專利名稱：重組魚生長(zhǎng)激素基因工程酵母菌pichia pastoris的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組魚生長(zhǎng)激素基因工程酵母菌Pichia Pastoris的構(gòu)建。
在國(guó)內(nèi)外報(bào)導(dǎo)的關(guān)于魚生長(zhǎng)激素的基因工程菌的工作，大部分是在大腸桿菌E.coli中完成的。雖然大腸桿菌在基因工程領(lǐng)域被廣泛地選用，但是由于它屬于原核生物，對(duì)真核生物蛋白的正確表達(dá)存在一定的缺陷并最終影響產(chǎn)物活性。而酵母作為異源蛋白的表達(dá)宿主，克服了大腸桿菌的缺點(diǎn)，體現(xiàn)在表達(dá)蛋白可以正確折疊、糖基化，具有活性。此外，酵母在食品工業(yè)中常用作飼料。因而酵母適合作為魚生長(zhǎng)激素的表達(dá)宿主。早期工作大多集中在釀酒酵母(S.cerevisiae)，1989年，Hayami就構(gòu)建金槍魚的生長(zhǎng)激素釀酒酵母工程菌(Agric.Biol.Chem，Vol53)。但是它易丟失帶有外源片斷的載體，或啟動(dòng)子不理想，甚至難于進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)培養(yǎng)，而甲基營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母Pichia Pastoris能彌補(bǔ)該不足，利用AOX I(乙醇氧化酶基因)的強(qiáng)啟動(dòng)子，以整合形式穩(wěn)定外源基因，此外，它的培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單明確，甲醇誘導(dǎo)方便易行，能達(dá)到很高的生長(zhǎng)密度而大大提高產(chǎn)量，因此，有利于工業(yè)上進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。利用酵母Pichia Pastoris表達(dá)外源蛋白不乏報(bào)導(dǎo)和專利，但是用其構(gòu)建重組魚生長(zhǎng)激素基因工程菌在國(guó)內(nèi)外卻是首例。
本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一種能夠在胞內(nèi)或胞外高效表達(dá)魚生長(zhǎng)激素的酵母工程菌Pichia Pastoris，由于該表達(dá)產(chǎn)物可促進(jìn)各種魚類、貝類的生長(zhǎng)，所以該菌可以作為餌料添加劑，用于魚類、貝類的人工養(yǎng)殖。
本發(fā)明中的魚生長(zhǎng)激素cDNA是由我們實(shí)驗(yàn)室從魚腦下垂體中分離克隆得到的，并測(cè)定了其全部cDNA序列。論文于1995年發(fā)表在《生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)》，Vol27(5)，且該序列被收入國(guó)際基因庫(kù)。將魚生長(zhǎng)激素基因克隆到酵母高效表達(dá)穿梭載體中，利用電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)入酵母。通過(guò)P.CR技術(shù)和地高辛(DIG)標(biāo)記的探針從轉(zhuǎn)化子中篩選出十個(gè)高拷貝的含有魚生長(zhǎng)激素(GH)基因的菌株。檢測(cè)多拷貝轉(zhuǎn)化子的表型后，實(shí)驗(yàn)室里用三角錐瓶進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及Western雜交確證表達(dá)產(chǎn)物為魚生長(zhǎng)激素，表達(dá)量約為100mg/l，而工業(yè)發(fā)酵中有良好的通氣條件，并能利用簡(jiǎn)單確定的培養(yǎng)基，產(chǎn)量至少為1g/l，因此有很好的工業(yè)發(fā)酵前景。
本發(fā)明基于前期的魚生長(zhǎng)激素基因cDNA序列的測(cè)定和酵母，尤其是甲基營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母Pichia Pastoris的優(yōu)越性，構(gòu)建了一種高效表達(dá)的重組魚生長(zhǎng)激素基因工程酵母菌，為日后工業(yè)生產(chǎn)飼料打下基礎(chǔ)。附圖
為魚生長(zhǎng)激素基因在酵母高效表達(dá)載體pHIL-D2中的克隆以下對(duì)本發(fā)明的具體思路及方法做詳細(xì)描述一、引物P1055’-AAAGAA TTCATG CAG CCA ATC ACA GAG AAC-3’EcoRIP1035’-GGGGAA TTCTAC AG(AG)GTG CAG TT(AG)GC(CT)TC-3’EcoRIP2055’-TGG T(GT)G A(AG)T C(GCT)T GGG A-3’P2035’-CAT G(CT)C(CT)TT(CT)TT(AG)AA(AG)CA-3’p3055’-GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC-3’p3035’-GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCC-3’二、常用溶液、培養(yǎng)基的配制1.LB培養(yǎng)基NaCl 1％Yeast extract 0.5％Tryptone 1％瓊脂 1.5％(固體培養(yǎng)基)2.2xYT培養(yǎng)基NaCl 0.5％Yeast extract 1.0％Tryptone 1.6％3.YPD培養(yǎng)基
yeast extract 1％peptone2％dextrose 2％4.MGY培養(yǎng)基YNB1.34％glycerol 1％biotin 4×10-5％5.MD培養(yǎng)基YNB1.34％biotin 4×10-5％dextrose 1％6.MM培養(yǎng)基YNB1.34％biotin 4×10-5％methanol 0.5％7.IMD培養(yǎng)基10×IM1salt36.7mM KH2PO422.7mM(NH4)2SO42.0mM MgSO4.7H2O 6.7mM KCl0.7mM CaCl2.2H2O400×trace salt0.2μM CuSO41.25μM KI4.5μM MnSO42.0μM NaMoO4.2H2O0.75μM H3BO317.5μM ZnSO4.7H2O44.5μM FeCl3.6H2Obiotin 0.4ug/mlglucose2％8.BMGY培養(yǎng)基yeast extract 1％peptore2％potassium phosphate100mM(pH6.0)YNB1.34％biotin 4×10-5％glycerol 1％9.BMMY培養(yǎng)基yeast extract 1％peptone2％potassium phosphate100mM(pH6.0)YNB1.34％
biotin 4×10-5％methanol 0.5％10.堿法抽提質(zhì)粒溶液I(GET)葡萄糖 50mMEDTA 10mMTris-Hcl 25mM pH8.011.堿法抽提質(zhì)粒溶液IINaOH0.2MSDS 1％12.堿法抽提質(zhì)粒溶液IIIKAc/5M 15ml冰HAc 7mldd Water3ml13.PCR反應(yīng)緩沖液(10×)Tris-Hcl0.1M/pH8.3MgCl215mMKCl 0.5M明膠0.1％14.連接酶緩沖液(5×)Tris-HCl 0.25M/pH7.6MgCl250mMATP 5mMDTT 5mM15.CIP緩沖液Tris-HCl 100mM pH8.3MgCl210mMZnCl210mM16.RNase貯液將RNase溶于10mM Tris-HCl/pH7.5，15mM NaCl，配成濃度為10mg/ml的溶液，于100℃加熱15分鐘，分裝成小份。17.TAE(50×)Tris-HAc 2MEDTA 50mM18.TE緩沖液Tris-HCl 10mM/pH8.0EDTA 1mM19.TES緩沖液Tris-HCl 10mM/pH8.0
EDTA 1mMNaCl 0.1M20.瓊脂糖凝膠電泳上樣緩沖液(6×)溴酚藍(lán) 0.25％蔗糖 40％21.雜交液5×SSCblocking reagent 1％(w/v)N-lauroylsarcosine Na-Salt 0.1％(w/v)SDS0.02％(w/v)22.雜交檢測(cè)Bufferbuffer1Tris-HCl 100mM/pH7.5NaCl 150mMbuffer21％ blocking reagent溶解于bufferlbuffer3Tris-HCl 100mM/PH9.5NaCl 100mMMgCl250mMbuffer4Tris-HCl 10mM/PH8.0EDTA 1mM23.丙烯酰胺水溶液(30.8％)丙烯酰胺 30％N，N′-甲叉丙烯酰胺0.8％24.SDS-PAGE分離膠緩沖液(4×)Tris pH8.8 18.2％SDS0.4％25.SDS-PAGE濃縮膠緩沖液(4×)Tris pH6.8 6.06％SDS0.4％26.SDS-PAGE電極緩沖液(5×)Tris pH8.3 3％SDS0.5％Gly14.4％27.SDS-PAGE上樣緩沖液(2×)Tris 20mM pH8.2EDTA 2mM
SDS 2％β-巰基乙醇 10％甘油 16％溴酚藍(lán)0.05％28.NaI溶液(100ml)NaI 90.8gNa2SO32g經(jīng)0.45um濾膜過(guò)濾29.洗脫液乙醇50mlTris-HCl(20mM/PH7.4)/EDTA(1mM)/NaCl(100mM)50ml30.魔力柱樹(shù)脂硅藻土 50mg/ml鹽酸胍 6M31.TE pH7.4Tris-HCl pH7.4 10mMEDTA pH8.0 1mM32.TE/LiClLiCl0.1MTris-HCl pH7.4 10mMEDTA1mM33.PEG溶液40％PEG-3350于TE/LiCl34.SCE pH5.8sorbitol1MEDTA1mM檸檬酸鈉10mM35.2×CTAB抽提緩沖液CTAB2％NaCl1.4MTris-HCl100mM pH8.0EDTA20mM36.轉(zhuǎn)移緩沖液Tris-HCl48Mm甘氨酸 39MmSDS 0.037甲醇20％37.PBSNaCl0.8％
KCl 0.02％Na2HPO40.144％KH2PO40.024％38.封閉試劑PBS中加入1％ blocking三.方法(一).魚生長(zhǎng)激素DNA在pBluescript及pHIL-D2中的克隆1.魚生長(zhǎng)激素DNA的制備以本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的含生長(zhǎng)激素片段的質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增10×PCR緩沖液 5μldNTP5μlP1051μlP1031μlDNA模板 10μl(20ng)ddW 28μl加2滴礦物油，99℃ 15分鐘，加入1μlTaq酶(2unit)，94℃ 30sec；55℃ 30sec；72℃ 30sec；20個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。
擴(kuò)增產(chǎn)物用silica純化。2.pBluescript-fGH的構(gòu)建將GH DNA片段PCR產(chǎn)物用EcoR I進(jìn)行酶切反應(yīng)，電泳后，用silica純化。pBluescript用EcoR I酶切，經(jīng)去磷酸化、silica純化后，與GH片段進(jìn)行連接反應(yīng)，經(jīng)轉(zhuǎn)化XLl-Blue感受態(tài)細(xì)胞，挑取6個(gè)白色菌落，接種LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，以EcoR I進(jìn)行酶切反應(yīng)。經(jīng)電泳，選酶切片段為GH片段大小的(560bp)，以GH內(nèi)部引物P205，P203作PCR反應(yīng)，循環(huán)條件94℃ 30sec；50℃ 1min；72℃ 30sec。擴(kuò)增30圈。將PCR產(chǎn)物電泳，擴(kuò)增片段約為250 bp，確證插入的為GH片段。3.pHIL-D2-GH的構(gòu)建用EcoR I酶切pBluescript-GH，并用silica純化。pHIL-D2經(jīng)EcoRI酶切，去磷酸化，silica純化后，與GH片段進(jìn)行連接反應(yīng)。經(jīng)轉(zhuǎn)化XL1-Blue，以P105，P303為引物，直接挑取單菌落加入反應(yīng)體系做菌落PCR，以確證GH在pHIL-D2中的正確克隆方向。循環(huán)條件94℃ 30sec；55℃1min；72℃ 30sec。擴(kuò)增30圈。經(jīng)電泳，能擴(kuò)增出來(lái)的為正確的插入方向。接種2×YT培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，進(jìn)行質(zhì)粒的大量提取。用NotI酶切，并用硅藻土進(jìn)行純化，以備轉(zhuǎn)化用。(二).電轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞1)挑單菌落酵母細(xì)胞于80ml YPD，30℃培養(yǎng)至OD600為1.3-1.5；2)5,000rpm，4℃離心5分鐘。重懸于8ml ddW；3)加入1ml 10×TE pH7.5，1ml 10×LiCl(1M，pH7.5)，30℃輕搖45分鐘；4)加入0.25ml 1M DTT，30℃輕搖15分鐘；5)用水稀釋至50ml，離心，分別以下列溶液重懸25ml冰冷的ddW；3ml冰冷的1M山梨醇；0.05ml冰冷的1M山梨醇；6)混合40μl細(xì)胞和少于100ng經(jīng)NotI線性化的pHIL-D2-GH，混勻，轉(zhuǎn)到冰冷的0.2cm電穿孔容器；7)冰浴5分鐘；8)用Bio-Rad Gene Pulser電擊時(shí)間約10ms，場(chǎng)強(qiáng)為7500v/cm.設(shè)定參數(shù)為1500v，50μF，200Ω；9)加入1ml冰浴的1M山梨醇，轉(zhuǎn)移到eppendorf管；10)取200μl涂布IMD板，30℃培養(yǎng)2-3天。(三).酵母PCR快速檢測(cè)方法篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子挑取單菌落轉(zhuǎn)化子于5μl 1％蝸牛酶/SCE溶液，30℃輕搖1小時(shí)，酶解破壁，99℃加熱15分鐘，稀釋至20μl，取2μl為模板做PCR反應(yīng)10×緩沖液 2μldNTP2μlP1050.25μlP1030.25μl模板2μlddW 12.5μlTaq酶 1μl95℃加熱2分鐘；94℃ 30sec；50℃ 1min；72℃ 30sec；擴(kuò)增2圈；94℃ 30sec；50℃ 30sec；72℃ 30sec；擴(kuò)增38圈；經(jīng)電泳，能擴(kuò)增出560 bp的片段的為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。(四).篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子1酵母DNA的提取1)接種單菌落陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子于YPD中，30℃培養(yǎng)3-4天；
2)5,000rpm離心45秒，用50mM TE(pH8.0)洗一次，壓干，稱重；3)按2ml/g細(xì)胞懸于TE，加入2％β-巰基乙醇，室溫?fù)u動(dòng)15分鐘。離心，用SCE洗一次；4)加入與TE相同體積的1％蝸牛酶/SCE，37℃振蕩2-3小時(shí)，5.000rpm離心10分鐘，SCE洗一次；5)加入0.5ml 2×CTAB抽取緩沖液，70℃，10分鐘；6)冷至室溫，加入0.5ml氯仿/異戊醇(24∶1)，充分混勻，離心；7)取上清，加入50μl 5％ CTAB/0.5M NaCl，混勻，重復(fù)6)；8)取上清，加入50μl 5％ CTAB/0.5M NaCl，混勻，加入0.5ml ddW；9)離心，沉淀溶于0.5ml 1M NaCl/TE，加入5μl 10％ SDS，5μl 1MMgCl2，0.25ml異丙醇，回收沉淀，70％乙醇洗兩次，溶于TE。2.點(diǎn)雜交1)點(diǎn)樣酵母染色體DNA樣品經(jīng)測(cè)分光定量后，取等量DNA 0.5μg點(diǎn)在膜上，樣品干燥后，將膜放于變性液(1.5M NaCl/0.5M NaOH)中變性5min，再用中和液(1.0M Tris-HCl/1.5M NaCl/PH8.0)中和5min，干燥后，紫外(254nm)交聯(lián)3min。
2)預(yù)雜交1-2hr。
3)雜交DIG標(biāo)記探針?lè)兴?min，迅速冰浴進(jìn)行變性；換雜交液，加入探針20ng/ml，65℃雜交8-16hr。
4)洗膜用2x SSC/0.1％SDS室溫洗膜5min，兩次；用0.1x SSC/0.1％SDS 65℃洗膜15min，兩次。
5)檢測(cè)(在室溫下進(jìn)行)a.bufferl洗膜1minb.加buffer2 1ml，放置30minc.將antibody conjugate按1∶5000稀釋在buffer2中，繼續(xù)放置30mind.用bufferl洗膜15min，兩次e.用buffer3平衡2min，并換一次buffer3f.將NBT-solution及X-phosphate-solution分別按4.5μl/1ml及3.5μl/lml buffer3加入并進(jìn)行顯色，可在buffer4洗滌，終止顯色。
g.也可用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)用濾紙吸去多余的buffer3，加約5μl化學(xué)發(fā)光劑CSPD浸潤(rùn)雜交膜，放入雜交袋中，用X射線膠片壓片，曝光5-6小時(shí)，然后沖洗膠片。
6)選擇雜交信號(hào)強(qiáng)的為多拷貝轉(zhuǎn)化子。(五).表型檢測(cè)將等量的多拷貝轉(zhuǎn)化子分別接種MD和MM培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)，在MM中和在MD中生長(zhǎng)速度相同的為Mut+(甲醇利用正常型)，在MM中的生長(zhǎng)速度明顯慢于MD的為Muts(甲醇利用緩慢型)。(六).表達(dá)1.Mut+轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá)1)挑取單克隆接種25ml MGY，30℃培養(yǎng)至OD600為2-6；2)5,000rpm離心5分鐘，去上清，用MM重懸細(xì)胞至OD600為1.0；3)蓋兩層紗布，30℃培養(yǎng)；4)每24小時(shí)加入100％甲醇至終濃度為0.5％；5)培養(yǎng)3-4天，收獲1ml培養(yǎng)物，最大速離心1分鐘，去上清，存于-20℃；2.Muts轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá)1)挑取單克隆接種25ml MGY，30℃培養(yǎng)至OD600為2-6；2)5,000rpm離心5分鐘，去上清，用MM將細(xì)胞濃縮5-10倍；3)蓋兩層紗布，30℃培養(yǎng)；4)每24小時(shí)加入100％甲醇至終濃度為0.5％；5)培養(yǎng)6-7天，收獲1ml培養(yǎng)物，最大速離心1分鐘，去上清，存于-20℃3.SDS-PAGE樣品的制備(1).釋放內(nèi)容物的方法1)將誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)物用ddW洗兩次；2)加入50μl 1％蝸牛酶/SCE，37℃，輕搖3小時(shí)，緩慢離心；3)山梨醇洗兩次；4)加入1×上樣緩沖液100μl，沸水浴5分鐘，離心，取上清。
(2).上清液處理方法1).用10％TCA沉淀上清液蛋白，-20℃放置30分鐘，離心收集沉淀；2).乙醇乙醚(1∶1)洗3次，真空干燥；3).加入1×上樣緩沖液，溶解，沸水浴5分鐘，取10ul上樣。4.SDS-PAGE(1).依下配方配制分離膠10ml，混勻，灌膠；
凝膠儲(chǔ)液(30.8％) 4ml4×分離膠緩沖液 2.5mlddW 3.5ml10％過(guò)硫酸胺 80μlTEMED 8μl(2).待分離膠凝固后，依下配方配制濃縮膠5ml，混勻，灌膠于分離膠之上；凝膠儲(chǔ)液(30.8％) 0.65ml4×濃縮膠緩沖液 12.5mlddW 3.1ml10％過(guò)硫酸胺 40μlTEMED 4μl(3).取5μl樣品及分子量標(biāo)準(zhǔn)上樣；(4).電泳條件0.5v/cm，20min；1.5v/cm，約1.5hr；(5).電泳后，剝膠，于25％異丙醇，7％乙酸中固定至指示劑顏色退去(約1小時(shí))；(6).將凝膠浸沒(méi)于0.02％考馬斯亮蘭R250，7％乙酸中染色，約30分鐘；(7).用7％乙酸反復(fù)脫色至背景變白；(8).將凝膠轉(zhuǎn)至大小合適的濾紙上，覆蓋以保鮮膜，80℃真空干燥2小時(shí)。
(9).電泳后，在分子量為20,000處有一條帶，初步確證表達(dá)產(chǎn)物為生長(zhǎng)激素。5.western雜交1)蛋白樣品及標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)激素樣品按上述條件經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行分離；2)將硝酸纖維素膜用水潤(rùn)濕；3)在托盤中加入轉(zhuǎn)移緩沖液，將濾紙浸入其中；在上面依次加上凝膠，硝酸纖維素膜，濾紙，衛(wèi)生紙，及重物，并經(jīng)常更換已潤(rùn)濕的衛(wèi)生紙，轉(zhuǎn)移過(guò)夜；4)硝酸纖維素膜用PBS洗3次，加入封閉試劑，室溫下?lián)u動(dòng)溫育2小時(shí)；5)用PBS洗膜2次，各5分鐘。在封閉試劑中加入鼠抗鱸魚生長(zhǎng)激素抗體，稀釋比為1∶1000。室溫下?lián)u動(dòng)溫育至少1小時(shí)；6)用PBS洗膜4次，每次5分鐘。在封閉試劑中加入羊抗小鼠IgG-HRP，稀釋比為1∶1000。室溫下?lián)u動(dòng)溫育1小時(shí)；7)用PBS洗膜4次，每次5分鐘。
8)溶解6mg二甲基聯(lián)苯胺于10ml 50mM Tris(PH 7.6)，過(guò)濾，加入10ul 30％ H2O2，將膜在其中搖動(dòng)1-5分鐘，顯色。用PBS洗膜終止反應(yīng)。
9)雜交后，蛋白質(zhì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)激素對(duì)應(yīng)處有一條雜交帶，進(jìn)一步確證表達(dá)產(chǎn)物為生長(zhǎng)激素。
以上是以載體pHIL-D2為例。本發(fā)明中的方法，其中所說(shuō)的載體還包括pPIC3，pHIL-S1，pHIC9等酵母胞內(nèi)及分泌表達(dá)載體。
權(quán)利要求
1.一種重組魚生長(zhǎng)激素基因工程酵母菌，其特征在于在甲基營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母Pichia Pastoris中克隆了魚生長(zhǎng)激素基因，并能在胞內(nèi)或胞外高效表達(dá)魚生長(zhǎng)激素。
2.一種基因工程酵母菌的構(gòu)建方法，該方法包括以下步驟(1)將目的基因克隆到載體中；(2)將克隆有目的基因的載體轉(zhuǎn)化到酵母中；(3)在轉(zhuǎn)化子中篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；(4)在陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子；(5)檢測(cè)多拷貝轉(zhuǎn)化子的表型；(6)對(duì)多拷貝轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并驗(yàn)證表達(dá)產(chǎn)物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所說(shuō)的目的基因?yàn)轸~生長(zhǎng)激素基因。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所說(shuō)的載體包括pHIL-D2，pPIC3，pHIL-S1，pPIC9等酵母胞內(nèi)及分泌表達(dá)載體。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所說(shuō)的酵母為甲基營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母Pichia Pastoris。
6.可由權(quán)利要求2的方法獲得的重組魚生長(zhǎng)激素基因工程酵母菌，能在胞內(nèi)或胞外高效表達(dá)魚生長(zhǎng)激素。
全文摘要
本發(fā)明利用甲基營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母pichia Pastoris這一理想的真核蛋白高水平表達(dá)系統(tǒng),將魚生長(zhǎng)激素基因克隆到酵母整合型質(zhì)粒載體,經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、誘導(dǎo)表達(dá),獲得了高效表達(dá)的重組魚生長(zhǎng)激素基因工程酵母菌。
文檔編號(hào)C12N15/18GK1207415SQ9711562
公開(kāi)日1999年2月10日 申請(qǐng)日期1997年8月6日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月6日
發(fā)明者陳丹, 楊豐, 王瑋, 徐洵 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所