專利名稱：利用合成基因在酵母菌中生產(chǎn)草魚生長激素的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及養(yǎng)魚業(yè)，特別涉及利用酵母菌大量生產(chǎn)淡水魚生長激素和將其用于魚類養(yǎng)殖的方法。
淡水養(yǎng)殖在我國水產(chǎn)業(yè)中占有重要位置。以配合飼料進行集約化養(yǎng)殖代替自然放養(yǎng)已獲得明顯的經(jīng)濟效益，并已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展趨勢。為提高養(yǎng)殖魚類的生長速度和產(chǎn)量，高蛋白含量的魚粉、動物血粉、植物蛋白等已廣泛用于配合飼料生產(chǎn)，而類固醇類激素也已用于飼料添加劑以促進魚類生長(美國專利#4,210,634,1980)。但由于類固醇類激素在魚代謝中不易被降解，可能在被食用后引入人體，因而引起人們憂慮。
多肽生長激素具有調(diào)節(jié)和促進生長的作用，是脊椎動物(包括魚類)體內(nèi)固有的成分，并可在動物體內(nèi)自動降解而不影響人類食用。多種有經(jīng)濟價值的海魚生長激素基因已被克隆，我們克隆了生長最快的淡水養(yǎng)殖魚草魚的生長激素基因(Zhu et al,1992.Eur.J.Biochem.206.643-648)。已有報道，用含有虹鱒生長激素的酵母飼喂幼魚后，幼魚生長加快，無論體重和體長都大于對照魚(Tsai et al,1994.The Prgressive Fish-culturist,56,7-12)。我們的初步研究發(fā)現(xiàn)，用草魚生長激素直接浸泡魚苗，亦可促進其生長。但至今尚未有用酵母生產(chǎn)淡水魚類生長激素和將其用于魚類養(yǎng)殖的報道和專利。
南韓Lucky Ltd公司Cho等人的專利(美國的專利#5,270,180,1993)敘述了用合成基因在酵母中生產(chǎn)鮭魚生長激素，鮭魚生長激素含量可達50mg/l培養(yǎng)物，(OD550=15)，比相應DNA重組基因在酵母中的表達水平明顯提高。但由于鮭魚生長激素分子與淡水魚的差異較大，影響在淡水魚養(yǎng)殖上的應用。
本發(fā)明的目的是合成草魚生長激素基因，并在酵母菌中高效表達，大量生產(chǎn)草魚生長激素，以用于淡水漁業(yè)和提高其生產(chǎn)效益。
技術(shù)方案根據(jù)天然草魚生長激素多肽的氨基酸順序，設計適合在酵母菌表達的該基因的DNA編碼順序。為此，首先合成一系列的寡聚脫氧核糖核酸，采用多聚酶鏈式反應(PCR)技術(shù)進行草魚生長激素基因人工合成。在此基礎上，將此基因克隆在酵母基因表達系統(tǒng)，使之與酵母染色質(zhì)DAN整合，并篩選高基因拷貝和高表達的酵母株。提取其總蛋白，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳和染色掃描后，分析草魚生長激素占酵母細胞總蛋白的量。經(jīng)氨基酸順序分析，測酵母菌株生產(chǎn)的草魚生長激素多肽與天然多肽的一致性。經(jīng)多代培養(yǎng)鑒定，測該基因表達水平的穩(wěn)定性。
有益效果1、草魚生長激素基因表達產(chǎn)物占酵母菌總蛋白的12％，其中50-60為水溶性蛋白；2、酵母菌生產(chǎn)的草魚生長激素多肽與天然多肽相同；3、經(jīng)50代培養(yǎng)鑒定，該基因表達水平持續(xù)穩(wěn)定；4、將含有合成草魚生長激素的酵母作魚飼料添加劑喂幼魚，或用其它方法處理魚苗，能促進其生長，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖效益。
附

圖1根據(jù)天然草魚生長激素基因氨基酸順序，合成16個寡聚脫氧核糖核酸；附圖216個寡聚脫氧核糖核酸在合成基因中的位置及兩端的EcoRl酶切位點；附圖3合成的草魚生長激素基因DNA順序及相應氨基酸順序；附圖4用于在酵母表達的草魚生長激素基因重組質(zhì)粒pGGH。PGAP為Glyceroldehyde-3-phosphate dehydrogenase基因啟動子，GH為草魚生長激素合成基因；附圖5草魚生長激素合成基因表達產(chǎn)物的SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳。“1”和“4”為蛋白分子量，“2”為未克隆基因的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母的蛋白提取物，“3”為合成基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母的蛋白提取物，箭頭標示生長激素區(qū)帶。
方法與步驟1、根據(jù)天然草魚生長激素合成的16個寡聚脫氧核糖核酸的順序見圖1。其中8個為正向順序，另8個為“搭橋”反向順序，該基因5’端和3’端分別附有EcoR1酶切位點，見圖2。
2、進行PCR反應的100μ1溶液中含上述16個寡聚脫氧核糖核酸各5μmol,dATP,dCTP,dGTP和dTTPg各0.5μmol,Tris-HCl(pH9.3)25μmol,KCl50μmol,MgCl22μmol,β-巰基乙醇1μmol,Taq DNA聚合酶2.5單位。PCR反應在Perkin-Elmer2400型反應器進行，反應為30周期，每周期程序是95℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘，74℃1分鐘。PCR產(chǎn)物克隆在pGEM-T載體上，并測定合成基因的DNA順序，見圖3。
3、合成生長激素基因DNA經(jīng)EcoR1消化后，與預先經(jīng)EcoR1消化的表達載體pGAPZA(Invitrogen Inc.)DNA連接(14℃16h)。連接后的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并大量制備重組基因pGGH DNA，見圖4。
4、用Invitrogen Inc.Ⅱ型電脈沖儀將pGGH DNA導入酵母宿主細胞，用含Zeocin的YPD培養(yǎng)基篩選，獲得高拷貝轉(zhuǎn)化株。YPD培養(yǎng)基組成為1％酵母提取物，2％水解干酪素，2％D-葡萄糖。Zeocin為Invitrogen Inc.產(chǎn)品，篩選使用濃度為100、500、1000、2000和3000μg/ml。
5、含拷貝pGGH基因酵母轉(zhuǎn)化株經(jīng)Southerm blot,Northerm blot鑒定后，在YD培養(yǎng)基(1％酵母提取物，0.5％D-葡萄糖)、30℃震蕩培養(yǎng)，并于24、48、72和96小時取樣檢查草魚生長激素表達產(chǎn)物的產(chǎn)量。
6、用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳及蛋白質(zhì)區(qū)帶轉(zhuǎn)移技術(shù)，以兔抗草魚生長激素IgG鑒定表達產(chǎn)物。結(jié)果表明，草魚生長激素基因表達產(chǎn)物占酵母菌總蛋白的12％左右，其中50-60-為水溶性蛋白，見圖5。
權(quán)利要求
1.一種利用合成基因在酵母菌中生產(chǎn)草魚生長激素的方法，其特征是A、16個寡聚脫氧核糖核酸的順序，其中8個為正向順序，另8個為“搭橋”反向順序，該基因5’端和3’端分別附有EcoR1酶切位點；B、人工合成的草魚生長激素基因克隆在表達載體pGAPZA中，構(gòu)成重組質(zhì)粒pGGH DNA；C、用電脈沖方法將pGGH DNA導入酵母宿主細胞并使之與染色質(zhì)整合；D、篩選高拷貝整合和高表達的酵母菌轉(zhuǎn)化株。
全文摘要
根據(jù)天然草魚生長激素多肽的氨基酸順序,設計了適合其在酵母表達的DNA編碼順序,采用PCR技術(shù)完成了草魚生長激素基因人工合成。在此基礎上,將此基因克隆在酵母基因表達系統(tǒng),使之與酵母染色質(zhì)DNA整合,并篩選高基因拷貝和高表達的酵母株。該菌株表達的草魚生長激素占酵母細胞總蛋白的12%,經(jīng)氨基酸順序分析表明酵母所生產(chǎn)的草魚生長激素多肽與天然多肽相同,該基因表達水平持續(xù)穩(wěn)定,可應用于漁業(yè)和提高水產(chǎn)養(yǎng)殖效益。
文檔編號C12N15/81GK1216320SQ9710929
公開日1999年5月12日 申請日期1997年11月5日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月5日
發(fā)明者朱作言, 吳石君, 汪亞平, 劉漢勤 申請人:中國科學院水生生物研究所, 吳石君