10被命名為WW2的生物的分類學(xué)分類在例5中分離的生物用GC-FAME和Biolog進行分類。上述方法分別表明，該生物為邊緣假單胞菌(Pseudomonas marginalis)或惡臭假單胞菌A1型。磷脂酶C活性分析[R.M.Berka，G.L.Gray和M.L.Vasil(1981)“Studies of phospholipase C(heat-labilehomolysin in Pseudomonas aeruginosa)”，Infection and Immunity341071-1074]及明膠液化活性分析[R.N.Krieg，ed.，(1984)Bergey′sManual of Systematic Bacteriology，Vol.1(J.G.Holt，Series ed)，Williams and Wilkins，Baltimore，pp.163-165]表明其為惡臭假單胞菌種。由Mirobe Inotech Laboratories，Inc進行了GC-FAME和Biolog試驗。因此，對WW2的新的命名是惡臭假單胞菌WW2。
例11提取含有靛紅水解酶活性的DNA片段通過Harwood和Cutting的方法[(1990)Molecular BiologicalMethods for Bacillus，John Wiley，New York，pp.140-145]從例5所披露的生物中提取全DNA。隨后的所有DNA操作均用Sambrook等所披露的標準方法[(1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Springs Harbor Laboratory]或用由生產(chǎn)商推薦的試劑盒進行。對DNA進行部分消化，每10μg DNA用0.25單位的Sau 3A限制內(nèi)切酶(NEB)在37℃下消化1小時。在瓊脂糖凝膠上分離消化的DNA，并通過電洗脫法提取1-10kb的片段。用pTrc 99A表達載體(Pharmacia，產(chǎn)品目錄號#27-5007)構(gòu)建質(zhì)粒文庫。將連接混合物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)Sure Cell(Stratagene，產(chǎn)品目錄號#200238)中，隨后將其鋪平板于40，15cm含有50μg羧芐青霉素和50μg吲哚/ml，和1mMIDTG的2YT平板上。在37℃下生長過夜，然后輕輕噴灑含有10mg/ml溶菌酶和25mM EDTA的溶液，并在室溫下培養(yǎng)20分鐘，以裂解集落。隨后再用在50mM Tris-HCl，pH7.5和2mM 5，7-二甲基靛紅(5，7-二甲基靛紅是由用乙醇配制的20mM母液添加)中浸泡20-30分鐘的硝酸纖維素濾膜覆蓋上述經(jīng)部分裂解的細胞。陽性克隆被確認為桃紅色背景上的褪色斑點。在3,000個克隆中共鑒定到3個陽性克隆。通過在固體LB平板上進行的兩輪集落純化來純化挑取的集落。按下面例12中所披露的方法證實靛紅水解酶的活性，然后對克隆的DNA進行限制性分析證實其大小約為6.8kb。亞克隆得到一個2.3kb的片段，并在隨后按例12所述的全細胞分析時得到一個具有靛紅水解酶活性的1kb片段。然后測定1kb片段的全核苷酸序列，并示于圖3(序列1)中。推測的氨基酸序列如序列2所示。
例12證實大腸桿菌克隆生物中的靛紅水解酶活性以類似于例6所述方法分析例11中所鑒定的陽性克隆的全細胞的靛紅水解酶活性，不同的是所用培養(yǎng)基是含有羧芐青霉素的LB。含有全長片段或2.3kb片段的細胞無須IPTG誘導(dǎo)，這表明這種提取的DNA片段含有一個內(nèi)源啟動子。不過，亞克隆的1kb片段需要IPTG來表達其最大活性。
例13
構(gòu)建質(zhì)粒pCL-IST1如圖7所示，該質(zhì)粒的構(gòu)建是這樣完成的用SalI消化質(zhì)粒pAK1，通過瓊脂糖凝膠電泳提取含有tnaA結(jié)構(gòu)基因的3.2kb片段，用SalI將質(zhì)粒pCL-IH-S1線性性化后將該片段連接上去。
例14構(gòu)建質(zhì)粒pCL-IHA如圖8所示，該質(zhì)粒是用質(zhì)粒pTrc-IH#2、pMB2190和pCL1920分兩步構(gòu)建的。用EcoRI消化質(zhì)粒pMB2190[Darzins等(1986)Gene42293-302]和pTrc-IH#2，然后連接并轉(zhuǎn)化，從而分離到帶有質(zhì)粒pTrc-IH#2-kan的抗卡那霉素和氨芐青霉素的集落。這一克隆步驟可以實現(xiàn)從含有靛紅水解酶基因的pTrc-IH#2-kan上提取到2.5kb的SalI片段。然后將該片段克隆到pCL1920載體的單一SalI位點上，以得到產(chǎn)物之一pCL-IHA。
例15來自含有獲得了靛紅水解酶基因的2.3kb片段的菌株的發(fā)酵液缺乏對靛藍生產(chǎn)的抑制作用轉(zhuǎn)化生產(chǎn)宿主用Manniatis等所述的(Molecular Cloning-A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，P.250(1982)，CaCl2方法使細胞成為感受態(tài)，以轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株。
用FMS(911-ISP)和FM5(911-ISP，pCL-IHA)(圖8)實現(xiàn)靛藍的生物轉(zhuǎn)化。第一菌株為不含靛紅水解酶基因的對照株，而第二菌株含有具有靛紅水解酶基因的2.3kb DNA片段。從每個發(fā)酵罐中采集發(fā)酵液和細胞，并如例1所述向發(fā)酵液中添加葡萄糖。然后將細胞重懸于添加了葡萄糖的發(fā)酵液中或緩沖液中，按例1所述方法進行靛藍的搖瓶分析。
表6.在搖瓶分析中靛紅水解酶基因?qū)Φ逅{生產(chǎn)的影響培養(yǎng)基菌株 靛藍生產(chǎn)(g/gDW/hr)發(fā)酵液 FM5(911-ISP) 0.0416緩沖液 FM5(911-ISP) 0.115發(fā)酵液 FM5(911-ISP，pCL-IHA) 0.286緩沖液 FM5(911-ISP，pCL-IHA) 0.264比較緩沖液和發(fā)酵液的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，來自具有靛紅水解酶的菌株的發(fā)酵液不會抑制靛藍生成，而來自無靛紅水解酶的發(fā)酵液具有抑制作用。
例16靛紅水解酶基因的DNA序列通過改進的雙脫氧鏈終止法[Sanger等(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463-5467]測定在例11中提取的1kb片段的DNA序列。鑒定了一個由780bp組成的開放讀框(ORF)。分別有144bp的5′-非翻譯DNA和82bp的3′-非翻譯DNA，使克隆的DNA共有1006bp。其序列資料如圖3所示(序列1)。
例17純化靛紅水解酶實現(xiàn)了對由1kb DNA片段編碼的酶的部分純化。做法是以將讀框中的6組氨酸密碼子與例14中所述的ORF的5′末端連接的方式修飾該1kb片段，在IPTG誘導(dǎo)的條件下生長由該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細胞。將細胞懸浮在50mM Tris-HCl，pH7.5中，在French壓力室中對部分細胞沉淀和部分緩沖液進行破碎。用等體積的同一緩沖液進一步稀釋勻漿液，并以100,000g離心。按照生產(chǎn)商(QIAGEN，Inc.，CA)的建議，使高速離心上清液通過Ni-NTA樹脂柱。酶促活性結(jié)合到柱上，純化是這樣實現(xiàn)的用50mM磷酸鈉、300mM NaCl、10％甘油(pH6.0)(洗滌緩沖液)洗柱，直至A280降至低于0.04個吸附單位。然后用由50mL洗滌緩沖液配制的0-0.5M咪唑梯度液洗脫該柱。將通過靛紅水解測出其含有酶促活性的級分在SDS-PAGE上進行電泳[U.K.Laemmli(1970)Nature277680-685]。銀染凝膠出現(xiàn)一條33,000Da的主帶，而在最純的級分中只有微量的其它成分。這一結(jié)果與來自例7所述天然生物的蛋白的分子量測定結(jié)果一致。在這種情況下，由凝膠滲透層析測出的具有靛紅水解酶活性的蛋白的分子量為30-40kDa。綜合以上結(jié)果可知，靛紅水解酶在其天然狀態(tài)下為單體。
例18證實在發(fā)酵中因靛紅水解酶所致的靛玉紅含量的降低以常規(guī)方法，用含有靛紅水解酶基因的靛藍生產(chǎn)菌株或缺少該基因的菌株在14L發(fā)酵罐中發(fā)酵。在不同的發(fā)酵時間取樣，并按以下方法進行分析在12,000g下離心1ml發(fā)酵液15分鐘，除去上清液，將沉淀重懸于THF/DMSO(1/1；1ml)中，并渦旋混合1分鐘。在12,000g下再次離心該混合物。將上清液用于按例20方法進行HPLC分析。表7.隨靛紅水解酶的有無和發(fā)酵時間變化而得到的靛玉紅分析結(jié)果處理號X-BLU-22720 處理號X-BLU-22724時間 +水解酶 -水解酶[h] [g靛玉紅/l][g靛玉紅/l]4 0 08 0 012 0 016 0.00.020 0.032 0.04428 0.011 0.07232 0.052 0.1136 0.059 0.15540 0.033 0.15444 0.064 0.25048 0.094 0.192
用同樣的方法對若干發(fā)酵罐進行額外的終點分析(大約在第48小時，通常的發(fā)酵終止時間)。分析結(jié)果見下表。
表8.處理號22741、22743-46(有IH)和22598(無IH)的靛玉紅HPLC數(shù)據(jù)發(fā)酵罐處理號靛紅水解酶靛玉紅[g/l制劑]22741 + 0.2722743 + 0.0922744 + 0.1022745 + 0.0622746 + 0.1722717 + 0.0922756 + 0.0922757 + 0.1322759 + 0.1422760 + 0.1322761 + 0.2722598 - 1.13cone1 - 0.91結(jié)論以上實驗表明，由于靛藍生產(chǎn)菌株中所加靛紅水解酶基因的存在使得靛玉紅的含量降低2倍或更多。
例19證實在用來自大腸桿菌發(fā)酵過程的靛藍染色的粗斜布中因靛紅水解酶所致的靛玉紅含量降低靛藍染色的粗斜布的靛玉紅含量與染過色的布的紅色色澤相關(guān)，并且抗對靛藍染色的粗斜布的漂白作用，并可獲得漂白的外觀。下面的實驗證實了用來自大腸桿菌發(fā)酵過程的、無靛紅水解酶的靛藍染色的粗斜布的靛玉紅含量高于有靛紅水解酶的靛藍染色的粗斜布的。粗斜布樣品中靛玉紅含量的測定方法如下在一臺索格利特萃取器中用150ml乙醇萃取2克粗斜布1.5小時。在一臺旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上干燥萃取物，并溶于1ml THFDMSO溶劑中按例20方法進行HPLC分析。
表9.用有和沒有靛紅水解酶的宿主細胞生產(chǎn)的靛藍染色的粗斜布的靛玉紅含量粗斜布樣 樣品描述 靛紅水解酶 靛藍染料中的 靛玉紅濃度品編號 靛玉紅含量(mg/g粗斜布)NI94241 發(fā)酵靛藍- 0.91mg/ml 20％漿液 0.061NI11095 發(fā)酵靛藍+ 0.46mg/ml 20％漿液 0.011BC034 化學(xué)靛藍N/A 0.03mg/ml 20％漿液 低于檢測極限以上結(jié)果表明，在用含有較低含量的靛玉紅的靛藍染色的粗斜布上，靛玉紅的含量降低。其相關(guān)性是非線性的，而且控制其關(guān)系的因素尚不完全清楚。另外的定性觀察(由染色行業(yè)的專家來做)結(jié)果與定量觀察結(jié)果相一致。
例20證實靛玉紅對由靛藍染色的粗斜布的漂白作用的影響用靛藍染色粗斜布的典型方法1.布的水化(預(yù)染調(diào)理)A.將厚粗斜布切成9″×15″的片(樣品)(每種染液用2片)。B.在熱自來水中浸泡過夜(至少浸泡1小時)2.染液制備A.用60g 20％漿液制備混合母液。在加熱板上攪拌加入74.9g DIH2O23.0g 50％NaOH60.0g 20％靛藍漿液(有5％NaOH)
加熱至70℃左右，加入8.16g連二亞硫酸鈉。
攪拌至溶解，然后去掉熱源。
B.制備平衡溶液(使用在其中進行染色的容器)4.383g 去離子水25.3g 50％NaOH15.4g 連二亞硫酸鈉加入138.4g混合母液。
攪拌混勻，然后終止混合。3.染色方法將水浸過的樣品夾在洗衣型絞擰器之間，以除去多余的水，并保證在染色之前所有樣品的含水量一致。
B.按如下方法浸泡樣品。將樣品浸入染液中20秒，讓布通過絞擰器，除去多余的染液，讓布在環(huán)境空氣中(空中)暴露大約3分鐘，以便將浸染之間的靛白氧化成靛藍。
(浸染方案表表明浸染1-5開始和結(jié)束的分和秒；在浸染之間進行絞擰和風(fēng)干)浸染1 030-050浸染2 400-420浸染3 730-750浸染4 1100-1120浸染5 1430-1450在最后一次浸染之后通過絞擰器，并風(fēng)干5分鐘。
C.在冷水中漂洗，接著再在熱水中漂洗。讓布通過絞擰器并干燥。
D.如果必要，將每個樣品切成15個3″×3″的方塊。用次氯酸鈉漂白靛藍染色的樣品(用于產(chǎn)生流行外觀的刺激漂白條件)漂白方法A.漂白液制備將2.6g次氯酸鈉溶于1L去離子水中(加入來自5.25％母液的次氯酸鈉)加熱至50℃B.漂白液量以不足1∶50的比例將布加入漂白液中(200g干布/10L漂白液)(以合適例子所述的形式進行漂洗)C.加入時間將15個小樣品分成5組，每組3個。至少在去離子水中預(yù)浸5分鐘。將其中的4組加入漂白液中。加入時間為0、10、20和25分鐘，漂白30、20、10和5分鐘。D.驟冷和洗滌取出樣品并放入冷水中快速漂洗并加入約2L的10g/L連二亞硫酸鈉中在水中漂洗并加入約2L的10g/L Tide w/o漂白粉徹底漂洗充分干燥樣品E.在Hunter Lab色度儀上讀取L-值添加靛玉紅至市售化學(xué)靛藍漿液中，使其比例為每克靛藍10mg和70mg靛玉紅。充分混合含添加劑的染料，并按照例20中所披露的染色和漂白方法染色粗斜布。按下述方法讀取色值。作圖的數(shù)據(jù)如圖9所示。評價用次氯酸鈉漂白靛藍染色的粗斜布的效率用Hunter Lab色度計(Hunter Associates Laboratory，Inc.，Reston Virginia)以L-值形式測定漂白效果。L-值被稱為樣品的“亮度”，以O(shè)表示黑色，100表示純白色。結(jié)果以(ΔL-值形式表示。通過HPLC測定靛玉紅濃度測定方法如下柱250×4.6mm，RP-18，5μm；在254nm下檢測；所用溶劑系統(tǒng)溶劑A-90％水、10％乙腈、2g/L溴化四丁銨，溶劑B-90％乙腈、10％水、2g/L溴化四丁銨。
梯度方案％A ％B 時間流速(ml/分)65350 0.765352 0.73565500.76535510.76535550.1靛玉紅在該系統(tǒng)中的保留時間為31.8分，而靛藍是在第27.5分鐘洗脫。
圖9中的數(shù)據(jù)表明，在高含量靛玉紅條件下漂白作用被抑制。盡管第30分鐘時的差異似乎很小，但在本領(lǐng)域技術(shù)人員看來，用有或沒有靛玉紅的靛藍染色的布差異顯著。盡管無靛玉紅和加入10mg靛玉紅的樣品符合要求，但含有70mg靛玉紅的樣品不符合要求。
序列表(1)一般資料(i)申請人WALTER WEYLERTIMOTHY C.DODGEJOHN LAUFFDANIEL J.WENDT(ii)發(fā)明名稱改進的靛藍微生物生產(chǎn)方法(iii)序列數(shù)3(iv)相關(guān)地址(A)收件人Genencor International，Inc.
(B)街道180 Kimball Way(C)市So.San Francisco(D)州CA(E)國家USA(F)郵編(ZIP)94080(v)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，version#1.25(EPO)(vi)當(dāng)前申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日11/20/95(C)分類號(viii)律師/代理人資料(A)姓名Margaret A.Horn(B)注冊號33，401(C)文件/檔案號GC274(ix)電信信息(A)電話(415)742-7536(H)傳真(415)742-7217(2)序列1資料(i)序列特征(A)長度1006bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列1CGAGGACTGG AGAACAGAGA GCTATAAGAT TTATGCAATT TACCCGTCAA GAAAAAACAT 60GAACCCAGCA CTTCGGGTTT TTCTGGACTA TATGTACCTT CACCTCCCGC ATCAGATTTC120CGGGACTTCT TTCGAGGAAA ACTCATGACC AGCATTAAAC TCCTTGCAGA GAGTCTGCTC180AAAGACAAAA TAAAGATCGT CGATCTATCG CACACCTTGA GATCCGAATT TCCGACACTG240ACATTACCTC CTCAGTTTGG GCAAACCTGG GCGTTCAAGA AGGAGGAAAT ATCGCGCTAC300GACGACCGTG GGCCCGCTTG GTACTGGAAC AACTTTTCCT GCGGCGAACA CACTGGTACT360CACTTTGATG CCCCAGTCCA TTGGGTCACA GGCGAATCCG TGCCTGAGAA CTCAGTAGAT420CGTATTGACC CACAGCGCTT TATGGCACCG GCAGTAGTGA TTGATGCCTC TAAAGAGGTA480CTAGAAAATC CGGACTGGGT TCTAGAGCCA GAATTTATCC AGGAGTGGGA GAAACTGCAT540GGCCGGATCG AAGCCGGTTC CTGGTTTCTA CTCCGGACAG ATTGGTCGAA GAAAATCAAT600AACCCGCTTG AGTTTGCTAA CCTGATAGAC GGCGCACCTC ACACGCCAGG CCCAAGCCAG660CGTACAGTTG AATGGCTTAT CGCCGAACGT GATGTCGTGG GCTTTGGGGT TGAGACGATC720AATATTGATG CGGGCCTTTC AGGCCGCTGG GAAGTTCCAT ACCCTTGCCA CAACAAGATG 780CTGGGAGCAG GACGATTCGG GCTGCAGTGC TTGAACAATC TTGACCTGTT ACCACCAACA 840GGAGCAGTAA TCATCTCCGC TCCACTGAAG ATCGAAGATG GCTCAGGCAG CCCGCTGCGG 900GTACTGGCTA TTTTTGATCG AGAATAACTG AGAGTACCCT GGGGCCGATA GACTCATCGG 960CCCCAAGTGA GTGTTCTCTA CTCGTAGTAG AAGCGAAGAC CAACTT 1006(2)序列2資料(i)序列特征(A)長度260氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列2Met Thr Ser Ile Lys Leu Leu Ala Glu Ser Leu Leu Lys Asp Lys Ile1 5 10 15Lys Ile Val Asp Leu Ser His Thr Leu Arg Ser Glu Phe Pro Thr Leu20 25 30Thr Leu Pro Pro Gln Phe Gly Gln Thr Trp Ala Phe Lys Lys Glu Glu35 40 45Ile Ser Arg Tyr Asp Asp Arg Gly Pro Ala Trp Tyr Trp Asn Asn Phe50 55 60Ser Cys Gly Glu His Thr Gly Thr His Phe Asp Ala Pro Val His Trp65 70 75 80Val Thr Gly Glu Ser Val Pro Glu Asn Ser Val Asp Arg Ile Asp Pro85 90 95Gln Arg Phe Met Ala Pro Ala Val Val Ile Asp Ala Ser Lys Glu Val100 105 110Leu Glu Asn Pro Asp Trp Val Leu Glu Pro Glu Phe Ile Gln Glu Trp115 120 125Glu Lys Leu His Gly Arg Ile Glu Ala Gly Ser Trp Phe Leu Leu Arg130 135 140Thr Asp Trp Ser Lys Lys Ile Asn Asn Pro Leu Glu Phe Ala Asn Leu145 150 155 160Ile Asp Gly Ala Pro His Thr Pro Gly Pro Ser Gln Arg Thr Val Glu165 170 175Trp Leu Ile Ala Glu Arg Asp Val Val Gly Phe Gly Val Glu Thr Ile180 185 190Asn Ile Asp Ala Gly Leu Ser Gly Arg Trp Glu Val Pro Tyr Pro Cys195 200 205His Asn Lys Met Leu Gly Ala Gly Arg Phe Gly Leu Gln Cys Leu Asn210 215 220Asn Leu Asp Leu Leu Pro Pro Thr Gly Ala Val Ile Ile Ser Ala Pro225 230 235 240Leu Lys Ile Glu Asp Gly Ser Gly Ser Pro Leu Arg Val Leu Ala Ile245 250 255Phe Asp Arg Glu260(2)序列3資料(i)序列特征(A)長度13個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列3Met Thr Ser Ile Lys Leu Leu Ala Glu Ser Leu Leu Lys1 5 10
權(quán)利要求
1.一種編碼具有靛紅清除活性的酶的DNA片段。
2.如權(quán)利要求1的DNA片段，包括序列1的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1的DNA片段的酶表達產(chǎn)物。
4.如權(quán)利要求3的酶，包括序列2的氨基酸序列。
5.一種包括權(quán)利要求1的DNA片段的表達載體。
6.用如權(quán)利要求5的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
7.一種包括權(quán)利要求2的DNA片段的表達載體。
8.一種用權(quán)利要求7的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
9.一種用于在合適的宿主微生物中生產(chǎn)靛藍的改進方法，該方法包括在有利于3-吲哚氧基積累的條件下培養(yǎng)所述微生物，其改進包括將一種編碼靛紅清除酶活性的DNA片段導(dǎo)入宿主微生物中。
10.如權(quán)利要求9的方法，其中，所述編碼靛紅清除酶活性的DNA片段是包括序列1的DNA片段。
11.如權(quán)利要求9的方法，其中，所述編碼靛紅清除酶活性的DNA片段被整合到所述微生物的染色體中。
12.如權(quán)利要求9的方法，其中，編碼靛紅清除酶活性的DNA片段包含于一個或多個能夠在適當(dāng)條件下指導(dǎo)該DNA片段中所含基因的表達的染色體外因子中。
13.如權(quán)利要求9的方法，其中，所述合適的宿主微生物包括由葡萄糖生產(chǎn)靛藍所需的內(nèi)源或外源DNA。
14.如權(quán)利要求13的方法，其中，所述微生物包括選自編碼色氨酸操縱子的一種或多種酶的DNA片段、編碼能將吲哚轉(zhuǎn)化成3-吲哚氧基的加氧酶的DNA片段、和編碼能將色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚的酶的DNA片段的內(nèi)源或外源DNA。
15.如權(quán)利要求14的方法，其中，所述DNA片段被整合到所述微生物的染色體中。
16.如權(quán)利要求14的方法，其中，所述DNA片段包含于一個或多個能夠在適當(dāng)條件下指導(dǎo)該DNA片段中所含基因的表達的染色體外因子中。
17.如權(quán)利要求14的方法，其中，所述加氧酶是芳族雙加氧酶或芳族單加氧酶。
18.如權(quán)利要求14的方法，其中，所述編碼色氨酸操縱子的DNA包括一種能產(chǎn)生吲哚積累的色氨酸合酶突變型。
19.如權(quán)利要求18的方法，其中，所述色氨酸合酶突變型是trpB382。
20.如權(quán)利要求9的方法，其中，所述合適的宿主微生物包括由色氨酸產(chǎn)生靛藍所需的內(nèi)源或外源DNA。
21.如權(quán)利要求20的方法，其中，所述微生物包括編碼一種能將色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚的酶的DNA。
22.如權(quán)利要求21的方法，其中，所述DNA編碼色氨酸酶。
23.如權(quán)利要求20的方法，其中，所述DNA被整合到所述微生物的染色體上。
24.如權(quán)利要求20的方法，其中，所述DNA包含于一個或多個能在合適條件下指導(dǎo)該DNA中所含基因的表達的染色體外因子中。一種用于靛藍發(fā)酵生產(chǎn)的改進方法，該方法包括在適于產(chǎn)生吲哚或3-吲哚氧基的條件下在發(fā)酵液中培養(yǎng)一種能產(chǎn)生吲哚或3-吲哚氧基的合適宿主微生物，其改進包括，在合適條件下以清除存在于所述發(fā)酵液中的靛紅或靛玉紅的方式處理所述微生物的發(fā)酵液。
25.如權(quán)利要求25的方法，其中，通過酶促、化學(xué)方法或吸附技術(shù)清除所述靛紅或靛玉紅。
26.如權(quán)利要求25的方法，其中，所述用于處理發(fā)酵液以清除靛紅或靛玉紅的合適條件包括將發(fā)酵液的pH提高到11左右，并把發(fā)酵液溫度提高到50-70℃左右保持約2-5小時或更短時間。
27.如權(quán)利要求25的方法，其中，通過讓發(fā)酵液接觸靛紅清除酶而清除靛紅。
28.如權(quán)利要求27的方法，其中，所述靛紅清除酶是靛紅水解酶。
29.如權(quán)利要求28的方法，其中，所述靛紅水解酶是權(quán)利要求4的酶。
30.如權(quán)利要求25的方法，其中，所述靛紅清除是讓所述發(fā)酵液接觸活性碳或合適的樹脂，以吸附其中的靛紅。
全文摘要
提供了一種生物合成靛藍的改進方法,其改進包括除去生產(chǎn)這種靛藍的發(fā)酵液中的諸如靛紅和靛玉紅這樣的副產(chǎn)物?？梢岳弥T如靛紅水解酶的靛紅清除酶的酶促活性或諸如處理參數(shù)(高溫、pH)的其它技術(shù)除去靛紅,或通過讓所述含有靛紅的發(fā)酵液與諸如碳或合適樹脂的合適吸附化合物/組合物接觸以除去靛紅。由于靛紅是靛玉紅的前體,靛玉紅的含量因靛紅的清除而降低。
文檔編號C12R1/19GK1202933SQ96198454
公開日1998年12月23日 申請日期1996年11月19日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月20日
發(fā)明者W·維勒, T·C·道奇, J·J·拉夫, D·J·溫特 申請人:金克克國際有限公司