專(zhuān)利名稱(chēng)：修飾方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種修飾方法。
特別是，本發(fā)明涉及體內(nèi)修飾方法。
半乳甘露聚糖是一類(lèi)異源細(xì)胞壁多糖，它們由具有不同數(shù)目α-1-6連接的半乳糖側(cè)鏈的β-1-4連接方式甘露聚糖主鏈組成。
最主要工業(yè)使用的半乳甘露聚糖得自豆類(lèi)瓜爾豆(Cyamopsistetragonolobus)和長(zhǎng)角豆(Ceratonia siliqua)的胚乳。這些半乳甘露聚糖的半乳糖含量不同，瓜爾豆半乳糖與甘露糖之比大約為1∶1.6，而長(zhǎng)角豆樹(shù)膠(LBG)的該比率大約為1∶34。
半乳糖含量的差異對(duì)瓜爾豆膠和LBG的功能性質(zhì)具有顯著影響。這兩種半乳甘露聚糖低濃度(1-2％)下形成高粘度溶液，但LBG具有的另一性質(zhì)是能夠形成具有其它多糖(諸如噸膠、角叉菜膠和瓊脂糖)的堅(jiān)硬凝膠。食品工業(yè)將LBG廣泛用于乳制品(主要是冰淇淋)、色拉調(diào)料、調(diào)味汁、低卡路里產(chǎn)品和寵物食品。然而，LBG的使用由于價(jià)格高和供應(yīng)不規(guī)律而受限制。
因此，希望大規(guī)模生產(chǎn)諸如因?yàn)樘岣吒事短桥c半乳糖之比(諸如類(lèi)似于LBG)而具有改進(jìn)功能性質(zhì)的半乳甘露聚糖。
由于瓜爾豆膠和LBG之間種屬化學(xué)的相似性，并且瓜爾豆膠的價(jià)格低得多，因此已經(jīng)試圖在體外將瓜爾豆膠轉(zhuǎn)化為具有類(lèi)LBG性質(zhì)和具有類(lèi)似于LBG相似化學(xué)組成的半乳甘露聚糖。
這樣一種體外處理的實(shí)例包括使用α-半乳糖苷酶。在該方面，參見(jiàn)McCleary等1983和EP-A-0255153。
通過(guò)使用由瓜爾豆種子純化的α-半乳糖苷酶，獲得半乳糖含量為10-34％的瓜爾豆膠(Bulpin等1990)。改性瓜爾豆膠膠凝行為的分析表明，將凝膠與角叉菜膠混合形成的半乳糖含量為24％的制劑表現(xiàn)出的流變學(xué)性質(zhì)與LBG相似。相比之下，未處理瓜爾豆膠的半乳糖含量為38％，LBG的半乳糖含量為23％。
然而，從工業(yè)觀點(diǎn)來(lái)看，瓜爾豆膠的體外脫半乳糖基涉及許多問(wèn)題。
首先，由于必須除去瓜爾豆膠中大約40％的半乳糖，因此必須制備大量的α-半乳糖苷酶。
第二，在保溫期間，非常重要的是甘露聚糖主鏈不發(fā)生水解，必需使用高度純化的α-半乳糖苷酶制劑，以避免任何微量的甘露聚糖酶活性。已經(jīng)公布了從瓜爾豆膠種子異源生產(chǎn)α-半乳糖苷酶的方法(Overbeeke等1986)。然而，在研究對(duì)瓜爾豆膠作用之前，純化來(lái)自測(cè)試物種生產(chǎn)的α-半乳糖苷酶，提示甘露聚糖酶的問(wèn)題仍有待解決。
第三，半乳甘露聚糖的產(chǎn)量降低，因?yàn)榘肴樘呛拷档?0％相當(dāng)于減少大約15％的改性瓜爾豆膠。在成品中，釋放的半乳糖可能是不希望有的，可能必須除去。
第四，在與α-半乳糖苷酶保溫期間有相當(dāng)大的半乳甘露聚糖解聚風(fēng)險(xiǎn)。
此外，有污染微生物在釋放內(nèi)源β-甘露聚糖酶的反應(yīng)混合物上形成菌落的風(fēng)險(xiǎn)。
最后，必須從反應(yīng)混合物中除去水。除該方法的費(fèi)用外，也導(dǎo)致可以用來(lái)獲得最適反應(yīng)條件的緩沖液濃縮。
這些實(shí)例證明，修飾瓜爾豆膠的現(xiàn)行方法牽涉多個(gè)問(wèn)題，其中一些與相當(dāng)大的費(fèi)用有關(guān)。
因此，需要改進(jìn)的瓜爾豆膠修飾方法。
在該方面，我們現(xiàn)在認(rèn)識(shí)到，如果利用重組DNA技術(shù)在植物(諸如瓜爾豆植株)體內(nèi)修飾含甘露糖/半乳糖的化合物(諸如瓜爾豆膠)將是有益的。
因此，廣義來(lái)講，本發(fā)明涉及在能夠合成該化合物的生物(或其部分)中含甘露糖/半乳糖化合物(諸如瓜爾豆膠)的體內(nèi)修飾，其中該生物所用的方法對(duì)該生物為非天然的方法，諸如利用DNA技術(shù)的方法。發(fā)生的修飾可以與該化合物(例如甘露糖和/或半乳糖)的一個(gè)或多個(gè)前體有關(guān)，或與該化合物本身有關(guān)(即包含該化合物的一個(gè)化合物的甘露糖和/或半乳糖單元的修飾)。
特別是，本發(fā)明涉及一個(gè)體內(nèi)修飾方法，它影響，最好是提高能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)的甘露糖與半乳糖之比，或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比。該體內(nèi)修飾方法不是天然產(chǎn)生的方法。
因此，使用本發(fā)明的體內(nèi)修飾方法，可以改變生物體內(nèi)內(nèi)部甘露糖與半乳糖之比和/或其甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比。
體內(nèi)改性瓜爾豆膠生產(chǎn)的一個(gè)要求是將合適基因?qū)牍蠣柖沟姆椒ǖ膶?shí)用性。這由Jrsboe和Okkels(1994)在有限程度上完成，他們轉(zhuǎn)移了一個(gè)可選擇或可篩選的用來(lái)開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)化方法的基因。這些作者沒(méi)有報(bào)道用一個(gè)基因轉(zhuǎn)化影響甘露糖與半乳糖之比。從生物技術(shù)的觀點(diǎn)來(lái)看，這是重要的一點(diǎn)，生產(chǎn)體內(nèi)改性的瓜爾豆膠的主要障礙是缺乏半乳甘露聚糖生物合成的知識(shí)。至今尚未分離并表征體內(nèi)控制瓜爾豆膠生物合成的基因或基因產(chǎn)物。然而，我們現(xiàn)在已經(jīng)確定了控制瓜爾豆膠體內(nèi)生物合成的某些基因或基因產(chǎn)物，因此我們能夠使瓜爾豆膠體內(nèi)改性。
在一個(gè)推薦方面，本發(fā)明涉及一個(gè)體內(nèi)修飾方法，它影響(最好是提高)能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)的甘露糖與半乳糖之比，或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比，該體內(nèi)修飾方法包括表達(dá)編碼一個(gè)基因產(chǎn)物的核苷酸序列，該基因產(chǎn)物具有的影響是(a)含甘露糖/半乳糖化合物甘露糖和半乳糖組分的甘露糖與半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物甘露糖和半乳糖前體的甘露糖與半乳糖之比；并且其中該核苷酸序列對(duì)該生物(或其部分)而言不是天然的核苷酸序列。
在另一推薦方面，本發(fā)明涉及一個(gè)體內(nèi)修飾方法，它影響(最好是提高)能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)的甘露糖與半乳糖之比，或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比，該體內(nèi)修飾方法包括提供一個(gè)基因產(chǎn)物，該基因產(chǎn)物能夠影響(a)含甘露糖/半乳糖化合物甘露糖和半乳糖組分的甘露糖與半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前體的甘露糖與半乳糖之比；該方法影響(a)含甘露糖/半乳糖化合物甘露糖和半乳糖組分的甘露糖與半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前體的甘露糖與半乳糖之比；其中該基因產(chǎn)物尚未用對(duì)該生物(或其部分)為天然核苷酸序列的核苷酸序列表達(dá)。
本發(fā)明的另一廣義方面涉及使用一種核苷酸序列，以在體內(nèi)影響(最好是提高)能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)的甘露糖與半乳糖之比，或含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比，其中編碼一基因產(chǎn)物的核苷酸序列影響(a)含甘露糖/半乳糖化合物甘露糖和半乳糖組分的甘露糖與半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前體的甘露糖與半乳糖之比；并且其中該核苷酸序列對(duì)該生物(或其部分)而言不是天然的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一廣義方面涉及使用一種基因產(chǎn)物，以在體內(nèi)影響(最好是提高)能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)的甘露糖與半乳糖之比，或含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比，其中該基因產(chǎn)物影響(a)含甘露糖/半乳糖化合物甘露糖和半乳糖組分的甘露糖與半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前體的甘露糖與半乳糖之比；其中該基因產(chǎn)物尚未用對(duì)該生物(或其部分)為天然核苷酸序列的核苷酸序列表達(dá)。
“含甘露糖/半乳糖化合物”一詞是指包含至少一個(gè)甘露糖基團(tuán)和至少一個(gè)半乳糖基團(tuán)的化合物。
在這些推薦方面中的每個(gè)方面，該含甘露糖/半乳糖化合物最好為半乳甘露聚糖。
在這些推薦方面中的每個(gè)方面，更優(yōu)選該含甘露糖/半乳糖化合物為瓜爾豆膠。
在這些推薦方面中的每個(gè)方面，更優(yōu)選能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物為瓜爾豆植株，其含甘露糖/半乳糖化合物為半乳甘露聚糖。然而，包括其它產(chǎn)生半乳甘露聚糖的植物，諸如葫蘆巴和苜蓿。被認(rèn)為不產(chǎn)生適量半乳甘露聚糖的植物屬于茄科和煙草種。
“能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)”也包括能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的任何合適生物，特別是植物，使得該生物甘露糖與半乳糖體內(nèi)內(nèi)部之比改變。該術(shù)語(yǔ)也包括能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物的任何部分，使得該部分的甘露糖與半乳糖之比改變。該術(shù)語(yǔ)也包括在生物內(nèi)或在組織培養(yǎng)基中的部分。該部分最好是在該生物本身內(nèi)。一個(gè)部分的一個(gè)實(shí)例是種子。
“對(duì)該生物而言為天然核苷酸序列”是指在其天然環(huán)境中并且操作性地連接與其天然相關(guān)的啟動(dòng)子的整個(gè)核苷酸序列，該啟動(dòng)子也在其天然環(huán)境中。
“甘露糖和半乳糖前體”包括作為含甘露糖/半乳糖化合物(最好是半乳甘露聚糖)生物合成前體的甘露糖本身或其衍生物和/或半乳糖本身或其衍生物。另外，該術(shù)語(yǔ)包括隨后用作含甘露糖/半乳糖化合物(最好是半乳甘露聚糖)生物合成前體的甘露糖本身或其衍生物和/或半乳糖本身或其衍生物。該術(shù)語(yǔ)最好是指用作含甘露糖/半乳糖化合物(最好是瓜爾豆半乳甘露聚糖)生物合成前體的甘露糖本身或其衍生物和/或半乳糖本身或其衍生物(諸如甘露糖-6-磷酸鹽或GDP-甘露糖)。
“基因產(chǎn)物”包括肽、多肽、蛋白質(zhì)、酶和RNA，該術(shù)語(yǔ)最好是指酶。
該生物體(或其部分)內(nèi)甘露糖與半乳糖之比或該生物的含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比最好高于該瓜爾豆植株或其半乳甘露聚糖的甘露糖與半乳糖之比。
該生物體內(nèi)甘露糖與半乳糖之比或該生物的含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比更優(yōu)選大致類(lèi)似于長(zhǎng)角豆或其半乳甘露聚糖的甘露糖與半乳糖之比。
該生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物最好為瓜爾豆植株或瓜爾豆膠。
本發(fā)明也涉及用本發(fā)明方法制備的含甘露糖/半乳糖化合物。該含甘露糖/半乳糖化合物將稱(chēng)為按照本發(fā)明的含甘露糖/半乳糖化合物。
此外，本發(fā)明也包括包含按照本發(fā)明的含甘露糖/半乳糖化合物的食料。
另外，本發(fā)明也包括包含按照本發(fā)明的含甘露糖/半乳糖化合物與另一種多糖混合的組合物，諸如一種食料。該另一種糖最好是任何一種或多種噸膠、角叉菜膠和瓊脂糖。
另外，本發(fā)明包括制備按照本發(fā)明組合物或食料的方法，它包含將按照本發(fā)明的含甘露糖/半乳糖化合物與另一合適組分混合。
用一種或多種合適策略，可以達(dá)到本發(fā)明的廣義方面，其中每種策略組成本發(fā)明的一個(gè)推薦實(shí)施方案。
第一種策略涉及一種或多種基因產(chǎn)物或其編碼核苷酸序列，其中這些基因產(chǎn)物可用于GDP-甘露糖的生物合成中。該策略涉及一種或多種編碼酶的基因的轉(zhuǎn)化，這些酶是GDP-甘露糖生物合成所需的，這些酶即為磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)和/或GDP-甘露糖焦磷酸化酶。
在該方面，據(jù)信可用于GDP-甘露糖生物合成的一種或多種基因產(chǎn)物提高甘露糖-6-磷酸的水平，它隨后提高含甘露糖/半乳糖化合物(諸如半乳甘露聚糖)的甘露糖與半乳糖之比。
第一種策略的推薦方面涉及至少使用PMI和/或其編碼核苷酸序列。據(jù)信該P(yáng)MI基因產(chǎn)物提高甘露糖-6-磷酸的水平，它隨后提高含甘露糖/半乳糖化合物(諸如半乳甘露聚糖)的甘露糖與半乳糖之比。更優(yōu)選該P(yáng)MI為植物PMI。
第二種策略涉及使用α-半乳糖苷酶及其編碼核苷酸序列。用該策略，可以利用α-半乳糖苷酶，諸如來(lái)自番瀉樹(shù)或咖啡豆的α-半乳糖苷酶，以在體內(nèi)改變含甘露糖/半乳糖化合物(諸如半乳甘露聚糖)的甘露糖與半乳糖之比。
第三種策略涉及第一種策略與第二種策略的組合，這些策略可以以任何順序使用或同時(shí)使用。
本發(fā)明的推薦方面涉及包含表達(dá)任何一種或多種本發(fā)明核苷酸序列的構(gòu)建物。
本發(fā)明的另一推薦方面涉及包含或表達(dá)任何一種或多種本發(fā)明核苷酸序列的載體。
本發(fā)明的另一推薦方面涉及包含或表達(dá)任何一種或多種本發(fā)明的載體、構(gòu)建物或核苷酸序列的質(zhì)粒。
本發(fā)明的另一推薦方面涉及包含或表達(dá)任何一種或多種本發(fā)明的質(zhì)粒、載體、構(gòu)建物或核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因生物(或其部分)。
本發(fā)明的其它推薦方面包括表達(dá)或允許表達(dá)或轉(zhuǎn)化任何一種或多種核苷酸序列、構(gòu)建物、質(zhì)粒、載體、細(xì)胞、組織、器官或生物以及他們的產(chǎn)物的方法。
本發(fā)明的其它推薦方面包括使用這些基因產(chǎn)物制備或處理食料，包括動(dòng)物飼料。
本發(fā)明也涉及分離用本發(fā)明方法制備的瓜爾豆膠。
本發(fā)明也涉及用本發(fā)明方法制備的瓜爾豆膠。
現(xiàn)在通過(guò)參看本發(fā)明的其它推薦方法，更詳細(xì)地描述本發(fā)明的第一種策略。
按照本發(fā)明該方面的第一個(gè)推薦方面，提供包含
圖1所示氨基酸序列的酶或其變異體、同源物或其片段。
按照本發(fā)明該方面的第二個(gè)推薦方面，提供第一個(gè)方面的酶的編碼核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列。
按照本發(fā)明該方面的第三個(gè)方面，提供包含圖1所示序列的核苷酸序列或其變異體、同源物或其片段，或與其互補(bǔ)的序列。
按照本發(fā)明該方面的第四個(gè)方面，提供包含或表達(dá)按照先前方面中任一方面發(fā)明的構(gòu)建物。
按照本發(fā)明該方面的第五個(gè)方面，提供包含或表達(dá)按照先前方面中任一方面發(fā)明的載體。
按照本發(fā)明該方面的第六個(gè)方面，提供包含或表達(dá)按照先前方面中任一方面發(fā)明的質(zhì)粒。
按照本發(fā)明該方面的第七個(gè)方面，提供包含或表達(dá)按照先前方面中任一方面發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物(或其部分)。
在本發(fā)明該方面的這些推薦方面中，該核苷酸序列或該酶最好是本發(fā)明上述方面定義的或其中含有的或通過(guò)上述方面表達(dá)的核苷酸序列或酶。
本發(fā)明該方面的其它方面包括表達(dá)或允許表達(dá)或轉(zhuǎn)化任何一種核苷酸序列、構(gòu)建物、質(zhì)粒、載體、細(xì)胞、組織、器官或生物及其產(chǎn)物的方法。
本發(fā)明該方面的其它方面包括使用該酶制備或處理食料，包括動(dòng)物飼料。
因此，本發(fā)明該方面的一個(gè)推薦方面涉及磷酸甘露糖異構(gòu)酶(“PMI”)和編碼該酶的核苷酸序列。特別是，本發(fā)明的推薦方面涉及重組PMI。
此外，本發(fā)明的推薦方面涉及使用該重組PMI改變生物(或其部分)的甘露糖與半乳糖之比和/或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比，尤其是半乳甘露聚糖的甘露糖與半乳糖之比。
本發(fā)明的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)在于，通過(guò)使用該重組PMI，可以提高生物(或其部分)的甘露糖與半乳糖之比和/或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比，特別是體內(nèi)改性的瓜爾豆膠的甘露糖與半乳糖之比。通過(guò)插入?yún)⑴c含甘露糖/半乳糖化合物(諸如甘露糖-6-磷酸)生物合成的一個(gè)或多個(gè)基因產(chǎn)物的一個(gè)或多個(gè)編碼基因，達(dá)到該優(yōu)點(diǎn)，該基因最優(yōu)選為本發(fā)明的核苷酸序列。
其它主要優(yōu)點(diǎn)在于，該重組酶可以容易地大量制備。此外，該核苷酸序列當(dāng)插入(最好是穩(wěn)定插入)生物(或其部分)的基因組時(shí)，可以用來(lái)改變體內(nèi)甘露糖與半乳糖濃度之比。
該核苷酸序列最好為DNA序列。
在一個(gè)高度推薦的實(shí)施方案中，該核苷酸序列為重組DNA序列。
該核苷酸序列最好得自保藏物NCIMB 40774。
在一個(gè)高度推薦的實(shí)施方案中，用重組DNA技術(shù)表達(dá)該酶。
該酶最好用得自保藏物NCIMB 40774的核苷酸序列表達(dá)。
該生物最好為植物。
該植物更優(yōu)選為瓜爾豆植株。
該含甘露糖/半乳糖化合物最好為瓜爾豆膠。
該酶或編碼該酶的核苷酸序列可以在體內(nèi)與一種或多種其它酶或其編碼核苷酸序列一起使用，這些其它酶或其編碼核苷酸序列最好用重組DNA技術(shù)制備。PMI酶或編碼PMI酶的核苷酸序列也可以在體外使用。該P(yáng)MI酶或其編碼核苷酸序列也可以與一種或多種其它酶或其編碼核苷酸序列一起使用，這些酶或其編碼核苷酸序列最好用重組DNA技術(shù)制備。
與該酶有關(guān)的“變異體”、“同源物”或“片段”包括該序列的一個(gè)(或多個(gè))氨基酸的任何置換、變異、修飾、取代、缺失或加入，只要產(chǎn)生的氨基酸序列具有PMI活性，最好至少具有圖1所示酶的相同活性。具體地說(shuō)，“同源物”一詞包括結(jié)構(gòu)和/或功能同源，只要產(chǎn)物的酶具有PMI活性。關(guān)于序列同源性，最好至少75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％與圖1所示序列同源。更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少98％與圖1所示序列同源。
與編碼該酶的核苷酸序列有關(guān)的“變異體”、“同源性”或“片段”包括該序列的一個(gè)(或多個(gè))核酸的任何置換、變異、修飾、取代、缺失或加入，只要產(chǎn)生的核苷酸序列編碼的酶具有PMI活性，最好至少具有圖1所示酶的相同活性。具體地說(shuō)，“同源性”一詞包括結(jié)構(gòu)和/或功能同源性，只要產(chǎn)物的核苷酸序列編碼的酶具有PMI活性。關(guān)于序列同源性，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％與圖1所示序列同源。更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少98％與圖1所示序列同源。
上述術(shù)語(yǔ)與該序列的等位變異同義。
“互補(bǔ)”一詞是指本發(fā)明也包括可以與本發(fā)明核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
現(xiàn)在通過(guò)參考本發(fā)明其它推薦方面，更詳細(xì)地描述本發(fā)明的第二種策略。
按照本發(fā)明該方面的第一個(gè)推薦方面，提供包含圖4所示氨基酸序列的酶或其變異體、同源物或其片段。
按照本發(fā)明該方面的第二個(gè)推薦方面，提供第一個(gè)方面的酶的編碼核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列。
按照本發(fā)明該方面的第三個(gè)推薦方面，提供包含圖4所示序列的核苷酸序列或其變異體、同源物或其片段，或與其互補(bǔ)的序列。
按照本發(fā)明該方面的第四個(gè)推薦方面，提供包含或表達(dá)按照前述任一方面發(fā)明的構(gòu)建物。
按照本發(fā)明該方面的第五個(gè)推薦方面，提供包含或表達(dá)前述任一方面發(fā)明的載體。
按照本發(fā)明該方面的第六個(gè)推薦方面，提供包含或表達(dá)前述任一方面發(fā)明的質(zhì)粒。
按照本發(fā)明該方面的第七個(gè)推薦方面，提供包含或表達(dá)前述任一方面發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物(或其部分)。
在本發(fā)明該方面的這些推薦方面中，該核苷酸序列或該酶最好是本發(fā)明上述方面中定義或包含或通過(guò)上述方面表達(dá)的核苷酸序列或酶。
本發(fā)明該方面的其它推薦方面包括表達(dá)或允許表達(dá)或轉(zhuǎn)化任一核苷酸序列、構(gòu)建物、質(zhì)粒、載體、細(xì)胞、組織、器官或生物及其產(chǎn)物。
本發(fā)明該方面的其它推薦方面包括使用該酶制備或處理食料，包括動(dòng)物飼料。
本發(fā)明該方面的一個(gè)推薦方面因此涉及α-半乳糖苷酶和編碼該酶的核苷酸序列。
特別是，本發(fā)明的推薦方面涉及重組α-半乳糖苷酶。
另外，本發(fā)明的推薦方面涉及使用該重組α-半乳糖苷酶，以改變或者生物(或其部分)和/或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比，尤其是半乳甘露聚糖的甘露糖與半乳糖之比。
本發(fā)明的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)利用該重組α-半乳糖苷酶，可能提高一種生物(或其部分)和/或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比，特別是體內(nèi)修飾的瓜爾豆膠的甘露糖與半乳糖之比。
其它主要優(yōu)點(diǎn)是該重組酶可以容易地大量制備。此外，該核苷酸序列當(dāng)插入(最好是穩(wěn)定插入)一種生物(或其部分)的基因組時(shí)，可以用來(lái)改變體內(nèi)甘露糖與半乳糖濃度之比。
該核苷酸序列最好是一種DNA序列。在高度推薦的實(shí)施方案中，該核苷酸序列是重組DNA序列。
該核苷酸序列最好得自保藏物NCIMB 40831。
在一個(gè)高度推薦的實(shí)施方案中，使用重組DNA技術(shù)表達(dá)該酶。
該酶最好用得自保藏物NCIMB 40831的核苷酸序列表達(dá)。
該生物最好是一種植物。
該植物更優(yōu)選是瓜爾豆植株。
該含甘露糖/半乳糖化合物最好是瓜爾豆膠。
該酶或編碼該酶的核苷酸序列可以在體內(nèi)與一種或多種其它酶或其編碼核苷酸序列一起使用，這些酶或其編碼核苷酸序列最好用重組DNA技術(shù)制備。α-半乳糖苷酶或編碼α-半乳糖苷酶的核苷酸序列也可以在體外使用。該α-半乳糖苷酶或其編碼核苷酸序列也可以與一種或多種其它酶或其編碼核苷酸序列一起使用，這些酶或其編碼核苷酸序列最好用重組DNA技術(shù)制備。
與該酶有關(guān)的“變異體”、“同源物”或“片段”包括該序列的一個(gè)(或多個(gè))氨基酸的任何置換、變異、修飾、取代、缺失或加入，只要產(chǎn)生的氨基酸序列具有α-半乳糖苷酶活性，最好至少具有圖4所示酶的相同活性。具體地說(shuō)，“同源物”一詞包括結(jié)構(gòu)和/或功能同源物，只要產(chǎn)物的酶具有α-半乳糖苷酶活性。關(guān)于序列同源物，最好至少75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％與圖4所示序列同源。更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少98％與圖4所示序列同源。
與編碼該酶的核苷酸序列有關(guān)的“變異體”、“同源物”或“片段”包括該序列的一個(gè)(或多個(gè))核苷酸的任何置換、變異、修飾、取代、缺失或加入，只要產(chǎn)生的核苷酸序列編碼的酶具有α-半乳糖苷酶活性，最好至少具有圖4所示酶的相同活性。具體地說(shuō)，“同源物”一詞包括結(jié)構(gòu)和/或功能同源物，只要產(chǎn)物的核苷酸序列編碼的酶具有α-半乳糖苷酶活性。關(guān)于序列同源物，最好至少75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％與圖4所示序列同源。更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少98％與圖4所示序列同源。
上述術(shù)語(yǔ)與該序列的等位變異同義。
“互補(bǔ)”一詞是指本發(fā)明也包括可以與本發(fā)明核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
與本發(fā)明有關(guān)的“核苷酸”一詞包括基因組DNA、cDNA、合成DNA和RNA。它最好是指DNA，更優(yōu)選為本發(fā)明編碼序列的cDNA。
與諸如“結(jié)合物”、“盒”和“雜種”之類(lèi)術(shù)語(yǔ)同義的術(shù)語(yǔ)“構(gòu)建物”包括直接或間接與一個(gè)啟動(dòng)子連接或融合的核苷酸序列。間接連接的實(shí)例是提供適當(dāng)?shù)拈g隔基團(tuán)，諸如內(nèi)含子序列，諸如Shl內(nèi)含子或ADH內(nèi)含子，置于該啟動(dòng)子和該核苷酸序列中間。在所有情況下，都非常推薦該術(shù)語(yǔ)不包括通常相連該酶野生型編碼基因與該野生型基因啟動(dòng)子當(dāng)它們兩者處于其天然環(huán)境中發(fā)生的天然重組。因此，本發(fā)明一個(gè)高度推薦實(shí)施方案涉及操作性地與異源啟動(dòng)子連接的本發(fā)明核苷酸序列。
該構(gòu)建物甚至可以含有或表達(dá)一種標(biāo)記，后者允許在轉(zhuǎn)移遺傳構(gòu)建物的植物中(諸如瓜爾豆)中選擇該遺傳構(gòu)建物。存在可以使用的各種標(biāo)記，它們例如為編碼甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶(尤其對(duì)于植物)的那些標(biāo)記或提供除草劑抗性或抗生素抗性(例如抗G418、潮霉素、博來(lái)霉素、卡那霉素和慶大霉素)的那些標(biāo)記。
“載體”一詞包括表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化載體。
“表達(dá)載體”一詞是指能夠體內(nèi)或體外表達(dá)的構(gòu)建物。
“轉(zhuǎn)化載體”一詞是指能夠從一種物種轉(zhuǎn)移到另一種物種的構(gòu)建物，諸如質(zhì)粒從大腸桿菌轉(zhuǎn)移至農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移到植物。
“組織”一詞包括組織本身和器官。
與本發(fā)明有關(guān)的“生物”包括可以包含編碼按照本發(fā)明酶的核苷酸序列和/或得自它的產(chǎn)物的任何生物，和/或其中按照本發(fā)明的核苷酸序列存在于該生物中時(shí)可以表達(dá)。
該生物最好是瓜爾豆植株。
本發(fā)明有關(guān)的“轉(zhuǎn)基因生物”包括包含編碼按照本發(fā)明酶的核苷酸序列和/或得自它的產(chǎn)物的任何生物，和/或其中按照本發(fā)明的核苷酸序列在該生物中可以表達(dá)。該核苷酸最好整合到該生物的基因組中。
該轉(zhuǎn)基因生物最好是一種植物，更優(yōu)選是瓜爾豆植株。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物包括包含任何一種或多種按照本發(fā)明酶的編碼核苷酸序列、按照本發(fā)明的構(gòu)建物、按照本發(fā)明的載體、按照本發(fā)明的質(zhì)粒、按照本發(fā)明的細(xì)胞、按照本發(fā)明的組織或其產(chǎn)物，包括其組合。例如該轉(zhuǎn)基因生物也可以包含任何在一種或多種異源啟動(dòng)子控制下的一種或多種編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列。
在一個(gè)高度推薦的實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)基因生物(或其部分)不包含啟動(dòng)子和編碼按照本發(fā)明酶的核苷酸序列的組合，其中該啟動(dòng)子和該核苷酸序列對(duì)該生物(或其部分)都是天然的，并處于其天然環(huán)境中。因此，在該高度推薦的實(shí)施方案中，當(dāng)按照本發(fā)明的天然核苷酸編碼序列在也處于其天然環(huán)境中的天然啟動(dòng)子控制下時(shí)，本發(fā)明不包括處于其天然環(huán)境中的按照本發(fā)明的天然核苷酸編碼序列。另外，在該高度推薦的實(shí)施方案中，當(dāng)按照本發(fā)明的天然酶處于其天然環(huán)境中并它由也處于其天然環(huán)境中的天然核苷酸序列編碼時(shí)，而且該核苷酸序列在也處于其天然環(huán)境中的其天然啟動(dòng)子控制下時(shí)，本發(fā)明不包括該按照本發(fā)明的天然酶。
“啟動(dòng)子”以本領(lǐng)域的通常意義使用，例如在Jacob-Mond基因表達(dá)理論中的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。
該啟動(dòng)子還包括一個(gè)或多個(gè)特征，以確?；蛱岣咴诤线m宿主中的表達(dá)。例如，這些特征可以是諸如Pribnow框或TATA框之類(lèi)的保守區(qū)。啟動(dòng)子甚至可以含有影響(諸如保持、增強(qiáng)、降低)本發(fā)明核苷酸序列表達(dá)水平的其它序列。例如，合適的其它序列包括Shl內(nèi)含子或ADH內(nèi)含子。其它序列包括誘導(dǎo)型元件，諸如溫度、化學(xué)藥品、光或應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)型元件。
此外，可以存在提高轉(zhuǎn)錄或翻譯的合適元件。后一種元件的實(shí)例是TMV 5’信號(hào)序列(參見(jiàn)Sleat Gene 217217-225；和DawsonPlant Mol.Biol.2397)。
因此，一方面，按照本發(fā)明的核苷酸序列在允許該核苷酸序列表達(dá)的啟動(dòng)子控制下。在該方面，該啟動(dòng)子可以是細(xì)胞和組織特異性啟動(dòng)子。例如，如果該生物是一種植物，那么該啟動(dòng)子可以是影響該核苷酸序列在一個(gè)或多個(gè)種子、莖、芽、根和葉組織中表達(dá)的啟動(dòng)子。
作為實(shí)例，本發(fā)明核苷酸序列的啟動(dòng)子可以是PCT/EP95/02195中描述的α-Amy 1啟動(dòng)子(或者已知為Amy 1啟動(dòng)子、Amy 637啟動(dòng)子或α-Amy 637啟動(dòng)子)。
或者，本發(fā)明核苷酸序列的啟動(dòng)子可以是PCT/EP95/02196中描述的α-Amy 3啟動(dòng)子(或者已知為Amy 3啟動(dòng)子、Amy 351啟動(dòng)子或α-Amy 351啟動(dòng)子)。關(guān)于該Amy 351啟動(dòng)子，可以失活其一部分，使得該部分失活的啟動(dòng)子以更特異性的方式，諸如僅在特定組織類(lèi)型或器官中表達(dá)該核苷酸序列?！笆Щ睢币辉~是指修飾該啟動(dòng)子的表達(dá)方式，但其中該部分失活的啟動(dòng)子仍作為啟動(dòng)子起作用的意義上的部分失活。然而，如上所述，該修飾啟動(dòng)子能夠在至少一種(但不是全部)原始啟動(dòng)子的特定組織表達(dá)該核苷酸序列。其它啟動(dòng)子序列部分失活的實(shí)例(不必是Amy 351啟動(dòng)子的部分失活)包括改變?cè)搯?dòng)子序列、或與該核苷酸序列部分的結(jié)合物質(zhì)的折疊方式，使得該核苷酸的一部分不被例如RNA聚合酶識(shí)別。部分失活A(yù)my 351啟動(dòng)子的另一種優(yōu)選方式是縮短它，形成其片段。另一種方式可能突變至少一部分該序列，使得RNA聚合酶不能與該部分或另一部分結(jié)合。
另一種修飾是使調(diào)節(jié)蛋白(例如已知來(lái)自絲狀真菌的CreA蛋白)的結(jié)合位點(diǎn)突變，以發(fā)揮碳分解代謝物抑制作用，因此消除該天然啟動(dòng)子的分解代謝物的抑制作用。
在Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis T.(編輯)Molecular Cloning.A laboratory manual.第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，紐約，1989中可以發(fā)現(xiàn)重組DNA技術(shù)的一般內(nèi)容。
即使在EP-B-0470145和CA-A-2006454中沒(méi)有公開(kāi)本發(fā)明的酶和核苷酸序列，但那兩個(gè)文獻(xiàn)確實(shí)提供了一些可以用來(lái)制備按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的有用的技術(shù)背景評(píng)論?，F(xiàn)在在以下評(píng)論中包括一些這些背景評(píng)論的改編。
構(gòu)建遺傳修飾植物的基本原理是在該植物基因組中插入遺傳信息，以便獲得該插入遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定保持。
存在幾種插入該遺傳信息的技術(shù)，兩種主要的原理是直接導(dǎo)入該遺傳信息和采用載體系統(tǒng)導(dǎo)入該遺傳信息。在Potrykus(Annu Rev PlantPhysiol Plant Mol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的論文中可以發(fā)現(xiàn)一般技術(shù)的綜述。
因此，一方面本發(fā)明涉及一種載體系統(tǒng)，它攜帶按照本發(fā)明的核苷酸序列或構(gòu)建物，并能夠?qū)⒃摵塑账嵝蛄谢蛟摌?gòu)建物導(dǎo)入生物(諸如一種植物)的基因組中。
該載體系統(tǒng)可以包含一種載體，但它可以包含兩種載體。在兩種載體的情況下，該載體系統(tǒng)通常稱(chēng)為雙載體系統(tǒng)。在Gynheung An等，(1980)，Binary Vectors，Plant Molecular Biology Manual A3，1-19中詳細(xì)地描述了雙載體系統(tǒng)。
用給定啟動(dòng)子或核苷酸序列或構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的一個(gè)廣泛使用的系統(tǒng)基于使用來(lái)自根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒或來(lái)自毛根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒，An等，(1986)，Plant Physiol.81，301-305和Butcher D.N.等，(1980)，Tissue Culture Methods for Plant Pathologists，編輯D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208。
已經(jīng)構(gòu)建了幾種不同的Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，它們適用于構(gòu)建上述植物或植物細(xì)胞構(gòu)建物。這樣一種Ti質(zhì)粒的非限制性實(shí)例是pGV3850。
本發(fā)明的核苷酸序列或構(gòu)建物應(yīng)該最好插入該Ti質(zhì)粒的T-DNA末端序列之間或鄰近T-DNA序列，以便避免恰好在T-DNA邊界周?chē)男蛄袛嗔?，這些區(qū)中的至少一個(gè)區(qū)似乎是修飾T-DNA插入該植物基因組中所必需的。
正如從上述解釋所理解的，如果該生物為一種植物，那么本發(fā)明的載體系統(tǒng)最好是含有感染該植物必需的序列(例如vir區(qū))和至少一個(gè)T-DNA序列邊界部分的載體系統(tǒng)，其中該邊界部分位于同一載體上作為遺傳構(gòu)建物。
另外，該載體系統(tǒng)最好是根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?；蛎r(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒或它們的衍生物，這些質(zhì)粒是眾所周知的，并廣泛用于轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建，存在基于這些質(zhì)?；蚱溲苌锏脑S多載體系統(tǒng)。
在轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建中，本發(fā)明的核苷酸序列或構(gòu)建物在插入該植物中之前，可以首先在可以復(fù)制該載體并易于操作的微生物中構(gòu)建。一種有用的微生物實(shí)例是大腸桿菌，但可以使用具有上述性質(zhì)的其它微生物。當(dāng)在大腸桿菌中已經(jīng)構(gòu)建了上面限定的載體系統(tǒng)的載體時(shí)，必要時(shí)可以將其轉(zhuǎn)移到合適的農(nóng)桿菌菌株中，例如根癌農(nóng)桿菌中。因此，最好將含有本發(fā)明核苷酸序列或構(gòu)建物的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到合適的農(nóng)桿菌菌株(例如根癌農(nóng)桿菌)中，以便獲得含有本發(fā)明核苷酸序列或構(gòu)建物的農(nóng)桿菌細(xì)胞，隨后將該DNA轉(zhuǎn)移到待修飾的植物細(xì)胞中。
正如CA-A-2006454中報(bào)道的，可利用大量的克隆載體，它們含有在大腸桿菌中的復(fù)制系統(tǒng)和一種允許篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞的標(biāo)記。這些載體包括例如pBR322、pUC系列、M13 mp系列、pACYC 184等。
這樣，本發(fā)明的核苷酸序列或構(gòu)建物可以導(dǎo)入該載體中的合適限制位置中。含有的質(zhì)粒用來(lái)在大腸桿菌中轉(zhuǎn)化。在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞，然后收獲這些細(xì)胞，并將其裂解。然后回收該質(zhì)粒。一種分析方法是一般使用的序列分析、限制分析、電泳和進(jìn)一步的生化分子生物學(xué)方法。每次操作后，可以限制性酶切所用的DNA序列，并將其與下一個(gè)DNA序列連接。可以在同一質(zhì)?；虿煌|(zhì)粒中克隆每種序列。
在每次將按照本發(fā)明的構(gòu)建物或核苷酸序列導(dǎo)入植物中后，可能必需存在和/或插入其它DNA序列。例如如果使用植物細(xì)胞的Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，那么作為導(dǎo)入基因的側(cè)翼區(qū)，可以連接至少Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒的T-DNA的右邊界，然而通?？梢赃B接T-DNA的右邊界和左邊界。已經(jīng)廣泛研究了使用T-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，并在EP-A-120516；HoekemaThe Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985，第V章，；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci.，41-46；和An等，EMBO J.(1985)4277-284中進(jìn)行了描述。
用農(nóng)桿菌直接感染植物組織是一種簡(jiǎn)單的技術(shù)，它已經(jīng)廣泛使用，并在Butcher，D.N.等，(1980)，Tissue Culture Methods for PlantPathologists，編輯D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208中進(jìn)行了描述。關(guān)于該主題的其它內(nèi)容參見(jiàn)Potrykus(Annu Rev Plant Physiol PlantMol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-TechMarch/April 1994 17-27)。用該技術(shù)，可以在植物的某些部分或某些組織上感染該植物，這些部分或組織例如為葉、根、莖的一部分或該植物的另一部分。
用攜帶本發(fā)明核苷酸序列的農(nóng)桿菌直接感染植物組織，該感染植物通常是受傷的，例如通過(guò)用剃刀切割該植物或用針將該植物穿孔，或用研磨劑摩擦該植物。然后用農(nóng)桿菌接種傷口。然后讓接種的植物或植物部分在合適的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并讓其發(fā)育為成熟植株。
構(gòu)建植物細(xì)胞時(shí)，可以按照眾所周知的組織培養(yǎng)方法生長(zhǎng)并保持這些細(xì)胞，這些方法諸如在合適的添加諸如氨基酸、植物激素、維生素之類(lèi)的必需生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。
可以采用由細(xì)胞或組織培養(yǎng)物再生植株的已知方法，例如通過(guò)采用抗生素篩選轉(zhuǎn)化苗和通過(guò)在含有合適營(yíng)養(yǎng)物、植物激素等的培養(yǎng)基中亞培養(yǎng)苗，完成轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生為遺傳修飾的植株。
可以在EP-A-0449375中發(fā)現(xiàn)植物轉(zhuǎn)化的其它內(nèi)容。
在丹麥專(zhuān)利申請(qǐng)第940662號(hào)(于1994年6月10日申請(qǐng))中可以發(fā)現(xiàn)甚至其它有用的轉(zhuǎn)化胎兒動(dòng)植物的內(nèi)容。
因此，本發(fā)明涉及使用基因產(chǎn)物(例如參與甘露糖生物合成的PMI酶)提高生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比。另外，本發(fā)明涉及該核苷酸序列和它編碼的基因產(chǎn)物。
本發(fā)明基于該令人驚訝的發(fā)現(xiàn)通過(guò)插入編碼下述基因產(chǎn)物的一個(gè)或多個(gè)基因，可以提高瓜爾豆膠的甘露糖與半乳糖之比，其中這些基因產(chǎn)物參與含甘露糖/半乳糖化合物(諸如甘露糖-6-磷酸，即PMI)的生物合成。
本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)與根據(jù)本領(lǐng)城內(nèi)容預(yù)期的相反。在該方面，由來(lái)自葫蘆巴和瓜爾豆發(fā)育中的胚乳未純化制劑的分析，Edwards提示GDP-甘露糖可能是半乳甘露聚糖生物合成的前體(Edwards等，1989，Reid和Edwards 1995)。通過(guò)反應(yīng)混合物中不同量的GDP-甘露糖的分析，作者總結(jié)出甘露糖與半乳糖之比的控制可能在于合成半乳甘露聚糖的糖基轉(zhuǎn)移酶本身特異性的水平。這可能啟示，糖基轉(zhuǎn)移酶可能是瓜爾豆膠體內(nèi)修飾的遺傳操作的關(guān)鍵靶。
因此，總之，本發(fā)明的該推薦方面涉及將磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因插入植物中，最好插入瓜爾豆中。
該策略的基本原理基基于我們對(duì)插入瓜爾豆半乳甘露聚糖中的甘露糖得自GDP-甘露糖的理解。然而，在瓜爾豆中合成該GDP-甘露糖的方式是未知的。典型方法是通過(guò)GDP-葡萄糖異構(gòu)化，但某些初步數(shù)據(jù)提示，在某些豆類(lèi)中，至少可以通過(guò)將果糖-6-磷酸異構(gòu)化為甘露糖-6-磷酸，而甘露糖-6-磷酸異構(gòu)化為甘露糖-1-磷酸，隨后它轉(zhuǎn)化為GDP-甘露糖來(lái)合成GDP-甘露糖。但甚至如果后一種途徑應(yīng)該是可操作的，那么PMI活性的提高本身預(yù)期不能影響半乳甘露聚糖組合物，因?yàn)榈谝唬?6-磷酸到甘露糖-6-磷酸的異構(gòu)化是完全可逆反應(yīng)，第二，Reid和Edwards(1995)已經(jīng)預(yù)言，該甘露糖與半乳糖之比由半乳甘露聚糖合成酶的特異性決定。關(guān)于該策略，正如可明顯看出的，甚至當(dāng)在瓜爾豆中采用弱表達(dá)啟動(dòng)子時(shí)，我們已經(jīng)得到甘露糖與半乳糖之比的提高。但是，采用較強(qiáng)的啟動(dòng)子，甚至可以達(dá)到更高的比率水平。
本發(fā)明也基于下述令人驚訝的發(fā)現(xiàn)通過(guò)插入一種或多種參與瓜爾豆或其前體生物合成的基因產(chǎn)物的一種或多種編碼基因，可以提高瓜爾豆膠的甘露糖與半乳糖之比。如上所述，在本發(fā)明的一個(gè)推薦方面中，該基因編碼PMI。在另一個(gè)推薦方面，該基因編碼α-半乳糖苷酶，最好是咖啡豆α-半乳糖苷酶或番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶，更優(yōu)選番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶。
包含本發(fā)明PMI基因的以下樣品按照布達(dá)佩斯條約通過(guò)識(shí)別保藏于1995年11月9日保藏在在工業(yè)和海洋細(xì)菌有限公司的國(guó)家保藏中心(NCIMB)(23 St.Machar Drive，Aberdeen，Scotland，United Kingdom，AB2 1 RY)含有質(zhì)粒pPMI-60的大腸桿菌K12。
保藏號(hào)為NCIMB 40774。
本發(fā)明也包括得自該保藏物的核苷酸序列及其編碼產(chǎn)物。
包含本發(fā)明α-半乳糖苷酶基因的以下樣品按照布達(dá)佩斯條約通過(guò)識(shí)別保藏于1996年11月28日保藏在工業(yè)和海洋細(xì)菌有限公司的國(guó)家保藏中心(NCIMB)(23 St.Machar Drive，Aberdeen，蘇格蘭，英國(guó)，AB21 RY)含有質(zhì)粒pT7-SEcDNA5的大腸桿菌K12。
保藏號(hào)為NCIMB 40831。
本發(fā)明也包括得自該保藏物的核苷酸序列及其編碼產(chǎn)物。
現(xiàn)在通過(guò)實(shí)施例描述本發(fā)明。在以下實(shí)施例中，參考附圖，其中圖1表明按照本發(fā)明的一個(gè)酶的氨基酸序列和按照本發(fā)明的一個(gè)核苷酸序列的序列；圖2是pcDNAII的質(zhì)粒圖譜；圖3是pSG-Man5的質(zhì)粒圖譜；圖4表明另一種按照本發(fā)明的酶的氨基酸序列和另一種按照本發(fā)明的核苷酸序列的序列；圖5是pPS48的質(zhì)粒圖譜；圖6是pPS48SEGAL的質(zhì)粒圖譜；圖7是pBKL4的質(zhì)粒圖譜；圖8是pBKIASEGAL的質(zhì)粒圖譜；圖9是pPS48-GALIII的質(zhì)粒圖譜；以及圖10是pBKL4GALIII的質(zhì)粒圖譜。
采用PMI基因體內(nèi)修飾瓜爾豆膠來(lái)自瓜爾豆的磷酸甘露糖異構(gòu)酶的克隆在質(zhì)粒pcDNAII(Invitrogen公司)中構(gòu)建代表來(lái)自未成熟瓜爾豆胚乳的mRNA的cDNA表達(dá)文庫(kù)，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株Top10F～(Invitrogen公司)中。通過(guò)從大量隨機(jī)挑出的分離菌落中純化質(zhì)粒，控制cDNA文庫(kù)的質(zhì)量。這些質(zhì)粒的限制酶消化表明全部含有至少500bp的一種插入。
大腸桿菌菌種CD1 man-含有一個(gè)失活PMI基因，因此不能代謝甘露糖(Darzins等1985)。該菌種用于以下互補(bǔ)研究。
用Hanahan(1985)的方法，將CD1 man-細(xì)胞制成感受態(tài)。獲得效價(jià)為3-4×106個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞/μg的文庫(kù)質(zhì)粒cDNA。當(dāng)用Bluescript對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)相似的效價(jià)。
在互補(bǔ)研究之前，進(jìn)行大量的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其中將轉(zhuǎn)化細(xì)胞平板接種到含有M9鹽(Maniatis等1982)、加入0.05g/l亮氨酸、0.05g/l甲硫氨酸、0.05g/l蘇氨酸、1.0g/l鹽酸硫胺素、50mg/l氨芐青霉素、6.0g/l甘露糖和9.0g/l瓊脂糖的選擇培養(yǎng)基上。該培養(yǎng)基下文稱(chēng)為M9-SGP。
在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用在其天然啟動(dòng)子(Mils和Guest 1984)控制下的大腸桿菌PMI基因轉(zhuǎn)化CD1 man-感受態(tài)細(xì)胞，而在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用在植物啟動(dòng)子CaMV 35S(pSGMAN1，參見(jiàn)Bojsen等1993)控制下的大腸桿菌PMI基因轉(zhuǎn)化這些細(xì)胞。在這些兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞平板接種到M9-SGP上，產(chǎn)生大量的大菌落。當(dāng)感受態(tài)CD1 man-細(xì)胞不用或用Bluescript對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化時(shí)，沒(méi)有獲得大菌落，但觀察到大量非常小的幾乎不可見(jiàn)的菌落。因此，該M9-SGP選擇培養(yǎng)基適用于篩選含有活性PMI基因的細(xì)胞。
用從該瓜爾豆胚乳cDNA文庫(kù)中分離的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)CD1 man-細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的CD1 man-細(xì)胞平板接種到選擇底物M9-SGP上。于37℃培養(yǎng)2天后，大多數(shù)平板接種的細(xì)胞似乎是非常小的菌落，而少于0.1％的菌落則大得多。
純化來(lái)自較大菌落的質(zhì)粒，將其再次轉(zhuǎn)化到感受態(tài)CD1 man-細(xì)胞中。分析20個(gè)不同再次轉(zhuǎn)化菌落粗提取物的PMI活性。通過(guò)Gill等(1986)描述的偶聯(lián)酶促分析測(cè)定PMI活性。其中一個(gè)檢測(cè)的菌落含有非常高的PMI活性。該克隆命名為PMI-60，其保藏號(hào)為NCIMB40774。
為了測(cè)試是否該插入物來(lái)源于瓜爾豆的PMI-60中，按照Dellaporta等(1983)的方法，從葉中純化瓜爾豆基因組DNA，用限制酶消化，按照Feinberg和Vogelstein的方法(1983)進(jìn)行Southern印跡分析，并用得自PMI-60、用P-32標(biāo)記的質(zhì)粒DNA進(jìn)行探測(cè)。分別于68℃用6×SSC和于68℃用0.2×SSC進(jìn)行雜交和洗滌(Maniatis等1982)。PMI-60探針與大量消化的瓜爾豆基因組DNA片段雜交。
通過(guò)應(yīng)用引物步查的雙脫氧測(cè)序法(Sanger和Coulson 1977)，首先用熒光素標(biāo)記的引物(反向引物和通用引物)，隨后用熒光素-dATP進(jìn)行內(nèi)部標(biāo)記，對(duì)質(zhì)粒PMI-60(稱(chēng)為pPMI-60)的插入物進(jìn)行測(cè)序。
cDNA克隆的大小為1.66kb，其中PMI基因包括1.29kb。PMI的起始密碼子和終止密碼子分別位于0.09kb和1.38kb處。該插入含有的假定多腺苷酸化信號(hào)位于終止密碼子下游的0.11kb處，為poly A終止的。
通過(guò)與其它已知PMI序列的比較，進(jìn)一步找出該插入的鑒定的特征。在翻譯起始下游的137-145氨基酸處發(fā)現(xiàn)一個(gè)保守區(qū)DGNHKPEM，它被認(rèn)為涉及磷酸甘露糖異構(gòu)酶的活性PMI位點(diǎn)(Coulin等1993)。
因此，PMI-60中插入物的存在導(dǎo)致在含有甘露糖的選擇培養(yǎng)基上的快速生長(zhǎng)、PMI活性高和與瓜爾豆DNA雜交。此外，與來(lái)自其它PMI基因的某些序列有同源性。這些數(shù)據(jù)證明，PMI-60中的該插入物是來(lái)自瓜爾豆的PMI基因。
該P(yáng)MI序列是第一個(gè)從植物中克隆和測(cè)序的PMI序列。采用磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)基因的轉(zhuǎn)化以下轉(zhuǎn)化研究表明，通過(guò)插入磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)(諸如來(lái)自大腸桿菌或瓜爾豆的磷酸甘露糖異構(gòu)酶)，可以提高瓜爾豆膠的甘露糖與半乳糖之比。根據(jù)可利用的底物，重組PMI催化果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為甘露糖-6-磷酸，或催化甘露糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸。瓜爾豆的轉(zhuǎn)化通過(guò)Jrsboe和Okkels(1994)描述的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，獲得轉(zhuǎn)基因瓜爾豆植株，上述論文的內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。推薦的根癌農(nóng)桿菌菌種是這些研究中的LBA 4404。
稱(chēng)為pDO18的質(zhì)粒中T-DNA中的插入含有3個(gè)基因(右邊界至左邊界)β-葡糖苷酸酶(GUS)基因、磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)基因和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因。用Bojsen等(1993)中詳細(xì)描述的35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)每種基因的表達(dá)。用HPLC分析瓜爾豆膠手工制備無(wú)胚和種皮的純胚乳，按照Edwards等(1992)的方法，在勻漿期間用70％乙醇重復(fù)處理。將乙醇沉淀加入2ml 2 N三氟乙酸(TFA)中，于120℃水解2小時(shí)。通過(guò)于50℃蒸發(fā)除去TFA。將干燥的沉淀溶于500μl HPLC級(jí)H2O，將25μl樣品加到Aminex HPX-87P柱(300×7.8mm)上。在層析柱烘箱中將該柱加熱至80℃，用H2O洗脫。用RI檢測(cè)器檢測(cè)糖洗脫液。使用該系統(tǒng)，基線分離甘露糖和半乳糖。測(cè)定各個(gè)峰面積，并計(jì)算甘露糖與半乳糖之比。得自Sigma的瓜爾豆膠和LBG與來(lái)自非轉(zhuǎn)基因瓜爾豆植株的胚乳樣品一起用作標(biāo)準(zhǔn)。獲得的Sigma瓜爾豆膠和非轉(zhuǎn)基因胚乳的甘露糖與半乳糖之比都為1.6∶1，而Sigma的LBG的甘露糖與半乳糖之比為3.5∶1。這些比率與一般接受的那些比率非常一致(Reid和Edwards 1995)。在PMI轉(zhuǎn)化的瓜爾豆中的甘露糖與半乳糖之比分析了含有PMI基因的幾種獨(dú)立的瓜爾豆轉(zhuǎn)化體在胚乳半乳甘露聚糖中的甘露糖與半乳糖之比，參見(jiàn)下表。<
每個(gè)轉(zhuǎn)化體都提高了瓜爾豆膠的甘露糖與半乳糖之比。
通過(guò)插入來(lái)自瓜爾豆的磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)基因，進(jìn)行相似的研究。在該方面，據(jù)信根據(jù)可利用的底物，該瓜爾豆PMI催化果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為甘露糖-6-磷酸，或催化甘露糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸。采用α-半乳糖苷酶基因體內(nèi)修飾瓜爾豆膠在以下實(shí)施例中，表明α-半乳糖苷酶基因插入瓜爾豆可以導(dǎo)致瓜爾豆膠的體內(nèi)修飾。番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶cDNA的克隆和測(cè)序如下通過(guò)PCR分離來(lái)自番瀉樹(shù)胚乳的α-半乳糖苷酶cDNA克隆。
按照Logemann等(Anal.Biochem.163(1987)16-20)的方法，從番瀉樹(shù)胚乳中純化總RNA。在PCR后，用Perkin Elmer的RT-PCR試劑盒，按照該試劑盒的方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將大約1mg總RNA和1mg寡聚dT與逆轉(zhuǎn)錄酶一起于42℃保溫45分鐘后，于99℃保溫5分鐘，于5℃保溫5分鐘。
為了進(jìn)行以下PCR，使用兩種得自瓜爾豆α-半乳糖苷酶cDNA序列(Overbeeke等，Plant Mol.Biol.13(1989)541-550)的寡核苷酸P1(5’-CAACGGGGCTTGCTGCTTTAGG)和P2(5’-GCCTATGTCA-GACCAGGATGC)，它們?cè)诠蠣柖功?半乳糖苷酶cDNA序列中分別位于位置415-437和1248-1270。
PCR條件為于94℃ 1分鐘，于55℃ 2分鐘，于72℃ 2分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，然后于72℃ 10分鐘。
通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，分析PCR產(chǎn)物，獲得850bp的單一產(chǎn)物。
將命名為SEGAL的DNA產(chǎn)物克隆到pR7Blue載體(Novagen)中，采用Termo測(cè)序酶熒光循環(huán)測(cè)序試劑盒(Amershem)和ALF DNA測(cè)序儀(Pharmacia)測(cè)定該核苷酸序列。
通過(guò)先前描述的稱(chēng)為3’和5’RACE方法(Nielsen等，Plant Mol.Biol.31(1996)539-552)，獲得番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶cDNA的3’和5’端。簡(jiǎn)而言之，關(guān)于3’RACE，將大約1mg上述總RNA和2.5pmol下述引物與逆轉(zhuǎn)錄酶一起，于42℃保溫45分鐘，QT(5’CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T)17)然后于99℃保溫5分鐘，于5℃保溫5分鐘。
通過(guò)2輪PCR擴(kuò)增該cDNA。
第一次PCR的下游引物為Q0(5’-CCAGTGAGCAGAGTGACG)，而上游引物為3’GSP1(5’-GTCCTCTGAGTGATAACAGAGTGG)，該上游引物為一種基因特異性引物，得自番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶cDNA(圖4)中位置1096-1118的片段SEGAL的850bp核苷酸序列。
在第二次PCR中，下游引物為Q1(5’-GAGGACTCGAGCTCAAGC)而上游引物為3’GSP2(5’-GGTGTTGTGGAATAGAAGTTCATC)，該上游引物為一種基因特異性引物，得自番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶cDNA(圖4)中位置1123-1146的片段SEGAL的850bp核苷酸序列。
第一次PCR的PCR條件為于94℃ 1分鐘，于60℃ 2分鐘，于72℃ 2分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，然后于72℃ 10分鐘。第二次PCR的條件為于94℃ 1分鐘，于50℃ 2分鐘，于72℃ 2分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，然后于72℃ 10分鐘。
通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析第二次PCR后的PCR產(chǎn)物，獲得530bp的單一產(chǎn)物。
將命名為3’SEGAL的DNA產(chǎn)物克隆到pT7Blue載體(Novagen)中，采用Termo測(cè)序酶熒光循環(huán)測(cè)序試劑盒(Amersham)和ALF DNA測(cè)序儀(Pharmacia)測(cè)定該核苷酸序列。
關(guān)于5’RACE，使用來(lái)自Gibco BRL的5’RACE系統(tǒng)與由片段SEGAL的850bp核苷酸序列構(gòu)建的3重基因特異性引物。簡(jiǎn)而言之，將大約1mg上述所用的相同總RNA和2.5pmol番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶cDNA(圖4)中位置561-582的該基因特異性引物，于70℃保溫10分鐘，5’GSP1(5’-TTGCACCTTGGTCTTCATGTCC)，然后加入逆轉(zhuǎn)錄酶，于42℃保溫30分鐘，于70℃保溫15分鐘，加入RNA酶H，再于55℃保溫10分鐘。
按照Gibco BRL方法將該cDNA加dC尾。該加尾cDNA進(jìn)行兩輪PCR。
在第一輪PCR中，使用上游ANKER引物(5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG)與番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶cDNA(圖4)中位置510-536的下述基因特異性下游引物一起使用5’GSP2(5-CATAGCTTTACTGCATGTTTGGTTTCC)，在第二輪PCR中，使用上游UNI引物(5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACG)和番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶cDNA(圖4)中位置438-462的下述基因特異性下游引物5’GSP3(5’-CAGCCAGAGCCTTAATTCCTGAAGG)，第一輪PCR的PCR條件為于94℃ 1分鐘，于51℃ 2分鐘，于72℃ 2分鐘，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，然后于94℃ 1分鐘，于59℃ 2分鐘，于72℃ 2分鐘，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，然后于72℃ 10分鐘。
第二輪PCR的條件為于94℃ 1分鐘，于59℃ 2分鐘，于72℃ 2分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，然后于72℃ 10分鐘，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析第二輪PCR后的PCR產(chǎn)物，獲得480bp的單一產(chǎn)物。
將命名為5’SEGAL的DNA產(chǎn)物克隆到pT7Blue載體(Novagen)中，采用Termo測(cè)序酶熒光循環(huán)測(cè)序試劑盒(Amersham)和ALF DNA測(cè)序儀(Pharmacia)測(cè)定該核苷酸序列。
由上述獲得的3個(gè)PCR克隆5’SEGAL、SEGAL和3’SEGAL組合包含1630bp的番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶的完整核苷酸序列，示于圖4中。該核苷酸序列的分析揭示(圖4)一個(gè)編碼406個(gè)氨基酸殘基的開(kāi)放讀框，第一個(gè)甲硫氨酸位于第93核苷酸位置，翻譯終止密碼子位于第1311核苷酸位置。得出的氨基酸序列示于圖4中的核苷酸序列之上。含有番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶的植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建如下構(gòu)建包含番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶的表達(dá)載體。
通過(guò)在pUC8(Vieira和Messing，Gene 19(1982)259-268)中插入含有雙份-90至-420區(qū)的0.75kb的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S RNA啟動(dòng)子(E35S)(Kay等，Science 236(1987)1299-1302)、含有CaMV 35SRNA多腺苷酸化序列(Odell等，Nature 313(1985)810-812)和一個(gè)合成寡核苷酸接頭(PstI-BamHI-SmaI-SacI-SalI-SphI)的0.21kb片段，構(gòu)建載體pPS48(圖5)。
通過(guò)PCR將3個(gè)DNA片段5’SEGAL、SEGAL和3’SEGAL連接在一起，重建一個(gè)番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶cDNA克隆，它含有該編碼序列和非翻譯的5’端的大多數(shù)。
采用引物5’GSP3和B255，再擴(kuò)增片段5’SEGAL，它含有一個(gè)BamHI位點(diǎn)加上番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶cDNA(圖4)中位置14-36的核苷酸(5’-ATTGGATCCACTCACAC-GTATACACTACAC)采用引物3’GSP2和B254，再擴(kuò)增片段3’SEGAL，它含有一個(gè)SphI位點(diǎn)加上番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶cDNA(圖4)中位置1353-1373的核苷酸(5’-TTAGCATGCCCTTGGGATTGTATT-TCCTC)，將這些PCR片段與片段SEGAL混合，通過(guò)采用鄰接引物B254和B255擴(kuò)增連接的序列。
PCR的條件為對(duì)于5’SEGAL，于94℃ 1分鐘，于57℃ 2分鐘，于72℃ 2分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，然后于72℃ 10分鐘。對(duì)于3’SEGAL，于94℃ 1分鐘，于48℃ 2分鐘，于72℃ 2分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，然后于72℃ 10分鐘。對(duì)于最后連接3個(gè)片段的PCR，于94℃ 1分鐘，于58℃ 2分鐘，于72℃ 2分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，然后于72℃ 10分鐘。
通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析最后一輪PCR的PCR產(chǎn)物，獲得1380bp的單一產(chǎn)物。
將該DNA產(chǎn)物克隆況pT7Blue載體(Novagen)中，采用Termo測(cè)序酶熒光循環(huán)測(cè)序試劑盒(Amersham)和ALF DNA測(cè)序儀測(cè)定該核苷酸序列。
通過(guò)用BamHI和SphI消化，分離該DNA片段，并將其克隆到表達(dá)載體pPS48中，產(chǎn)生pPS48SEGAL(圖6)。
如下構(gòu)建包含番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶表達(dá)盒的植物轉(zhuǎn)化載體。
通過(guò)缺失NPTII盒，并插入一個(gè)合成寡核苷酸接頭(EcoRI-ClaI-SalI-HindIII-SpeI-KpnI-BamHI)和一個(gè)在GUS盒和左邊界之間含有鄰接CaMV 35S RNA啟動(dòng)子(Odell等，Nature 313(1985)810-812)和一個(gè)來(lái)自章魚(yú)堿合成酶基因的多腺苷酸化序列(Caplan等，Science 22(1983)815-821)的NPTII基因的新NPTII盒，由pBI121(Clontec Laboratories)構(gòu)建載體pBKL4(圖7)。
從pPS48SEGAL切下番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶表達(dá)盒，將其插入pBKL4中。
將產(chǎn)生的質(zhì)粒pBKL4SEGAL(圖8)轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株(Hockema等，Nature 303(1983)179-180)中，用于植物轉(zhuǎn)化。用番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)化瓜爾豆采用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，按照J(rèn)rsboe和Okkels(1994)詳細(xì)描述的方法(其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中)，將來(lái)自番瀉樹(shù)的α-半乳糖苷酶基因轉(zhuǎn)化到瓜爾豆中。分析用番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶基因轉(zhuǎn)化的瓜爾豆植株的甘露糖與半乳糖之比。
將番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶基因轉(zhuǎn)化的瓜爾豆植株的純胚乳在2N三氟乙酸中水解(參見(jiàn)上述細(xì)節(jié))后，用HPLC進(jìn)行分析。
示于下表中的結(jié)果得自4個(gè)獨(dú)立的含有番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶基因的瓜爾豆轉(zhuǎn)化體胚乳的分析。
按相對(duì)于未轉(zhuǎn)化對(duì)照胚乳而言，以甘露糖與半乳糖之比增加的百分比給出結(jié)果。
含有咖啡豆α-半乳糖苷酶的植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建。
如下構(gòu)建包含咖啡豆α-半乳糖苷酶編碼序列的表達(dá)載體。
通過(guò)在pUC8(Vieira和Messing，Gene 19(1982)259-268)中插入含有雙份-90至-420區(qū)的0.75bp的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S RNA啟動(dòng)子(E35S)(Kay等，Science 236(1987)1299-1302)、含有CaMV 35SRNA多腺苷酸化序列(Odell等，Nature 313(1985)810-812)和一個(gè)合成寡核苷酸接頭(PstI-BamHI-SmaI-SacI-SalI-SphI)的0.21bp片段。構(gòu)建載體pPS48(圖5)。
通過(guò)采用一個(gè)上游引物(咖啡豆α-半乳糖苷酶cDNA序列中的位置13-35)5’-TTGGATCCACCCAAAA-GCTGGTGCTCC和下游引物(在咖啡豆α-半乳糖苷酶cDNA序列中的位置1229-1264)5’-TTAGCATGCCTGTTAATCACTGTGGG的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，從質(zhì)粒pCB-BZ(Zhu和Goldstein Gene 140(1994)227-231)分離含有咖啡豆α-半乳糖苷酶編碼序列的DNA片段，產(chǎn)生一個(gè)在α-半乳糖苷酶基因5’端含有一個(gè)BamHI位點(diǎn)和3’端一個(gè)SphI位點(diǎn)的1.2kb DNA片段。
將該DNA片段克隆到pT7Blue(Novagen)中，采用TGermo測(cè)序酶熒光循環(huán)測(cè)序試劑盒(Amersham)和ALF DNA測(cè)序儀(Pharmacia)測(cè)定該核苷酸序列。
通過(guò)用BamHI和SphI消化，分離該DNA片段，并將其克隆到載體pPS48中，產(chǎn)生pPS48-GALIII(圖9)。
如下構(gòu)建包含咖啡豆α-半乳糖苷酶表達(dá)盒的植物轉(zhuǎn)化載體。
通過(guò)缺失NPTII盒，并插入一個(gè)合成寡核苷酸接頭(EcoRI-ClaI-SalI-HindIII-SpeI-KpnI-BamHI)和一個(gè)在GUS盒和左邊界之間含有鄰接CaMV 35S RNA啟動(dòng)子(Odell等，Nature 313(1985)810-812)和一個(gè)來(lái)自章魚(yú)堿合成酶基因的多腺苷酸化序列(Caplan等，Science 222(1983)815-821)的NPTII基因的新NPTII盒，由pBIl2l(Clontec Laboratories)構(gòu)建載體pBKL4(圖7)。
通過(guò)用XbaI消化從pPS48-GALIII切下咖啡豆α-半乳糖苷酶表達(dá)盒，將其插入SpeI消化的pBKL4中。
將產(chǎn)生的質(zhì)粒pBKL4-GALIII(圖10)轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株(Hockema等，Nature 303(1983)179-180)中，用于植物轉(zhuǎn)化。用咖啡豆α-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)化瓜爾豆采用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，按照J(rèn)rsboe和Okkels(1994)詳細(xì)描述的方法，將來(lái)自咖啡豆的α-半乳糖苷酶基因轉(zhuǎn)化到瓜爾豆中。分析用咖啡豆α-半乳糖苷酶基因轉(zhuǎn)化的瓜爾豆植株胚乳的甘露糖與半乳糖之比。
將用咖啡豆α-半乳糖苷酶基因轉(zhuǎn)化的瓜爾豆植株的純胚乳在2N三氟乙酸中水解(參見(jiàn)上述細(xì)節(jié))后，用HPLC進(jìn)行分析。示于下表中的結(jié)果得自4個(gè)獨(dú)立的含有咖啡豆α-半乳糖苷酶基因的瓜爾豆轉(zhuǎn)化體胚乳的分析。按相對(duì)于未轉(zhuǎn)化對(duì)照胚乳而言，以甘露糖與半乳糖之比增加的百分比給出結(jié)果
>瓜爾豆膠體內(nèi)修飾的討論在上述兩個(gè)實(shí)施例中，表明將α-半乳糖苷酶基因插入瓜爾豆中，可以導(dǎo)致瓜爾豆膠的體內(nèi)修飾，這由轉(zhuǎn)基因的半乳甘露聚糖的甘露糖與半乳糖之比高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏陌肴楦事毒厶堑母事短桥c半乳糖之比的事實(shí)證明。
除用磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因的實(shí)施例(參見(jiàn)上述)外，這些是在植物細(xì)胞壁貯藏多糖體內(nèi)修飾方面提出的第一個(gè)數(shù)據(jù)。概述這些結(jié)果表明，構(gòu)建能夠形成瓜爾豆膠使得影響甘露糖與半乳糖之比的轉(zhuǎn)基因植物是可能的。
在該方面，PMI轉(zhuǎn)化系、咖啡豆α-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)化系和番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)化系產(chǎn)生的甘露糖與半乳糖之比都高于非轉(zhuǎn)化系。例如，與甘露糖與半乳糖之比之比為1.65的非轉(zhuǎn)化系相比，咖啡豆α-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)化體的甘露糖與半乳糖之比高至1.75，而某些番瀉樹(shù)α-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)化體的甘露糖與半乳糖之比甚至高至2。這些結(jié)果非常令人驚訝。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的，體內(nèi)修飾的程度取決于轉(zhuǎn)化到瓜爾豆中的基因編碼的半乳甘露聚糖相關(guān)酶的活性。因此，該啟動(dòng)子的置換或修飾或其它調(diào)節(jié)核苷酸序列或氨基酸序列可能導(dǎo)致不同于上述實(shí)施例中所述那些半乳甘露聚糖的體內(nèi)修飾。
本發(fā)明的其它修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
如上所述，圖1提出了編碼PMI酶的核苷酸序列和該P(yáng)MI酶的氨基酸序列。為了消除疑問(wèn)，該核苷酸序列可以稱(chēng)為SEQ ID No.1，而該氨基酸序列可以稱(chēng)為SEQ ID No.2。
如上所述，圖4提出了編碼α-半乳糖苷酶的核苷酸序列和該α-半乳糖苷酶的氨基酸序列。為了消除疑問(wèn)，可以將該核苷酸序列稱(chēng)為SEQID No.3，而將該氨基酸序列稱(chēng)為SEQ ID No.4。
參考文獻(xiàn)Bojsen等(1993)PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO 94/20627。
Bulpin P V，Gidley M J，Jeffcoat R，Underwood D R.用植物α-半乳糖苷酶修飾半乳甘露聚糖聚合物的生物技術(shù)方法的發(fā)展。Carbohydr.Polymers 1990，12155.
Coulin F，Magnenat E，Proufood A E I，Payton M A和Wells T N C(1993).Biochemistry3214139-14144.
Darzins等1985.J Bacteriol161249-257.
Dellaporta S L，Wood J和Hicks J B(1983).植物DNA小制備第II版本。Plant Molecular Biology Reporter1第4期，19-21.
Edwards M，Bulpin P V，Dea I C M，Reid J S G.豆類(lèi)種子半乳甘露聚糖的體外生物合成。Planta.1989，17841.
Feinberg A P和Vogelstein B(1983).放射性標(biāo)記高特異性活性DNA限制性?xún)?nèi)切酶片段的技術(shù)。Analytical Biochemistry132，6-13.
Gill等(1986)J Bacteriol 167，611-615Hanahan D(1985).大腸桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)，Glover D M(編輯)，DNAcloning volI-a practical approach.IRL出版，牛津，第109-135頁(yè)。ISBN0-947946-18-7.
Jrsboe M和Okkels F T(1994)瓜爾豆的轉(zhuǎn)化。PCT專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/DK94/00221。
McCleary B V，Critchley P，Bulpin B V.多糖的加工。歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)，1983，0 121 960。
Maniatis T，F(xiàn)ritsch E F，Sambrook J(1982).Molecular cloning alaboratory manual.冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約。ISBN0-87969-136-0。
Mills和Guest.1984.Gene3241-48.
Overbeeke N，F(xiàn)ellinger A J，Hughes S G.用通過(guò)重組DNA方法轉(zhuǎn)化的宿主生產(chǎn)瓜爾豆α-半乳糖苷酶。歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)，1986，0 255 153。
Reid J S G，Edwards M E.種子內(nèi)的半乳甘露聚糖和其它細(xì)胞壁貯藏多糖。Food polysaccharides and their application.編輯A MStephen，Marcel Dekker，1996，第155-186頁(yè)。
Sahger F，Micllen S和Coulson A R(1977).Proc Natl，Acad.Sci.USA745463-5467.
權(quán)利要求
1.體內(nèi)修飾方法，它影響能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比。
2.體內(nèi)修飾方法，它影響或者能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)或者其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比；該體內(nèi)修飾方法包括表達(dá)編碼一種基因產(chǎn)物的核苷酸序列，該基因產(chǎn)物影響(a)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖組分的甘露糖與半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前體的甘露糖與半乳糖之比。其中該核苷酸序列對(duì)該生物(或其部分)不是天然核苷酸序列。
3.體內(nèi)修飾方法，它影響或者能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)或者其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比；該體內(nèi)修飾方法包括允許一種能夠?qū)σ韵戮哂杏绊懙幕虍a(chǎn)物(a)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖組分的甘露糖與半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前體的甘露糖與半乳糖之比，影響(a)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖組分的甘露糖與半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前體的甘露糖與半乳糖之比；其中該基因產(chǎn)物不由對(duì)該生物(或其部分)為天然核苷酸序列的核苷酸序列表達(dá)。
4.一種核苷酸序列的用途，該核苷酸序列在體內(nèi)影響或者能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)或者其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比，其中該核苷酸序列編碼的基因產(chǎn)物影響(a)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖組分的甘露糖與半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前體的甘露糖與半乳糖之比；并且其中該核苷酸序列對(duì)該生物(或其部分)不是天然核苷酸序列。
5.一個(gè)基因產(chǎn)物的用途，該核苷酸序列在體內(nèi)影響或者能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)或者其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比，其中該基因產(chǎn)物影響(a)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖組分的甘露糖與半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前體的甘露糖與半乳糖之比；其中該基因產(chǎn)物不由對(duì)該生物(或其部分)為天然核苷酸序列的核苷酸序列表達(dá)。
6.按照權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的發(fā)明，其中該含甘露糖/半乳糖化合物為半乳甘露聚糖。
7.按照權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的發(fā)明，其中能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的該生物為瓜爾豆植株。
8.按照權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的發(fā)明，其中該生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物的體內(nèi)甘露糖與半乳糖之比高于該瓜爾豆植株或其半乳甘露聚糖。
9.按照權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的發(fā)明，其中該生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物的體內(nèi)甘露糖與半乳糖之比與角豆或其半乳甘露聚糖的甘露糖與半乳糖之比大致相似。
10.按照權(quán)利要求2-9中任一項(xiàng)的發(fā)明，其中該基因產(chǎn)物為至少一種可用于GDP-甘露糖生物合成的基因產(chǎn)物。
11.按照權(quán)利要求10的發(fā)明，其中該基因產(chǎn)物為圖1所示的蛋白質(zhì)或其變變異體、同源物或衍生物。
12.按照權(quán)利要求10或11的發(fā)明，其中該基因產(chǎn)物由圖1所示核苷酸序列編碼，或是其變異體、同源物或衍生物和/或得自NCIMB40774。
13.按照權(quán)利要求2-9中任一項(xiàng)的發(fā)明，其中該基因產(chǎn)物為α-半乳糖苷酶。
14.按照權(quán)利要求13的發(fā)明，其中該基因產(chǎn)物為圖4所示的蛋白質(zhì)或其變異體、同源物或衍生物。
15.按照權(quán)利要求13或14的發(fā)明，其中該基因產(chǎn)物由圖4所示核苷酸序列編碼，或?yàn)槠渥儺愺w、同源物或衍生物和/或得自NCIMB40831。
16.一種酶，它包含圖1所示氨基酸序列或其變異體、同源物或衍生物。
17.編碼權(quán)利要求16的酶的核苷酸序列或與其互補(bǔ)和/或可得自NCIMB 40774的序列。
18.按照權(quán)利要求17的核苷酸序列，其中該核苷酸序列為DNA序列。
19.一種核苷酸序列，它包含圖1所示序列、或其變異體、同源物或片段或與其互補(bǔ)和/或得自NCIMB 40774的序列。
20.一種構(gòu)建物，它包含或表達(dá)按照權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)的發(fā)明。
21.一種載體，它包含或表達(dá)按照權(quán)利要求16-20中任一項(xiàng)的發(fā)明。
22.一種質(zhì)粒，它包含或表達(dá)按照權(quán)利要求16-21中任一項(xiàng)的發(fā)明。
23.一種轉(zhuǎn)基因生物(或其部分)，它包含或表達(dá)按照權(quán)利要求16-22中任一項(xiàng)的發(fā)明。
24.按照權(quán)利要求23的生物(或其部分)，其中該生物為瓜爾豆植株。
25.按照權(quán)利要求10的發(fā)明，其中該基因產(chǎn)物由按照權(quán)利要求16-24中任一項(xiàng)的發(fā)明表達(dá)或?yàn)榘凑諜?quán)利要求16-24中任一項(xiàng)的發(fā)明。
26.一種酶，它包含圖4所示氨基酸序列或其變異體、同源物或其片段。
27.編碼權(quán)利要求26的酶的核苷酸序列、或與其互補(bǔ)的和/或可得自NCIMB 40831的序列。
28.按照權(quán)利要求27的核苷酸序列，其中該核苷酸序列為DNA序列。
29.一種核苷酸序列，它包含圖4所示序列或其變異體、同源物或其片段、或與其互補(bǔ)的和/或得自NCIMB 40831的序列。
30.一種構(gòu)建物，它包含或表達(dá)按照權(quán)利要求26-29中任一項(xiàng)的發(fā)明。
31.一種載體，它包含或表達(dá)按照權(quán)利要求26-30中任一項(xiàng)的發(fā)明。
32.一種質(zhì)粒，它包含或表達(dá)按照權(quán)利要求26-31中任一項(xiàng)的發(fā)明。
33.一種轉(zhuǎn)基因生物(或其部分)，它包含或表達(dá)按照權(quán)利要求26-32中任一項(xiàng)的發(fā)明。
34.按照權(quán)利要求33的轉(zhuǎn)基因生物(或其部分)，其中該生物為瓜爾豆植株。
35.按照權(quán)利要求9的發(fā)明，其中該基因產(chǎn)物由按照權(quán)利要求26-34中任一項(xiàng)的發(fā)明表達(dá)或?yàn)榘凑諜?quán)利要求26-34中任一項(xiàng)的發(fā)明。
36.含甘露糖/半乳糖化合物，它用權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)或從屬于它的任一權(quán)利要求的方法制備。
37.一種食料，包含按照權(quán)利要求36的含甘露糖/半乳糖化合物。
38.一種組合物，它包含與另一多糖混合的按照權(quán)利要求36的含甘露糖/半乳糖化合物。
39.一種組合物，它包含與噸膠、角叉菜膠和瓊脂糖中任一種或多種混合的按照權(quán)利要求36的含甘露糖/半乳糖化合物。
40.制備一種組合物和一種食料的方法，其中該組合物或該食料包含與另一合適組分混合的按照權(quán)利要求36的含甘露糖/半乳糖化合物。
41.大致如本文描述的方法。
42.大致如本文描述并參考圖1的核苷酸序列。
43.大致如本文描述并參考圖1的酶。
44.大致如本文描述并參考圖4的核苷酸序列。
45.大致如本文描述并參考圖4的酶。
全文摘要
描述一種體內(nèi)修飾方法。該體內(nèi)修飾方法影響或者能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比。
文檔編號(hào)C12N9/90GK1207772SQ96199781
公開(kāi)日1999年2月10日 申請(qǐng)日期1996年12月2日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月4日
發(fā)明者M·約斯波伊, J·布倫斯特德特, S·G·佩特森 申請(qǐng)人:丹尼斯科有限公司