專利名稱：Dna的回收方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于微生物中含有的DNA的回收方法。
在基因工程的領(lǐng)域中，常常需要使大腸桿菌等微生物進(jìn)行性狀轉(zhuǎn)變，培養(yǎng)所得到的性狀轉(zhuǎn)變體、從復(fù)制擴(kuò)增的性狀轉(zhuǎn)變體回收所希望的質(zhì)粒DNA。
但是，從性狀轉(zhuǎn)變體回收、純化質(zhì)粒DNA需要很多道工序，要花費(fèi)工夫。因此，有人提出了更簡(jiǎn)單地回收、純化質(zhì)粒DNA的方法。
例如，在特開平4-360686中公開了，通過膜濾器從將微生物菌體進(jìn)行溶菌的溶液中除去溶液中的不溶物，接著利用超濾除去雜質(zhì)，然后將DNA濃縮的質(zhì)粒DNA和/或粘接DNA的純化方法。
再有，在特開平8-23976中公開了，利用平均孔徑10nm-35nm的過濾器，從質(zhì)粒混合液中除去雜質(zhì)的超卷曲狀質(zhì)粒DNA的純化方法。
但是，在用這些方法純化的DNA中，在微生物菌體中還含有與DNA同時(shí)含有的RNA，為了只回收DNA，需要另外的RNA分解工序。
作為分離RNA和DNA的方法，已經(jīng)知道同時(shí)使用DNA吸附性載體和離液序列高的溶液的方法(離液序列高的離子法)(R.Roomet al，J.Clin.MicroBiol。Vol.28，No.3，P495-503)。利用該方法除去微生物菌體中與DNA同時(shí)含有的RNA，僅純化DNA的方法，在特開平7-250681中已被揭示。
該方法是包括下述工序的質(zhì)粒DNA的提取純化方法，即將性狀轉(zhuǎn)變體培養(yǎng)液集菌在第1DNA提取純化用濾筒中的工序；溶菌及不要的RNA的分離工序；利用第1DNA提取純化用濾筒過濾雜質(zhì)的工序；用第2DNA提取純化用濾筒進(jìn)行吸附、洗凈、溶出DNA的工序。
但是，該方法必須使用2個(gè)濾筒，而且上述第1DNA提取純化用濾筒至少具有捕集過濾器和膜濾器，第2DNA提取純化用濾筒至少具有玻璃纖維濾器和玻璃粉末層及膜濾器，與簡(jiǎn)單的過濾器相比，其構(gòu)造十分復(fù)雜。另外，該方法使用上述的2個(gè)過濾筒，需要幾次反復(fù)進(jìn)行溶液的供給和排出(利用吸引)。
因此，本發(fā)明的目的是，提供利用離液序列高的離子法、使用構(gòu)造更簡(jiǎn)單的器具、通過較少的操作來回收純化的DNA的方法。
本發(fā)明是關(guān)于DNA的回收方法(第1方法)，該方法是將微生物菌體進(jìn)行溶菌，使游離的DNA吸附在載體上，回收吸附在載體上的DNA的方法，其特征在于，該方法由下列工序組成在上述載體的存在下，將微生物菌體進(jìn)行溶菌，而且將溶菌所得到的DNA吸附在上述載體上的工序；從上述載體中分離用于溶菌和吸附的溶液的工序；以及用DNA溶出用溶液使吸附在上述載體上的DNA溶出而回收的工序。
另外，本發(fā)明是關(guān)于DNA的回收方法(第2方法)，該方法是將微生物菌體進(jìn)行溶菌，使游離的DNA吸附在載體上，回收吸附在載體上的DNA的方法，其特征在于，該方法由下列工序組成向在具有溶液保持能力和在吸引時(shí)具有溶液滲透能力的膜濾器上設(shè)置載體的柱上供給微生物菌體的工序；接著，將上述柱中的微生物菌體溶菌，而且使由溶菌得到的DNA吸附在上述載體上的工序；利用吸引從柱中除去在前面的工序中用于溶菌和吸附的溶液的工序；向柱供給DNA溶出用溶液，進(jìn)行吸引而回收吸附在上述載體上的DNA的工序。
以下說明本發(fā)明。
本發(fā)明的第1方法和第2方法都是將微生物菌體溶菌，使游離的DNA吸附在載體上，回收吸附在載體上的DNA的方法。
對(duì)本發(fā)明方法的對(duì)象-微生物菌體沒有特別的限制，只要是包含目的DNA的微生物菌體就可以。例如可以是將作為目的的DNA導(dǎo)入縮主微生物的性狀轉(zhuǎn)變體。
本發(fā)明方法中的(1)微生物菌體的溶菌和(2)游離DNA向載體吸附和溶出各自是公知的方法。
然而本發(fā)明方法的特征是，在一個(gè)槽(pot)中進(jìn)行上述微生物菌體的溶菌和游離DNA向載體的吸附。
本發(fā)明的第1方法是，在載體存在下，濃次向微生物菌體中添加溶菌用溶液和DNA吸附用溶液，使DNA吸附在上述載體上，或者在載體存在下，向微生物菌體中依次添加溶菌用溶液和中和及DNA吸附用溶液，使DNA吸附在上述載體上。
在含有離液序列高的離子的DNA吸附用溶液存在下，玻璃吸附DNA，但不吸附RNA(R.Room et al.，J.Clin.MicroBiol.Vol.28，No.3，P495-503)。作為載體，可以從玻璃、硅膠、陰離子交換樹脂、羥基磷灰石和DiatomaceousEarth之類的硅藻土制品中選擇。對(duì)載體的形狀不加特別限制，但以具有吸附用的大表面積者為佳。載體例如可以是篩網(wǎng)過濾器、有孔玻璃殊或粉末。例如，載體可以是玻璃過濾器、有孔玻璃珠或玻璃粉末。
DNA吸附用溶液是含有離液序列高的離子的溶液。另外，溶菌用溶液可由菌體的細(xì)胞壁分解溶液(溶液I)、堿-離子化表面活性劑溶液(溶液II)和中和液(溶液III)組成，或者可由菌體的細(xì)胞壁分解溶液(溶液I)和堿-離子化表面活性劑溶液(溶液II)組成。但是，在后者的場(chǎng)合(溶菌用溶液由溶液I和溶液II組成的場(chǎng)合)，使用含有中和劑和離液序列高的離子的單一溶液即中和及DNA吸附用溶液。
菌體的細(xì)胞壁分解溶液(溶液I)具有使菌體原生質(zhì)球化的作用，例如可舉出Tris-EDTA-葡萄糖-溶菌酶水溶液(溶液I)。另外，堿-離子化表面活性劑溶液(溶液II)具有使菌體的膜和蛋白質(zhì)溶解而進(jìn)行溶菌，同時(shí)使DNA變性的作用，例如可舉出NaOH-SDS水溶液(溶液II)。中和液(溶液III)具有中和利用溶液II成為堿性的溶液的作用，例如可舉出乙酸鉀水溶液。可以向菌體中依次添加這三種或二種溶液進(jìn)行溶菌。根據(jù)菌體的種類和量，適當(dāng)決定各溶液的濃度和使用量。
作為中和及DNA吸附用溶液，使用含有中和劑(例如乙酸鉀)和離液序列高的離子的溶液，可以與溶液的中和同時(shí)進(jìn)行DNA的吸附，具有能縮短處理時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)。另外，作為DNA吸附用溶液使用含有中和劑和離液序列高的離子的溶液時(shí)，將溶液的pH調(diào)整在6-12的范圍，從防止混入RNA的角度考慮是有利的。但是，該pH范圍因?yàn)橐踩Q于離子強(qiáng)度，所以可以根據(jù)條件適當(dāng)決定。再者，為了防止RNA的混入，也可以向溶液1中添加核糖核酸酶。
另外，作為DNA吸附用溶液和中和及DNA吸附用溶液的含有離液序列高的離子的溶液，例如可舉出含有LiClO4、KI、NaI、LiCl、NaCO2H、鹽酸胍等的水溶液。離液序列高的溶液的濃度和用量可以根據(jù)菌體的種類和數(shù)量適當(dāng)決定。DNA吸附用溶液或者中和及DNA吸附用溶液，在載體存在下，再添加到與先添加溶菌用溶液的菌體混合的混合物中。添加DNA吸附用溶液后，從菌體中溶解的DNA被吸附在載體上。
本發(fā)明的特征在于，被添加的上述各溶液，不需要分離除去先前添加的溶液，只要依次注入添加即可、不需要合適添加，不必要分離溶液。
再有，在添加一種溶液后，例如放置1秒至60分鐘后，添加下一種溶液來進(jìn)行各溶液的添加，從可靠地進(jìn)行各操作的觀點(diǎn)看，這是合適的。
接著使吸附DNA的載體與溶液分離。可以用傾濾、離心分離、過濾等方法進(jìn)行載體與溶液的分離。從溶液中分離出的載體，根據(jù)需要可以進(jìn)行洗凈、干燥。在洗凈時(shí)例如可以使用Tris-EDTA-NaCl/乙醇混合液、乙醇、乙醇/丙三醇混合液等。
接著，用DNA溶出用溶液使吸附在上述載體上的DNA溶出而進(jìn)行回收。DNA溶出用溶液，例如可以使用Tris-EDTA緩沖液。
本發(fā)明的第2方法，使用在具有溶液保持能力和在吸引時(shí)具有溶液滲透能力的膜濾器上設(shè)置載體的柱。使用該柱，可以更簡(jiǎn)便地進(jìn)行分離回收操作。在同時(shí)并行處理少量、多個(gè)樣品的場(chǎng)合，可以將多個(gè)柱捆扎在一起使用。另外，在具有數(shù)個(gè)貫通孔的平板的一方開口中設(shè)置膜濾器，在穴(小井)中填充載體，可以作為柱使用。
膜濾器，只要是具有溶液保持能力和在吸引時(shí)具有溶液透過能力者就可以使用，沒有特別限制?？梢灾苯邮褂檬惺鄣哪V器。另外，載體可以使用與上述第1方法中所說的相同的載體。柱的大小和形狀等，可以考慮處理菌的量和溶液的量適當(dāng)決定。
向上述柱中供給微生物菌體。供給的微生物菌體可以通過另外的過濾或離心分離等從培養(yǎng)液中分離出的微生物菌體，但是含有微生物菌體的培養(yǎng)液可原封不動(dòng)地供給上述柱，吸引培養(yǎng)液，通過用膜濾器捕集微生物菌體，可以供給微生物菌體。
隨后，向上述柱中依次添加溶菌用溶液和DNA吸附用溶液，使DNA吸附在上述載體上，或者向上述柱中依次添加溶菌用溶液和中和及DNA吸附用溶液，使DNA吸附在上述載體上。這里所使用的溶菌用溶液、DNA吸附用溶液和中和及DNA吸附用溶液，與在上述第1方法中所說明的相同。如上所述，本發(fā)明的特征是，向柱中添加的各溶液，不需要分離除去先前添加的溶液而原封不動(dòng)地依次注入添加，不需要合適的添加，不需要分離溶液。
在全部溶液的添加結(jié)束后，通過經(jīng)過膜濾器的吸引，從柱中除去溶液。這樣，菌體的殘?jiān)粼跒V器上，并且DNA也吸附在載體上，殘留在濾器上。接著，根據(jù)需要，將包含載體的柱洗凈，除去游離的RNA和蛋白質(zhì)等夾雜物后，可進(jìn)行干燥。從提高所回收的DNA的純度的觀點(diǎn)看，最好進(jìn)行上述洗凈。洗凈例如可以使用Tris-EDTA-NaCl/乙醇混合液、乙醇、乙醇/丙三醇混合液等。
接著，向柱供給DNA溶出用溶液，并進(jìn)行吸引，回收吸附在上述載體上的DNA。DNA溶出用溶液，例如可以使用Tris-EDTA緩中液。
本發(fā)明的第1方法和第2方法都由三個(gè)工序組成，即依次添加溶菌用溶液和DNA吸附用溶液或者中和及DNA吸附用溶液的工序；從溶液中分離載體的工序；以及從載體中溶出DNA的工序，通過這三個(gè)工序可以從微生物菌體回收DNA。另外，從提高回收到的DNA的純度的觀點(diǎn)看，在DNA的溶出工序之前設(shè)置夾雜物的洗凈工序是有利的。
利用本發(fā)明的方法回收的DNA是二根鏈的環(huán)狀質(zhì)粒DNA，粘粒DNA、Bacterial Artificial Chromosome (BAC)、Pl-derived ArtificialChromosome(PAC)也包括在質(zhì)粒DNA中。
以下，通過實(shí)施例詳細(xì)地說明本發(fā)明。
實(shí)施例1在含有100μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中將大腸桿菌SOLR菌株培養(yǎng)一夜，該菌株具有插入來自小鼠的5.6Kb的cDNA的質(zhì)粒pBluescript Sk(+)。將其中的0.6ml培養(yǎng)液移到96孔的玻璃濾器和用膜封閉的小井中，通過吸引過濾培養(yǎng)液，將菌體集中在玻璃濾器中。向含有菌體的各井中添加25μl的溶液(50mmol葡萄糖、25mmol三鹽酸緩沖液(pH8.0)、10mmol EDTA、10mg/ml(溶菌酶)，放置5分鐘。然后，添加50μl的溶液II(0.2N氫氧化鈉、1％十二烷基硫酸鈉)，放置5分鐘后，加入37.5μl的溶液III(3mol乙酸鉀(pH4.8))，放置5分鐘。再添加120μl的7mol胍基鹽酸鹽溶液(吸附用溶液)，通過吸引進(jìn)行過濾。
接著，添加300μl的洗凈緩沖液(100mmol三鹽酸鹽緩沖液(pH8.0)、5mmolEDTA、0.2mol氧化鈉、60％乙醇)，通過吸引進(jìn)行2次過濾過程，以300μl的80％乙醇進(jìn)行1次，以300μl的100％乙醇進(jìn)行1次。此后，進(jìn)行20分鐘的吸引，干燥玻璃濾器上的質(zhì)粒DNA，最后添加25-50μl的65％加溫的TE緩沖液(10mmol三鹽酸鹽(pH8.0)、1mmol EDTA)，通過吸引使質(zhì)粒DNA溶出。
通過這樣的操作，可以得到4-6μg的質(zhì)粒DNA。另外，其純度，相對(duì)于280nm的260nm的吸光度比高2左右，即使在利用雙脫氧法的DNA堿基序列決定法中使用也能充分使用。
實(shí)施例2
在含有100μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中將大腸桿菌SOLR菌株培養(yǎng)一夜，該菌株具有插入來自小鼠的5.6Kb的cDNA的質(zhì)粒pBluescript SK(+)。將其中0.6ml的培養(yǎng)液移到96孔的玻璃濾器和以膜封閉的井中，通過吸引過濾培養(yǎng)液，使菌體集中在玻璃濾器中。向含有菌體的各井中添加25μl的溶液I(50mmol葡萄糖、25mmol三鹽酸緩沖液(pH8.0)、10mmol EDTA、10mg/ml溶菌酶)，放置5分鐘。此后，添加50μl的溶液II(0.2N氫氧化鈉、1％十二烷基硫酸鈉)，放置5分鐘后，添加160μl的中和及吸附用溶液(0.7mol乙酸鉀(pH4.8)、5.3mol胍基鹽酸鹽溶液)，放置5分鐘。
接著，從井中通過吸引過濾混合溶液后，用300μl的80％乙醇洗凈3次，用300μl的80％乙醇-20％丙三醇洗凈1次。此后，進(jìn)行20分鐘吸引，干燥玻璃濾器上的質(zhì)粒DNA，最后添加25-50μl的65％加溫的TE緩沖液(10mmol三鹽酸(pH8.0)、1mol EDTA)，進(jìn)行吸引而溶出質(zhì)粒DNA。
通過這樣的操作，可以得到4-6μg的質(zhì)粒DNA。另外，其純度，相對(duì)于280nm的260nm的吸光度比高2左右，即使在利用雙脫氧法的DNA堿基序列決定法中使用也沒有問題。另外，作為吸附用溶液，使用乙酸鉀和胍鹽酸鹽的混合溶液，因此與實(shí)施例1相比，處理時(shí)間可以縮短約15分鐘。另外，在洗凈時(shí)使用80％乙醇、20％丙三醇，與使用100％乙醇的實(shí)施例1相比，向在溶出中使用TE緩沖液的玻璃濾器的浸透良好，看到質(zhì)粒DNA的回收量有某些改進(jìn)的優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例3代替玻璃濾器，使用硅藻土(BiO RAD ∞&Ltd.)、玻璃粉(リケン)、多孔質(zhì)高表面積玻璃(Bio101)或者陰離子交換樹脂(Qiagen)作為載體，除此之外，反復(fù)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作，各載體上得到4-6μg的質(zhì)粒DNA。4-6μg的質(zhì)粒DNA是最大收獲量，因此上述收獲量與實(shí)施例1是同等程度。每mg載體的質(zhì)粒DNA的收獲量，與載體的表面積成正比，下面示出每10mg載體的質(zhì)粒DNA的回收率。
硅藻土(Bio RAD ∞&Ltd.)15-20μg玻璃粉末(リケン) 5μg多孔質(zhì)高表面積玻璃(Bio101) 10-20μg陰離子交換樹脂(Qiagen) 5μg
權(quán)利要求
1.DNA的回收方法，該方法是將微生物菌體溶菌，使游離的DNA吸附在載體上，回收吸附在載體上的DNA的方法，其特征在于，由以下工序組成在上述載體存在下，將微生物菌體進(jìn)行溶菌，使由溶菌得到的DNA吸附在上述載體上的工序；將用于溶菌和吸附的溶液從上述載體分離的工序；以及用DNA溶出用溶液使吸附在上述載體上的DNA溶出并回收的工序。
2.DNA的回收方法，該方法是將微生物菌體溶菌，使游離的DNA吸附在載體上，回收吸附在載體上的DNA的方法，其特征在于，由以下工序組成向在具有溶液保持能力和在吸引時(shí)具有溶液透過能力的膜濾器上設(shè)置載體的柱供給微生物菌體的工序；接著，將上述柱中的微生物菌體溶菌，而且使由溶菌得到的DNA吸附在上述載體上的工序；通過吸引將前面的工序中用于溶菌和吸附的溶液從柱中除去的工序；向柱供給DNA溶出用溶液，進(jìn)行吸引而回收吸附在上述載體上的DNA的工序。
3.權(quán)利要求2所述的DNA回收方法，其特征在于，通過供給含有微生物菌體的培養(yǎng)液、接著吸引該培養(yǎng)液、用膜濾器捕集微生物菌體，進(jìn)行微生物菌體的供給。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的DNA回收方法，其特征在于，向微生物菌體中依次添加溶菌用溶液和DNA吸附用溶液，使DNA吸附在載體上。
5.權(quán)利要求4所述的DNA的回收方法，其中，溶菌用溶液由菌體的細(xì)胞壁分解溶液(溶液I)、堿-離子化表面活性劑溶液(溶液II)和中和液(溶液III)組成，DNA吸附用溶液是含有離液序列高的離子的溶液。
6.權(quán)利要求5所述的DNA回收方法，其中，溶液I是Tris-EDTA-葡萄糖-溶菌酶水溶液，溶液II是NaOH-SDS水溶液，溶液III是乙酸鉀水溶液。
7.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的DNA回收方法，其特征在于，向微生物菌體中依次添加溶菌用溶液和中和及DNA吸附用溶液，使DNA吸附在載體上。
8.權(quán)利要求7所述的DNA回收方法，其中，溶菌用溶液由菌體的細(xì)胞壁分解溶液(溶液I)和堿-離子化表面活性劑溶液(溶液II)組成，中和及DNA吸附用溶液是含有中和劑和離液序列高的離子的單一溶液。
9.權(quán)利要求8所述的DNA回收方法，其中，溶液I是Tris-EDTA-葡萄糖-溶菌酶水溶液，溶液II是NaOH-SDS水溶液，中和及DNA吸附用溶液是含有乙酸鉀和離液序列高的離子的溶液。
10.權(quán)利要求5或8所述的DNA回收方法，其中，溶液I含有核糖核酸酶。
11.權(quán)利要求7所述的DNA回收方法，其中，中和及DNA吸附用溶液被調(diào)整到pH6-12的范圍。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的DNA回收方法，其特征在于，用DNA溶出用溶液洗凈溶出前的載體，并進(jìn)行干燥。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的DNA回收方法，其中，載體選自玻璃、硅膠、陰離子交換樹脂、羥基磷灰石和硅藻土。
14.權(quán)利要求13所述的DNA回收方法，其中，載體是篩網(wǎng)過濾器、珠球或粉末。
全文摘要
回收純化的DNA的方法。其一是在載體存在下使微生物菌體溶菌,使由溶菌得到的DNA吸附在載體上;將溶菌和吸附用的溶液與載體分離;用可使DNA溶出的溶液使吸附于載體上的DNA溶出而回收。另一法是,向裝有膜濾器和載體的柱供給微生物菌體;將柱中的微生物菌體溶菌,使由溶菌得到的DNA吸附在載體上;由柱中除去溶菌和吸附用的溶液;將可使DNA溶出用溶液加入柱中,對(duì)載體上的DNA進(jìn)行吸引回收。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1187538SQ97114849
公開日1998年7月15日 申請(qǐng)日期1997年6月18日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月18日
發(fā)明者林崎良英 申請(qǐng)人:理化學(xué)研究所