專(zhuān)利名稱(chēng)：：制備光學(xué)活性反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺類(lèi)化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及制備光學(xué)活性反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺類(lèi)化合物的方法，和用光學(xué)活性反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺類(lèi)化合物制備光學(xué)活性1，5-苯并硫氮雜衍生物的方法。已知光學(xué)活性3-苯基縮水甘油酸或酯為制備具有各種藥理活性，例如冠狀血管擴(kuò)張活性，血小板聚集抑制活性等的1，5-苯并硫氮雜衍生物有用的中間體并為有用的藥物(見(jiàn)USP4,590,188)。同樣公知的光學(xué)活性3-苯基縮水甘油酸酯，特別是其(2S，3R)光學(xué)異構(gòu)體可以讓具有不對(duì)稱(chēng)水解(2R，3S)-3-苯基縮水甘油酸酯化合物能力的微生物細(xì)胞或處理的細(xì)胞在培養(yǎng)基中作用于相應(yīng)的3-苯基縮水甘油酸酯化合物外消體，由此水解其(2R，3S)光學(xué)異構(gòu)體，并從反應(yīng)混合物中分離和收集未被水解的(2S，3R)對(duì)映體來(lái)制備(EP-A-0417785)。本發(fā)明者深入細(xì)致地研究了用3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物代替3-苯基縮水甘油酯制備1，5-苯并硫氮雜衍生物的改進(jìn)方法，同時(shí)他們也研究了旨在由其獲得更為期望的光學(xué)活性型1，5-苯異硫氮雜衍生物的制備光學(xué)活性3-苯基環(huán)氧丙酰胺的改進(jìn)方法。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用具有優(yōu)先水解一個(gè)光學(xué)活性異構(gòu)體能力的微生物處理具有式(I)的相應(yīng)的反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺外消旋化合物，分離和收集未被上述微生物水解的另一對(duì)映體，以制備光學(xué)活性反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺的方法。式(I)中環(huán)A為取代的或未取代的苯環(huán)，R1為氫原子或低級(jí)烷基。本發(fā)明的另一目的是提供用上述光學(xué)活性反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺制備光學(xué)活性1，5-苯并硫氮雜衍生物的方法。經(jīng)本發(fā)明者研究發(fā)現(xiàn)所需1，5-苯并硫氮雜衍生物可由3-苯基環(huán)氧丙酰胺與2-氨基硫酚衍生物反應(yīng)，并使所得產(chǎn)物經(jīng)分子內(nèi)環(huán)合反應(yīng)(日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?5302/1996)得到。并且，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)一些微生物顯示具有優(yōu)先水解(2S，3R)和(2R，3S)反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺中的一種異構(gòu)體的能力，因此所需的光學(xué)活性3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物可用這些微生物處理反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺外消旋化合物，水解其中一種異構(gòu)體，隨后從反應(yīng)混合物中分離和收集來(lái)水解的對(duì)映體來(lái)制備，并且他們已完成了本發(fā)明。依據(jù)本發(fā)明，式(I)的光學(xué)活性反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物，其中環(huán)A為取代的或未取代的苯環(huán)，R1為氫原子或低級(jí)烷基，系用具有優(yōu)先水解(2S，3R)和(2R，3S)中一種異構(gòu)體能力的微生物的培養(yǎng)或處理培養(yǎng)與反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺接觸，隨后自反應(yīng)混合物中分離并收集未被水解的對(duì)映體來(lái)制備。本發(fā)明方法可應(yīng)用于具有式(I)的任何3-苯基環(huán)氧丙酰胺，其中環(huán)A為未取代的苯環(huán)，或?yàn)楸坏图?jí)烷基，低級(jí)烷氧基或鹵原子取代的苯環(huán)。環(huán)A的取代基包括例如在苯環(huán)4-位上的甲基，甲氧基等。R1的低級(jí)烷基包括例如甲基，乙基，異丙基或t-丁基。本發(fā)明的起始反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺外消旋化合物(I)不僅包括(2S，3R)和(2R，3S)異構(gòu)體的均等比例混合物，也包括這些異構(gòu)體的任何比例混合物。用于本發(fā)明的微生物包括具有優(yōu)先水解反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺外消旋化合物中(2S，3R)和(2R，3S)中的一種異構(gòu)體能力的任何微生物，例如細(xì)菌，酵母，霉菌等微生物。適宜的微生物實(shí)例為，屬于Comamonas類(lèi)，無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)類(lèi)，紅球菌屬(Rhodococcus)類(lèi)，分節(jié)芽孢桿菌(Arthrobacter)類(lèi)，紅色菌(Rhodobacter)類(lèi)，或產(chǎn)黃菌屬(Flavobacterium)類(lèi)的細(xì)菌，屬于假絲酵母菌屬(Candida)類(lèi)，紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)類(lèi)，隱球菌屬(Cryptococcus)類(lèi)，紅酵母屬(Rhodotorula)類(lèi)或亞羅酵母屬(Yarrowia)類(lèi)的酵母，和屬于白霉屬(Mucor)類(lèi)，曲霉屬(Aspergillus)類(lèi)，青霉屬(Penicillium)類(lèi)或短梗霉屬(Aureobasidium)類(lèi)的霉菌。這些微生物的特定例子可以包括，細(xì)菌例如，ComamonasacidovoransATCC11299a，同上IFO13582，水產(chǎn)無(wú)色桿菌(Achromobacteraquatilis)OUT8003，紅球菌屬類(lèi)(Rhodococcussp.)ATCC15592，蠟狀分節(jié)芽孢桿菌(Arthorbacterparaffineus)ATCC21219，近球形紅球菌(Rhodobactersphaeroides)ATCC21286，產(chǎn)黃菌屬FlavobacteriumrigenseNo.35(FERMBP-5289)；酵母例如麥芽假絲酵母菌(Candidamaltosa)IAM12247，同上JCM1504，近平滑假絲酵母菌(Candidaparapsilosis)IFO0708，皺褶假絲酵母菌(Candidarugosa)IFO0591，熱帶假絲酵母菌(Candidatropicalis)IFO1401，紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)IFO0559，紅酵母(Rhodotorulagulutinis)OUT6152，深紅酵母(Rhodotorularubra)OUT6158，溶脂性亞羅酵母(Yarrowialipolytica)IFO0717，同上IFO1209，羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)OUT6027(FERMP-14400)；霉菌例如米曲霉(Aspergillusoryzae)IFO5710，黃曲霉(Aspergillusflavus)IFO5839，總狀毛霉(Mucorracemosus)IFO6745，凍土毛霉(Mucorhiemalis)IFO6753，同上OUT1047，詹森毛霉(Mucorjanssenii)OUT1050，卷枝毛霉(MucorCircinelloides)IFO6746，特異青霉(Penicilliumnotatum)IFO4640，出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)IFO6405等。這些微生物可以用野生菌種，也可用突變的菌種和那些由這些微生物按照生物技術(shù)方式如基因重組和細(xì)胞融合衍生出的菌種。用于培養(yǎng)微生物的基質(zhì)實(shí)例包括上述微生物在其中可以生長(zhǎng)的任何基質(zhì)。例如可取地使用含有0.4至15％碳源(如糖類(lèi)例如葡萄糖，蔗糖或糖漿，有機(jī)酸例如富馬酸，枸櫞酸，或醇如甘油)，和0.3至2.0％的氮源(如無(wú)機(jī)銨鹽例如硫酸銨或氯化銨，尿素，蛋白胨，肉提取物，玉米漿，酵母提取物或酪蛋白水解物)。并且，如果需要，基質(zhì)中也可含有適宜量的無(wú)機(jī)鹽如磷酸鹽，鎂鹽，鉀鹽或鈣鹽和金屬離子和錳或鋅。當(dāng)為合成基質(zhì)時(shí)，如果需要，加入氨基酸例如脯氨酸或組氨酸，生物素或硫胺等是有效的。此外，如果需要，也可加入0.1至2.0％的植物油，外消旋反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物(I)和表面活性劑作為酶誘導(dǎo)物質(zhì)或去泡沫劑以增強(qiáng)酶的活性?；|(zhì)可取的是調(diào)節(jié)pH5至7使用。在上述基質(zhì)中接種了微生物以后培養(yǎng)可用通常的方式例如振搖培養(yǎng)，充氣攪拌培養(yǎng)，固定培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行。除非上述微生物可生長(zhǎng)產(chǎn)生酰胺酶，對(duì)培養(yǎng)條件不加限制，并可依基質(zhì)的種類(lèi)或培養(yǎng)方法選擇合適的條件。一般，需要調(diào)節(jié)起始培養(yǎng)的pH至5到7，并在室溫或在加熱下，例如20℃至40℃的溫度下進(jìn)行。在本發(fā)明中使用的培養(yǎng)或處理培養(yǎng)的微生物可以是任何能優(yōu)先水解反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺類(lèi)化合物(I)外消旋體中(2R，3S)和(2S，3R)一種異構(gòu)體的品種。培養(yǎng)的實(shí)例包括培養(yǎng)基和活的細(xì)胞和處理培養(yǎng)的實(shí)例包括洗滌的細(xì)胞，干燥細(xì)胞，培養(yǎng)上清液，磨碎的細(xì)胞，細(xì)胞產(chǎn)物的自消化，上述微生物細(xì)胞的提取，或由其中得到的部分純化酶或純化酶系均按照常規(guī)的方法?；畹募?xì)胞或培養(yǎng)上清液可將用上述微生物培養(yǎng)制備的培養(yǎng)液經(jīng)離心或過(guò)濾得到。洗滌的細(xì)胞為用生理鹽水洗滌活的細(xì)胞得到。干燥的細(xì)胞為將活的細(xì)胞或洗滌的細(xì)胞用冷凍干燥或丙酮干燥得到。磨碎的細(xì)胞是將活細(xì)胞或洗滌的細(xì)胞以各種物理化學(xué)方法處理，例如超聲處理，弗氏壓碎器，滲透休克，冷凍融化，氧化鋁研磨，用裂解酶，表面活性劑，或有機(jī)溶劑等處理得到。細(xì)胞提取物是由例如磨碎的細(xì)胞過(guò)濾除去固體物質(zhì)或經(jīng)離心分離等得到。部分純化的酶或純化的酶是以例如常規(guī)方法分步處理磨碎的細(xì)胞或上清液得到(如用硫酸銨分級(jí)處理，離子交換層析法或凝膠過(guò)濾層析法等)，以?xún)?yōu)先水解化合物(I)中(2R，3S)和(2S，3R)異構(gòu)體之一的能力做為純化它們的一種指標(biāo)。本發(fā)明的上述培養(yǎng)(活細(xì)胞等)或處理培養(yǎng)可以不需任何進(jìn)一步處理加以應(yīng)用，但也可以在使用前用已知方法，例如用聚丙烯酰胺，含硫多糖凝膠(如角叉菜凝膠)，藻酸凝膠或瓊脂凝膠等方法使之固定化。更且，用已知方法的組合純化微生物細(xì)胞提取物以得到酶也是可以應(yīng)用的。用上述微生物優(yōu)先水解反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物(I)外消旋體的反應(yīng)可用下圖說(shuō)明。圖中環(huán)A和R1均與上述的界定相同。如此，應(yīng)用具有優(yōu)先水解反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物(I)外消旋體中(2R，3S)-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物能力的微生物，得到(2S，3R)光學(xué)活性化合物(IA)。另一方面，應(yīng)用具有優(yōu)先水解反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物(I)外消旋體中(2S，3R)-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物能力的微生物，得到(2R，3S)光學(xué)活性化合物(IB)。依據(jù)本發(fā)明的方法，反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物(I)外消旋體的水解反應(yīng)可以讓培養(yǎng)的或處理培養(yǎng)的微生物與反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物(I)接觸并孵育此混合物來(lái)進(jìn)行。底物，反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物(I)外消旋體的濃度一般可由重量的0.1至80％，可取的為重量的0.1至20％，同時(shí)反應(yīng)在室溫或加熱下進(jìn)行，可取的溫度為10至50℃，更可取的溫度為20至40℃。反應(yīng)過(guò)程中，調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物的pH值在5至9是可取的，更可取的是6至8。至于反應(yīng)混合物，可以用水性溶劑如水，水-二甲基甲酰胺混合物，但從底物穩(wěn)定性的觀點(diǎn)考慮，反應(yīng)可在水性溶劑(如水)和有機(jī)溶劑的兩相溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行。有機(jī)溶劑包括，例如，芳香烴(如甲苯，二甲苯，氯苯等)，鹵代的或非鹵代的脂肪烴(如異辛烷，四氯化碳，二氯甲烷，三氯甲烷等)，乙酸酯(如乙酸乙酯，乙酸丁酯等)，酮類(lèi)(如甲基異丁基酮，丙酮等)，醚類(lèi)(如t-丁基甲基醚，二異丙基醚等)，醇類(lèi)(如甲醇，乙醇，正丙醇，異丙醇，正丁醇，t-丁醇等)。在這些溶劑中，甲苯，甲基異丁基酮，甲醇，乙醇和四氯化碳是更可取的。當(dāng)反應(yīng)在有表面活性劑存在下進(jìn)行時(shí)，反應(yīng)可被促進(jìn)，所以反應(yīng)時(shí)間縮短，同時(shí)所需的光學(xué)活性反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物的收率增加。表面活性劑可以是十六烷基溴化吡啶，十六烷基三甲基溴化銨。聚己二醇，聚氧乙烯辛基苯基醚等，同時(shí)表面活性的量可取的范圍為基于反應(yīng)混合物重量的約0.0001至約0.1％。由上述水解得到的光學(xué)活性反式-苯基環(huán)氧丙酰胺可以用常規(guī)方法從反應(yīng)混合物中容易地分離。例如，當(dāng)水解是在水性溶劑系統(tǒng)中如水-二甲基甲酰胺中進(jìn)行時(shí)，一種光學(xué)活性的反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物被水解并隨后脫羧轉(zhuǎn)變?yōu)槿╊?lèi)化合物。此醛可以用向其中加入亞硫酸氫鈉進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為水溶性加成物。另一方面，未水解的光學(xué)活性對(duì)映體難溶于水，所以，所需的光學(xué)活性反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物可用有機(jī)溶劑如乙酸乙酯自水解反應(yīng)后的反應(yīng)混合物中提取它并在減壓下濃縮以結(jié)晶分離出來(lái)。當(dāng)水解是在水-有機(jī)溶劑的兩相溶劑系統(tǒng)進(jìn)行時(shí)，一種光學(xué)活性反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物被水解并轉(zhuǎn)移到水相，而未水解的光學(xué)活性對(duì)映體化合物留于有機(jī)溶劑中，所以所需的光學(xué)活性化合物可以從水解反應(yīng)后的反應(yīng)混合物中經(jīng)收集有機(jī)層并在減壓下濃縮分離出來(lái)。如此得到的光學(xué)活性反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物(IB)或(IA)可以與式(II)的2-氨基硫酚衍生物反應(yīng)然后使產(chǎn)物經(jīng)分子內(nèi)環(huán)合反應(yīng)轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的式(III)(2S，3S)-1，5-苯并硫氮雜衍生物式(III)中環(huán)B為取代的或未取代的苯環(huán)，R2為氫原子或二-低級(jí)烷基氨基-低級(jí)烷基，環(huán)A與上述的界定相同。或可轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的式(IV)(2R，3R)-1，5-苯并硫氮雜衍生物其中環(huán)A，環(huán)B和R2均與上述界定的相同。(II)式中環(huán)B和R2均與上述界定的相同。(2S，3R)-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物(IA)或(2R，3S)-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物(IB)與2-氨基硫酚衍生物(II)的反應(yīng)可在有鐵催化劑(如硫酸鐵等)存在下，或無(wú)鐵催化劑存在下，在有機(jī)溶劑(如二甲苯等)中進(jìn)行。隨后的分子內(nèi)環(huán)合反應(yīng)可在有或無(wú)酸(如甲烷磺酸等)存在下，在有機(jī)溶劑中(如二甲苯等)中，在0至250℃溫度下進(jìn)行。用于上述反應(yīng)的2-氨基硫酚衍生物(II)的環(huán)B為苯環(huán)，其上可任選的具有一個(gè)低級(jí)烷基或一個(gè)鹵原子。R2的二-低級(jí)烷基氨基-低級(jí)烷基為，例如，二甲氨基甲基，2-(二甲氨基)乙基等。起始的外消旋反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物(I)可用，例如USP4959359等透露的方法制備。即，反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物(I)外消旋體可由式(VII)的縮水甘油酸酯化合物其中環(huán)A與上述界定的相同，與式(VIII)的化合物H2NR1(VIII)其中R1與上述界定的相同，在適當(dāng)?shù)娜軇?如甲醇，四氫呋喃，二甲基甲酰胺，甲苯，二甲苯等)在0至100℃的溫度下反應(yīng)來(lái)制備。在說(shuō)明書(shū)中，低級(jí)烷基意指C1-C6烷基，低級(jí)烷氧基意指C1-C6。依據(jù)本發(fā)明的方法，一種光學(xué)活性反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物可由相應(yīng)的外消旋反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物，在進(jìn)一步中得到高純度的結(jié)晶。所以，本發(fā)明的方法可以成為制備光學(xué)活性反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物的工業(yè)上有利的方法。此外，依據(jù)本發(fā)明，一種作為有用的藥物光學(xué)活性的1，5-苯并硫氮雜衍生物可容易地用此光學(xué)活性反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物制備。所以，本發(fā)明的方法對(duì)于以工業(yè)規(guī)模制備光學(xué)活性1，5-苯并硫氮雜衍生物也是有用的。實(shí)施例本發(fā)明可用下列實(shí)施例和參考例加以說(shuō)明，但不應(yīng)解釋為是對(duì)其的限制。實(shí)施例1一種酰胺酶的產(chǎn)生基質(zhì)(3ml)(組分2％富馬酸單納鹽，1％酵母提取物；0.2％氯化胺；0.2％磷酸二鉀鹽；0.02％硫酸鎂·七水合物；0.003％硫酸鐵七水合物；0.1％氯化鈉；0.1％ε-己內(nèi)酰胺；pH7.0)加于試管中(13mmΦ×120mm)，并在120℃滅菌10分鐘。在基質(zhì)中接種一白金耳的列于表1的各種微生物，然后在30℃以300rpm振搖進(jìn)行培養(yǎng)(振搖培養(yǎng))24小時(shí)(細(xì)菌)或二天(酵母)。如此得到的培養(yǎng)液中加入1.0MTris-HCl緩沖液(pH7.0，0.3ml)和外消旋-反式-3-(4-甲基苯基)環(huán)氧丙酰胺(下文中相當(dāng)于外消旋反式-MPGA，40mg/ml)在二甲基甲酰胺(DMF)中的溶液(0.075ml)，同時(shí)混合物在30℃300rpM振搖下進(jìn)行水解24小時(shí)。在每個(gè)反應(yīng)溶液中存留的光學(xué)活性MPGA量(mg)是以下列的方法測(cè)定的。乙酸乙酯(3ml)加到反應(yīng)溶液中以提取MPGA。收集乙酸乙酯層(100μl)并加入到正己烷和異丙醇(15∶1)的混合物(2.9ml)中。此樣品以CHIRALCELOB-H(4.6mmΦ×250mm，由DaicelChemicalIndustries，Ltd.制作)高效液相層析法(HPLC)進(jìn)行分析，測(cè)定(2R，3S)-MPGA和(2S，3R)-MPGA保留在反應(yīng)溶液中的量。HPLC是用正己烷∶異丙醇(15∶1)混合溶劑，在40℃以1ml/min的流速進(jìn)行的。結(jié)果列于表1。在表1中″空白″意指用同樣方法在沒(méi)有微生物培養(yǎng)液時(shí)進(jìn)行同樣反應(yīng)的反應(yīng)溶液中光學(xué)活性MPGA的量。表1光學(xué)活性MPGA存留的量(mg)微生物(2S，3R)異構(gòu)體(2R，3S)異構(gòu)體空白1.281.28細(xì)菌ComamonasacidovoransATCC11299a0.87＜0.01水產(chǎn)無(wú)色桿菌OUT80030.351.23紅球菌屬ATCC155920.031.17蠟狀分節(jié)芽孢桿菌ATCC212190.231.28近球形紅球菌ATCC212860.981.28產(chǎn)黃菌屬FlavobacteriumrigenseNo.350.841.28(FERMBP-5289)酵母麥芽假絲酵母菌IAM122470.170.91麥芽假絲酵母菌JCM15040.831.15近平滑假絲酵母菌IFO07080.140.92皺褶假絲酵母菌IFO05910.181.04熱帶假絲酵母菌IFO14010.370.95紅冬孢酵母IFO05590.570.89紅酵母OUT61520.230.09深紅酵母OUT61580.510.90溶脂性亞羅酵母IFO07170.821.03溶脂性亞羅酵母IFO12090.770.95實(shí)施例2用除以3％葡萄糖代替2％富馬酸單鈉鹽外與例1使用的相同酰胺酶產(chǎn)生基質(zhì)(pH6.0)培養(yǎng)列于表2的微生物。孵育進(jìn)行三天(霉菌)或兩天(酵母)。1.0MTris-HCL緩沖液(pH7.0，0.3ml)和外消旋反式-MGPA(40mg/ml)在DMF的溶液(0.075ml)加入到如此制得的培養(yǎng)液中，混合物在30℃，300rpm振搖下進(jìn)行水解24小時(shí)。每個(gè)反應(yīng)溶液中光學(xué)活性MPGA的存留量(mg)用與例1相同的方式測(cè)定，結(jié)果列于表2表2光學(xué)活性MPGA的存留量(mg)微生物(2S，3R)異構(gòu)體(2R，3S)異構(gòu)體空白1.281.28霉菌米曲霉IFO57100.481.01黃曲霉IFO58390.300.81總狀毛霉IFO67451.280.64凍土毛霉OUT10471.320.18詹森毛霉OUT10501.481.12卷枝毛霉IFO67461.311.00凍土毛霉IFO67531.380.85特異青霉IFO46400.320.86出芽短梗霉IFO64050.591.22酵母羅倫隱球酵母OUT6027(FERMP-14400)1.081.33實(shí)施例3ComamonasacidovoransATCC11299a用500ml體積的搖瓶(20瓶)中裝入與實(shí)施例1相同的酰胺酶產(chǎn)生基質(zhì)(100ml)，在30℃140rpm振搖培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)液中加1M磷酸鹽緩沖劑(pH7，10ml)和外消旋反式-MPGA(100mg)在DMF(1ml)中的溶液，同時(shí)此反應(yīng)混合物在30℃，140rpm振搖培養(yǎng)(底物總量2g/20瓶)。反應(yīng)1.5小時(shí)后，將所有反應(yīng)混合物合并，向其中加入丙酮(6立升；反應(yīng)混合物體積的三倍)。反應(yīng)混合物攪拌10分鐘得到丙酮干燥的細(xì)胞。用硅藻土(celite)過(guò)濾除去如此得到的細(xì)胞。濾液在減壓下濃縮除去丙酮，含有(2s，3r)-MPGA的水層用乙酸乙酯1.5立升提取。乙酸乙酯層連續(xù)用亞硫酸鈉溶液(pH6.4，600ml)，飽和氯化鈉水溶液(600ml)，碳酸氫鈉水溶液(pH7-9)，和飽和氯化鈉水溶液(500ml×3)洗滌。乙酸乙酯層用無(wú)水硫酸鎂干燥并在減壓下濃縮得到的固體在90℃溶于甲苯(200ml)。溶液在室溫靜置一小時(shí)，然后在4℃再靜置二小時(shí)。析出的(2S，3R)-MPGA結(jié)晶過(guò)濾收集。重結(jié)晶的收率第一次結(jié)晶647mg第二次結(jié)晶99.7mg第三次結(jié)晶15.1mg總量761.8mg光學(xué)活性化合物分離收率(％)76％器械分析結(jié)果IR(KBr)Vmax3402.2cm-1，3200cm-1，1640cm-1NMR(DMSO)2.30(s，3H)，3.47(d，1H，J＝1.9Hz)，3.97(d，1H，J＝1.9Hz)，7.15-7.33(4H)，7.42和7.57(s×2，1H×2)MS(m/z)177(M+)光學(xué)純度100％e.e.(用CHIRALCELOB-HHPLC分析)M.p.176.5-177.5℃旋光性[α]D26＝+158°(c＝0.50甲醇)實(shí)施例4用與例3同樣的方式，ComamonasacidovoransATCC11299a在酰胺酶產(chǎn)生基質(zhì)中振搖培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)液中加入1M磷酸鹽緩沖劑(pH7，10ml)和外消旋反式-MPGA(100mg)在DMF中的溶液(1ml)，反應(yīng)混合物在30℃140rpm振搖培養(yǎng)。以固定時(shí)間間隔每次收集2ml反應(yīng)溶液，并將其中的MPGA用等體積的乙酸乙酯提取。每份樣品中存留光學(xué)活性MPGA的量用CHIRALCELOB-HHPLC分析測(cè)定。反應(yīng)是在兩個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行的，即批號(hào)A和批號(hào)B，同時(shí)(2S，3R)-MPGA和(2R，3S)-MPGA在每個(gè)批號(hào)中隨時(shí)間變化的存留量列于表3和表4。在表3和表4中，外消旋反式-MPGA的水解比例(％)，和(2S，3R)-MPGA的光學(xué)純度也同時(shí)指明。水解比例(C)(％)用下式計(jì)算。C(%)=(1-A+BA0+B0)&times;100]]>Ao+Bo做為底物加入的外消旋MPGA量A(2S，3R)-MPGA的存留量B(2R，3S)-MPGA的存留量表3批號(hào)A的結(jié)果</tables>表4批號(hào)B的結(jié)果</tables>實(shí)施例5外消旋反式-3-(4-甲氧苯基)環(huán)氧丙酰胺(外消旋反式-MeOPGA)的水解。酰胺酶產(chǎn)生基質(zhì)(組成2％富馬酸單鈉鹽；1％酵母提取物；0.2％氯化銨；0.2％磷酸二鉀鹽；0.02％硫酸鎂·七水合物；0.003％硫酸鐵·七水合物；0.1％氯化鈉；0.1％ε-己內(nèi)酰胺，pH7)中接種ComamonasacidovoransATCC11299a，混合物在30℃300rpm振搖孵育42水時(shí)。培養(yǎng)液(2.2ml)中加入0.4MTris-HCl緩沖劑(pH7，8或9各0.75ml)和含有外消旋反式-MeOPGA(3mg)的DMF溶液(0.05ml)，同時(shí)此混合物在30℃300rpm振搖孵育25分鐘。反應(yīng)溶液中的MeOPGA用乙酸乙酯(3ml)提取，并用CHIRALCELODHPLC分析。(2S，3R)-MeOPGA和(2R，3S)-MeOPGA的存留比例示于表5。表5在不同pH值時(shí)每個(gè)光學(xué)活性MeOPGA的存留比例(％)</tables>HPLC分析的條件柱CHIRALCELOD流速1.0ml/min溫度40℃檢測(cè)235nm溶劑正己烷∶異丙醇＝20∶1實(shí)施例6微生物產(chǎn)生(2S，3R)-3-(4-甲基苯基)環(huán)氧丙酰胺((2S，3R)-MPGA)含有酰胺酶產(chǎn)生基質(zhì)(100ml/瓶，組成2％富馬酸單鈉鹽；1％酵母提取物；0.2％氯化銨；0.2％磷酸二鉀鹽；0.02％硫酸鎂·七水合物；0.003％硫酸鐵4·七水合物；0.1％氯化鈉；0.1％ε-己內(nèi)酰胺，pH7)的500ml搖瓶中接種ComamonasacidovoransIFO13582，同時(shí)混合物在30℃140rpm振搖下孵育24小時(shí)。培養(yǎng)液中加入1M磷酸緩沖劑(pH7，10ml)和含有外消旋反式-MPGA(100mg)的DMF溶液(1ml)，此混合物在30℃140rpm振搖下孵育6小時(shí)。反應(yīng)溶液(2ml)中的MPGA用乙酸乙酯(2ml)提取，并用CHIRALCELOB-H柱以HPLC分析。(2S，3R)-MPGA和(2R，3S)-MPGA存留比例示于表6表6</tables>HPLC分析的條件柱CHIRALCELOB-H流速1.0ml/min溫度40℃檢測(cè)235nm溶劑正己烷∶異丙醇＝15∶1參考例1(1)(2R，3S)-3-(4-甲氧苯基)環(huán)氧丙酰胺(1.93g)和二甲苯(15ml)的混合物在氮?dú)庀禄亓?。在回流起始后立即向反?yīng)溶液中加入2-氨基硫酚(1.38g)和流酸鐵·七水合物(0.28mg)的甲醇(0.2ml)溶液。在同一溫度下反應(yīng)五分鐘后，反應(yīng)溶液冷卻至室溫。反應(yīng)溶液用HPLC分析以確定3-(2-氨基苯硫基)-2-羥基-3-(4-甲氧苯基)丙酰胺(2.69g)(threo/erythro＝91/9)的生成。反應(yīng)溶液在減壓下濃縮除去溶劑，得到的殘?jiān)诩訜嵯氯苡谝掖?3ml)和水(3ml)。溶液在冷卻下逐漸降至0℃以析出結(jié)晶。析出的結(jié)晶經(jīng)過(guò)濾收集。收集的結(jié)晶用冰冷的50％乙醇洗滌，然后在50℃干燥得(2S，3S)-3-(2-氨基苯硫基)-2-羥基-3-(4-甲氧苯基)丙酰胺(0.84g)。M.p.110-112℃[α]D25+506°(C＝1.0，甲醇)HPLC分析的條件柱WATERSPURESIL5μC18120(4.6×150mm)Waters，Inc.制造溶劑乙腈∶10mM磷酸二氫鉀(pH3)＝30∶70流速1.0ml/minUV檢測(cè)254nm溫度40℃(2)(2S，3S)-3-(2-氨基苯硫基)-2-羥基-3-(4-甲氧苯基)丙酰胺(1.59g)，二甲苯(8ml)和甲烷磺酸(24ml)的混合物回流11小時(shí)，令反應(yīng)溶液在攪拌下冷卻至室溫。析出的結(jié)晶經(jīng)過(guò)濾收集，用冷甲醇洗滌，并在50℃干燥得(2S，3S)-2，3-二氫-3-羥基-2-(4-甲氧苯基)-1，5-苯并硫氮雜-4(5H)-酮(1.41g)。M.p.203-205℃[α]D25+114.3°(C＝0.5，二甲基甲酰胺)1H-NMR(DMSO-d6，δ)3.76(3H，s)，4.30(1H，dd)，4.74(1H，d)，5.05(H，d)，6.87-7.62(8H，m)，10.32(1H，s)HPLC測(cè)定的光學(xué)純度＞99.9e.e.％HPLC分析的條件柱CHIRALCELOD(4.6×150mm)，DaicelChemicalIndustries，Ltd.制造。溶劑正己烷∶乙醇＝85∶15流速0.5ml/minUV檢測(cè)254nm溫度35℃參考例2(1)(2S，3R)-3-(4-甲基苯基)-環(huán)氧丙酰胺和2-氨基-5-甲基硫酚用與參考例1-(1)相同的方式處理得(2R，3R)-3-(2-氨基-5-甲基苯硫基)-2-羥基-3-(4-甲基苯基)丙酰胺。M.p.145-146℃[α]D25-410℃(C＝1，甲醇)(2)(2R，3R)-3-(2-氨基-5-甲基苯硫基)-2-羥基-3-(4-甲基苯基)-丙酰胺用與參考例1-(2)相同的方式處理得(2R，3R)-2，3-二氫-3-羥基-2-(4-甲基苯基)-8-甲基-1，5-苯并硫氮雜-4(5H)-酮。M.p.212-214℃[α]D25-129.2°(C＝1，二甲基甲酰胺)1H-NMR(DMSO-d6，δ)2.29(3H，s)，4.29(1H，dd)，4.67(1H，d)，5.03(1H，d)，7.02-7.42(7H，m)，10.20(1H，s)權(quán)利要求1.一種制備光學(xué)活性反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物的方法，此法包括將具式(I)的外消旋反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物進(jìn)行光學(xué)分析。式(I)中環(huán)A為取代的或未取代的苯環(huán)，R1為氫原子或低級(jí)烷基。2.依據(jù)權(quán)利要求1的一種制備光學(xué)活性反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物的方法，其中光學(xué)分析的進(jìn)行采用具有優(yōu)先水解上述外消旋化合物(I)中(2S，3R)或(2R，3S)異構(gòu)體之一能力的微生物培養(yǎng)或處理培養(yǎng)與外消旋反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺接觸以水解其中的一個(gè)異構(gòu)體，同時(shí)從反應(yīng)混合物中分離和收集未被水解的光學(xué)活性對(duì)映體。3.依據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中微生物為從屬于Comamonas類(lèi)，無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)類(lèi)，紅球菌屬(Rhodococcus)類(lèi)，分節(jié)芽孢桿菌(Arthrobacter)類(lèi)，紅色菌(Rhodobacter)類(lèi)，或產(chǎn)黃菌屬(Flavobacterium)類(lèi)的細(xì)菌，屬于假絲酵母菌屬(Candida)類(lèi)，紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)類(lèi)，隱球菌屬(Cryptococcus)類(lèi)，紅酵母屬(Rhodotorula)類(lèi)或亞羅酵母屬(Yarrowia)類(lèi)的酵母，和屬于白霉屬(Mucor)類(lèi)，曲霉屬(Aspergillus)類(lèi)，青霉屬(Penicillium)類(lèi)或短梗霉屬(Aureobasidium)類(lèi)霉菌中選擇的一種。4.依據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中微生物是從Comamonasacidovorans，水產(chǎn)無(wú)色桿菌(Achromobacteraquatilis)，紅球菌屬類(lèi)(Rhodococcussp.)，蠟狀分節(jié)芽孢桿菌(Arthorbacterparaffineus)，近球形紅球菌(Rhodobactersphaeroides)，產(chǎn)黃菌屬Flavobacteriumrigense，麥芽假絲酵母菌(Candidamaltosa)，近平滑假絲酵母菌(Candidaparapsilosis)，皺褶假絲酵母菌(Candidarugosa)，熱帶假絲酵母菌(Candidatropicalis)，紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)，紅酵母(Rhodotorulagulutinis)，深紅酵母(Rhodotorularubra)，羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)，溶脂性亞羅酵母(Yarrowialipolytica)，米曲霉(Aspergillusoryzae)，黃曲霉(Aspergillusflavus)，總狀毛霉(Mucorracemosus)，凍土毛霉(Mucorhiemalis)，詹森毛霉(Mucorjanssenii)，卷枝毛霉(MucorCircinelloides)，特異青霉(Penicilliumnotatum)，出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)中選擇的一種。5.依據(jù)權(quán)利要求2，3和4中任何一種方法，其中微生物具有優(yōu)先水解反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物(I)的(2R，3S)異構(gòu)體的能力。6.依據(jù)權(quán)利要求2，3和4中任何一種方法，其中微生物具有優(yōu)先水解反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物(I)的(2S，3R)異構(gòu)體的能力。7.依據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物(I)(2R，3S)異構(gòu)體為(2R，3S)-3-(4-甲基苯基)-環(huán)氧丙酰胺。8.依據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物(I)(2S，3R)異構(gòu)體為(2S，3R)-3-(4-甲氧苯基)-環(huán)氧丙酰胺。9.依據(jù)權(quán)利要求1和2中的任一方法，其中外消旋反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物(I)的環(huán)A為苯環(huán)，其上可任選地由低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基和鹵原子所取代。10.制備式(III)的(2S，3S)-1，5-苯并硫氮雜衍生物的方法式(III)中環(huán)A為取代的或未取代的苯環(huán)，環(huán)B為取代的或未取代的苯環(huán)，R2為氫原子或二-低級(jí)烷氨基-低級(jí)烷基，或?yàn)橹苽涫?IV)的(2R，3R)-1，5-苯并硫氮雜衍生物的方法式(IV)中環(huán)A，環(huán)B和R2均與上述的界定相同，制備方法包括權(quán)利要求1或2得到的光學(xué)活性反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物與式(II)的2-氨基硫酚衍生物反應(yīng)，隨后使產(chǎn)物再經(jīng)分子內(nèi)環(huán)合反應(yīng)，式(II)中的環(huán)B和R2均與上述的界定相同。全文摘要制備光學(xué)活性反式-3-苯基環(huán)氧丙酰胺化合物的方法，此法包括使環(huán)A為取代的或未取代的苯環(huán)和R文檔編號(hào)C12P17/02GK1163269SQ9710087公開(kāi)日1997年10月29日申請(qǐng)日期1997年3月17日優(yōu)先權(quán)日1997年3月17日發(fā)明者松前裕明,出井晶子,西田卓生,尾崎泰彥,柴谷武爾申請(qǐng)人:田邊制藥株式會(huì)社