專利名稱：微生物同步發(fā)酵正十三烷生產(chǎn)十一烷1，11二羧酸方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物同步發(fā)酵正烷烴生產(chǎn)長鏈α，ω-二元酸的方法，尤其是發(fā)酵正十三烷(nC13)高產(chǎn)十一烷1，11-二羧酸(DC13)的方法。
C10以上的長鏈二元酸是化工上合成高級香料，高級尼龍工程塑料，高檔服裝用尼龍熱熔膠，高溫電介質(zhì)，高級涂料，潤滑油添加劑和耐寒性增塑劑等的重要原料。尤其是十三碳二元酸(DC13)和十五碳二元酸(DC15)，它們分別是合成日用香料麝香T和名貴香料麝香酮的重要原料。
C10以上的長鏈二元酸，在自然界中不單獨(dú)存在，只有少數(shù)幾種二元酸可從植物油中裂介制取，例如癸二酸(DC10)可從蓖麻籽油裂介制取；DC13可從菜籽油中抽提出甘油芥酸酯再用臭氧氧化方法生產(chǎn)；DC15可從蒜頭果油中的腦神經(jīng)酸裂介制取。但它們都受農(nóng)田和氣候的限制，遠(yuǎn)不能滿足需要。化工上至今也還沒有經(jīng)濟(jì)可行的合成路線和方法。微生物學(xué)家應(yīng)用生物工程技術(shù)，利用微生物發(fā)酵石油中的正構(gòu)烷烴生產(chǎn)相應(yīng)鏈長的二元酸，彌補(bǔ)了化工上的不足，開辟了長鏈二元酸的新來源。
七十年代以前，各國科學(xué)家對微生物發(fā)醇生產(chǎn)二元酸的研究，只處于理論研究階段，所產(chǎn)生和積累的二元酸也都是十個(gè)碳以下的短鏈二元酸，七十年代以后，進(jìn)入應(yīng)用研究階段，通過大量的菌種誘變篩選，培育出一批新突變菌株，能從十個(gè)碳以上的正烷烴產(chǎn)生和積累與基質(zhì)鏈長相同的長鏈二元酸，并通過不斷的培育和代謝調(diào)控研究，使每升發(fā)酵液中二元酸的積累從開始時(shí)的幾克，十幾克，幾十克提高到目前的一百多克和二百克左右。
八十年代以來，二元酸的研究進(jìn)入小規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)階段，并出現(xiàn)了幾個(gè)有實(shí)際生產(chǎn)價(jià)值的專利文獻(xiàn)。中國專利87105445.0，CN1046757A，CN1092108A和CN1130685A分別提出生產(chǎn)長鏈α，ω-二元酸的方法，特別是分別高產(chǎn)DC16，DC17，DC15和DC12的方法。在16升自動控制罐中，發(fā)酵5天，DC16為123g/L，發(fā)酵6天，DC17為133g/L，在2.5m3通用式發(fā)酵罐中，發(fā)酵6天，DC15為178g/L，在3m3發(fā)酵罐中，發(fā)醇5天，DC12為145g/L。
對DC13的研究，日本礦業(yè)株式會社率先工業(yè)放大，1984年建成年產(chǎn)200噸的DC13的工業(yè)發(fā)酵裝置，并投入生產(chǎn)。中國專利CN1071951A提出一種微生物異步發(fā)酵生產(chǎn)長鏈α，ω-二元酸的方法，尤其是生產(chǎn)DC13的方法。其方法是分兩步進(jìn)行，根據(jù)實(shí)驗(yàn)例4，第一步是把培養(yǎng)好的600升菌種液接入裝有正十三烷(nC13)125升和培養(yǎng)基1775升的3m3發(fā)酵罐內(nèi)(即裝液量為83％)，控制PH在4.5±0.1，繁殖培養(yǎng)菌體，24小時(shí)，菌體濃度達(dá)到8.7％(濕菌重)；第二步，補(bǔ)加20％(V/V)的nC13，調(diào)PH至7.8±0.1，轉(zhuǎn)入發(fā)酵產(chǎn)酸階段，發(fā)酵72小時(shí)，DC13達(dá)到98.2g/L，繼續(xù)發(fā)酵72小時(shí)，產(chǎn)酸達(dá)到166.3g/L(從接種開始到發(fā)酵結(jié)束，共168小時(shí))，轉(zhuǎn)化率為84％。
本發(fā)明的目的是提出另一種利用微生物同步發(fā)酵正烷烴生產(chǎn)C11-C18長鏈α，ω-二元酸的方法，尤其是高產(chǎn)DC13的方法。
本發(fā)明所用的菌株為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)P-12-242，是以一株氧化正烷烴生產(chǎn)混合二羧酸的熱帶假絲酵母(參見《微生物學(xué)報(bào)》20(1)88-93，1980)為出發(fā)菌株，通過亞硝酸和紫外線的多次反復(fù)誘變篩選培育出來的，能從C11-C18的各種單一正烷烴和混合正烷烴，尤其是正十三烷，高產(chǎn)出地生產(chǎn)相應(yīng)鏈長的二羧酸。熱帶假絲酵母P-12-242(以下簡稱P-12-242)保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.。
P-12-242的生理特性如下一、糖類的發(fā)酵葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麥芽糖+，乳糖-。
二、同化葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麥芽糖+，纖維二糖+，海藻糖+，乳糖-，密二糖-，棉子糖-，松三糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+，L-阿戊糖+，D-阿戊糖-，核糖-，鼠李糖-，α-甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤蘚醇-，甘露醇+，肌醇-，核糠醇+，半乳糖醇-，葡萄糖醇+，檸檬酸鈉-，丁二酸鈉+，乳酸鈣-。
三、生長素的需要生物素++，維生素B1++，維生素B2+，維生素B6+，維生素B12+，葉酸+，煙酸+，泛酸+，肌醇+，對氨基苯甲酸+。
四、其它硝酸鹽-，凍化牛奶-，熊果酸分解-，凝固牛奶-，油脂酶-。
形態(tài)特征奶油白色，皺褶型，菌落為蛋糕狀和桃酥狀。
培養(yǎng)特征在麥芽汁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，假菌絲多而長；在烷烴種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，有一定數(shù)量的短假菌絲；而在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵時(shí)，大部分是單個(gè)橢園細(xì)胞。本發(fā)明的種子培養(yǎng)基(1)、10個(gè)巴林糖度的麥芽汁加2％瓊脂制成的固體斜面；(2)、10個(gè)巴林的麥芽汁液體培養(yǎng)基；(3)、烷烴種子培養(yǎng)基包含KH2PO46-12g/L，玉米漿3-8g/L，酵母膏3-8g/L，蔗糖3-8g/L，尿素3-6g/L，重蠟40-70ml/L，自來水配制，自然PH。
培養(yǎng)種子的過程為取一接種環(huán)P-12-242酵母菌體，涂布在麥芽汁固體斜面上(15×180試管，每支裝6-7mL培養(yǎng)基，放成斜面)，于28-30℃培養(yǎng)40小時(shí)。取一支上述培養(yǎng)好的P-12-242菌種分部刮入裝有25ml烷烴種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于28-30℃220轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)40-48小時(shí)，作為搖瓶發(fā)酵種子或者取兩支上述培養(yǎng)好的P-12-242菌種全部刮入裝有500mL培養(yǎng)基的5000ml三角瓶中，于180轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)搖床上28-30℃培養(yǎng)44-48小時(shí)，作為一級種子罐的種子。
用本發(fā)明的P-12-242菌株生產(chǎn)長鏈二羧酸，特別是十三碳二羧酸的具體方法是把發(fā)酵的種子接入PH5.5-9.0，最好為6.5-7.5的含有15-45％(V/V)的C11-C18的正烷烴和85-55％(V/V)發(fā)酵培養(yǎng)基的混合液中。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為堿金屬磷酸鹽6-14g/L，最好為7-10g/L，氯化鈉0.5-2.0g/L、酵母膏1-6g/L，最好為3-5g/L，玉米漿0.5-2g/L，尿素0.5-2.5g/L最好為1.0-2.0g/L，硝酸鹽5-15g/L，最好為6-12g/L，蔗糖10-30g/L，最好為10-20g/L，消泡劉400-1200ppm以及一些其他公知的營養(yǎng)源，在PH5.8-7.5之間將上述混合物在25-30℃，最好在27-31℃通氣發(fā)酵48-170小時(shí)。28小時(shí)內(nèi)，PH控制在6.8以下，以菌體生長為主，產(chǎn)酸為付，此時(shí)菌株生長光密度OD達(dá)到0.6左右，產(chǎn)酸達(dá)到20-30g/L，在28-60小時(shí)，PH控制在7.3以下，產(chǎn)酸為主，菌體生長為付，此時(shí)OD達(dá)至0.9左右，產(chǎn)酸達(dá)到75-85g/L，從60小時(shí)以后，每隔6-8小時(shí)用NaOH溶液調(diào)一次PH至7.5-8.0，菌體量不再增加，而產(chǎn)酸量繼續(xù)迅速增加，然后將產(chǎn)生的二羧酸從發(fā)酵液中分離出來。在發(fā)酵開始時(shí)，混合液中正烷烴含量為10-20％(V/V)，以后在適當(dāng)時(shí)間補(bǔ)加正烷烴，使發(fā)酵液中正烷烴濃度始終＞5％(V/V)為準(zhǔn)。堿金屬磷酸鹽可從KH2PO4，NaH2PO4K2HPO4和Na2HPO4中選一種。硝酸鹽可從鉀或鈉鹽中選一種。
發(fā)酵結(jié)束后，加入適量的水，加堿至PH10-12，加熱至85-90℃，進(jìn)行破乳分層，上層為殘油，回收再用，放出中間清液，下層菌體層再處理一次或壓濾或離心，合并清液，加入適量活性炭，在85-90℃，脫色30分鐘，除去活性炭后，脫色液加熱至60-70℃，加HCI或H2SO4至PH4-5進(jìn)行酸化結(jié)晶，冷卻至30℃后，壓濾，用空氣吹干，60℃烘干，得白色十三碳二羧酸結(jié)晶。
用本發(fā)明的P-12-242菌株和發(fā)酵方法，可生產(chǎn)C11-C18的各種單一和混合二羧酸。其中在2.5噸罐上，從正十三烷發(fā)酵生產(chǎn)十三碳二羧酸，發(fā)酵6天，產(chǎn)酸量高達(dá)180-200g/L，后處理總收率達(dá)到80％，純度達(dá)到96％以上。
實(shí)例一(1)、取一接種環(huán)P-12-242菌種，涂布在15×180大試管麥芽汁固體斜面上，30℃培養(yǎng)兩天。(2)、取上述菌種一支，接入裝有25ml烷烴種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中于30℃在220轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)48小時(shí)。烷烴種子培養(yǎng)基中KH2PO48g/L，酵母膏5g/L，玉米漿3g/L，蔗糖5g/L，尿素3g/L，重蠟50ml/L，自來水配制，PH5.0。(3)、在裝有15ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，接入3.5ml上述種子液，在200轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)搖床上發(fā)酵4天，每24小時(shí)用NaOH調(diào)一次PH至7.5-8.0。發(fā)酵培養(yǎng)基含KH2PO48g/L，酵母膏2g/L，玉米漿1g/L，氯化鈉1.5g/L，尿素1g/L，正十三烷200ml/L，泡敵500ppm，KNO37g/L，自來水配制，PH7.5，在110℃下滅菌30分鐘。發(fā)酵結(jié)束后用HCl調(diào)PH至3，用100ml乙醚提取，除去乙醚，得白色結(jié)晶，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定，計(jì)算二羧酸含量。結(jié)果DC12產(chǎn)量為85.2g/L，經(jīng)氣相色譜分析，DC12純度為97.46％。
實(shí)例2按照實(shí)例1的方法，只是正烷烴用nC15，結(jié)果DC15的產(chǎn)量為53.6g/L，純度為96.81％。
實(shí)例3按照實(shí)例1的方法，只是正烷烴用nC17，結(jié)果DC17的產(chǎn)量為52.0g/L，純度為97.2％。
實(shí)例4種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法同實(shí)例1，發(fā)酵培養(yǎng)基為KH2PO48g/L，NaCl1g/L，酵母膏2g/L，玉米漿1g/L，KNO37g/L，蔗糖15g/L，泡敵600ppm，尿素1.8g/L，正十三烷200ml/L，自來水配制，PH7.5，發(fā)酵4天，DC13產(chǎn)量為86.06g/L，DC13純度93.3％。
實(shí)例5種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法同實(shí)例一，發(fā)酵培養(yǎng)基同實(shí)例4。把培養(yǎng)兩天，經(jīng)鏡檢無雜菌的400LP-12-242種液接入裝有1500L發(fā)酵培養(yǎng)基，其中nC13300L經(jīng)121℃滅菌40分鐘的2500L發(fā)酵罐中，29℃，200轉(zhuǎn)/分，罐壓0.8Kg/cm2，通氣量1∶0.8，28小時(shí)以前，PH控制在6.8以下，28-60小時(shí)，PH控制在7.3以下，60小時(shí)后每隔8-6小時(shí)，用NaOH溶液調(diào)一次PH至7.5，從第三天開始，每天補(bǔ)加正十三烷120L，共3次，發(fā)酵6天多(161小時(shí))，發(fā)酵清液中十三碳二羧酸含量為205g/L。發(fā)酵結(jié)束后，加入300L自來水，加熱至80℃，加堿調(diào)PH至11，冷卻降溫至50℃，放入分層罐中靜置分層一天，放出上層殘油，回收使用，下層菌層通過壓濾，除去菌體，濾清液與中層清液合并，加入0.7％活性炭，90℃脫色15分鐘，壓濾除去活性炭，脫色濾清液打入酸化罐中，加水至DC13濃度為4％，加熱至70℃，加入濃HCl酸化至PH3，冷卻降溫至30℃左右，板框壓濾，空氣吹干，固形物在60℃烘干，得白色DC13249Kg，轉(zhuǎn)化率94.0％，純度為96.7％。
權(quán)利要求
1.一種利用微生物同步發(fā)酵正烷烴生產(chǎn)C11-C18各種長鏈α，ω-二元酸的方法，其特征在于以正十三烷(nC13)為基質(zhì)的培養(yǎng)基中，用熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)P-12-242，即CGMCC NO.0297發(fā)酵，然后回收所形成的二元酸。
2.熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)P-12-242即CGMCC NO.0297菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用微生物同步發(fā)酵正十三烷(nC
文檔編號C12P7/40GK1162644SQ9710387
公開日1997年10月22日 申請日期1997年4月4日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月4日
發(fā)明者陳遠(yuǎn)童, 龐月川, 郝秀珍 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所