專利名稱：一種重組人堿性成纖維細胞生長因子的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及人堿性成纖維細胞生長因子(Basicfibroblast growth factor，簡稱bFGF)的基因工程制備方法，以及重組人bFGF本身或含有bFGF的制劑作為治療冠心病及心肌梗塞的藥物或保健品。
成纖維細胞生長因子是廣泛存在于多種組織中的一類多肽生長因子，1974年由Gospodarwicz從牛腦垂體中發(fā)現(xiàn)，由于它對成纖維細胞有明顯的促分裂作用，故命名為成纖維細胞生長因子，以酸性和堿性兩種形式存在。1985年，人們完成了牛bFGF的氨基酸序列分析工作，在隨后的兩年中，文獻陸續(xù)報導(dǎo)了牛和人的各種組織來源的bFGF氨基酸序列，并實現(xiàn)了它的基因克隆和表達。近年來有文獻報導(dǎo)bFGF表達水平不斷提高(Knoerzer，Gene，7521-30.1989；Squires，J Biol Chem，26316297-163021988)，由于得到了大量純品，大大促進了其生物功能研究。目前的研究表明，它除了對成纖維細胞有很強的促分裂作用外，對多種來自中胚層的細胞，尤具是血管內(nèi)皮細胞有很強的促分裂作用，是所知的最活躍的促血管形成生長因子。是近年來研究最活躍的領(lǐng)域之一。
堿性成纖維細胞生長因子bFGF是具有重要的應(yīng)用開發(fā)前景的細胞因子之一，本發(fā)明的目的是通過改造5′端基因，使從中國人外周血中克隆的bFGF基因在大腸桿菌中獲高效表達，并利用快速簡便的工藝，得到大量的符合標(biāo)準的臨床用藥，最終用于冠心病和心肌梗塞的治療。估計bFGF對下列疾病具有潛在的臨床應(yīng)用價值1、通過bFGF的創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)作用，可以用于燒傷、燙傷、慢性潰瘍、褥瘡和嚴重的軟組織挫裂傷的治療；
2、通過bFGF的神經(jīng)營養(yǎng)作用，可以用于中樞及外周神經(jīng)損傷、腦外傷后遺癥、脊柱手術(shù)后、老年性癡呆、缺血性腦病、神經(jīng)性耳聾和視神經(jīng)變性等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療；3、通過bFGF促血管形成和心肌營養(yǎng)作用，可以用于慢性心肌缺血(冠心病)、急慢性心肌梗塞和冠狀動脈搭橋術(shù)后再狹窄的治療。
由于bFGF的以上實用價值，國外已有數(shù)家制藥公司和廠家在研制生產(chǎn)bFGF的新方法和新工藝。
本發(fā)明采用下述技術(shù)方案(1)鑒于遺傳密碼有兼并性和大腸桿菌對氨基酸密碼子的偏愛與人體細胞的差異，本發(fā)明專門設(shè)計合成了人bFGF基因5′端含大腸桿菌偏愛密碼子的DNA片段，它可以在不改變產(chǎn)物人bFGF的氨基酸組成與排列順序的基礎(chǔ)上，提高bFGF基因在大腸桿菌中的表達水平。其步驟首先在5′和3′端引物引導(dǎo)下，自中國人外周血單個核細胞總RNA中擴增出特異的人bFGF cDNA片段。將PCR擴增產(chǎn)物插入國內(nèi)已廣泛采用的高效表達載體pBV220中，構(gòu)建成bFGF表達質(zhì)粒pBbFGF。它能在大腸桿菌HB101和DH5α中高表達，使bFGF占菌體總蛋白的15％左右，表達率經(jīng)100次以上傳代不降低。
(2)通過發(fā)酵工程菌，用M9作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，適當(dāng)增加碳源和氮源，通過優(yōu)化溶氧、攪拌速度、發(fā)酵pH值等工藝參數(shù)，最終培養(yǎng)物0D600值可達6左右，生物量為每升培養(yǎng)物6～8g，產(chǎn)物表達率在12.8～16.5％之間。產(chǎn)物表達量可達每升培養(yǎng)物80～100mg。
(3)在此基礎(chǔ)上建立了純化工藝，其中包括菌體的破碎和產(chǎn)物抽提、肝素親和層析純化、凝膠排阻層析精制。本工藝由于純化產(chǎn)物來自于可溶性的表達上清，因此產(chǎn)物比活性較高，結(jié)構(gòu)單一。引入肝素親和層析主要是利用了它的高選擇性，進一步的凝膠排阻層析可以去除少量雜質(zhì)蛋白和熱原。每升發(fā)酵產(chǎn)物可得人bFGF純品近40mg，回收率50％左右，純度＞96％，比活性可達1×10°U/mg水平，明顯高出文獻報導(dǎo)水平。運用30L發(fā)酵罐一批可得到數(shù)萬人份的bFGF制劑。
(4)純品加入人血清白蛋白、甘露醇以及磷酸鹽緩沖液等穩(wěn)定劑后，用微孔濾膜過濾除菌，冷凍干燥成粉狀成品。注射用水溶解后應(yīng)用，可用于外傷、神經(jīng)損傷和心肌缺血性疾病的治療。
治療實驗性兔急性心肌梗塞，給予1.4μg/kg/次人bFGF 6次，療程10天，可使兔心梗面積和梗塞心肌重量較對照組減少50.9％和53.8％，明顯優(yōu)于陽性對照藥物硝酸甘油，明顯改善了心功能和血流動力學(xué)指標(biāo)，組織學(xué)也顯示梗塞區(qū)血管增生活躍。結(jié)果表明發(fā)生心肌梗塞后早期應(yīng)用bFGF，可以促進急性心肌梗塞的心肌愈合，改善心肌梗塞的預(yù)后。人bFGF對心肌缺血/再灌注損傷大鼠的實驗結(jié)果提示應(yīng)用后可增加冠脈流量，冠脈流出液中蛋白、酶和其它反映心肌損傷的指標(biāo)明顯降低。
本發(fā)明運用重組DNA技術(shù)，在不改變編碼氨基酸的前提下，改變基因5′端部分核苷酸，從而提高了產(chǎn)物的表達，且產(chǎn)物以高活性可溶性形式存在。下游純化方式簡便，收率高，達到臨床用藥的質(zhì)量要求。本產(chǎn)品用于實驗性心肌缺血疾病的治療，能得到顯著的療效。
本發(fā)明用下述實例進行說明實施例1、PCR引物設(shè)計及人bFGFF基因擴增人bFGF蛋白質(zhì)分子由146個氨基酸基構(gòu)成，其中N末端8個氨基酸序列是Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly，由于原基因5′端序列GC含量太高，不利于在原核系統(tǒng)中表達，因此本設(shè)計首要思想是降低5′端GC含量，設(shè)計后的5′端引物序列是
5 EcoRIAGGAATTC ATG CCA GCT TTG CCC GAG GAT GGT GGT A3′端引物序列為5 BamHI雙終止ATGGATCC TCA TCA GCT CTT AGC AG A CAT TGG采用固相亞磷酸三酯法合成上述兩條寡聚脫氧核糖核苷酸，制備膠電泳分離純化。
采用微量異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法自中國人外周血單個核細胞中純化總RNA，使A260/A280比值＞1.8，取10μl(約4.5μg)總RNA，加40pmol5′端引物，70℃熱變性5min，室溫冷卻使其自然降溫，待降至室溫后，42℃水浴中依次加入下列樣品反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液3μlRNA酶抑制劑 20U40nM焦磷酸鈉3μlAMV逆轉(zhuǎn)錄酶 15U(1μl)dNTP(各2.5mM) 2μl加無RNA酶水至 30μl上述混合物42℃水浴反應(yīng)60min，加H2O 70μl 70℃作用5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，該反應(yīng)物可作為PCR擴增的起始模板，取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物20μl，加入下列成分10×PCR緩沖液 10μldNTP(各2.5mM) 16μl5′和3′兩側(cè)引物各40pmol加H2O至99.5μl
上述混合物94℃，3min后加入0.5μl Tap DNA聚合酶2.5U，混勻，94℃變性反應(yīng)40秒、58℃退火40秒、72℃延伸反應(yīng)60秒，進行30個循環(huán)的擴增反應(yīng)后延伸6min，取反應(yīng)物進行電泳鑒定觀察到0.46kb的單一條帶，符合完整的人bFGF基因的長度，并且能與標(biāo)記的5′端引物雜交。
實施例2、人bFGF基因在大腸桿菌中的表達及序列分析用限制性內(nèi)切酶EeoRI和BamHI雙酶切0.46kb的PCR擴增產(chǎn)物和表達載體質(zhì)粒pBV220，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，分別回收0.46kb和3.66kb的DNA片段。兩片段等摩爾混合，T4 DNA連接酶12～16℃連接反應(yīng)過夜，連接物轉(zhuǎn)化入CaCl2處理的E.coli大腸桿菌DH5α中，經(jīng)氨芐青霉素篩選培養(yǎng)。挑選單個菌落，制備質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，含有人bFGFF基因片段并且插入方向正確者，命名為pBbFGF，相應(yīng)的工程菌命名為pBbFGF/DH5α。
含有以上表達質(zhì)粒的工程菌經(jīng)過擴增培養(yǎng)、溫度誘導(dǎo)，在17kb左右多出一條蛋白條帶。該蛋白能與人bFGF單克隆抗體呈顯特異反應(yīng)。
在測序引物引導(dǎo)下，分別自兩測對插入的人bFGF基因片段進行DNA序列分析，肯定了所擴增的PCB產(chǎn)物符合設(shè)計構(gòu)想，其編碼的氨基酸序列與人bFGF序列相同(測得的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列見

圖1)。
實施例3、人bFGF的發(fā)酵生產(chǎn)工程菌30℃過夜培養(yǎng)后，按10％比例接種于M9培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)到0D600為1.0～1.5時，將溫度升至42℃，同時補加酪蛋白水解物(1g/L)和葡萄糖(4g/L)，此時bFGF即誘導(dǎo)產(chǎn)生，4h后收集菌體。電泳鑒定bFGF表達水平，薄層掃描顯示bFGF占菌體總蛋白的12.8～16.5％之間。
實施例4、工程菌的保存及穩(wěn)定性工程菌加30％甘油，-20℃保存。短期保存菌種可用軟瓊脂LB平板。為檢查工程菌的穩(wěn)定性，將原始菌種、50代和100代菌分別抽提質(zhì)粒進行酶切鑒定，結(jié)果三者相同。同時三個菌擴增培養(yǎng)物的產(chǎn)物表達水平相當(dāng)，證明本發(fā)明中的工程菌是十分穩(wěn)定的。
實施例5、bFGF的分離純化由于人bFGF在菌體內(nèi)以可溶性形式存在，因此在菌體破碎后上清首先經(jīng)過肝素親和層析分離，然后再經(jīng)過凝膠排阻層析精制，可以較快速地得到bFGF純品。
肝素凝膠柱經(jīng)20mM Tris-HCl，1mM EDTA-Na2，2mMβ-巰基乙醇，0.1M NaCl，pH7.4緩沖液平衡后上樣，上樣后經(jīng)含0.5、1M NaCl的上述緩沖液洗脫雜蛋白后，再用含1.5M NaCl的上述緩沖液洗脫bFGF。
上述粗純產(chǎn)物經(jīng)超濾濃縮后再過Sephacryl S-200凝膠排阻層析柱作進一步精制，收集分子量17kd的bFGF純品。
實施例6、bFGF產(chǎn)物的鑒定SDS-PAGE和HPLC檢定純度均在98％以上，Balb/C 3T3細胞株MTT法測定其生物活性，比活性在1×106U/mg以上。N末端蛋白質(zhì)序列分析結(jié)果與體內(nèi)天然蛋白相同，順序是P.A.L.P.E.D.G.G.S.G.A.F.P.P.G.H。
實施例7、無菌過濾、分裝、凍干根據(jù)蛋白含量和活性，按以下比例加輔料和穩(wěn)定劑rh-bFGF每支20、50、100μg甘露醇 25mg/支人血清白蛋白1mg/支緩沖液為20mM PB，pH7.0，以上原料必須符合注射用藥的要求。
無菌過濾在潔凈度達到100級的條件下，用0.22μM微孔濾膜過濾，分裝、凍干、封口、貼簽、裝箱。保存于2～8℃的冷藏環(huán)境中。
權(quán)利要求
1.一種重組人堿性成纖維細胞生長因子的制備方法，包括PCR引物設(shè)計、擴增的基因、表達質(zhì)粒的構(gòu)建、表達產(chǎn)物的純化工藝，其特性在于(1)5′端PCR引物及擴增cDNA 5′端序列為EcoRIAGGAATTC ATG CCA GCT TTG CCC GAG GAT GGT GGT A(2)上述bFGF cDNA與含有PL.PR啟動子的原核表達載體pBV220組裝成高效表達質(zhì)粒pBbFGF；(3)pBbFGF轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用溫度誘導(dǎo)bFGF基因的表達，產(chǎn)物以可溶性形式存在工程菌內(nèi)；(4)通過發(fā)酵技術(shù)擴增工程菌，用M9作基礎(chǔ)培養(yǎng)液，溫度誘導(dǎo)同時補加酪蛋白水解物、葡萄糖等營養(yǎng)成分；(5)發(fā)酵后破碎菌體，收集上清采用肝素親和層析和凝膠排阻層析二步法純化產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1制備的人bFGF純品加入人血清白蛋白等穩(wěn)定劑后，無菌過濾、分裝、凍干后制成成品，保存于2～8℃的冷藏環(huán)境中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的藥物制劑，可以用于治療急性心肌梗塞等心肌缺血性疾病，冠心病的治療和保健藥品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組人堿性成纖維細胞生長因子的制備方法。本發(fā)明利用遺傳密碼具有兼并性的原理,設(shè)計了大腸桿菌偏愛密碼子,PCR擴增的人bFGFcDNA片段與原核表達載體如pBV220組裝成高效表達質(zhì)粒pBbFGF,轉(zhuǎn)化大腸桿菌后用溫度誘導(dǎo)bFGF基因表達,表達最達菌體總蛋白的15%。工程菌經(jīng)發(fā)酵擴增,破碎菌體上清采用肝素親和層析和凝膠排阻層析二步法純化產(chǎn)品,加保護劑后制成藥用凍干制劑。該制劑可治療急性心肌梗塞等心肌缺血性疾病,作為冠心病的治療和保健藥品。
文檔編號C12N1/21GK1188151SQ9710018
公開日1998年7月22日 申請日期1997年1月17日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月17日
發(fā)明者陳玉林 申請人:北京白鷺園生物技術(shù)有限責(zé)任公司