專利名稱：：用于細(xì)菌對(duì)藥物敏感試驗(yàn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是一種醫(yī)學(xué)上對(duì)細(xì)菌作藥物敏感試驗(yàn)的方法。更具體的講是對(duì)活體形態(tài)的致病細(xì)菌進(jìn)行對(duì)藥物敏感試驗(yàn)的顯色/比色的方法。各種致病細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性各異。測(cè)定細(xì)菌對(duì)不同藥物的敏感程度，對(duì)于臨床治療中的用藥選擇，以便及時(shí)有效地控制感染，具有重要的意義。目前的細(xì)菌對(duì)藥物敏感性試驗(yàn)方法可有擴(kuò)散法和稀釋法兩類。擴(kuò)散法中常用的有紙片法、快速紙片法(用氯化三苯四氮唑的TTC法)等，都是在對(duì)試液作18～24小時(shí)的培養(yǎng)后，通過測(cè)定抑菌圈的大小來判定細(xì)菌對(duì)藥物是否敏感。這類方法通常只能作定性的測(cè)定，只有在與稀釋法相配合，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)的回歸分析得到其抑菌圈直徑與MIC(最小抑菌濃度)間相關(guān)關(guān)系的回歸方程后，才可用于定量檢測(cè)。稀釋法中有試管稀釋法、微量液體稀釋法等，雖可克服擴(kuò)散法的缺點(diǎn)，能作定量或半定量的MIC測(cè)定，但其同樣也都要有18～24小時(shí)的培養(yǎng)過程，并且是通過觀察菌液是否渾濁來判定結(jié)果，敏感性差，難以發(fā)現(xiàn)有10％的改變。本發(fā)明的目的是針對(duì)上述情況，提供一種能快速、準(zhǔn)確、方便和直觀地進(jìn)行細(xì)菌對(duì)藥物敏感試驗(yàn)的定性和定量的測(cè)定方法。本發(fā)明的用于細(xì)菌對(duì)藥物敏感試驗(yàn)的方法，是以pH7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液中配制成的濃度為5毫克/毫升的噻唑藍(lán)為檢測(cè)試劑。將菌懸液與標(biāo)準(zhǔn)濃度的抗菌素在35℃～37℃常規(guī)恒溫條件下保溫作用2～5小時(shí)后，按菌懸液∶檢測(cè)試劑體積比為20∶1的量與檢測(cè)試劑混合，菌懸液的起始濃度≥1.5×106/毫升，以其顯色反應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌對(duì)藥物敏感性的定性或定量的判定。具體的判定方法可以采用肉眼直接觀察法，或是用分光光度儀測(cè)定其光密度(OD)值的方法。如果采用肉眼直接觀察的方法，其所用試樣的菌懸液最小濃度可為1.5×106/毫升，與標(biāo)準(zhǔn)濃度抗菌素混合后，于35～37℃常規(guī)恒溫條件保溫2～5小時(shí)，再加入檢測(cè)試劑，于室溫條件下放置～10分鐘，直接觀察該混合試樣是否有藍(lán)色的顯色反應(yīng)。如試樣不顯藍(lán)色仍保持為無色狀態(tài)，表明其中無活菌存在；若顯藍(lán)色，則判定為有活菌存在。由于測(cè)試孔板通常均為白色，在此背景顏色下，這種藍(lán)色顯色反應(yīng)的細(xì)小變化都會(huì)極為明顯和易于觀察判別。因而其不僅可作為簡(jiǎn)單而直觀的定性判定，還能很容易按常規(guī)方法，通過直接觀察按常規(guī)抗菌素濃度梯度排列的各混合試樣的藍(lán)色顯色反應(yīng)，以與藍(lán)色試樣所鄰接的該未顯色試樣作出藥物最小抑菌濃度值的定量判定。如果采用儀器作定量判定，所用試樣菌懸液的起始濃度可為1×106/毫升。與標(biāo)準(zhǔn)濃度抗菌素混合后，于35～37℃常規(guī)恒溫條件保溫2～5小時(shí)，加入檢測(cè)試劑，于35℃～37℃常規(guī)恒溫條件下保溫30～60分鐘后，按菌液量∶二甲基亞砜體積比為1∶2加入二甲基亞砜并混勻，以分光光度儀測(cè)510～530納米，最好是520納米處的光密度值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，即可作出藥物最小抑菌濃度值的定量判定。噻唑藍(lán)的化學(xué)名稱為3-(4，5)-雙甲基-2-噻唑-(2，5)-二苯基溴化四氮唑鹽(簡(jiǎn)稱MTT)，呈黃色粉末?，F(xiàn)只在腫瘤的診斷治療中被用于對(duì)細(xì)胞毒測(cè)定、動(dòng)物細(xì)胞存活和增殖反應(yīng)等方面的測(cè)定。目前認(rèn)為其作用原理是基于黃色的MTT能被哺乳動(dòng)物活細(xì)胞中的線粒體脫氫酶，如琥珀酸脫氫酶和心肌黃酶等還原成藍(lán)色的甲臜(Formazan)，并且其生成量與活細(xì)胞的數(shù)量及活力成正比，死細(xì)胞或紅細(xì)胞沒有這種能力，活化的細(xì)胞比靜止的細(xì)胞能產(chǎn)生更多的甲瓚。從而通過比色分析方法可對(duì)細(xì)胞的數(shù)量及其代謝的強(qiáng)弱進(jìn)行測(cè)定分析。由于細(xì)菌與哺乳動(dòng)物的細(xì)胞是兩類完全不同的細(xì)胞，細(xì)菌為低等的原核細(xì)胞，沒有哺乳動(dòng)物細(xì)胞等高等真核細(xì)胞所特有的線粒體。因而這一反映細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及存活狀況的MTT染色法一直被認(rèn)為只能用于對(duì)人類等哺乳動(dòng)物的細(xì)胞檢測(cè)上。本發(fā)明通過對(duì)金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、普通變形桿菌、綠膿假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌等ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌等臨床分離菌株，細(xì)胞培養(yǎng)液的污染菌，腫瘤病人腹水中污染菌，雙歧桿菌等厭氧菌，以及一些霉菌等多種常見細(xì)菌進(jìn)行試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)菌的活細(xì)菌同樣可被MTT染成藍(lán)色，死細(xì)菌則不能被染色。活菌經(jīng)染色后顯微鏡觀察，菌體呈藍(lán)色，菌液亦呈藍(lán)色，其顏色深淺與菌液濃度成正相關(guān)；用分光光度儀比色分析的光密度(OD)值與菌液濃度成直線關(guān)系。為進(jìn)一步考察本發(fā)明上述方法測(cè)定的可靠性，對(duì)被測(cè)菌液試樣進(jìn)行了加熱處理對(duì)存活率影響的試驗(yàn)。用肉湯將金黃色葡萄球菌(ATCC25923)和大腸桿菌(ATCC)均稀釋成濃度為1×108/毫升后，分別在60℃溫度時(shí)加熱不同時(shí)間，以及在30分鐘內(nèi)以不同溫度加熱處理后，再按菌液量∶MTT檢測(cè)試劑＝20∶1的量加入上述檢測(cè)試劑，室溫下作用30分鐘，再按試樣體積的兩倍量加入二甲基亞砜并混勻，于520納米波長(zhǎng)比色的OD值計(jì)算兩種試驗(yàn)條件下各自的細(xì)菌存活率。試驗(yàn)結(jié)果分別如表1和表2所示。此結(jié)果顯示出，其藍(lán)色深淺及比色分析的OD值與加熱的溫度高低及作用時(shí)間長(zhǎng)短均成正相關(guān)。表160℃下不同加熱時(shí)間的細(xì)菌存活率試驗(yàn)結(jié)果</tables>表2不同溫度下加熱30分鐘的細(xì)菌存活率試驗(yàn)結(jié)果</tables>常用化學(xué)消毒劑，如甲醛、新潔爾滅、75％乙醇、詩(shī)樂氏、滅菌王等作用于菌液時(shí)，MTT加入其中后的顏色深淺及比色分析的OD值均與這些消毒劑的濃度及作用時(shí)間成正相關(guān)。以新潔爾滅為例，對(duì)上述同種菌液分別以不同濃度的新潔爾滅均處理60分鐘，和均以1％新潔爾滅處理不同時(shí)間后，按上述相同方法作加入MTT檢測(cè)試劑的處理后，于520納米波長(zhǎng)比色的OD值計(jì)算兩種試驗(yàn)條件下各自的細(xì)菌存活率試驗(yàn)結(jié)果，分別如表3和表4所示。試驗(yàn)還表明用臭氧處理時(shí)的情況與上述試驗(yàn)類似。表3不同濃度新潔爾滅處理60分鐘后的細(xì)菌存活率試驗(yàn)結(jié)果</tables>表41％新潔爾滅不同處理時(shí)間的細(xì)菌存活率試驗(yàn)結(jié)果</tables>上述的試驗(yàn)結(jié)果充分表明，以MTT作為檢測(cè)試劑，通過對(duì)細(xì)菌進(jìn)行藍(lán)色染色時(shí)，只有活細(xì)菌才被染色，死細(xì)菌則不被染色。這一結(jié)果與目前常規(guī)稀釋法的結(jié)果相同，因而本發(fā)明的這一MTT方法完全可以被應(yīng)用于對(duì)細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)的測(cè)定。通過多次重復(fù)試驗(yàn)，本發(fā)明方法的檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)穩(wěn)定，重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果幾乎完全一致，試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)率基本為100％。以本發(fā)明方法與常規(guī)稀釋法作測(cè)定M1C的平行試驗(yàn)，其所測(cè)MIC的吻合度達(dá)可95％，所顯示的細(xì)菌定性藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果(耐藥、中度敏感、極敏感)則完全一致，只是其MIC較常規(guī)方法低1-2個(gè)稀釋度。從而表明，本發(fā)明上述的MTT方法與目前的常規(guī)方法在對(duì)細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)時(shí)，可得到基本一致和吻合的檢測(cè)判定結(jié)果。由于本發(fā)明方法是以顯色方式進(jìn)行，并且所顯的藍(lán)色明顯和易于觀察分辨，可使其比目前常規(guī)所用的擴(kuò)散法和稀釋法具有多方面的優(yōu)越性。例如，目前上述常規(guī)方法測(cè)定的時(shí)間通常需18～24小時(shí)，本發(fā)明上述的MTT方法則不超過5小時(shí)；上述常規(guī)稀釋法對(duì)結(jié)果的判定是通過對(duì)各測(cè)試孔中菌液是否渾濁來實(shí)現(xiàn)，不直觀，本發(fā)明上述的MTT方法則是通過在各測(cè)試孔白色背景下的藍(lán)色顯色反應(yīng)實(shí)現(xiàn)；本發(fā)明MTT方法的準(zhǔn)確度和敏感性均非常高，對(duì)上述常規(guī)稀釋法檢測(cè)中不易判定的測(cè)試孔，通過加入MTT檢測(cè)試劑，觀察是否出現(xiàn)藍(lán)色即可準(zhǔn)確作出判定。因此本發(fā)明的上述MTT方法與目前的常規(guī)檢測(cè)方法相比，明顯具有更加快速、準(zhǔn)確、方便和直觀，特別是可以用方便的直接觀察方式作出定量性的判定的優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)方面具有極大的實(shí)用價(jià)值和意義。以下介紹的是作為對(duì)本發(fā)明上述內(nèi)容進(jìn)一步詳細(xì)說明的實(shí)例。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述的實(shí)例。各例中所用的MTT檢測(cè)試劑的配制方法為將市售的MTT溶解于pH7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液中，配制成濃度為5毫克/毫升的溶液，微孔濾膜(0.22微米)過濾后，于-20℃保存?zhèn)溆?。?以本發(fā)明方法與常規(guī)微量稀釋法對(duì)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC25932)的藥物敏感狀況作對(duì)照試驗(yàn)。常規(guī)微量稀釋法，采用由華神藥業(yè)股份有限公司研制的“華神藥敏檢測(cè)試劑盒”，按其說明書規(guī)定的方法操作。培養(yǎng)22小時(shí)后觀察孔中試樣是否渾濁。本發(fā)明方法在該藥敏板上已有標(biāo)準(zhǔn)濃度抗菌素的各孔中均加入濃度為1.5×106/毫升的菌液，于35～37℃常規(guī)孵育5小時(shí)后，測(cè)試板的各孔中分別均加入上述備用的MTT檢測(cè)試劑5微升混合，于室溫條件下放置10～30分鐘，用眼直接觀察孔中試樣是否顯藍(lán)色。兩種方法的試驗(yàn)結(jié)果及判定結(jié)論如表5所示。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種方法雖在某些藥物的具體MIC值上略有小的差異，但對(duì)細(xì)菌的藥物敏感性判定結(jié)論則是完全一致的。例2以本發(fā)明方法與常規(guī)微量稀釋法對(duì)陰溝腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC23355)的藥物敏感狀況作對(duì)照試驗(yàn)。常規(guī)微量稀釋法的操作同上例，培養(yǎng)24小時(shí)后觀察孔中試樣是否渾濁。本發(fā)明方法的操作也同上例，培養(yǎng)5小時(shí)并加入檢測(cè)試劑后，觀察孔中試樣是否顯藍(lán)色。兩種方法的試驗(yàn)結(jié)果及判定結(jié)論如表6所示。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種方法雖在某些藥物的具體MIC值上略有小的差異，但對(duì)細(xì)菌的藥物敏感性判定結(jié)論同樣也是完全一致的。表5兩種方法對(duì)金黃色葡萄球菌的藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果</tables>表6兩種方法對(duì)陰溝腸桿菌的藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果權(quán)利要求1.一種用于細(xì)菌對(duì)藥物敏感試驗(yàn)的方法，其特征在于以pH7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液中配制成的濃度為5毫克/毫升的噻唑藍(lán)為檢測(cè)試劑，將菌懸液與標(biāo)準(zhǔn)濃度的抗菌素在35℃～37℃常規(guī)恒溫條件下保溫作用2～5小時(shí)后，按菌懸液∶檢測(cè)試劑體積比為20∶1的量與檢測(cè)試劑混合，菌懸液的起始濃度≥1.5×106/毫升，以其顯色反應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌對(duì)藥物敏感性的判定。2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌對(duì)藥物敏感試驗(yàn)的方法，其特征在于所說的菌懸液起始濃度為1.5×106/毫升，與標(biāo)準(zhǔn)濃度抗菌素混合于35～37℃常規(guī)恒溫條件保溫2～5小時(shí)，再加入檢測(cè)試劑于室溫條件下放置～10分鐘后，直接觀察各混合試樣，以有藍(lán)色顯色反應(yīng)作為有活菌存在的定性判定。3.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌對(duì)藥物敏感試驗(yàn)的方法，其特征在于所說的菌懸液濃度為1.5×106/毫升，與標(biāo)準(zhǔn)濃度抗菌素混合于35～37℃常規(guī)恒溫條件保溫2～5小時(shí)，再加入檢測(cè)試劑于室溫條件下放置～10分鐘后，直接觀察按常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)抗菌素濃度梯度排列的各混合試樣的藍(lán)色顯色反應(yīng)，以與藍(lán)色顯色試樣所鄰接的該未顯色試樣作藥物最小抑菌濃度值的定量判定。4.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌對(duì)藥物敏感試驗(yàn)的方法，其特征在于所說的菌懸液濃度為1×106/毫升，與標(biāo)準(zhǔn)濃度抗菌素混合于35～37℃常規(guī)恒溫條件保溫2～5小時(shí)，再加入檢測(cè)試劑繼續(xù)保溫30～60分鐘后，按菌液量∶二甲基亞砜體積比為1∶2加入二甲基亞砜并混勻，以分光光度儀510～530納米處的光密度值作藥物最小抑菌濃度值的定量判定。5.如權(quán)利要求4所述的細(xì)菌對(duì)藥物敏感試驗(yàn)的方法，其特征在于以所說的分光光度儀的520納米處的光密度值作藥物最小抑菌濃度值的定量判定。全文摘要本發(fā)明涉及的是一種用于細(xì)菌對(duì)藥物敏感試驗(yàn)的方法。以pH7.2—7.4的磷酸鹽緩沖液中配制成的濃度為5毫克/毫升的噻唑藍(lán)為檢測(cè)試劑,將菌懸液與標(biāo)準(zhǔn)濃度的抗菌素在35℃～37℃常規(guī)恒溫條件下保溫作用2～5小時(shí)后,按菌懸液:檢測(cè)試劑體積比為20∶1的量與檢測(cè)試劑混合,菌懸液的起始濃度≥1.5×10文檔編號(hào)C12Q1/06GK1178838SQ9710776公開日1998年4月15日申請(qǐng)日期1997年11月5日優(yōu)先權(quán)日1997年11月5日發(fā)明者劉曉波申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院